PL223157B1 - Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanie - Google Patents
Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanieInfo
- Publication number
- PL223157B1 PL223157B1 PL385243A PL38524308A PL223157B1 PL 223157 B1 PL223157 B1 PL 223157B1 PL 385243 A PL385243 A PL 385243A PL 38524308 A PL38524308 A PL 38524308A PL 223157 B1 PL223157 B1 PL 223157B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strain
- spt23
- saccharomyces cerevisiae
- mga2
- yeast strain
- Prior art date
Links
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 title claims description 38
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 title claims description 37
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 23
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 23
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 21
- 239000002551 biofuel Substances 0.000 claims description 16
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 13
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 12
- 241000233866 Fungi Species 0.000 claims description 9
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 claims description 8
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 claims description 8
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 7
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 7
- 239000003550 marker Substances 0.000 claims description 7
- 241000235349 Ascomycota Species 0.000 claims description 6
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 claims description 6
- 101100310867 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) SPT23 gene Proteins 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 claims description 5
- 241000235058 Komagataella pastoris Species 0.000 claims description 5
- 241000221945 Podospora Species 0.000 claims description 5
- 241000223259 Trichoderma Species 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 239000006152 selective media Substances 0.000 claims description 5
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 claims description 4
- 235000013305 food Nutrition 0.000 claims description 4
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 4
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 claims description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 claims description 3
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 claims description 2
- 101150000874 11 gene Proteins 0.000 claims 1
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 claims 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims 1
- 210000005253 yeast cell Anatomy 0.000 claims 1
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerol Natural products OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 19
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 18
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 18
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 14
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 8
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 8
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 8
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 8
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 7
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 6
- -1 glycerol fatty acid esters Chemical class 0.000 description 6
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 5
- 101150057439 SPT23 gene Proteins 0.000 description 5
- 101100291026 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) MGA2 gene Proteins 0.000 description 5
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 3
- 101150024655 MGA2 gene Proteins 0.000 description 3
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 3
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000012261 overproduction Methods 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N triformin Chemical compound O=COCC(OC=O)COC=O UFTFJSFQGQCHQW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M (R)-mevalonate Chemical compound OCC[C@](O)(C)CC([O-])=O KJTLQQUUPVSXIM-ZCFIWIBFSA-M 0.000 description 2
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N D-xylopyranose Chemical compound O[C@@H]1COC(O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-IOVATXLUSA-N 0.000 description 2
- KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N DL-mevalonic acid Natural products OCCC(O)(C)CC(O)=O KJTLQQUUPVSXIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 2
- 210000004899 c-terminal region Anatomy 0.000 description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 2
- 150000002031 dolichols Chemical class 0.000 description 2
- 230000032050 esterification Effects 0.000 description 2
- 238000005886 esterification reaction Methods 0.000 description 2
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 2
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 2
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 1
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 1
- 101000650779 Boana raniceps Raniseptin-5 Proteins 0.000 description 1
- 240000002791 Brassica napus Species 0.000 description 1
- 235000006008 Brassica napus var napus Nutrition 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101150009006 HIS3 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000207836 Olea <angiosperm> Species 0.000 description 1
- 101100394989 Rhodopseudomonas palustris (strain ATCC BAA-98 / CGA009) hisI gene Proteins 0.000 description 1
- 102000006275 Ubiquitin-Protein Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010083111 Ubiquitin-Protein Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000010775 animal oil Substances 0.000 description 1
- PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N arabinose Natural products OCC(O)C(O)C(O)C=O PYMYPHUHKUWMLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000498 ball milling Methods 0.000 description 1
- SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N beta-D-Pyranose-Lyxose Natural products OC1COC(O)C(O)C1O SRBFZHDQGSBBOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003225 biodiesel Substances 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000011138 biotechnological process Methods 0.000 description 1
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000008121 dextrose Substances 0.000 description 1
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 description 1
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 description 1
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 1
- 239000003502 gasoline Substances 0.000 description 1
- 238000012224 gene deletion Methods 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003301 hydrolyzing effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 description 1
- 229920005610 lignin Polymers 0.000 description 1
- 125000003473 lipid group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004322 lipid homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N nile red Chemical compound C1=CC=C2C3=NC4=CC=C(N(CC)CC)C=C4OC3=CC(=O)C2=C1 VOFUROIFQGPCGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 150000002894 organic compounds Chemical class 0.000 description 1
- 239000011368 organic material Substances 0.000 description 1
- JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N phencyclidine Chemical compound C1CCCCN1C1(C=2C=CC=CC=2)CCCCC1 JTJMJGYZQZDUJJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000027086 plasmid maintenance Effects 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000006337 proteolytic cleavage Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 230000007928 solubilization Effects 0.000 description 1
- 238000005063 solubilization Methods 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 150000005846 sugar alcohols Polymers 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000005809 transesterification reaction Methods 0.000 description 1
- 230000034512 ubiquitination Effects 0.000 description 1
- 238000010798 ubiquitination Methods 0.000 description 1
- 239000008158 vegetable oil Substances 0.000 description 1
- 235000013311 vegetables Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02E—REDUCTION OF GREENHOUSE GAS [GHG] EMISSIONS, RELATED TO ENERGY GENERATION, TRANSMISSION OR DISTRIBUTION
- Y02E50/00—Technologies for the production of fuel of non-fossil origin
- Y02E50/10—Biofuels, e.g. bio-diesel
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy zmodyfikowany szczep drożdżowy, sposób jego wytwarzania i jego zastosowanie do produkcji biopaliw. W szczególności wynalazek dotyczy zmodyfikowanych szczepów typu dzikiego z gatunku Saccharomyces cerevisiae oraz innych szczepów z rodzaju Saccharomyces, Ascomycota (workowce) oraz innych drożdży, jak Pichia pastoris, Yarrovia lipolytica oraz grzybów nitkowatych z rodzaju Aspergillus, Podospora czy Trichoderma, używanych do produkcji białek (enzymów, inhibitorów) w procesach biotechnologicznych.
Znane są różne sposoby produkcji biopaliw. I tak ze zgłoszenia międzynarodowego WO2007129921 znany jest zintegrowany proces produkcji etanolu z lesistego materiału roślinnego przez kontaktowanie przepływu ciągłego materiału roślinnego z przepływem ciągłym przeciwnego prądu wodnego, przy temperaturze podwyższonej i ciśnieniu w celu wytworzenia materiału roślinnego pozbawionego ligniny; wydobycie etanolu z ligniny; kontaktowanie pozostałego materiału roślinnego z wodą przy temperaturze podwyższonej i ciśnieniu do solubilizy ksylozy; hydrolizująca celulozy obecnej w materiale roślinnym do wytworzenia glukozy, która z kolei fermentuje się w celu wyprodukowania etanolu.
Z WO2007126975 znana jest izolowana nowa Gram ujemna bakteria, przy czym bakteria jest tlenowym, fakultatywnym metylotrofem, który produkuje kolonie, które mogą użyć metanolu jako jedynego źródła węgla i mogą utlenić glukozę i etanol do kwasu. Omówiono też nowe oczyszczone po lipeptydy i wyizolowane kwasy nukleinowe oraz metodę zastosowania bakterii i oczyszczonych polipeptydów do degradowania materiału organicznego w komórkach do biopaliwa.
Z WO2007127059 znana jest tworząca emulsję kompozycja biopaliwa zawierającego około 50-95% przynajmniej jednego płynnego oleju roślinnego albo zwierzęcego albo ich mieszaniny, 1-50% wody jako fazę rozpraszającą, około 1-25% związku organicznego wybranego od grupy zawierającej mono-, di-, tri- alkohole wielowodorotlenowe, około 0,05-10% przynajmniej jednego emulgatora. Biopaliwo jest przygotowane z tych komponentów przez mieszanie z wysoko tnącą energią.
Publikacja WO2008006860 opisuje przygotowywanie estrów kwasu tłuszczowego glicerolu albo przez transesteryfikację trójglicerydu albo, alternatywnie, przez proces estryfikacji kwasów tłuszczowych poprzednio otrzymanych przez hydrolizę trójglicerydów, z glicerolem, w obecności katalizatora. Wynalazek opisuje użycie tych estrów kwasu tłuszczowego i glicerolu do przygotowania biopaliwa. Takie biopaliwo stosuje się w przygotowywaniu innych biopaliw wybranych z grupy obejmującej glicerol, biodiesel, benzyna, diesel i ich mieszaniny, przez jego mieszanie z dodatkami.
Nieoczekiwanie okazało się, że sposobem według wynalazku możliwe jest otrzymanie biopaliwa z zastosowaniem zmodyfikowanych szczepów drożdżowych, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, transformowanych plazmidami kodującymi czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2 pozbawione domeny transmembranowej, które nieoczekiwanie kontrolują (zwiększają) biosyntezę lipidów i morfologię ciałek lipidowych.
Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, posiadający zwiększoną biosyntezę lipidów i zmienioną morfologię ciałek lipidowych, transformowany plazmidami kodującymi czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2 pozbawione C-terminalnej domeny transmembranowej (Spt23-Atm, Mga2-Atm) [zawierającymi delecje we fragmencie kodującym C-terminalną część tych białek], posiadającymi marker URA3, przy czym gen SPT23 posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na:
fig. 1: Gen SPT23/YKL020C-Atm Chromosom 11 i odpowiadającą mu sekwencję aminokwasową: fig. 2: Białko Spt23-Atm natomiast Gen MGA2-Atm ma sekwencję nukleotydową przedstawioną na: fig. 3: Gen MGA2/YIR033W-Atm Chromosom 9 i odpowiadającą mu sekwencję aminokwasową: fig. 4: Białko Mga2-Atm
Sposób wytwarzania szczepu drożdżowego, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, według wynalazku, polega na tym, że szczep typu dzikiego drożdży, Saccharomyces cerevisiae posiadający odpowiedni marker pokarmowy, transformuje się plazmidami kodującymi odpowiednio czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2 pozbawione domeny transmembranowej, pSEY8-SPT23 lub pSEY8-MGA2, posiadającymi marker URA3, po czym otrzymane transformanty hoduje się do fazy stacjonarnej w pożywce selekcyjnej.
PL 223 157 B1
W sposobie według wynalazku, jako szczep typu dzikiego stosuje się szczep wybrany z grupy obejmującej szczep z rodzaju Saccharomyces, zwłaszcza gatunku Saccharomyces cerevisiae, oraz innych szczepów z rodzaju Saccharomyces, Ascomycota (workowce), korzystnie drożdży, jak Pichia pastoris, Yarrovia lipolytica oraz grzybów nitkowatych z rodzaju Aspergillus, Podospora czy Trichoderma.
W korzystnym wariancie sposobu według wynalazku, możliwe jest użycie zmodyfikowanych genów kodujących czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2 pozbawione domeny transmembranowej (transbłonowej), przy użyciu plazmidu integracyjnego niosącego gen SPT23 lub MGA2 z delecją (YIP-SPT23-Atm, YIP-MGA2-Atm), umożliwiającego wymianę kopii genomowej tych genów na kopię z delecją lub też pozwalającego na integrację drugiej niezależnej kopii poza kopią genomową typu dzikiego do wytworzenia odpowiedniego szczepu drożdży.
W sposobie według wynalazku, korzystnie, transformanty hoduje się w pożywce selekcyjnej warunkującej utrzymanie plazmidu.
Jak stwierdzono, w badaniach własnych, otrzymane sposobem według wynalazku szczepy takie mają znacznie podwyższoną biosyntezę steroli i trójglicerydów (są to estry glicerolu i kwasów tłuszczowych), które mogą być bardzo użyteczne.
Zastosowanie szczepu drożdży, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, według wynalazku, do wytwarzania biopaliw.
Dokładniej zastosowanie może przebiegać następująco: wyhodowane komórki transformantów zbiera się i wydobywa z nich lipidy, korzystnie przez zamrożenie i rozbicie komórek, a następnie ekstrakcję lipidów z rozbitych komórek za pomocą rozpuszczalników organicznych, po czym rozpuszczalniki się odparowuje.
Korzystnie, zebrane komórki, zamraża się, po czym rozbija się z użyciem kulek szklanych i młynka o obrotach około 5000/min. Następnie lipidy ekstrahuje się z rozbitych komórek za pomocą rozpuszczalników organicznych, korzystnie wybranych z grupy obejmującej heksan lub mieszaninę chloroformu z metanolem, po czym rozpuszczalniki się odparowuje.
Wydobycie lipidów wytworzonych przez komórki zmodyfikowanego szczepu, można wykonać, każdym znanym i stosowanym w przemyśle biotechnologicznym sposobem, korzystnie po rozbiciu komórek z zastosowaniem ultradźwięków czy wysokiego ciśnienia.
Wszystkie wymienione wyżej rodzaje grzybów mogą być użyte do produkcji biopaliw. Jak pokazują uzyskane wyniki, szczepy wyrażające takie geny mają znacznie podwyższoną biosyntezę steroli i trójglicerydów, które mogą być użyteczne właśnie w produkcji biopaliw.
Komórki grzybów trzeba rozbić przez zastosowanie wysokiego ciśnienia, ultradźwięków albo mielenia w młynach kulowych. Lipidy nie dają się prosto wycisnąć z całych komórek, jak z rzepaku czy oliwek, bo drożdże i grzyby nitkowate mają chitynowe ściany komórkowe,
W sposobie według wynalazku, transformuje się szczep typu dzikiego, który ma tytko markery pokarmowe, niezbędne do selekcji transformantów, powodując zwiększenie biosyntezy ważnych i użytecznych lipidów, które mogą być wykorzystane do produkcji biopaliw. Można do tego użyć też każdy szczep, który ma stosowny marker. To samo (delecje) można też otrzymać przez manipulacje w genach SPT23 i MGA2 w genomie, przy użyciu plazmidu integracyjnego niosącego gen SPT23 lub MGA2 z delecją, który umożliwi wymianę kopii geneomowej tych genów na kopię z delecją lub też pozwoli na integrację drugiej niezależnej kopii poza kopią genomową typu dzikiego. Plazmid ten w niektórych przypadkach następnie może być usunięty z genomu. Do celów biotechnologicznych ta druga metoda z integracją SPT23 lub MGA2 z delecją jest nawet lepsza, bo integracja jest stabilna i komórki mogą być hodowane na pożywkach nieselektywnych bez obawy gubienia genu SPT23 lub MGA2 z delecją.
Analiza lipidów wytworzonych przez szczep według wynalazku, wykazała, że w szczepach typu dzikiego (np. S. Cerevisiae, MK1 α his3 teu2 ura3 Iys2 trp1) transformowanych plazmidami kodującymi czynniki transkrypcyjne Spt23 i Mga2 pozbawione domeny transmembranowej i konstytutywnie aktywne, występuje znaczny wzrost biosyntezy steroli i trójglicerydów. Ligaza ubikwitynowa Rsp5, która reguluje aktywację Spt23 i Mga2 poprzez ich ubikwitynację umożliwiającą proteolityczne odcięcie domeny transmembranowej, w tym przypadku (tj. przy braku domeny transmembranowej) nie ogranicza aktywnego działania Spt23 i Mga2 i mogą one aktywować geny kodujące enzymy szlaku biosyntezy steroli i trójglicerydów. Poziom całkowity innych lipidów będących produktami końcowymi szlaku mewalonowego, w tym dolicholi, po nadprodukcji Spt23-Atm i Mga2-Atm był obniżony, gdyż produkty pośrednie powstałe we wczesnych etapach szlaku mewalonowego, którego produktami są
PL 223 157 B1 zarówno sterole jak i dolichole, zostały w większym stopniu użyte do biosyntezy steroli w porównaniu do szczepu nie nadprodukującego Spt23 czy Mga2.
Nadprodukcja Spt23 i Mga2 powodowała powstawanie ogromnych ciałek lipidowych w komórce, które były obserwowane w mikroskopie fluorescencyjnym po barwieniu barwnikiem Nile Red. Ciałka lipidowe są organellami magazynującymi estry steroli i trójglicerydy. Analiza poziomu estrów steroli, formy steroli związanych z kwasami tłuszczowymi, wykazała brak znaczącego wpływu nadprodukcji Spt23 i Mga2 na poziom tych związków, podczas gdy poziom całkowitych steroli (wolne sterole + estry steroli) był zwiększony w tych warunkach. Wskazuje to, że Spt23 i Mga2 są zaangażowane w regulację syntezy steroli, ale nie mają wpływu na ich estryfikację kwasami tłuszczowymi. Co więcej zwiększenie poziomu wolnych steroli nie było dla komórki toksyczne i nie powodowało zwiększonego przetwarzania ich do estrów steroli. Podsumowując, wyniki te wskazują, że aktywatory transkrypcji Spt23 i Mga2 kontrolują homeostazę lipidów i morfologię ciałek lipidowych.
Jest wysoce prawdopodobne, że ekspresja genów SPT23-Atm i MGA2-Atm w innych grzybach, zwłaszcza workowcach spowoduje także zwiększoną biosyntezę steroli i trójglicerydów w komórkach, ponieważ analiza komputerowa wykazała, że u wszystkich grzybów (Fungi) występują homologi drożdżowych genów SPT23 i MGA2, przy czym gen SPT23 Saccharomyces cerevisiae posiada sekwencję nukleotydową przedstawioną na rysunku fig. 1 oraz odpowiadającą mu sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 2, natomiast Gen MGA2-Atm ma sekwencję nukleotydową przedstawioną na rysunku fig. 3 oraz odpowiadającą mu sekwencję aminokwasową przedstawioną na rysunku fig. 4.
Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.
P r z y k ł a d I
Otrzymanie transformanta szczepu dzikiego Saccharomyces cerevisiae
Komórki szczepu Saccharomyces cerevisiae posiadającego odpowiedni marker pokarmowy ura3, transformowano plazmidami pSEY8-SPT23 lub pSEY8-MGA2 z markerem URA3, kodującymi odpowiednio czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2 pozbawione domeny transmembranowej (Jentsch i wsp., Cell. 2000), po czym otrzymane transformanty hodowano w fazie stacjonarnej na pożywce selekcyjnej warunkującej utrzymanie plazmidu SC-ura [Sherman, 2002 Methods Ezymol. 350, 3-41; 2% dekstroza, 0,67% drożdżowe zasady azotowe (Difco), aminokwasy, adenina].
Otrzymany sposobem według wynalazku szczep wykazywał znacznie podwyższoną biosyntezę steroli i trójglicerydów (estry glicerolu i kwasów tłuszczowych).
P r z y k ł a d y II - VIII
Podobnie postępowano ze szczepami innych rodzajów grzybów Saccharomyces, Ascomycota (workowce) oraz Pichia pastoris, Yarrovia lipolytica, a także grzybów nitkowatych z rodzaju Aspergillus, Podospora czy Trichoderma, przy użyciu plazmidu integracyjnego niosącego gen SPT23 lub MGA2 z delecją, umożliwiającego wymianę kopii geneomowej tych genów na kopię z delecją, pozwalającego na integrację drugiej niezależnej kopii, poza kopią genomową typu dzikiego do wytworzenia odpowiedniego szczepu drożdży.
Wszystkie otrzymane sposobem według wynalazku szczepy wykazywały znacznie podwyższoną biosyntezę steroli i trójglicerydów (glicerolu i kwasów tłuszczowych).
P r z y k ł a d IX
Wytwarzanie biopaliw
Wyhodowane komórki transformantów zbierano i wydobywano z nich lipidy, przez zamrożenie i rozbicie komórek, z użyciem kulek szklanych i młynka o obrotach około 5000 obr./min. Następnie lipidy ekstrahowano z rozbitych komórek za pomocą mieszaniny rozpuszczalników organicznych chloroformu z metanolem [pro], po czym rozpuszczalniki odparowano, a otrzymane lipidy przerabiano standardową metodą na biopaliwo.
Claims (7)
- Zastrzeżenia patentowe1. Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, znamienny tym, że posiada zwiększoną biosyntezę lipidów i zmienioną morfologię ciałek lipidowych, przy czym transformowany jest plazmidami kodującymi czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2, pozbawione domeny transmembranowej, zawierającymi delecje we fragmencie kodującym C-terminalną część tych białek i posiadającymi następującą sekwencję nukleotydową:PL 223 157 B1Gen SPT23/YKL020C-Atm Chromosom 11 przedstawioną na fig. 1.
- 2. Zmodyfikowany szczep drożdżowy według zastrz. 1, znamienny tym, że szczepem typu dzikiego jest szczep z gatunku Saccharomyces cerevisiae lub inny szczep z rodzaju Saccharomyces, Ascomycota (workowce) lub szczep innych drożdży takich jak Pichia pastoris, Yarrovia lipolytica oraz grzybów nitkowatych z rodzaju Aspergillus, Podospora czy Trichoderma.
- 3. Sposób wytwarzania zmodyfikowanego szczepu drożdżowego, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że dziki szczep drożdży, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, posiadający odpowiedni marker pokarmowy, transformuje się plazmidami kodującymi odpowiednio czynniki transkrypcyjne Spt23 lub Mga2 pozbawione domeny transmembranowej, pSEY8-SPT23 lub pSEY8-MGA2, po czym otrzymane transformanty hoduje się do fazy stacjonarnej w pożywce selekcyjnej.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako szczep typu dzikiego stosuje się szczep z gatunku Saccharomyces cerevisiae lub inny szczep z rodzaju Saccharomyces, Ascomycota (workowce) lub szczep innych drożdży takich jak Pichia pastoris, Yarrovia lipolytica oraz grzybów nitkowatych z rodzaju Aspergillus, Podospora czy Trichoderma.
- 5. Zastosowanie szczepu drożdży, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, określonego w zastrz. 1, do wytwarzania biopaliw.
- 6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że komórki transformantów hoduje się do fazy stacjonarnej i zbiera, a następnie rozbija i wydobywa standardową metodą, lipidy wytworzone przez komórki szczepu według wynalazku.
- 7. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że komórki drożdży zbiera się przez wirowanie, rozbija, korzystnie z użyciem ultradźwięków, wysokiego ciśnienia, młyna kulowego lub przez zamrażanie, a następnie ekstrahuje się z nich lipidy za pomocą rozpuszczalników organicznych wybranych z grupy obejmującej heksan lub mieszaninę chloroformu z metanolem, po czym rozpuszczalniki się odparowuje.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL385243A PL223157B1 (pl) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL385243A PL223157B1 (pl) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL385243A1 PL385243A1 (pl) | 2009-11-23 |
| PL223157B1 true PL223157B1 (pl) | 2016-10-31 |
Family
ID=42987317
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL385243A PL223157B1 (pl) | 2008-05-20 | 2008-05-20 | Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL223157B1 (pl) |
-
2008
- 2008-05-20 PL PL385243A patent/PL223157B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL385243A1 (pl) | 2009-11-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US12486470B2 (en) | Processes for producing industrial products from plant lipids | |
| US20230058089A1 (en) | Processes for producing hydrocarbon products | |
| US20240271149A1 (en) | Plants producing modified levels of medium chain fatty acids | |
| US9499829B2 (en) | Processes for producing lipids | |
| US9896691B2 (en) | Compositions and methods for lipid production | |
| US9738912B2 (en) | Gene disruptants producing fatty acyl-CoA derivatives | |
| Tsai et al. | Delta-9 fatty acid desaturase overexpression enhanced lipid production and oleic acid content in Rhodosporidium toruloides for preferable yeast lipid production | |
| US9340768B2 (en) | Transformation of glycerol and cellulosic materials into high energy fuels | |
| WO2011159991A1 (en) | Extraction solvents derived from oil for alcohol removal in extractive fermentation | |
| KR20110096555A (ko) | 재조합 종속영양성 미생물에서 맞춤 오일의 제조 | |
| KR20140033378A (ko) | 자일로오스를 대사시키는 유전자 조작된 미생물 | |
| US20160222419A1 (en) | Genetically engineered saccharomyces cerevisiae and yarrowia lipolytica and production of fatty alcohols | |
| US12600978B2 (en) | Process for producing lipids | |
| Li et al. | Over-expression of LPAAT gene in Phaeodactylum tricornutum enhances fatty acid accumulation and increases fatty acid chain length. | |
| EP4118209A1 (en) | Production of short chain fatty acids | |
| US20240060101A1 (en) | Systems and methods of making oil from microorganisms | |
| KR102212882B1 (ko) | 지방산 생산능이 증가된 클라미도모나스 속 미세조류 및 클라미도모나스 속 미세조류의 지방산 생산능을 증가시키는 방법 | |
| PL223157B1 (pl) | Zmodyfikowany szczep drożdżowy, zwłaszcza Saccharomyces cerevisiae, sposób jego wytwarzania i zastosowanie | |
| ES2579384B1 (es) | Producción de alcoholes grasos | |
| WO2010017610A1 (pt) | Processo de produção microbiana de lipídeos e composição compreendendo tais lipídeos | |
| CN121826018A (zh) | 一株高产油脂的解脂耶氏酵母基因工程菌及其构建方法 | |
| WO2017042413A1 (es) | Producción de aceites microbianos con alto contenido en acidos grasos de cadena muy larga | |
| NZ627107B2 (en) | Processes for producing lipids | |
| CN102869768A (zh) | 生产脂肪酸和脂肪酸衍生物的微生物工程 |