PL223478B1

PL223478B1 - Zastosowanie związku do wytwarzania leku do leczenia i/lub zapobiegania odpowiedzi immunologicznej na tle zapalnym

Info

Publication number: PL223478B1
Application number: PL391988A
Authority: PL
Inventors: Thomas Luger
Original assignee: Brzoska Thomas; Grabbe Stephan; Thomas Luger
Priority date: 2001-02-14
Filing date: 2002-02-08
Publication date: 2016-10-31
Also published as: SI1427405T1; PT2198723E; SI2198723T1; WO2002064131A2; SI2196202T1; EP1749524B1; EP1427405B1; EP2196202B1; DK1427405T3; ES2281511T3; CN101810847B; PL391988A1; EP2260843A3; CN1269477C; NZ528191A; EP2189156A1; US10046020B2; US20120045462A1; ATE502632T1; CY1114214T1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku wybranego spośród dipeptydu lizynoproliny, tri peptydu lizyno-prolino-treoniny i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń zapalnych wybranych z grupy obejmującej: choroby autoimmunologiczne oraz odrzucenie przeszczepu.

Hormon α-melanotropowy będący tridekapeptydem (aMSH) jest wytwarzany z hormonu prekursorowego proopiomelanokortyny (POMC). Produktami genu kodującego POMC jest kilka biologicznie aktywnych hormonów peptydowych takich jak np. β-lipotropina, adrenokortykotropina (ACTH), β-endorfina i melanotropiny (α-, β- i yMSH). W ich przetwarzaniu uczestniczą enzymy proteolityczne o różnej swoistości. Możliwe są dodatkowe modyfikacje potranslacyjne takie jak acetylacja.

Działanie aMSH i innych peptydów POMC na tkanki zachodzi za pośrednictwem rodziny specyficznych receptorów. Te receptory melanokortyny (MC) należą do grupy receptorów sprzężonych z białkiem G. Sklonowano pięć różnych receptorów melanokortyny (MC-1 do MC-5). Przyjmuje się, że aMSH jest ważnym peptydem sygnałowym dla regulowania różnych funkcji melanocytów. Uważa się np., że aMSH wpływa na proliferację, różnicowanie i produkcję cytokin przez melanocyty.

Wykazano także, że produkty genu kodującego POMC mają zdolność do wpływania na odpowiedzi immunologiczne i reakcje zapalne. Przyjmuje się np., że aMSH hamuje aktywność kilku cytokin prozapalnych, podczas gdy produkcja cytokiny przeciwzapalnej IL-10 jest stymulowana przez aMSH. Oznacza to, że aMSH odgrywa ważną funkcję w hamowaniu odpowiedzi immunologicznych i reakcji zapalnych. W badaniach wykazano że w działaniu immunomodulacyjnym i przeciwzapalnym aMSH pośredniczy jego C-końcowy region (aminokwasy 11-13: Lys-Pro-Val), ponieważ podawanie C-końcowego tripeptydu było wystarczające do indukowania takiego działania (Catania i Lipton, 1993, Endocr. Rev. 14, 564-576; Bhardvaj i in., 1996, J. Immunol. 156, 2517-2521).

W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym 88/00833 ujawniono zastosowanie tripeptydu Lys-Pro-Val do wytwarzania leków do leczenia zapaleń. Również C-końcowy tripeptyd aMSH zaproponowano jako środek do zapobiegania utracie włosów (francuski opis patentowy nr 2733421).

Nieoczekiwanie stwierdzono, że tripeptyd Lys-Pro-Thr właściwości przeciwzapalne. Nieoczekiwanie, nawet mniej związki takie jak Lys-Pro i Lys także wykazują korzystne właściwości.

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie związku wybranego spośród dipeptydu lizynoproliny, tripeptydu lizyno-prolino-treoniny i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń zapalnych wybranych z grupy obejmującej: choroby autoimmunologiczne oraz odrzucenie przeszczepu.

Korzystnie, gdy związkiem jest tripeptyd lizyno-prolino-treonina.

Korzystnie, gdy zaburzeniem zapalnym jest odrzucenie przeszczepu.

Korzystnie, gdy związek podaje się dootrzewnowo, dożylnie doustnie.

Korzystnie, gdy związek podaje się w dawce 20 pg/kg masy ciała do 10 mg/kg masy ciała.

Korzystnie, gdy związek jest podawany w postaci maści lub kremu.

Korzystnie, gdy w maści lub kremie związek występuje w stężeniu od 1 pM do 1 mM.

Ponadto korzystnie stosuje się co najmniej dwa różne związki.

Naturalnie występujące aminokwasy mają zazwyczaj konfigurację (L). Aminokwasy związków stosowanych według wynalazku mogą mieć konfigurację (L) lub (D). Tak więc możliwymi związkami o budowie KPT są:

(L)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(D)Thr, (L)Lys-(D)Pro-(D)Thr, (L)Lys-(L)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(D)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(D)Pro-(D)Thr, (D)Lys-(L)Pro-(L)Thr, (D)Lys-(L)Pro-(D)Thr,

Możliwe są również modyfikacje chemiczne innymi grupami ochronnymi znanymi per se. Modyfikacje mogą także obejmować grupę aminową w łańcuchu bocznym lizyny lub grupę hydroksylową treoniny. Możliwe są także inne modyfikacje w bocznej części grupy NH2, np. wydłużenie przez glicynę.

PL 223 478 B1

Wymienione związki można stosować do leczenia wszystkich typów ostrych lub przewlekłych zapaleń, które obejmują choroby autoimmunologiczne oraz odrzucenie przeszczepu. Związki korzystnie stosuje się do leczenia stanów zapalnych skóry. W tym przypadku korzystne jest stosowanie związku jako preparatu do podawania miejscowego w postaci maści lub kremu. Taka maść lub krem może ponadto obejmować typowe składniki jak opisał np. Braun-Falco i in. (1996) Dermatologie und Venerologie, Springer Verlag, Berlin lub Merk, Bickers (1992) Dermatopharmakologie und Dermatotherapie.

W innym korzystnym rozwiązaniu, związki można stosować według wynalazku w leczeniu zaburzeń zapalnych w zapaleniach występujących w miejscach w organizmie, które weszły w kontakt ze środowiskiem. Te obejmują w szczególności błonę śluzową jamy ustnej, przewodu pokarmowego i płuc.

Wymienione związki można także stosować w sprejach, do inhalacji w leczeniu zapaleń dróg oddechowych.

Typowo związek miesza się z farmaceutycznie dopuszczalnym nośnikiem lub rozcieńczalnikiem. Procesy wytwarzania leków znane per se wskazano w Forth, Henschler, Rummel (1996) Allgemeine und spezielle Pharmakologie und Toxikologie, Urban & Fischer.

Związki o wzorze (I) można także dodawać do pokarmów w celu zmniejszenia potencjału alergicznego pewnych składników pożywienia. Stężenie w pokarmach wynosi od 1 pM do 1 mM.

Peptyd Lys-Pro-Thr zapobiega aktywacji czynnnika transkrypcji NF-kB przez TNFa, IL-1 lub LPS w komórkach śródbłonka i w keratynocytach. Konsekwencją jest zmniejszona ekspresja cząsteczek adhezji komórkowej (komórki śródbłonka) i chemokin (keratynocyty). Autorzy wynalazku zdołali także wykazać, że np. peptyd KPT zapobiega występowaniu alergii kontaktowych (reakcje nadwrażliwości kontaktowej, reakcje CHS) i indukuje specyficzną dla alergenu, długotrwałą tolerancję. W reakcjach CHS należy rozróżnić dwie części: początkowy kontakt (faza indukcji) z antygenem daje podstawę dla późniejszej reakcji CHS, i następnie kontakt z antygenem prowadzi do występowania reakcji (kontaktowe zapalenie skóry, obrzęk, świąd, itp.). Związki stosowane według wynalazku można stosować przed obydwoma częściami, i gdy stosuje się (iniekcja lub zastosowanie miejscowe) przed początkowym kontaktem, występuje hamowanie CHS i indukcji tolerancji, a gdy stosuje się je w czasie indukcji kontaktowego zapalenia skóry, związki zapobiegają występowaniu zapalenia skóry. We wszystkich tych zastosowaniach istnieje w znacznym stopniu całkowite hamowanie reakcji alergicznej.

Ponadto stwierdzono, że Lys-Pro-Thr zmniejsza ekspresję cząsteczek kostymulujących na komórkach dendrytycznych. Jest to najbardziej prawdopodobna część mechanizmu związanego z hamowaniem CHS i indukcją tolerancji. Jednocześnie, związki zwiększają sekrecję przeciwzapalnej IL-10 przez monocyty. Ten wpływ jest analogicznie częścią mechanizmu związanego alergicznym kontaktowym zapaleniem skóry.

Nie wiążąc się z jakąkolwiek teorią, związki według wynalazku mogą łączyć się z receptorami β-adrenergicznymi. Można ponadto założyć, że peptydy stosowane według wynalazku są zdolne do wiązania się z receptorem IL-1 typu I. Nie można też wykluczyć, że peptydy według wynalazku łączą się także z innymi receptorami takimi jak np. receptor opioidowy K. Na podstawie tego założenia przypuszcza się, że peptydy według wynalazku są zdolne do wiązania się z wieloma receptorami, które w zdarzeniu zapalnym w wyniku aktywacji przez ich specyficzne ligandy, będą działały w sposób prozapalny. Wiązanie peptydu według wynalazku z tymi receptorami zapobiega wiązaniu specyficznych ligandów z tymi receptorami, zapobiegając w ten sposób do indukcji działań prozapalnych. Z drugiej strony, wiązanie peptydów według wynalazku z receptorami ich związku wyjściowego (aMSH) aktywuje te receptory i indukuje w ten sposób kolejną komponentę mechanizmu działania, wpływając przeciwzapalnie.

Wynalazek został przedstawiony na rysunku, na którym:

Fig. 1 wykazuje, że dożylna iniekcja aMSH, KPV lub KPT tłumi fazę uczulenia CHS.

Fig. 2 wykazuje, że dożylne podawanie aMSH, KPV lub KPT może indukować tolerancję.

Fig. 3 przedstawia sekrecję IL-10 przez ludzkie PBL 24 godziny po podaniu aMSH, KPV lub KPT.

Fig. 4 przedstawia sekrecję IL-10 przez ludzkie PBL 48 godzin po podaniu aMSH, KPV lub KPT.

Fig. 5 wykazuje, że receptory aMSH ulegają ekspresji na komórkach THP-1.

PL 223 478 B1

Fig. 6a do d, 7a do d i 8a do d pokazują, że znakowane aMSH, KPV lub KPT mają zdolność wypierania znakowanej biotyną aMSH z miejsc wiążących na komórkach THP-1 w teście konkurencyjnym.

Fig. 9a pokazuje ekspresję cząsteczek adhezji komórkowej (CAMS) na powierzchni komórek HMEC-1 24 godziny po leczeniu TNFa + aMSH lub TNFa + KPT.

Fig. 9b pokazuje przyleganie limfocytów do HDMEC (test uwalniania chromu), A: limfocyty T molt4; B: limfocyty B i JY.

Fig. 10 wskazuje wpływ aMSH, KP, KPV lub KPT aktywację NF-kB w potraktowanych LPS komórkach HMEC-1.

Fig. 11 a pokazuje, że liczba naczyń, w których ulega ekspresji selektyna E w przekrojach tkankowych, zmniejsza się pod wpływem leczenia aMSH.

Fig. 11b wskazuje, że liczba punkcikowatych uszkodzeń na uszach potraktowanych LPS myszy zmniejsza się pod wpływem leczenia aMSH.

Fig. 12 wskazuje, że leczenie BMDC in vitro przy użyciu aMSH lub KP tłumi CHS i może indukować tolerancję.

Fig. 13a wskazuje, że w teście przesunięcia prążka NF-kB intensywność prążka heterodimera p65/p50 NF-kB zmniejszona przez różne peptydy pochodzące od aMSH.

Fig. 13b wskazuje wpływ aMSH, KP lub K na reakcję CHS i wpływ aMSH lub KP na indukcję tolerancji u myszy BalbC.

Fig. 14 wskazuje hamowanie CHS przez komórki T, które skontaktowano in vitro z DC obciążonym antygenem potraktowanym aMSH lub pochodną.

Fig. 15 wskazuje indukcję tolerancji przez komórki T, które skontaktowano in vitro z DC obciążonym antygenem i potraktowanym aMSH lub pochodną.

Fig. 16 wskazuje regulację w górę CTLA-4 na komórkach T po kontakcie z DC obciążonym antygenem i potraktowanym aMSH lub pochodną. A: CD4 dodatnie komórki T; B: CDS doda tnie komórki T.

Następujące przykłady podano w celu bardziej szczegółowego wyjaśnienia wynalazku.

P r z y k ł a d 1

Myszy:

7- do 10-tygodniowe samice myszy Balb/C otrzymano od firmy Charles River (Sulzfeld, Niemcy) i trzymano zgodnie z przepisami rządowymi.

Podawanie aMSH lub KPV lub KPT lub KP:

aMSH i peptydy przechowywano jako próbki w temperaturze -20°C do momentu użycia. Przed iniekcją, konkretny związek rozpuszczono w PBS, 0,1% osocza mysiego, i przechowywano na lodzie aż do wstrzyknięcia dożylnego do żyły ogonowej myszy. 2 godziny przed uczuleniem wstrzykiwano 5 pg aMSH lub 1,5 pg peptydu (KP: 50 pg) na mysz.

Określanie CHS i tolerancji:

Myszy uczulano przez rozprowadzanie na ogolonym brzuchu myszy nie poddawanych wcześniej żadnym eksperymentom 75 pl 0,5% DNFB w acetonie/oliwie z oliwek (4:1). CHS wywoływano przez nakładanie 10 pl 0,3% DNFB na uszy myszy na obydwu stronach jednego ucha. CHS określono jako stopień obrzęku ucha wystawionego na działanie haptenu w porównaniu z drugim uchem, potraktowanym preparatem kontrolnym, i mierzono stosując cyrkle sprężynowe 24 godziny po ekspozycji hapten. Myszy, których uszy były wystawione na działanie haptenu bez poprzedniego uczulenia stanowiły kontrole negatywne. W celu określenia, czy iniekcja aMSH lub peptydów przed podawaniem haptenu prowadzi do indukcji tolerancji, myszy poddano dożylnej iniekcji (brzuch) lub ekspozycji (lewe ucho) jak opisano w przypadku aMSH lub peptydów 2 godz. przed uczuleniem. Aby potwierdzić zmniejszenie CHS przez aMSH, jedno ucho myszy poddawano działaniu haptenu 7 dni uczuleniu, i 24 do 36 godzin później określono odpowiedź w postaci obrzęku ucha. 14 dni później te same myszy uczulano ponownie jeden raz podając środek na ogolony grzbiet (tym razem bez egzogennego aMSH), i badano pod względem ich zdolności do indukowania odpowiedzi CHS metodą ponownej ekspozycji prawego ucha na hapten tydzień później.

W doświadczeniach, w których zastosowano preparaty aMSH do podawania miejscowego, preparaty stosowano u myszy w miejscu uczulonym (brzuch) bezpośrednio przed lub 3 godziny lub 24 godziny przed uczuleniem.

PL 223 478 B1

Wynik:

Dożylna iniekcja aMSH i KPV lub KPT lub KP hamuje u myszy zdolność do indukowania odpowiedzi CHS na ekspozycja DNFB mającą miejsce 7 dni później. Tak więc u tych myszy nie rozwinęło się specyficzne dla DNFB uczulenie. KPT najskuteczniej hamował odpowiedź CHS (patrz Fig. 1 i 13b).

W celu rozróżnienia pomiędzy chwilową immunosupresją i specyficzną tolerancją immunologiczną, myszy uczulano drugi raz i wystawiano na działanie haptenu. Myszy, którym wstrzykiwano aMSH lub KPV lub KPT przed pierwszym uczulaniem nie ulegały uczulenia nawet przez podawanie drugiej uczulającej dawki haptenu, co wskazuje, że te myszy rozwinęły tolerancję na DNFB. Podczas gdy dla KPV wykazano słaby wpływ, stwierdzono znaczące hamowanie odpowiedzi w postaci zmniejszonego obrzęku ucha po podaniu aMSH oraz KPT i KP (patrz Fig. 2 i 13b).

P r z y k ł a d 2

Materiał i metody:

Jednojądrowe komórki (PBMC) oddzielono od „kożuszków” krwi ludzkiej przez odwirowanie w gradiencie gęstości przy użyciu aparatu Ficoll Hypaque. Komórki (1 x 10⁶ na ml), hodowane w RPMI 1640 z antybiotykami i 10% FCS, nie traktowano albo stymulowano aMSH lub peptydami KPV lub KPT z lub bez IL-1 β (10 U/ml). Nadsącze hodowli PBMC zebrano po inkubacji przez 24 lub 48 godzin i przechowywano w temperaturze -20°C do dalszego zastosowania. Do wykrywania IL-10 stosowano dostępny w handlu test ELISA.

Wyniki:

Ludzkie PBMC, nietraktowane lub potraktowane różnymi stężeniami aMSH lub peptydów wytwarzały po inkubacji przez 24 godziny niewielkie ilości IL-10 (5-10 pg/ml). Podczas gdy aMSH (10^-11 M), KPV (10^-8 do 10^-9 M) i KPT (10^-8 do 10^-9 M) ewidentnie indukowały produkcję IL-10 (patrz Fig. 3).

Ludzkie PBMC wytwarzały znaczące ilości IL-10 po inkubacji przez 48 godzin. aMSH, KPV i KPT znacznie zwiększały produkcję IL-10 przez ludzkie PBLC. Nie stwierdzono zasadniczej różnicy pomiędzy działaniem aMSH a peptydów (patrz Fig. 4).

Wyniki, które pokazano dowodzą, że peptyd KPT jest zdolny, podobnie jak aMSH i KPV, do zapobiegania uczuleniu CHS po podaniu dożylnym i do indukowania tolerancji specyficznej dla haptenu. KPT jest także zdolny do indukowania produkcji IL-10 in vivo i in vitro. Te dane także uprawdopodobniają zależność immunosupresyjnego wpływu aMSH in vivo nie tylko od indukcji IL-10.

P r z y k ł a d 3

Materiał i metody:

Wszystkie etapy prowadzono w temperaturze 0 do 4°C. Monocytową linię komórkową THP-1 przemyto jednokrotnie PBS, jednokrotnie kwaśnym buforem glicyny (50 mM glicyny, 100 mM chlorku sodu, pH 3) i trzy razy RPMI. Następnie komórki (2,5 x 10⁶ na ml) ponownie zawieszono w 100 pl RPMI/1% BSA i przeniesiono do 96-studzienkowych płytek do mikromiareczkowania. Po dodaniu znakowanego biotyną aMSH (10^- M), komórki inkubowano w temperaturze 4°C przez 1 godzinę, przemyto jednokrotnie PBS, ponownie zawieszono w 100 pl PBS/1% BSA i inkubowano ze znakowaną FITC streptawidyną (40 (pg/ml) w ciemności w temperaturze 4°C przez 30 minut. Po ostatnim etapie przemywania, komórki ponownie zawieszono w PBS. Ilość związanego znakowanego biotyną aMSH analizowano stosując cytometr przepływowy. W doświadczeniach kontrolnych komórki inkubowano bez znakowanego biotyną aMSH lecz w obecności streptawidyny FITC. Martwe komórki wykluczono przez dodanie jodku propidium krótko przed analizą FACS. Specyficzność wiązania znakowanego biotyną MSH określono przez dodanie nieznakowanego aMSH (10^-6 do 10^-12 M) lub KPV do KPT (10^-6do 10^-12 M).

Wyniki:

Według analizy PACS z użyciem znakowanego biotyną aMSH, w niestymulowanych komórkach THP-1 następuje ekspresja znaczących ilości miejsc wiążących, które są specyficzne dla aMSH, w porównaniu do mieszanin kontrolnych inkubowanych tylko ze streptawidyną FITC. Stężenie aMSH stosowane w doświadczeniu wynosiło 10^- M (patrz Fig. 5).

W celu określenia, czy w komórkach THF-1 ulega ekspresji jeden spośród znanych receptorów melanokortyny (MC) prowadzono RT-PCR ze starterami specyficznymi dla MC-1, MC-2, MC-3 i MC-4. Całkowite RNA otrzymano z komórek THP-1. Wykrywano produkt PCR specyficzny dla MC-1 o spodziewanej długości równej 416 pz (Rajora i in., 1996, J. Leuk. Biol., 59, 248). Nie wykrywano produktów PCR specyficznych dla MC-2, MC-3 lub MC-4. Wyniki pokazują, że na komórkach THP-1 ulega ekspresji MC-1 który, w przeciwieństwie do innych receptorów melanokortyny, jest specyficzny dla aMSH i ACTH.

PL 223 478 B1

W celu zbadania, czy miejsca wiążące ulegające ekspresji na THP-1 są specyficzne dla aMSH, prowadzono badania wiązania kompetycyjnego aMSH lub KPV lub KPT.

Specyficzne wiązanie zmierzono przez inkubację komórek THP-1 ze znakowanym biotyną aMSH (10^- M) i różnymi stężeniami nieznakowanego aMSH lub peptydów. Nieznakowany aMSH w stężeniu równym 10^-8 znacznie hamował wiązanie aMSH. Nie obserwowano znaczącego hamowania gdy aMSH stosowano w stężeniach równych 10^-6, 10^-10 M lub 10^-12 M (Fig. 6a-6d).

Gdy stosowano nieznakowany KPV, obserwowano znaczące hamowanie tylko w stężeniu równym 10^-6 M (patrz Fig. 7a-7d).

W przypadku peptydu KPT, znaczące hamowanie wiązania aMSH obserwowano w każdym badanym stężeniu. (10^-6 do 10^-12 M, patrz Fig. 8a do 8d).

Te wyniki pokazują, że peptyd KPT wiąże się z receptorem melanokortyny komórek THP-1, który jest specyficzny dla aMSH, co wskazuje, że aMSH i KPT mają wspólne miejsce wiążące. Jednakże, ponieważ KPT wykazuje współzawodnictwo w wiązaniu receptorem nawet przy bardzo niskich stężeniach, to jest prawdopodobne, że peptyd ten ma większe powinowactwo wiązania z receptorem MC-1 niż MSH.

P r z y k ł a d 4

Materiał i metody:

Ludzkie komórki śródbłonka drobnych naczyń skóry (HDMEC) i linię komórkową HMEC-1 (ludzka linia komórkowa drobnych naczyń śródbłonka 1) potraktowano albo TNFa albo LPS w obecności lub nieobecności jednego z peptydów. Komórki zebrano po 3 i po 6 godzinach po podaniu związków w celu uzyskania RNA lub przeprowadzenia analizy cząsteczek adhezyjnych testem EIA lub FACS 3, 6, 16 lub 24 godziny po podaniu związku. RNA poddano odwrotnej transkrypcji, i próbki poddano PCR w celu uzyskania genów kodujących E selektynę, ICAM-1, VCAM lub dla β-aktynę jako genu porządkowego w celu przeprowadzenia oznaczenia półilościowego. W celu oznaczenia adhezji limfocytów, komórki śródbłonka posiano na płytkac h i inkubowano z limfocytami znakowanymi Cr. Po przemyciu pozostałych limfocytów związanych z warstwą EC określono przez pomiar radioaktywności w próbkach.

Wyniki:

Traktowanie komórek śródbłonka aMSH lub KPT hamowało wywołaną przez LPS lub TNFa

-6 -12 ekspresję cząsteczek adhezyjnych. Ten wpływ obserwowano w zakresie stężenia od 10^- do 10^- M aMSH lub peptydu. Peptyd KPT wykazywał największy wpływ na ekspresję cząsteczek adhezyjnych mRNA.

Wywołana przez LPS lub TNFa powierzchniowa ekspresja cząsteczek adhezyjnych została znacznie ograniczona przez wszystkie podane związki agonistyczne. Takie wyniki otrzymano stosując zarówno metodę EIA, z zastosowaniem całych komórek jak i metodą FACS, gdzie użyto specyficznych przeciwciał (patrz. Fig. 9a, przedstawiająca wyniki uzyskane metodą EIA).

aMSH znacznie zmniejsza wiązanie komórek T i B z potraktowanymi LPS lub TNF-aMSH warstwami EC (patrz Fig. 9b). Te wyniki zebrane razem pokazują, że aMSH wpływa przyleganie limfocytów do EC, a więc także zmniejsza wynaczynienie limfocytów w warunkach zapalenia w tkance. Popierają to dane in vivo dotyczące zlokalizowanego stanu zapalnego naczyń.

P r z y k ł a d 5

Materiał i metody:

Komórki naskórka (EC) lub normalne ludzkie keratynocyty (HNK) potraktowano IL-1, LPS lub TNFa w obecności lub bez peptydów. Po 15 lub 30 minutach otrzymano białka jądrowe i poddano testowi przesunięcia ruchliwości elektroforetycznej (EMSA) ze znakowanym radiologicznie oligonukleotydem o specyficznej sekwencji wiążącej NF-kB. Jako związku wiążącego się kompetycyjnie użyto nieznakowanego oligonukleotydu. W pewnych doświadczeniach, w celu potwierdzenia że uzyskane prążki należą do homodimeru p50 albo heterodimeru p50/p65, stosowano przeciwciała przeciwko łańcuchowi p65 lub p50 NFkB.

Wynik:

Dodanie peptydów do EC potraktowanych TNFa lub LPS i HNK potraktowanych IL-1 prowadzi do zmniejszonej aktywacji czynnika transkrypcyjnego NF-kB (patrz Fig. 10 i 13a). To z kolei prowadzi do ograniczenia transkrypcji genów kodujących liczne mediatory prozapalne (cytokiny, chemokiny, cząsteczki adhezyjne, itp.). Tożsamość obserwowanych prążków w EMSA jako heterodimeru NF-kB potwierdzono przez zastosowanie przeciwciała anty-p65.

PL 223 478 B1

P r z y k ł a d 6

Materiał i metody:

Myszy potraktowano LPS przez iniekcję s.c. w jedno ucho. Ta iniekcja przygotowawcza indukuje długotrwały wzrost ekspresji selektyny E w miejscu iniekcji LPS. 24 godziny później wstrzykiwano

i.p. drugą dawkę LPS (prowokacja). Ta druga iniekcja LPS prowadzi do gwałtownej nekrolizy naczynia i do powstawania punkcikowych uszkodzeń, które łatwo zmierzyć ze względu na ich rozmiar i liczbę. aMSH (25 pg) podawano w czasie przygotowawczej iniekcji LPS.

Wynik:

Iniekcja aMSH w czasie przygotowawczego podawania LPS hamuje indukcję miejscowej ekspresji E selektyn w uchu (patrz Fig. 11 a) i znacznie zmniejsza liczbę i rozmiar punkcikowych uszkodzeń utworzonych po prowokacyjnej iniekcji LPS (patrz Fig. 11b).

P r z y k ł a d 7

Materiał i metody:

Komórki dendrytyczne szpiku kostnego (BMDC) wyodrębniono z kości udowej myszy i potraktowano IL-4 i GM-CSF przez 6 lub 9 dni. W dniu 6 lub 9, komórki potraktowano aMSH (2 x 0^-11 M) lub peptydem KP (2 x 10^-6 M) 3 godziny i 2,5 godziny przed ponownym wstrzyknięciem myszom nie poddawanym wcześniej żadnym eksperymentom, o takim samym tle genetycznym. 2 godziny przed ponownym wstrzyknięciem, komórki potraktowano haptenem (1 mM DNBS, rozpuszczalna w wodzie forma DNFB). Bezpośrednio przed ponownym wstrzyknięciem, komórki przemyto 2 x PBS. Każdemu zwierzęciu wstrzykiwano dożylnie 5 x 10^- komórek. Komórki kontrolne potraktowano jedynie DNBS lub jedynie aMSH lub pozostawiono nie potraktowane. 5 dni iniekcji zwierzętom przyłożono DNFB na ucho, i grubość i zmierzono następnego dnia. 2 tygodnie później, zwierzęta ponownie uczulono DNFB i ponownie przyłożono na ucho 5 dni później. Na koniec zmierzono obrzęk ucha.

Wyniki:

Zwierzęta-biorcy, którym wstrzykiwano niepotraktowane komórki lub komórki potraktowane aMSH nie wykazały żadnej odpowiedzi immunologicznej po pierwszej prowokacji, zgodnie z przewidywaniem. Zwierzęta-biorcy, którym wstrzykiwano potraktowane BMDC potraktowane DNBS wykazały odpowiednią reakcję CHS w czasie pierwszej prowokacji. Ta reakcja była stłumiona u zwierząt, którym wstrzykiwano komórki uprzednio potraktowane in vitro TNBS i aMSH lub TNBS i KP. Tak więc, kontakt DC z aMSH lub peptydem wystarcza do indukowania hamowania CHS (patrz 12).

W czasie drugiej prowokacji i odpowiedniego ponownego uczulenia, zwierzęta, którym ponownie wstrzykiwano komórki potraktowane DNBS, nie wykazały odpowiedzi immunologicznej, a zwierzęta, którym wstrzykiwano komórki potraktowane DNBS/aMSH nie wykazały odpowiedzi immunologicznej, co wskazuje, że w tolerancji wywołanej przez aMSH podobnie pośredniczy DC (patrz Fig. 12).

P r z y k ł a d 8 „Immunoterapia komórkami dendrytycznymi lub komórkami T traktowanymi aMSH lub pochodną aMSH”

Wyodrębniono (z krwi, szpiku kostnego lub tkanki) komórki dendrytyczne (DC). Możliwe jest też jednak zastosowanie mieszanin komórek zawierających DC (np. mieszanin komórek naskórka) i hodowanie w obecności GM-CSF i IL-4 (korzystnie: 250-1000 μ/ml dla każdej substancji).

Po okresie dojrzewania (korzystnie 6-9 dni), do komórek wprowadza się antygen (stężenie zależy od antygenu, podobnie jak okres dojrzewania) i traktuje się aMSH lub jego pochodnymi. Pochodne odpowiadają przynajmniej aminokwasom 12 i 13 z aMSH (Lys-Pro), korzystnie stosuje się pochodne zawierające Lys-Pro-Val. Możliwe są konfiguracje D i L aminokwasów, jak również konserwatywne wymiany AA. Można zatem zastosować także Lys-Pro-Thr, który pochodzi od IL-1 β i jego pochodnych z wydłużonym N-końcem. Można także stosować pochodne z wydłużonym C-końcem. Dodanie peptydu można przeprowadzić przed dodaniem antygenu, jednocześnie, później, jednorazowo lub więcej niż raz (korzystna dawka zależy od peptydu, np. dla aMSH 10^-8 M do 10^-14 M).

Następnie tak potraktowane komórki wstrzykuje się dożylnie do organizmu biorcy (możliwe jest ₅ także podawanie i.p. lub s.c.); myszy: dolna granica w przybliżeniu 2 x 10 komórek. Zależnie od antygenu, wystarczy wykonać pojedynczą iniekcję lub może być konieczne wykonanie wielu iniekcji. Jest także możliwe, że iniekcje będą musiały być powtórzone po pewnym okresie (nie są jeszcze dostępne żadne dane na temat).

Alternatywną możliwością jest kontaktowanie DC komórkami T poza organizmem i następnie wstrzykiwanie do organizmu biorcy mieszaniny lub komórek T. W tym przypadku, wprowadzenie antygenu do DC może mieć miejsce przed kontaktem z komórkami T lub podczas kontaktu. Komórki T

PL 223 478 B1 mogą ponadto pochodzić od osobników, którzy już zostali uczuleni na konkretny antygen. Dolna granica u myszy wynosi około 1 milion komórek T, przy czym korzystna jest większa ilość komórek (Fig. 14 i 15).

Zaletą takiego sposobu stosowania jest zapobieganie wszystkim rodzajom niepożądanych odpowiedzi immunologicznych, które są specyficzne dla antygenu, i w których specyficzne dla antygenu limfocyty (B lub komórki T) odgrywają rolę patogenetyczną. Te obejmują między innymi alergie, choroby autoimmunologiczne, przewlekłe stany zapalne. Jeśli stosuje się dostatecznie duże ilości komórek możliwe jest także wyleczenie wcześniej występujących stanów.

Te nieoczekiwane wyniki wskazywać mogą, nie wiążąc się z jakąkolwiek teorią, na fakt, że aMSH jest silnym immunomodulatorem i ma liczne właściwości przeciwzapalne. Właściwości te obejmują między innymi hamowanie ekspresji cząsteczek kostymulujących w DC. Podobne właściwości wykazują także pochodne aMSH według wynalazku, obejmujące C-końcowy tripeptyd i dipeptyd Lys-Pro. Pochodne o różnym składzie aminokwasów (konserwatywne zamiany AA) także mają porównywalne właściwości, i obejmują w szczególności Lys-Pro-Thr pochodzącą od IL-1 β (tak, że należy przypuszczać, że peptydy o wydłużonym N-końcu (analogicznie do aMSH) rozbudowane z sekwencją kolinearną do IL-1 β mają taki wpływ).

aMSH, jak również jego pochodne, mają zdolność indukowania in vivo tolerancji specyficznej dla haptenu. DC są wyspecjalizowanymi komórkami prezentującymi antygen, które mają zdolność indukowania licznych rodzajów odpowiedzi immunologicznych, i które determinują także przebieg takiej odpowiedzi. Te odpowiedzi immunologiczne obejmują w szczególności odpowiedzi immunologiczne, w których pośredniczą komórki T.

Obecnie można wykazać, że traktowanie in vitro DC mieszanin komórek DC/T antygenem w obecności aMSH lub jego pochodnych prowadzi po iniekcji do organizmu do uzyskania komórek podobnie indukujących tolerancję specyficzną dla haptenu.

Wydaje się, że w tym przypadku mechanizm polega na modulowaniu przez aMSH lub jego pochodne prezentacji antygenu przez DC tak, że wytwarzane są supresyjne komórki T. Możliwe stało się więc wykazanie, że komórki T w odpowiednich mieszaninach wykazują dużą ekspresję CTLA-4 (Fig. 16). Jest to jedna spośród cząsteczek powierzchniowych, która charakteryzuje supresyjne komórki T.

Możliwe jest hamowanie prewencyjne chorób autoimmunologicznych, przewlekłych stanów zapalnych z zastosowaniem wytwarzanych w ten sposób komórek DC lub T. Możliwe jest także wyleczenie wcześniej istniejącego stanu patologicznego przy zastosowaniu dostatecznie dużej liczby komórek.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie związku wybranego spośród dipeptydu lizyno-proliny, tripeptydu lizyno-prolino-treoniny i ich farmaceutycznie dopuszczalnych soli do wytwarzania leku do leczenia zaburzeń zapalnych wybranych z grupy obejmującej: choroby autoimmunologiczne oraz odrzucenie przeszczepu.
2. Zastosowanie według zastrz. 1, w którym związkiem jest tripeptyd lizyno-prolino-treonina.
3. Zastosowanie według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 2, w którym zaburzeniem zapalnym jest odrzucenie przeszczepu.
4. Zastosowanie według któregokolwiek z zastrzeżeń 1 do 3, w którym związek podaje się dootrzewnowo, dożylnie lub doustnie.
5. Zastosowanie według zastrz. 4, w którym związek podaje się w dawce 20 pg/kg masy ciała do 10 mg/kg masy ciała.
6. Zastosowanie według dowolnego z zastrzeżeń 1 do 5, w którym związek jest podawany w postaci maści lub kremu.
7. Zastosowanie według zastrz. 6, w którym w maści lub kremie związek występuje w stężeniu od 1 pM do 1 mM.