PL223657B1 - Podłoże kompozytowe z chitozanową warstwą aktywną, zwłaszcza do leczenia masywnych uszkodzeń skóry oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiot wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest materiał kompozytowy składający się z warstwy chitozanu, nani esionego na nośnik syntetyczny o rozwiniętej powierzchni właściwej, powyżej 10 cm /g, gdzie chitozan z powierzchnią zmodyfikowanego nośnika związany jest połączeniem o zwiększonej wytrzymałości mechanicznej, a na tak przygotowanym materiale znajdują się namnożone keratynocyty, lub fibroblasty, lub jednocześnie oba typy komórek oraz sposób przygotowania materiału kompozytowego, do leczenia rozległych i skomplikowanych uszkodzeń skóry.

Tło wynalazku

Chitozan jest materiałem bardzo często stosowanym w aplikacjach medycznych. Chitozan jest polimerem pochodzenia naturalnego. Powstaje poprzez częściową deacetylację chityny drugiego po celulozie najczęściej występującego polimeru w przyrodzie. Zarówno chityna jak i chitozan są składnikami skorupek i pancerzyków organizmów żywych. Materiał ten ma wiele cennych właściwości takich jak: biokompatybilność, biodegradowalność, działanie bakteriostatyczne i bakteriobójcze, działanie przeciwgrzybiczne, absorbowanie składników odżywczych dla komórek. Tego typu właściwości nie posiadają polimery syntetyczne. Chitozan ma również bardzo cenną właściwość przyspieszania gojenia ran. Właściwości przeciwbakteryjne chitozanu są wykorzystywane w produktach komercyjnych. Jako środek odkażający jest niezwykle skuteczny a przy tym zupełnie nietoksyczny. Zarówno chityna jak i chitozan mogą być stosowane do wspomagania reakcji obronnej organizmu przed patogenami. [Y-C. Chung, C-Y. Chen, Biores. Techn. 2008, 99, 2806-2814]. Pod względem chemicznym chitozan jest kopolimerem N-acetyloglukozaminy i glukozaminy, w którym zawartość glukozaminy wynosi 90%. Polimer ten ma strukturę zbliżoną pod względem budowy do glukozaminoglikanu, dzięki temu funkcjonalnie oba materiały są do siebie podobne. W warunkach in vivo chitozan jest rozkładany przez komórki przy użyciu lizozymów. Polimer jest cięty na poszczególne mery tak że produktami rozpadu są N-acetyloglukozamina oraz glukozamina, są to związki które normalnie występują wewnątrz organizmów żywych. Tak że degradacja biologiczna chitozanu nie powoduje powstawania żadnych toksycznych dla organizmów żywych związków [H-R. Lin et. al. Mater. Sci. & Engin. C 2007, 27, 280-284].

Ponieważ chitozan nie jest polimerem termoplastycznym to najczęściej stosowaną metodą jego formowania jest rozpuszczenie w kwasie octowym i dalsze operowanie tak otrzymanym roztworem w celu otrzymania pożądanego produktu. Przykładem tego typu formowania jest patent EP 2 105 144. Opisano w nim metodę pokrywania tabletek warstwą chitozanu, przy czym warstwa ta jest odporna na działanie wilgoci oraz wody, natomiast ulega rozpuszczeniu po dotarciu do żołądka. W celu przygotowania takiej powłoki przygotowywany jest roztwór chitozanu o stężeniu 4% w kwasie octowym. Przy czym stosowany jest chitozan o stopniu deacetylacji równym 70% lub większym. Następnie na gotowe tabletki lub kapsułki żelatynowe nanoszony jest ten roztwór i suszy. W ten sposób usuwany jest kwas, jednak tą metodą nie da się tego zrobić całkowicie. Dodatkiem, który powoduje dokładne usunięcie kwasu z roztworu a przy tym spowoduje nierozpuszczalność warstwy w wodzie są estry kwasów tłuszczowych i gliceryny. Składnik ten jest dodawany na etapie przygotowywania roztworu.

Chitozan jest również materiałem z którego można otrzymywać włókna, dzianiny, powłoki, włókniny czy pianki. Otrzymywanie tego typu produktów opisano w patencie EP 0 794 223. Jest to metoda otrzymywania analogiczna do metody wytwarzania wiskozy i stosowane są w tym procesie identyczne urządzenia. Następnie gotowe maty z włókien chitozanowych wytwarza się analogicznie jak w przemyśle włókienniczym. Materiał może mieć różnorodne zastosowania.

W publikacji patentowej EP 0 323 732 opisano materiał kompozytowy składający się z włókien celulozowych i chitozanu. Wytwarzanie takiego materiału polega na nasyceniu arkusza celulozy ro ztworami chitozanu w kwasie octowym. Po czym materiał suszy się aby później potraktować go roztworem kwasu tłuszczowego w alkoholu metylowym. Następnie materiał jest ponownie suszony. Zanurzanie w kwasach tłuszczowych powoduje że materiał jest bardziej odporny na działanie wilgoci i wody w porównaniu z materiałem, który nie zawiera na powierzchni kwasów tłuszczowych. Materiał według tego wynalazku pomyślany został przede wszystkim jako biodegradowalny materiał opakowaniowy.

Patent EP 0 663 212 opisuje otrzymywanie stabilnego hydrofilnego żelu, który składa się z mieszaniny neutralizowanego chitozanu i poli(N-winylolaktamu). Preferowanym w wynalazku poli(N-winylolaktamem) jest poliwinylopirolidon (PVP). Żel wytwarza się poprzez mechaniczne mieszanie ze sobą roztworów chitozanu i PVP. Materiał pomyślany jest jako opatrunek do leczenia trudno gojących

PL 223 657 B1 się ran skóry, nośnik leków aplikowanych przezskórnie lub jako materiał do nawilżania skóry i zapobiegania wysuszaniu skóry.

Patent US 2008/0242850 oraz EP 1 115 432 opisuje metodę otrzymywania scaffoldów chitozanowych o dużej wytrzymałości na rozciąganie, jednorodnej wielkości porów i dużej ilości połączeń pomiędzy porami. Materiał jest otrzymywany w sposób następujący. Chitozan jest rozpuszczany w wodnym roztworze kwasu octowego. Następnie roztwór jest wlewany do formy i zamrażany w temperaturze -70°C. Po zamrożeniu materiał jest liofilizowany w temperaturze -70°C. Otrzymany w ten sposób materiał jest zanurzany w 100% etanolu i płukany przez wiele godzin w celu usunięcia kwasu. Na koniec materiał jest płukany w wielu roztworach etanolu o zmniejszających się stężeniach etanolu z 90% do 50%, po czym następuje płukanie w wodzie i liofilizacja, po której otrzymuje się gotowy do użycia scaffold.

W patencie EP1308177 opisana metoda pozwala otrzymywać podłoża chitozanowe do hodowli komórkowych. Wytwarzanie warstwy chitozanowej rozpoczyna się od rozpuszczenia chitozanu w kwasie organicznym. Roztwór nanosi się na dno płytki hodowlanej i suszy. Po wysuszeniu usuwa się resztki kwasu poprzez zanurzenie membrany w roztworze alkalicznym np. w roztworze ługu sodowego czy buforu. Końcowymi procesami są płukanie membrany w wodzie dejonizowanej i suszenie. W celu zapewnienia większej stabilności warstwy chitozanowej autorzy dopuszczają stosowanie sieciowania chitozanu przy użyciu aldehydu glutarowego. Warstwa chitozanu jest dodatkowo biologicznie aktywowana substancjami, które przyspieszają wzrost komórek i kierują różnicowaniem się komórek.

W patencie KR 20030093009 opisano metodę wytwarzania przestrzennego scaffoldu z polim erów biodegradowalnych. W objętości polimeru hoduje się komórki przy czym mogą to być w zasadzie komórki dowolnego typu. Następnie komórki usuwa się z matrycy. Pozostaje sam polimer razem z matrycą pozakomórkową. Taki materiał można stosować do wspomagania terapii regeneracji tkanek.

W patencie RU 2391399 opisano metodę otrzymywania materiału zastępującego skórę. Wyk onany jest z matrycy chitozanowo-kolagenowej wewnątrz której umieszcza się komórki pluripotencjalne. Następnie różnicuje się je w kierunku fibroblastów oraz komórek tłuszczowych występujących pod powierzchnią skóry. Tak wytworzony materiał zastępuje w pewnym zakresie skórę i nadaje się do bezpośredniego wszczepiania. Zbliżone materiały są opisywane w patentach: CN 101721741, CN 101125216, KR 20070082114, KR 20030083824.

Wszystkie przytoczone powyżej przykłady mają jednak pewną wadę, a mianowicie warstwa żelowa jest bardzo słabo związana z powierzchnią nośnika co powoduje efekt „spływania” warstwy żelowej z nośnika umieszczonego pionowo pod wpływem sił grawitacji. Jest to poważne ograniczenie ponieważ podczas leczenia poważnych ubytków skóry powoduje konieczność zachowania przez pacjenta pozycji poziomej, często wykluczając możliwość chodzenia nawet przez dłuższe okresy. Sposobem zapobiegającym temu zjawisku było zwiększanie lepkości żelu przez zwiększenie stężania substratu formującego żel. Takie postępowanie znacznie podnosiło koszty otrzymania membrany kompozytowej, a poza tym często negatywnie wpływało na hodowle komórkowe do których przeznaczona była membrana kompozytowa.

Podczas badania trwałości membran kompozytowych w układzie nośnik-żel okazało się, że rozwiązaniem problemu jest znaczne zwiększenie wytrzymałości mechanicznej powierzchni kontaktu membrana podłoża - żel. Według wynalazku, nieoczekiwanie, uzyskano to poprzez odpowiednie rozwinięcie powierzchni membrany na którą nanosi się żel. Okazało się nieoczekiwanie, że można otrz ymać membranę kompozytową nie wykazującą efektu „spływania” żelu nawet przy znacznie niższych stężeniach substratu formującego żel, np. chitozanu czy dekstranu, od zwykle stosowanych.

Istota wynalazku

Podłoże kompozytowe z chitozanową warstwą aktywną, do leczenia masywnych uszkodzeń skóry, według wynalazku, charakteryzuje się tym, że stanowi go materiał kompozytowy składający się z warstwy chitozanu, naniesionej na nośnik syntetyczny wybrany z grupy obejmującej alifatyczne i aromatyczne poliestry, zwłaszcza polisulfon lub polieterosulfon, oraz polimery biodegradowalne, zwłaszcza polilaktyd lub dekstran, o rozwiniętej powierzchni właściwej, powyżej 10 cm /g, który pokryty jest warstwą namnożonych komórek keratynocytów lub fibroblastów, lub jednocześnie obydwoma typami tych komórek, przy czym grubość namnożonej warstwy jest równa grubości, co najmniej jednej komórki.

Podłoże według wynalazku, korzystnie stanowi membranę ze zmodyfikowanego, przy pomocy poroforu polisulfonu, polieterosulfonu, polilaktydu lub dekstranu, z wtłoczoną w jej powierzchnię m atrycą, i usuniętą po utrwaleniu jej kształtu w membranie, na której osadzona jest warstwa chitozanu,

PL 223 657 B1 pokryta in vitro, hodowlą fibroblastów lub keratynocytów albo obydwoma typami komórek jednocześnie.

Podłoże według wynalazku, korzystnie stanowi membranę ze zmodyfikowanego, przy pomocy poroforu, polisulfonu, polieterosulfonu albo polilaktydu lub dekstranu, z wtłoczoną w jej powierzchnię, a następnie, po nadaniu kształtu membranie, wypłukaną włókniną celulozową, na której osadzona jest warstwa chitozanu, pokryta hodowlą in vitro, fibroblastów lub keratynocytów albo obydwoma typami komórek jednocześnie.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania podłoża kompozytowego z chitozanową warstwą aktywną do leczenia masywnych uszkodzeń skóry, gdzie, warstwa aktywna związana jest z matrycą, połączeniem o zwiększonej wytrzymałości mechanicznej.

Sposób wytwarzania podłoża kompozytowego z chitozanową warstwą aktywną do leczenia m asywnych uszkodzeń skóry, według wynalazku, polega na tym, że

a) przygotowuje się podłoże syntetyczne z materiału wybranego z grupy obejmującej poliestry alifatyczne, polisulfony, polieterosulfony, polilaktyd lub dekstrany, w rozpuszczalniku wybranym z grupy obejmującej 1-metylo-2-pirolidon (NMP), N,N-dimetyloformamid (DMF) lub dimetyloacetamid (DMA) oraz dwu- i trójskładnikowe mieszaniny tych rozpuszczalników, dodając do roztworu 3-50% wagowych poroforu, liczonego w stosunku do zawartości polimeru głównego, przy czym porofor jest wybrany z grupy polimerów rozpuszczalnych zarówno w wodzie jak i w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach takich jak poliwinylopirolidony (PVP), polialkohole winylowe, lub glikole polietylenowe, a z tak otrzymanego roztworu formuje się membranę płaską.

b) w trakcie formowania membrany, w jej powierzchnię wtłacza się matrycę z włókniny celulozowej, po czym membranę żeluje się w wodzie lub innym nierozpuszczainiku polimeru głównego i przetrzymuje w nierozpuszczalniku polimeru głównego, aż cały porofor ulegnie rozpuszczeniu, po czym ewentualnie rozpuszcza się włókninę celulozową, korzystnie zanurzając membranę w amoniakalnym roztworze wodorotlenku miedzi (II) lub w disiarczku węgla, następnie membranę płucze się w roztworze kwasu azotowego i w wodzie dejonizowanej, aż do uzyskania obojętnego pH, po czym membranę suszy się, korzystnie w temperaturze 40-80°C.

c) na otrzymane podłoże syntetyczne nanosi sie roztwór chitozanu, w kwasie organicznym, następnie zanurza się w wodnym roztworze wodorotlenku sodu i płucze membranę w wodzie dejonizowanej aż do uzyskania neutralnego pH.

d) na warstwie chitozanowej prowadzi się hodowlę in vitro, fibroblastów lub keratynocytów albo obu typów komórek jednocześnie, przy czym hodowlę prowadzi się standardowymi technikami aż do wytworzenia litej warstwy komórek, która przypomina właściwościami i wyglądem tkankę.

Tak przygotowany materiał jest gotowy do użycia i ma odpowiedni potencjał leczniczy.

W sposobie według wynalazku, powierzchnię podłoża syntetycznego modyfikuje się korzystnie, poprzez mechaniczne wtłoczenie matrycy (fig. 1) i usunięcie jej z powierzchni.

Matrycę korzystnie wtłacza się na głębokość 0,1-2 mm w głąb warstwy nośnikowej, przy czym głębokość wtłaczania zależna jest od grubości tej warstwy nośnikowej.

Powierzchnię matrycy zwilża się rozpuszczalnikiem, nierozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalnika i nierozpuszczalnika polimeru wybranych z grupy obejmującej polisulfony i polieterosu lfony, w celu uniknięcia uszkodzenia formowanego podłoża syntetycznego.

Projekt jednej z możliwych do zastosowania matrycy przedstawiono na fig. 1. Powierzchnia matrycy może mieć dowolny kształt. Odstępy między poszczególnymi elementami matrycy mogą być dowolne w zależności od potrzeb. Również wysokość, szerokość i głębokość matrycy mogą być dowolne uzależnione jedynie od otrzymania wymaganych efektów końcowych modyfikacji powierzchni. Matryca może być wykonana z dowolnego materiału, pod warunkiem że ani rozpuszczalnik polimeru ani jego nierozpuszczalnik nie powodują uszkodzeń powierzchni materiału matrycy.

Sposobem według wynalazku wytwarza się podłoże syntetyczne z rozwiniętą warstwą powierzchniową. Taki typ powierzchni sprzyja odpowiednio silnemu wiązaniu się warstwy chitozanowej, przy czym warstwa chitozanowa jest wiązana jedynie mechanicznie.

Sposób według wynalazku składa się z kilku etapów.

Etap 1

Przygotowanie roztworu chitozanu, korzystnie o stężeniu wagowym 0,3-3% w wodnym roztworze kwasu octowego o stężeniu objętościowym 3-7%.

PL 223 657 B1

Etap 2

Przygotowuje się podłoże syntetyczne przez naniesienie na nośnik syntetyczny wybrany z grupy obejmującej poliestry alifatyczne lub polimery biodegradowalne, roztworu tego nośnika, korzystnie o stężeniu wagowym 15-30% w odpowiednim rozpuszczalniku korzystnie wybranym z grupy obejmującej 1-metylo-2-pirolidon (NMP) lub N,N-dimetyloformamid (DMF) lub dimetyloacetamid (DMA). Do roztworu dodaje się 3-50% wagowych poroforu, liczonego w stosunku do zawartości polimeru głównego. Przy czym porofor powinien być z grupy polimerów rozpuszczalnych zarówno w wodzie jak i w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach. Mogą to być takie związki jak poliwinylopirolidon (PVP), polialkohol winylowy lub glikol polietylenowy. Z tak otrzymanego roztworu formuje się membranę płaską. W trakcie formowania membrany w jej powierzchnię wtłacza się włókninę celulozową po czym żeluje się w wodzie lub innym nierozpuszczalniku polimeru głównego. Żelowanie prowadzi się tak długo aż cały porofor ulegnie rozpuszczeniu co przeważnie trwa ok. 24 godziny. Następnie rozpuszcza się włókninę celulozową zanurzając membranę w amoniakalnym roztworze wodorotlenku miedzi (II) lub w disiarczku węgla. Rozpuszczanie włókien celulozowych trwa przeciętnie 2-6 godzin. Następnie membrana jest płukana w 5-10% roztworze kwasu azotowego a później w wodzie dejonizowanej aż do uzyskania obojętnego pH. Na końcu membrana jest suszona w temperaturze 40-80°C.

Powierzchnię podłoża syntetycznego można modyfikować fizycznie również poprzez mechaniczne wtłoczenie matrycy (rys. 1) oraz po czasie 1-10 s usunięcie jej z powierzchni. Matrycę wtłacza się na głębokość 0,1-2 mm w głąb warstwy nośnikowej, przy czym głębokość wtłaczania zależna jest od grubości warstwy nośnikowej. Aby podczas wtłaczania i wyjmowania matrycy nie nastąpiło uszk odzenie formowanego podłoża syntetycznego, powierzchnię matrycy zwilża się rozpuszczalnikiem, nierozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalnika i nierozpuszczalnika stosowanego polimeru. Mieszanina rozpuszczalnika i nierozpuszczalnika polimeru może mieć dowolne proporcje, które są zależne od składu formowanej warstwy nośnej i od wymaganego efektu końcowego modyfikacji powierzchni. Projekt jednej z możliwych do zastosowania matrycy przedstawiony jest na fig. 1. Powierzchnia matrycy może mieć dowolny kształt. Odstępy między poszczególnymi elementami matrycy mogą być dowolne w zależności od potrzeb. Również wysokość, szerokość i głębokość matrycy mogą być dowolne uzależnione jedynie od otrzymania wymaganych efektów końcowych modyfikacji p owierzchni. Matryca może być wykonana z dowolnego materiału, pod warunkiem że ani rozpuszczalnik polimeru ani jego nierozpuszczalnik nie powodują uszkodzeń powierzchni materiału matrycy.

W opisany powyżej sposób otrzymywane jest podłoże syntetyczne z rozwiniętą warstwą p owierzchniową. Taki typ powierzchni sprzyja odpowiednio silnemu wiązaniu się warstwy chitozanowej, przy czym warstwa chitozanowa jest wiązana jedynie mechanicznie.

Etap 3

Jest to nanoszenie roztworu chitozanu na podłoże syntetyczne, którego otrzymywanie opisano powyżej. Naniesiony roztwór chitozanu w kwasie organicznym zanurza się w 3% wodnym roztworze wodorotlenku sodu na 24 godziny. Następnie membranę płucze się w wodzie dejonizowanej aż do uzyskania neutralnego pH.

Etap 4

Na warstwie chitozanowej prowadzi się hodowlę in vitro, fibroblastów lub keratynocytów albo obu typów komórek jednocześnie. Hodowlę prowadzi się standardowymi technikami aż do wytworzenia litej warstwy komórek, która przypomina właściwościami i wyglądem tkankę. Dopiero tak przyg otowany materiał jest gotowy do użycia i ma odpowiedni potencjał leczniczy.

Zasadniczą różnicą w stosunku do już opatentowanych wynalazków jest zastosowanie podłoża syntetycznego o odpowiednio modyfikowanej powierzchni. Wtłoczenie włókniny celulozowej w powierzchnię nośnika syntetycznego a następnie jej wytrawienie powoduje powstanie rozwiniętej powierzchni, która zapewnia mechaniczne łączenie się warstwy chitozanu z podłożem. Połączenie jest na tyle mocne że warstwa chitozanu jest stabilna i nie spływa z powierzchni nośnika. Jednak jeżeli na powierzchni chitozanu będą rozwijały się komórki, to po pewnym czasie w wyniku trawienia tego materiału przez żywe komórki warstwa chitozanu oddzieli się od podłoża syntetycznego. Taka właściwość tego materiału jest bardzo korzystna jeżeli materiał zostanie użyty jako opatrunek. Gdyż po okresie od 3 do 4 tygodni warstwa syntetyczna może zostać usunięta z powierzchni leczonej rany nie powodując żadnych uszkodzeń delikatnej tkanki. Zastosowanie podłoża syntetycznego w opatrunku ma wiele zalet. Polimer syntetyczny zapewnia odpowiednio dużą wytrzymałość mechaniczną co jest bardzo ważne w przypadku opatrunków. Chroni również leżącą poniżej warstwę z żywymi komórkami przed

PL 223 657 B1 utratą wody w wyniku parowania. Jednocześnie warstwa syntetyczna jest na tyle przepuszczalna że nie ogranicza dostępu powietrza do powierzchni rany.

Drugą różnicą w stosunku do innych dostępnych komercyjnie lub opatentowanych materiałów jest warstwa tkanki wytworzona na powierzchni oraz wewnątrz filmu chitozanowego. Tkanka ta właściwościami jest zbliżona do tkanki skóry. Powoduje to że leczenie masywnych ran i uszkodzeń skóry przebiega szybciej a skuteczność leczenia jest większa w porównaniu do obecnie stosowanych metod.

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

P r z y k ł a d I

Przygotowano 15% roztwór polieterosulfonu Ultrason E2020P w 1-metylo-2-pirolidonie poprzez rozpuszczenie 18 g polimeru w 100 ml rozpuszczalnika. Do roztworu dodano 0,54 g PVP 10000, co stanowi 3% masy polieterosulfonu. Po rozpuszczeniu poroforu roztwór wylano na szklaną suchą p owierzchnię i przy pomocy rakla rozprowadzono roztwór równomiernie po całej powierzchni. Membranę pozostawiono na 30 min na powietrzu, po czym na powierzchnię nałożono włókninę celulozową w formie arkusza i przyciskano płytką szklaną. Następnie całość zanurzono w wodzie dejonizowanej i pozostawiono w kąpieli na 24 godziny w celu usunięcia PVP. Po wyjęciu z wody materiał umieszczono w amoniakalnym roztworze wodorotlenku miedzi (II) i pozostawiono na 6 godzin. Następnie membranę zanurzono w kąpieli z 5% wodnym roztworem kwasu azotowego na czas 1 godziny. Po wyjęciu membrany z roztworu kwasu płukano ją w wodzie dejonizowanej, aż do otrzymania odczynu obojętnego po czym membranę suszono w temperaturze 40-80°C.

Przygotowano 1% roztwór chitozanu w 4% wodnym roztworze kwasu octowego. Roztwór nanoszono na powierzchnię podłoża syntetycznego przy pomocy rakla zgarniającego. Nanoszenie wyk onano tak, aby otrzymana powierzchnia była równa. Następnie całość zanurzono w 3% wodnym ro ztworze wodorotlenku sodu i pozostawiono na 24 godziny. Po tym czasie membranę płukano wielokrotnie wodą dejonizowaną, aż do uzyskania odczynu obojętnego popłuczyn.

Pobrano z hodowli in vitro komórki. Przeniesiono komórki do probówek wirowniczych. Dodano sojowy inhibitor trypsyny w celu zneutralizowania działania enzymu. Paletkę komórek odwirowano przez 5 min przy 1000 obr./min. Po odwirowaniu komórki przeniesiono na podłoża, na które naniesiono uprzednio pożywkę hodowlaną i umieszczono w inkubatorze w 37°C i stężeniu CO₂ 5% i wilgotności 80%. Pożywkę hodowlaną zmieniano co 2 dni. Zalecana jest pożywka DMEM z dodatkiem glukozy w ilości 4 g na 1 l pożywki. Hodowlę prowadzono przez okres 3-4 tygodni. Tak przygotowany materiał jest gotowy do zastosowania jako opatrunek.

P r z y k ł a d II

Przygotowano 25% roztwór polieterosulfonu Ultrason E6020P w N,N-dimetyloformamidzie poprzez rozpuszczenie 31,5 g polimeru w 100 ml rozpuszczalnika. Do roztworu dodano 12,6 g PVP 10000, co stanowiło 40% masy polieterosulfonu. Po rozpuszczeniu poroforu roztwór wylano na szklaną suchą powierzchnię i przy pomocy rakla rozprowadzono roztwór równomiernie po całej powierzchni. Membranę pozostawiono na 30 min na powietrzu, po czym na powierzchnię nałożono włókninę celulozową w formie arkusza i przyciskano płytką szklaną. Następnie całość zanurzono w wodzie dejonizowanej o temperaturze 60°C i pozostawiono w kąpieli na 24 godziny w celu usunięcia PVP. Po wyjęciu z wody materiał umieszczono w amoniakalnym roztworze wodorotlenku miedzi (II) i pozost awiono na 6 godzin. Następnie membranę zanurza się w kąpieli z 5% wodnym roztworem kwasu azotowego na czas 1 godziny. Po wyjęciu membrany z roztworu kwasu płukano ją w wodzie dejonizowanej, aż do otrzymania odczynu obojętnego, po czym membranę suszono w temperaturze 40-80°C.

Przygotowano 3% roztwór chitozanu w 6% wodnym roztworze kwasu octowego. Roztwór naniesiono na powierzchnię podłoża syntetycznego przy pomocy automatycznego urządzenia do lam inacji. Nanoszenie wykonano tak aby otrzymana powierzchnia była równa. Następnie całość zanurzono w 3% wodnym roztworze wodorotlenku sodu i pozostawiono na 24 godziny. Po tym czasie membranę płukano wielokrotnie wodą dejonizowaną, aż do uzyskania odczynu obojętnego popłuczyn.

Dalej postępowano identycznie jak w przykładzie I.

P r z y k ł a d III

Przygotowano 20% roztwór polisulfonu Udel P-1700 w mieszaninie 50 ml N,N-dimetyloformamidu i 50 ml 1-metylo-2-pirolidonu poprzez rozpuszczenie 25 g polimeru w 100 ml rozpuszczalnika mieszanego. Do roztworu dodaje się 3,75 g PVP 10000, co stanowi 15% masy polisulfonu. Po rozpuszczeniu poroforu roztwór wylewa się na szklaną suchą powierzchnię i przy pomocy automatyczn ego urządzenia do laminacji ciągłej rozprowadza się roztwór równomiernie po całej powierzchni. Me mbranę pozostawia się na 30 min na powietrzu, po czym na powierzchnię nakłada się włókninę celuloPL 223 657 B1 zową w formie arkusza i przyciska płytką szklaną. Następnie całość zanurza się w wodzie dejonizowanej o temperaturze 30°C i pozostawia się w kąpieli na 24 godziny w celu usunięcia PVP. Po wyjęciu z wody materiał umieszcza się w dwusiarczku węgla i pozostawia na 6 godzin w temperaturze 20°C. Następnie membranę wyciąga się z rozpuszczalnika i umieszcza w suszarce z filtrem powietrza i suszy w 60°C. W celu usunięcia z membrany ewentualnych niewielkich pozostałości dwusiarczku węgla płucze się ją kilkakrotnie w etanolu, następnie w wodzie dejonizowanej oraz suszy się w temperaturze 40-80°C.

Przygotowano 2% roztwór chitozanu w 5% wodnym roztworze kwasu octowego. Roztwór nanoszono na powierzchnię podłoża syntetycznego przy pomocy automatycznego urządzenia do laminacji. Nanoszenie musi być tak wykonane aby otrzymana powierzchnia była równa. Następnie całość zanurza się w 3% wodnym roztworze wodorotlenku sodu i pozostawia na 24 godziny. Po tym czasie membranę płucze się wielokrotnie wodą dejonizowaną aż do uzyskania odczynu obojętnego popłuczyn.

Dalej postępowano identycznie jak w przykładzie I.

P r z y k ł a d IV

Przygotować 30% roztwór polieterosulfonu Ultrason E6020P w N,N-dimetyloformamidzie poprzez rozpuszczenie 41 g polimeru w 100 ml rozpuszczalnika. Do roztworu dodano 18,45 g PVP 10000, co stanowi 45% masy polieterosulfonu. Po rozpuszczeniu poroforu roztwór wylano na szklaną suchą powierzchnię i przy pomocy rakla rozprowadzono roztwór równomiernie po całej powierzchni, tak aby grubość roztworu w każdym miejscu wynosiła 3 mm. Membranę pozostawiono na 30 min na powietrzu, po czym w powierzchnię wtłaczano matrycę na głębokość 0,5 mm. Przy czym matryca przed użyciem jest zwilżana 50% roztworem N,N-dimetyloformamidu w wodzie dejonzowanej i procedura jest powtarzana przy każdym cyklu. Po 3 s matrycę usuwano, a membranę zanurzano w wodzie dejonizowanej o temperaturze 60°C. Membranę pozostawiono w kąpieli na 24 godziny w celu usunięcia PVP.

P r z y k ł a d V

Przygotować 33% roztwór polilaktydu w 1,4-dioksanie poprzez rozpuszczenie 50 g polimeru w 100 ml rozpuszczalnika. Do roztworu dodano 18,45 g PVP 10000, co stanowi 36,9% masy polilaktydu. Po rozpuszczeniu poroforu roztwór wylano na szklaną suchą powierzchnię i przy pomocy rakla rozprowadzono roztwór równomiernie po całej powierzchni, tak aby grubość roztworu w każdym miejscu wynosiła 3 mm. Membranę pozostawiono na 30 min na powietrzu, po czym w powierzchnię wtłaczano matrycę na głębokość 0,5 mm. Przy czym matryca przed użyciem jest zwilżana 50% roztworem N,N-dimetytoformamidu w wodzie dejonzowanej i procedura jest powtarzana przy każdym cyklu. Po 3 s matrycę usuwano, a membranę zanurzano w wodzie dejonizowanej o temperaturze 60°C. Membranę pozostawiono w kąpieli na 24 godziny w celu usunięcia PVP.

Dalej postępowano identycznie jak w przykładzie I.

P r z y k ł a d VI

Przygotowano membranę nośnikową zgodnie z przykładem I.

Przygotowano 20% roztwór dekstranu w wodzie. Roztwór nanoszono na powierzchnię podłoża syntetycznego przy pomocy rakla zgarniającego. Nanoszenie wykonano tak, aby otrzymana powierzchnia była równa. Następnie suszono aż do osiągnięcia wilgotności w zakresie 40-50%. Pobrano z hodowli in vitro komórki. Przeniesiono komórki do probówek wirowniczych. Dodano sojowy inhibitor trypsyny w celu zneutralizowania działania enzymu. Paletkę komórek odwirowano przez 5 min przy 1000 obr./min. Po odwirowaniu komórki przeniesiono na podłoża, na które naniesiono uprzednio pożywkę hodowlaną i umieszczono w inkubatorze w 37°C i stężeniu CO₂ 5% i wilgotności 80%. Pożywkę hodowlaną zmieniano co 2 dni. Zalecana jest pożywka DMEM z dodatkiem glukozy w ilości 4 g na 1 l pożywki. Hodowlę prowadzono przez okres 3-4 tygodni. Tak przygotowany materiał jest gotowy do zastosowania jako opatrunek.

Powyższe przykłady mają na celu zobrazowanie wynalazku i nie ograniczają jego stosowania do membran polisulfonowych i polieterosulfonowych, ale mogą być z powodzeniem stosowane przy wykorzystaniu do tworzenia membran z innych polimerów zarówno bioresorbowalnych jak i nie bioresorbowalnych, a warstwy żelowej z innych materiałów niż chitozan przykładowo z dekstranów lub kolagenu.

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Podłoże kompozytowe z chitozanową warstwą aktywną, do leczenia masywnych uszkodzeń skóry, znamienne tym, że stanowi go materiał kompozytowy składający się z warstwy chitozanu, naniesionej na nośnik syntetyczny (membranę) wybrany z grupy obejmującej alifatyczne i aromatyc zne poliestry, zwłaszcza polisulfon lub polieterosulfon oraz polimery biodegradowalne, zwłaszcza polilaktyd lub dekstran, o rozwiniętej powierzchni właściwej powyżej 10 cm /g, który pokryty jest warstwą namnożonych komórek keratynocytów lub fibroblastów, lub jednocześnie obydwoma typami tych komórek, przy czym grubość namnożonej warstwy jest równa grubości, co najmniej jednej komórki.
2. 2. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że jako podłoże syntetyczne stosuje się membranę wykonaną z polimeru biodegradowatnego wybranego z grupy obejmującej polilaktyd, skrobia modyfikowana, polikaprolakton oraz pochodne.
3. 3. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi membranę ze zmodyfikowanego, przy pomocy poroforu, poliestru alifatycznego lub polimeru biodegradowalnego, z wtłoczoną w jej powierzchnię, a następnie po nadaniu kształtu membranie, usuniętą matrycą, na której to membranie osadzona jest warstwa chitozanu, pokryta in vitro, hodowlą fibroblastów lub keratynocytów albo obydwoma typami komórek jednocześnie.
4. 4. Podłoże według zastrz. 1, znamienne tym, że stanowi membranę ze zmodyfikowanego, przy pomocy poroforu, poliestru alifatycznego lub polimeru biodegradowalnego, z wtłoczoną w jej powierzchnię a następnie po nadaniu kształtu membranie, usuniętą matrycą, korzystnie stanowiącą wypłukaną włókniną celulozową, na której to membranie osadzona jest warstwa chitozanu, pokryta hodowlą in vitro, fibroblastów lub keratynocytów albo obydwoma typami komórek jednocześnie.
5. 5. Sposób wytwarzania podłoża kompozytowego z chitozanową warstwą aktywną do leczenia masywnych uszkodzeń skóry, znamienny tym, że

   a) przygotowuje się podłoże syntetyczne z poliestru alifatycznego lub polimeru biodegradowa lnego, przez rozpuszczenie w rozpuszczalniku wybranym z grupy obejmującej 1-metylo-2-piroiidon (NMP), N,N-dimetyloformamid (DMF) lub dimetyloacetamid (DMA) oraz dwu- i trójskładnikowe mieszaniny tych rozpuszczalników, dodając do roztworu 3-50% wagowych poroforu, liczonego w stosunku do zawartości polimeru głównego, przy czym porofor jest wybrany z grupy polimerów rozpuszczalnych zarówno w wodzie jak i w wyżej wymienionych rozpuszczalnikach, zwłaszcza poliwinylopirolidon (PVP), polialkohol winylowy lub glikol polietylenowy, z tak otrzymanego roztworu formuje się membranę płaską.

   b) w trakcie formowania membrany, w jej powierzchnię wtłacza się, a następnie po nadaniu kształtu membranie, usuwa się matrycę - korzystnie włókninę celulozową, po czym matrycę żeluje się w wodzie lub innym nierozpuszczalniku polimeru głównego, aż cały porofor ulegnie rozpuszczeniu, po czym ewentualnie rozpuszcza się włókninę celulozową, zanurzając membranę w amoniakalnym ro ztworze wodorotlenku miedzi (II) lub w disiarczku węgla, następnie membranę płucze się w roztworze kwasu azotowego i w wodzie dejonizowanej. aż do uzyskania obojętnego pH, po czym membranę suszy się, korzystnie w temperaturze 40-80°C.

   c) na otrzymane podłoże syntetyczne nanosi sie roztwór chitozanu, w kwasie organicznym, następnie zanurza się w wodnym roztworze wodorotlenku sodu i płucze membranę w wodzie dejonizowanej aż do uzyskania neutralnego pH.

   d) na warstwie chitozanowej prowadzi się hodowlę in vitro, fibroblastów lub keratynocytów albo obu typów komórek jednocześnie, przy czym hodowlę prowadzi się standardowymi technikami aż do wytworzenia litej warstwy komórek, która przypomina właściwościami i wyglądem tkankę.
6. 6. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że powierzchnię podłoża syntetycznego modyfikuje się poprzez mechaniczne wtłoczenie matrycy a następnie, po nadaniu kształtu membranie, usunięcie jej z powierzchni podłoża mechanicznie przez oderwanie, wypłukanie lub wytrawienie chemic zne włókniny celulozowej.
7. 7. Sposób według zastrz. 5 albo 8, znamienny tym, że powierzchnię podłoża syntetycznego modyfikuje się poprzez mechaniczne wtłoczenie matrycy, której powierzchnia zbudowana jest z rozmieszczonych regularnie, powtarzających się elementów o kształtach walców, ostrosłupów, granias tosłupów oraz kształtach pochodnych powstałych poprzez połączenie trzech typów wymienionych wcześniej kształtów.

   PL 223 657 B1
8. 8. Sposób według zastrz. 5 albo 8, znamienny tym, że matrycę korzystnie wtłacza się na głębokość 0,1-2 mm w głąb warstwy nośnikowej, przy czym głębokość wtłaczania zależna jest od grubości tej warstwy, nośnikowej.
9. 9. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że powierzchnię matrycy zwilża się rozpuszczalnikiem, nierozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalnika i nierozpuszczalnika wybranymi z grupy obejmującej: wodę, alkohole, formamidy, pirolidony.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się matrycę wykonaną z siatki nylonowej lub metalowej zwilżonej rozpuszczalnikiem, nierozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszcza lnika i nierozpuszczalnika.
11. 11. Sposób według zastrz. 5, znamienny tym, że jako podłoże syntetyczne stosuje się membranę wykonaną z polimeru biodegradowalnego wybranego z grupy obejmującej: polilaktyd, skrobia modyfikowana, polikaprolakton.
12. 12. Sposób według zastrz. 5 albo 6, znamienny tym, że modyfikuje się strukturę powierzchni podłoża syntetycznego poprzez wtłoczenie w powierzchnię podłoża włókniny celulozowej, a po żelowaniu podłoża włókninę rozpuszcza się.