PL224387B1 - Transgeniczny szczep Trichoderma atroviride, otrzymywanie i zastosowanie szczepu Trichoderma atroviride jako biofungicydu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy transgeniczny szczep Trichoderma atroviride posiadający aktywność biobójczą szczególnie przeciwgrzybową oraz sposób jego otrzymania, a także zastosowanie jako środka biobójczego, zwłaszcza przeciwgrzybowego. Szczep według wynalazku ma zastosowanie szczególnie w rolnictwie jako biofungicydy. Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja biobójcza do biologicznego zwalczania niepożądanych organizmów zawierająca nowy transgeniczny szczep Trichoderma atroviride.

Rolnictwo notuje ogromne straty plonów spowodowane zakażeniami grzybowymi roślin uprawnych zaatakowanych przez grzyby patogenne takie jak Pythium, Phytophthora, Fusarium, Botritis czy Rhizoctonia. Tradycyjne metody zapobiegania stratom plonów polegają na opryskach chemicznymi środkami ochrony roślin co poważnie obciąża środowisko naturalne. Od pewnego czasu pojawiła się dodatkowa możliwość chronienia plonów poprzez zastosowanie biofungicydów na bazie Trichoderma. Biologiczna ochrona roślin przed chorobami grzybowymi czyli biokontrola pozwala ograniczyć zanieczyszczenie środowiska chemicznymi fungicydami.

Grzyby z rodzaju Trichoderma mają naturalne właściwości przeciwgrzybowe w stosunku do grzybów patogennych dla roślin. Jednym z mechanizmów przeciwgrzybowego działania Trichoderma jest wydzielanie enzymów hydrolitycznych, które hydrolizując ścianę komórkową grzyba powodują śmierć jego komórek. Enzymy hydrolityczne są glikoproteinami, które są modyfikowane w retikulum endoplazmatycznym i aparacie Golgiego poprzez przyłączanie reszt cukrowych a następnie w pęcherzykach transportowych są przemieszczane do błony komórkowej i poprzez kanaliki w ścianie komórkowej są wyrzucane na zewnątrz.

W zgłoszeniu patentowym P393021 przedstawiono sposób aktywacji właściwości biokontrolnych Trichoderma, zwłaszcza szczepu biokontrolnego T. atroviride poprzez uaktywnienie procesu O-glikozylacji, pozornie niezwiązanego z wydzielaniem białek sekrecyjnych. Rozwiązanie opisane w zgłoszeniu P. 393021 oparto na związku między aktywnością syntazy dolichylofosfomannozy kluczowego enzymu procesu O-glikozylacji i sekrecją enzymów hydrolitycznych (Kruszewska i wsp. 1999). Enzymy hydrolityczne wydzielane przez Trichoderma są silnie O-glikozylowane. Uaktywnienie kluczowego enzymu procesu O-glikozylacji spowodowało przyspieszenie potranslacyjnych modyfikacji białek w tym hydrolaz i zwiększenie ich wydzielania. Hydrolazy wydzielane przez Trichoderma mają za zadanie zniszczyć ścianę komórkową grzyba patogennego lub kutikulę owada, co umożliwia jego eliminację. Dlatego też poprzez modyfikację procesu O-glikozylacji a co za tym idzie wydzielania hydrolaz udało się stworzyć szczepy Trichoderma o unikalnych właściwościach biokontrolnych jak opisano w zgłoszeniu P. 393021. W zgłoszeniu patentowym P. 393021 wzmocniono potranslacyjną modyfikację wydzielanych hydrolaz co usprawniło ich procesowanie w komórce i w ten sposób zwiększyło wydzielanie.

Praca Perlińskiej-Lenart U. i in. w Fungal Genet. Biol. 2006, 43(6): 422-9 „Overexpression of Saccharomyces cerevisiae RER2 gene in Trichoderma reesei affects dolichol dependent enzymes and protein glycosylation” dotyczy Trichoderma reesei, która nie ma działania biokontrolnego, a modyfikacja Trichoderma reesei prowadzi do zwiększonej aktywności enzymów dolicholozależnych i hiperglikozylacji białek sekrecyjnych. Trichoderma reesei nie jest odpowiedni jako szczep biokontrolny.

Opis patentowy WO2009102222 przedstawia zastosowanie naturalnie występujących na obszarze Nowej Zelandii szczepów T. atroviride do zwalczania patogenów roślinnych. Należy wskazać, że w zgłoszeniu tym nie ma żadnej wzmianki dotyczącej możliwych modyfikacji lub wykorzystania technik inżynierii genetycznej tych szczepów.

W stanie techniki nie opisano więc żadnych rozwiązań skutecznego zwalczania szkodników metodami innymi niż nieprzyjazne dla środowiska produkty syntezy chemicznej. Istnieje zatem potrzeba opracowania skutecznych środków biobójczych. Obecnie, dzięki zastosowaniu modyfikacji genetycznych uzyskano nowe szczepy o odpowiednich właściwościach przeciwgrzybowych. Właściwości te stanowią alternatywne rozwiązanie do szczepów opisanych w zgłoszeniu P393021 i P401450. Inny jest sposób uzyskania szczepów według wynalazku i mechanizm ich działania.

Według obecnego wynalazku wzmocnienie właściwości biobójczych szczepów Trichoderma atroviride uzyskuje się poprzez nadekspresję drożdżowego genu RER2 kodującego cis-prenylotransferazę. Cis-prenylotransferaza jest enzymem dolicholowej odnogi szlaku mewalonowego katalizującym syntezę dolicholu. Dolichol, w formie ufosforylowanej bierze udział w procesach glikozylacji, ale także wchodzi w skład błon komórkowych i pęcherzyków sekrecyjnych co jest istotne z punktu widzePL 224 387 B1 nia sekrecji białek. Niedobór dolicholu u drożdży powoduje niewłaściwą akumulację błon endoplazmatycznego retikulum i aparatu Golgiego, powolny wzrost komórek, defekty O- i N-glikozylacji i wrażliwość na higromycynę B (Sato i wsp. 1999). Takie zmiany powodują zaburzenia syntezy, transportu, glikozylacji i wydzielania białek. Ze stanu techniki wiadomo, że nadekspresja genu RER2 z drożdży

S. cerevisiae w niebiokontrolnym szczepie T. reesei spowodowała zwiększenie aktywności cis-prenylotransferazy kodowanej przez ten gen oraz, że białka wydzielane przez T. reesei były hiperglikozylowane (Perlińska-Lenart i wsp. 2006).

Jednakże ze względu na fakt, że T. reesei ma inne właściwości niż T. atroviride, twórcy nie spodziewali się, że zastosowanie modyfikacji genetycznej polegającej na wprowadzeniu do T. atroviride genu RER2 doprowadzi do tak korzystnych rezultatów i znaczącego wzmocnienia właściwości biobójczych nowych szczepów.

Przedmiotem wynalazku jest zmutowany szczep Trichoderma atroviride, zawierający zrekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą gen RER2 kodujący cis-prenylotransferazę. Korzystnie gen kodujący cis-prenylotransferazę pochodzi z Saccharomyces cerevisiae i gen kodujący koduje cis-prenylotransferazę o sekwencji nukleotydowej nr 1. Sekwencja aminokwasowa kodowana przez sekwencję nukleotydową nr 1 ma co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, lub 100% identyczności z sekwencją nr 2. W korzystnym rozwiązaniu gen RER2 z S. cerevisiae jest zintegrowany z genomem Trichoderma atroviride. Korzystnie, gen RER2 jest zintegrowany z genomem i szczep wykazuje nadekspresję tego enzymu.

Przedmiotem wynalazku jest także sposób otrzymywania szczepu transgenicznego Trichoderma atroviride, według wynalazku, w którym to sposobie wyodrębnia się DNA kodujący cis-prenylotransferazę, następnie transformuje się uzyskanym genem szczep Trichoderma atroviride, po czym uzyskuje się nadekspresję cis-prenylotransferazy w otrzymanym szczepie transgenicznym.

Korzystnie prowadzi się do integracji rekombinowanego DNA kodującego cis-prenylotransferazę z genomem Trichoderma atroviride.

Przedmiotem wynalazku jest również sposób zwalczania niepożądanych organizmów, w którym stosuje się szczep Trichoderma atroviride z nadekspresją DNA kodującego cis-prenylotransferazę. Korzystnie w sposobie według wynalazku stosuje się szczep Trichoderma atroviride, w którym występuje nadekspresja heterologicznego DNA kodującego cis-prenylotransferazę z Saccharomyces cerevisiae. Korzystnie zwalcza się choroby grzybowe roślin i plonów. Szczególnie korzystnie zwalcza się Pythium ultimum.

W innej odmianie przedmiotem wynalazku jest sposób zwiększania wzrostu rośliny i/lub wydajności plonów, w którym stosuje się szczep Trichoderma atroviride, z nadekspresją DNA kodującego cis-prenylotransferazę.

Przedmiotem wynalazku jest ponadto kompozycja biobójczą, która zawiera szczep Trichoderma atroviride z nadekspresją DNA kodującego cis-prenylotransferazę. Co więcej, przedmiotem wynalazku jest kompozycja do zwiększania plonów, która zawiera szczep Trichoderma atroviride, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego cis-prenylotransferazę.

Podobnie jak szczep Trichoderma atroviride można stosować inne szczepy, takie jak; T. asperellum, T. koningi, T. lixii i T. virens.

Szczegółowy opis wynalazku

W jednej z odnóg szlaku mewalonowego produkowany jest dolichol, który w formie ufosforyl owanej bierze udział w reakcjach glikozylacji białek a także wchodzi w skład błon komórkowych budujących wszystkie struktury uczestniczące w procesie sekrecji enzymów hydrolitycznych u Trichoderma. Kluczowym enzymem w produkcji dolicholu jest cis-prenylotransferaza kodowana przez gen RER2. Cis-prenylotransferaza (EC:2.5.1.31) jest (Z)-prenylotransferazą zależną od dwuwartościowych kationów Mn²+ i Mg²+, która warunkuje wydłużanie łańcucha węglowodorowego dehydrodolicholi oraz dehydroundekaprenoli poprzez dołączanie cząsteczek dwufosforanu izopentylu (IPP) w konfiguracji cis do ditrans dwufosforanu farnezylu (FPP) (Ogura i wsp. 1998).

Zgodnie z wynalazkiem zwiększenie aktywności przeciwgrzybowej i biokontrolnej Trichoderma atroviride polega na zwiększeniu aktywności cis-prenylotransferazy. Zwiększenie aktywności cis-prenylotransferazy osiąga się poprzez nadekspresję w Trichoderma atroviride P1 drożdżowego genu RER2 kodującego ten enzym. Gen RER2 jest zintegrowany z genomem T. atroviride w sposób przypadkowy przy użyciu metody transformacji.

W sposobie według wynalazku, korzystnie, przed wprowadzeniem do genomu Trichoderma, gen RER2 z Saccharomyces cerevisiae powiela się metodą PCR stosując starter RER2-U o sekwen4

PL 224 387 B1 cji: (5' CGG GAT TCA TGG AAA CGG ATA GTG GTA TA 3') i starter RER2-L o sekwencji: (5' CGG ATA TCT TAA TTC AAC TTT TTT TCT TTC AAA TC 3').

Zastosowana metoda PCR umożliwia uzyskanie odpowiednich końców w powielanym fragmencie DNA, dzięki czemu można go wklonować w konkretne miejsce w plazmidzie. Gen klonuje się pod promotor gpdA (dehydrogenaza aldehydu 3-fosfo glicerynowego) i terminator trpC (syntaza fosforanu indolo-3-glicelolowego) do plazmidu pAN521N. Wybrany promotor i terminator, korzystnie, pochodzi z grzybów nitkowatych, zwłaszcza Aspergillus czyli z grzyba nitkowatego blisko spokrewnionego z Trichoderma. Aby uzyskać wymaganą ekspresję genu klonuje się go pod promotor rozpoznawany przez komórki gospodarza. Grzyby nitkowate są pod tym względem bardzo elastyczne i są w stanie rozpoznać również promotory np. drożdżowe.

Korzystnie, plazmid pAN521N przecina się enzymem restrykcyjnym BamHI, wkleja wstawkę RER2 (produkt PCR) stosując ligazę T₄ a następnie przecina konstrukt enzymem Ncol, uzyskuje tępe końce działając nukleazą Mung Bean lub nukleazą S1 i dokonuje samoligacji. W sposobie według wynalazku do transformacji T.atroviride, korzystnie, stosuje się metodę kotransformacji mieszanką plazmidów: plazmidem pAN521N niosącym gen RER2 oraz plazmidem pRMLex_30 niosącym gen oporności na higromycynę B.

Zastosowanie plazmidu pAN521N determinuje użycie enzymu BamHI do cięcia w miejscu gdzie gen zostanie wklonowany. Powstałe dodatkowe miejsce ATG musimy usunąć tnąc plazmid enzymem Ncol i usuwając wolny koniec przy pomocy nukleazy Mung Bean lub nukleazy S1.

Do otrzymania transformantów użyto metody kotransformacji polegającej na użyciu do transformacji mieszaniny dwóch plazmidów, plazmidu zawierającego gen, którego nadekspresję chcemy uzyskać i plazmidu pomocniczego zawierającego gen markerowy. W tym przypadku korzystnie, pierwszy plazmid zawiera gen RER2, a drugi gen oporności na higromycynę B. Plazmidy, korzystnie, stosuje się w stosunku ilościowym 10-15:1 odpowiednio pierwszego plazmidu: plazmidu pomocniczego. Stosowanie mieszaniny plazmidów do transformacji ułatwia wchodzenie DNA do komórki grzybów nitkowatych. Transformację, korzystnie, wykonuje się w ten sposób, że transformanty selekcjonuje się na pożywkach z higromycyną B i 0.1% Tritonem X-100. Pożywka powinna zawierać higromycynę B, gdyż poszukiwane są transformanty, które nie są na nią wrażliwe i wyrosną na zawierającej ją pożywce. Triton X-100 jest natomiast związkiem zapobiegającym rozchodzeniu się kolonii grzyba po całej płytce co umożliwia wyselekcjonowanie pojedynczych transformantów.

Wśród transformantów opornych na higromycynę B wyszukuje się tych z genem RER2. W tym celu otrzymuje się DNA z transformantów i na tak przygotowanej matrycy metodą PCR namnaża się fragment DNA stosując startery homologiczne do sekwencji drożdżowego genu RER2. Następnie produkty PCR poddaje się analizie na żelu agarozowym, prążek o wielkości ok. 800 par zasad izoluje się z żelu a następnie sekwencjonuje. Wykonuje się również dwie kontrolne reakcje PCR: kontrolę pozytywną wykonuje się na matrycy genomowego DNA z S.cerevisiae i kontrolę negatywną na matrycy DNA z rodzicielskiego szczepu T.atroviride P1 (szczep nietransformowany). Sekwencje otrzymane w wyniku sekwencjonowania porównuje się z sekwencją genu RER2.

DNA z transformantów można również analizować metodą Southern blotting lecz taka analiza jest dłuższa i bardziej kosztowna. Wtedy DNA tnie się enzymem restrykcyjnym, korzystnie EcoRI, poddaje elektroforezie na żelu agarozowym, denaturuje, zobojętnia, przenosi na membranę nylonową i hybrydyzuje z sondą syntetyzowaną na matrycy z genu RER2 (produkt PCR jak wyżej).

Genomowe DNA można ciąć również innymi enzymami restrykcyjnymi, które nie tną wewnątrz genu RER2 np.: Bgll, EcoRV, Hindlll, Hpal, Ncol, Ndel, Notl, Pad, Pstl, Pvul, Pvull, Sacll, Sall, Smal, Spel, Stul, Xbal, Xhol.

Z transformantów zawierających gen RER2 otrzymano również całkowite RNA i metodą dot blotting stwierdzono, że zawierają one transkrypt RER2 czyli, że doszło do ekspresji wprowadzonego genu. Tak otrzymane i sprawdzone transformanty RER2 nazwane, RER11/10, RER30/10, RER32/10 stosuje się do dalszych badań.

Wynalazek został zilustrowany na rysunku, na którym

Fig. 1. przedstawia wpływ ekspresji genu RER2 na aktywność cis-prenylotransferazy. P1-szczep kontrolny T. atroviride; 11,30, 32 - transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

Fig. 2. A przedstawia właściwości hydrolityczne transformantów hodowanych na płytkach z pożywką minimalną i karboksymetylocelulozą jako źródłem węgla wyrażone jako zdolność do wzros tu na złożonym źródle węgla. P1-szczep kontrolny T. atroviride; 11, 30, 32 - transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

PL 224 387 B1

Fig. 2. B przedstawia wielkość halo wkoło kolonii grzybów hodowanych na płytkach z pożywką minimalną i karboksymetylocelulozą jako wyraz ilości wydzielanych enzymów hydrolitycznych P1-szczep kontrolny T. atroviride; 11,30, 32 - transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

Fig. 3 Przedstawia aktywność celulaz w pożywce po hodowli grzybów. P1-szczep kontrolny T.atroviride P1; 11,30, 32 - transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

Fig. 4 przedstawia aktywność N-acetyl-3-D-glukozaminidazy w pożywce po hodowli grzybów. P1-szczep kontrolny T.atroviride P1; 11,30, 32 - transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

Fig. 5 przedstawia wydzielanie białek do pożywki podczas hodowli grzybów na pożywce z laktozą. P1 -szczep kontrolny T. atroviride P1; 11, 30, 32 - transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

Fig. 6 przedstawia wzrost Pythium ultimum na płytkach po hodowli Trichoderma. Pythium wzrost kolonii P. ultimum na czystej płytce, P1-wzrost kolonii P. ultimum na płytkach na których uprzednio hodowano szczep kontrolny T. atroviride P1; 11, 30, 32 wzrost kolonii P. ultimum na płytkach na których uprzednio hodowano szczepy transformowane RER11/10, RER30/10 i RER32/10;

Fig. 7 przedstawia wzrost fasoli Phaseolus vulgaris L (var. nanus L.) w ziemi zakażonej Pythium ultimum. Kontrola pozytywna (kontrola) oznacza hodowlę roślin w ziemi, która nie była zakażona ani Pythium ani Trichoderma. (Pyth) - kontrola negatywna hodowla w ziemi zakażonej tylko Pythium ultimum. Pozostałe słupki pokazują wzrost roślin w ziemi zakażonej Pythium ultimum i szczepami Trichoderma P1 (szczep kontrolny) i transformantami (RER11/10, RER30/10 i RER32/10) (szare słupki) lub tylko zakażonej szczepami Trichoderma (czarne słupki);

Fig. 8 przedstawia procent wykiełkowanych nasion Phaseolus vulgaris L. (var. nanus L.) obliczony po 10 dniach wzrostu roślin. Kontrola pozytywna (Kontrola) oznacza hodowlę roślin w ziemi, która nie była zakażona ani Pythium ultimum ani Trichoderma. (Pyth) - kontrola negatywna - hodowla w ziemi zakażonej tylko Pythium ultimum. Pozostałe słupki pokazują wzrost roślin w ziemi zakażonej Pythium ultimum i szczepami Trichoderma P1 (szczep kontrolny) i transformantami (RER11/10, RER30/10 i RER32/10) (szare słupki) lub tylko zakażonej szczepami Trichoderma (czarne słupki);

Fig. 9 i fig. 10 przedstawiają odpowiednio sekwencję nukleotydową i aminokwasową cisprenylotransferazy z S. cerevisiae.

Fig. 11 przedstawia aktywność syntazy dwufosforanu farnezylu (FPP) w szczepach T. atroviride niosących gen RER2 z S. cerevisiae i w szczepie kontrolnym P1.

Fig. 12 przedstawia aktywność cis-prenylotransferazy w szczepach T. atroviride P1 niosących gen ERG20 z S. cerevisiae opisanych w zgłoszeniu P.401450

Poniżej przedstawiono przykłady wykonania wynalazku.

Przykład I. Gen RER2 z S.cerevisiae powielano metodą PCR stosując starter RER2-U o sekwencji: (5' CGG GAT TC A TGG AAA CGG ATA GTG GTA TA 3') i starter RER2-L o sekwencji: (5' CGG ATA TCT TAA TTC AAC TTT TTT TCT TTC AAA TC 3').

Metoda PCR pozwoliła na namnożenie fragmentu kodującego cis-prenylotransferazę z S. cerevisiae dzięki zastosowaniu genomowego DNA z drożdży S. cerevisiae jako matrycy i odpowiednich starterów zaprojektowanych do początku i końca genu. Dodatkowo startery zawierały sekwencję ro zpoznawaną przez enzym restrykcyjny BamHI co umożliwiło wstawienie uzyskanego produktu PCR do plazmidu pAN521N (Accession numer Z32697) pod promotor gpdA (dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego) i terminator trpC (syntaza fosforanu indolo-3-glicelolowego). Plazmid cięto enzymem restrykcyjnym BamHI, następnie wligowano wstawkę RER2 (produkt PCR) 5 stosując ligazę T₄ (Promega). Następnie plazmid przecięto Ncol, wytępiono końce nukleazą Mung Bean (Promega) i poddano selfligacji. Plazmid użyto do transformacji T. atroviride P1. Transformację wykonano według opisu Kubicek-Pranz, E.M., Gruber, F., Kubicek, C.P. (1991) Transformation of Trichoderma reesei with the cellobiohydrolase II gene as a means for obtaining strains with increased cellulase production and specific activity. J.Biotechnol. 20, 83-94 i Mach, R.L., Schindler, M., Kubicek, C.P. (1994) Transformation of Trichoderma reesei based on hygromycin B resistance using homologous expression signals. Curr. Genet. 25, 567-570. Transformanty selekcjonowano na pożywkach z higromycyną B i 0.1% Tritonem X-100.

Wśród transformantów poszukiwano tych, które w genomowym DNA zawierały 15 wintegrowany gen RER2 z S. cerevisiae. W tym celu z transformantów otrzymano DNA stosując zestaw odczynników „Wizard Genomic DNA purification kit” firmy Promega. Na matrycy DNA z transformantów, przy użyciu primerów RER2-U i RER2-L otrzymano fragmenty DNA, poddano je rozdziałowi na żelu agarozowym, odpowiednie prążki wycięto z żelu i poddano sekwencjonowaniu aby potwierdzić, że otrzym a6

PL 224 387 B1 ne DNA RER2 pochodzi z S. cerevisiae. Otrzymane transformanty oznaczone RER11/10, RER30/10 i RER32/10 użyto do dalszych badań.

Aby potwierdzić, że wintegrowane kopie genu RER2 ulegają ekspresji w T. atroviride otrzymano całkowite RNA z transformantów i metodą kropelkową Northern blotting stwierdzono obecność transkryptu RER2 u transformantów co dowodzi, że gen drożdżowy uległ ekspresji. Tak sprawdzone transformanty RER11/10, RER30/10 i RER32/10 użyto do dalszych badań.

Dokonana sposobem według wynalazku nadekspresja genu RER2 w T. atroviride spowodowała wzrost aktywności cis-prenylotransferazy kodowanej przez ten gen (fig. 1). Wzrost aktywności cis-prenylotransferazy zanotowano u wszystkich transformantów i wyniósł on 35, 93 i 30 odpowiednio dla RER11/10, RER30/10 i RER32/10.

Przykład II. Aby rozstrzygnąć, czy transformanty aktywniej rozkładają polisacharydy, co mogłoby świadczyć o tym, że wydzielają więcej lub bardziej aktywne enzymy hydrolityczne, transformanty poddano wstępnej analizie hodując je na płytkach z pożywką zawierającą karboksymetylocelulozę jako złożone źródło węgla. Zawiesinę konidiów poszczególnych transformantów i szczepu P1 posiano na środek płytki i każdego dnia mierzono przyrost grzybni. Wyniki pomiarów (fig. 2A) pokazują, że transformanty szybciej rosną czyli intensywniej hydrolizują karboksymetylocelulozę niż szczep kontrolny (nietransformowany) P1 co sugeruje, że wydzielają więcej hydrolaz lub wydzielane hydrolazy mają zwiększoną aktywność.

Zmierzono również halo powstałe wokół kolonii grzybów rosnących na płytce z karboksymetyl ocelulozą. Wielkość halo świadczy o hydrolizie substratu wkoło kolonii. Czym więcej hydrolaz wydziela grzyb tym większe halo wkoło kolonii (fig. 2B).

Przykład III. Aby sprawdzić czy transformanty wydzielają bardziej aktywne hydrolazy niż szczep wyjściowy, grzyby hodowano w pożywce minimalnej z laktozą, pobierano pożywkę co 24 godziny podczas trwania hodowli i oznaczano aktywność celulaz (fig. 3) i N-acetylo-3-D-glukozaminidazy (fig. 4). Stwierdzono, że celulazy i N-acetyl^-D-glukozaminidaza wydzielane przez transformanty wykazują wyższą aktywność niż te wydzielane przez szczep dziki P1. Zanotowano ponad dwukrotny wzrost aktywności celulaz w szczepie RER11/10 (o 125%) a najmniejszy wzrost w szczepie RER32/10 (o 75%). Aktywność N-acetylo-3-D-glukozaminidazy była wyższa w transformantach od 45 do 61% niż szczepie kontrolnym P1. Aktywność N-acetylo-3-D-glukozaminidazy obrazuje chitynolityczną aktywność wydzielanych białek. Szczepy Trichoderma o wysokiej aktywności chitynolitycznej mogą być stosowane jako bioinsektycydy przeciwko owadom niszczącym plony. Ponieważ zewnętrzny szkielet owadów (kutikula) jest zbudowany w dużej części z chityny hydroliza chityny może zwiększać sk uteczność działania bioinsektycydu.

Przykład IV. Zwiększenie aktywności biokontrolnej można uzyskać poprzez zwiększenie w ydzielania białek hydrolitycznych lub/i przez wydzielanie białek bardziej aktywnych. Aby określić czy transformanty wydzielają tylko aktywniejsze hydrolazy (Przykład III) czy również więcej białek niż szczep kontrolny P1 oznaczono również ilość białka wydzielanego przez transformanty podczas hodowli w pożywce płynnej. Wszystkie transformanty wydzielały więcej białek niż szczep kontrolny (fig. 5). Ponieważ dolichol produkowany przez cis-prenylotransferazę bierze udział w glikozylacjach, ale też wchodzi w skład błon komórkowych i pęcherzyków transportowych to wprowadzenie genu RER2, może prowadzić nie tylko do modyfikacji glikozylacji, ale też do modyfikacji wydajności transportu bi ałek, czy aktywności enzymów błonowych i innych aktywności w komórce zwiększając skuteczność uzyskanych szczepów.

Przykład V. Sprawdzono, jak metabolity wtórne i białka enzymatyczne wydzielane przez Trichoderma wpływają na wzrost grzybów patogennych. W tym celu Trichoderma była hodowana na płytkach pokrytych folią celulozową a następnie po zdjęciu folii na tych samych płytkach hodowano Pythium ultimum. Wzrost Pythium był poważnie zahamowany przez metabolity wydzielane przez wszystkie szczepy lecz dużo większe hamowanie obserwowano na płytkach, na których uprzednio rosły transformanty (fig. 6).

Przykład VI. Na koniec sprawdzono właściwości biokontrolne otrzymanych szczepów w stosunku do patogena roślin Pythium ultimum. Doświadczenie wykonano na fasoli Phaseolus vulgaris L. (var. nanus L). Sterylna ziemia była mieszana z grzybnią Pythium ultimum i z grzybnią Trichoderma po

2.g grzybni /1l ziemi. Do tak przygotowanej ziemi wsadzano nasiona fasoli. Po 10 dniach dokonano pomiaru wzrostu roślin (fig. 7) oraz zanotowano ile nasion wykiełkowało (fig. 8). Uzyskano nawet dwukrotnie wyższy procent wykiełkowanych nasion w ziemi skażonej patogenem kiedy nasiona były chronione przez transformanty Trichoderma RER11/10 i RER32/10 niż przez szczep P1 a szczep RER30

PL 224 387 B1 zwiększał ilość wykiełkowanych nasion o 42%. Podobnie wygląda ochronne działanie szczepów RER na wzrost roślin w ziemi zakażonej Pythium ultimum. Wszystkie szczepy według wynalazku powodują wyższy wzrost roślin a w obecności patogena Pythium ultimum wzrost ten jest równy wzrostowi roślin w ziemi jałowej. Wynik ten jest podobny do opisanego w zgłoszeniu P. 401450 jednak mechanizm działania szczepów według wynalazku jest inny. Uzyskane nowe szczepy mają zwiększoną aktywność cis-prenylotransferazy kodowanej przez gen RER2. Zwiększenie aktywności cis-prenylotransferazy w szczepach wg. wynalazku nie spowodowało znaczącego statystycznie wzrostu aktywności syntazy dwufosforanu farnezylu (fig. 9). Właśnie wzrost aktywności syntazy dwufosforany farnezylu kodowanej przez gen ERG20, który sięgnął od 155 do 218% aktywności kontrolnej charakteryzował szczepy według zgłoszenia P.401450. W szczepach wg wynalazku cis-prenylotransferaza w szlaku mewalonowym działa poniżej syntazy dwufosforanu farnezylu i zużywając substrat ogranicza jego ilość dla innych odnóg szlaku mewalonowego. Tak więc mechanizm działania szczepów wg wynalazku dotyczy tylko zwiększenia ilości produktów odnogi dolicholowej szlaku mewalonowego a nie wszystkich odnóg jak w zgłoszeniu P. 401450. W przypadku zgłoszenia P. 401450 oddziaływanie na odnogę dolicholową szlaku mewalonowego było ograniczone a aktywność cis-prenylotransferazy wzrosła tylko w jednym szczepie SGUL20/11 a wzrost wyniósł 26%. Pozostałe szczepy wykazały aktywność cis-prenylotransferazy podobną jak w kontroli P1 albo niższą o 29% (szczep SGUL104/11) 15 (fig. 10).

Podsumowując, wynalazek dostarcza nowe, alternatywne rozwiązanie szczepów biobójczych. Najbardziej spektakularną korzyścią jaką niesie wynalazek jest zwiększone wydzielanie białek hydrol itycznych, zwiększona aktywność celulaz, zwiększone wydzielanie metabolitów wtórnych osiągnięte u transformantów oraz znaczące podniesienie właściwości biokontrolnych transformowanych szczepów w porównaniu do kontroli P1, prowadzące do zwiększenia biomasy roślin chronionych, znaczącej poprawy kiełkowania nasion oraz większej skuteczności biobójczej uzyskanego szczepu. Jednocześnie uzyskanie lepszej ochrony roślin przy pomocy szczepów transformowanych nie wiąże się z żadnymi dodatkowymi kosztami związanymi z hodowlą grzyba ani też z żadnymi dodatkowymi manipulacjami.

Claims (15)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Zmutowany szczep Trichoderma atroviride zawierający wprowadzoną rekombinowaną cząsteczkę DNA obejmującą gen RER2 kodujący cis-prenylotransferazę.
2. 2. Szczep Trichoderma atroviride według zastrz. 1, znamienny tym, że gen kodujący cis-prenylotransferazę pochodzi z Saccharomyces cerevisiae.
3. 3. Szczep Trichoderma atroviride według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że gen kodujący koduje cis-prenylotransferazę o sekwencji nukleotydowej nr 2.
4. 4. Szczep Trichoderma atroviride według zastrz. 3, znamienny tym, że sekwencja aminokwasowa kodowana przez sekwencję nukleotydową nr 1 ma co najmniej 75%, co najmniej 80%, co najmniej 85%, co najmniej 90%, co najmniej 95%, lub 100% identyczności z sekwencją nr 2.
5. 5. Szczep Trichoderma atroviride według zastrz. 4, znamienny tym, że gen RER2 z S. cerevisiae jest zintegrowany z genomem Trichoderma atroviride.
6. 6. Szczep Trichoderma atroviride według zastrz. 5, znamienny tym, że gen RER2 jest zintegrowany z genomem i szczep wykazuje nadekspresję tego enzymu.
7. 7. Sposób otrzymywania szczepu transgenicznego Trichoderma atroviride określonego w dowolnym z zastrz. 1-6, znamienny tym, że transformuje się szczep Trichoderma atroviride wyodrębnioną cząsteczką DNA kodującą cis-prenylotransferazę i uzyskuje się nadekspresję cis-prenylotransferazy w otrzymanym szczepie transgenicznym.
8. 8. Sposób wytwarzania szczepu Trichoderma atroviride według zastrz. 7, znamienny tym, że prowadzi się do integracji rekombinowanego DNA kodującego cis-prenylotransferazę z genomem Trichoderma.
9. 9. Sposób zwalczania niepożądanych organizmów, znamienny tym, że stosuje się szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego cis-prenylotransferazę.
10. 10. Sposób według zastrz. 9, znamienny tym, że stosuje się szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja heterologicznego DNA kodującego cis-prenylotransferazę z Saccharomyces cerevisiae.

    PL 224 387 B1
11. 11. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że zwalcza się choroby grzybowe roślin i plonów.
12. 12. Sposób według zastrz. 9 albo 10, znamienny tym, że zwalcza się Pythium ultimum.
13. 13. Sposób zwiększania wzrostu rośliny i/lub wydajności plonów, znamienny tym, że stosuje się szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego cis-prenylotransferazę.
14. 14. Kompozycja biobójcza, znamienna tym, że zawiera szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego cis-prenylotransferazę.
15. 15. Kompozycja do zwiększania plonów, znamienna tym, że zawiera szczep Trichoderma atroviride określony w dowolnym z zastrz. 1-6, w którym występuje nadekspresja DNA kodującego cis-prenylotransferazę.