PL224877B1 - Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda.

Stan zdrowia ryb zależy od wielu czynników zarówno fizjologicznych, jak i środowiskowych. Wśród nich ważną rolę odgrywa mikroflora przewodu pokarmowego. Jej źródłem jest całe środowisko wodne. Bytujące w nim mikroorganizmy, wśród których zwykle dominują bakterie Yibrio, Aeromonas, Flavobacterium, Corynebacterium, Micrococcus, Pseudomonas i Clostridium, już w kilka godzin po rozpoczęciu przez larwy aktywnego pobierania pokarmu zasiedlają ich jeszcze nie w pełni wykształcony przewód pokarmowy. Następnie kolonizują go również bakterie fermentacji mlekowej. W przewodzie pokarmowym, zarówno narybku jak i dorosłych ryb morskich zwykle występują one w niewielkich ilościach. U wielu gatunków ryb słodkowodnych, a zwłaszcza pstrąga tęczowego, troci wędrownej oraz ryb karpiowatych, okoniowatych, jesiotrowatych i szczupakowatych są one natomiast dominującą grupą drobnoustrojów. Największy udział w populacji bakterii fermentacji mlekowej kolonizujących przewód pokarmowy ryb słodkowodnych mają bakterie z rodzaju Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus i Pediococcus. Naturalnymi i zwykle w pełni bezpiecznymi komponentami ekosystemu jelitowego wielu ryb słodkowodnych są także bakterie z rodzaju Carnobacterium. W przewodzie pokarmowym wolno żyjących troci wędrownych i pstrągów tęczowych reprezentowane są one przez takie gatunki jak: C. divergens, C. gallinarum, C. funditum, C. mobille i C. piscicola.

Bakterie Carnobacterium są katalazo-negatywnymi, gram-dodatnimi, nie tworzącymi spor, względnie beztlenowymi pałeczkami, blisko spokrewnionymi z bakteriami Lactobacillus. Są niezdolne do wzrostu na agarze octowym, zawierają kwas mesodiaminopimelinowy w ścianie komórkowej, hydrolizują argininę do cytruliny oraz w odróżnieniu od wielu innych LAB rosną nawet w temperaturze 4°C. Nie rozwijają się natomiast w temperaturze wyższej niż 45°C. Do prawidłowego wzrostu wymagają diety bogatej w węglowodany, aminokwasy, peptydy, kwasy tłuszczowe oraz witaminy. Carnobacterium, podobnie jak i inne bakterie fermentacji mlekowej, są zdolne do wytwarzania kwasu mlekowego, który obniża pH jelit i w konsekwencji tego hamuje wzrost wielu drobnoustrojów, m. in. chorobotwórczych dla ryb. Istotną rolę w hamowaniu wzrostu drobnoustrojów chorobotwórczych dla ryb odgrywają również inne metabolity bakterii Carnobacterium tj., nadtlenek wodoru, aldehyd octowy i bakteriocyny. Spośród wymienionych związków szczególnie silną aktywność przeciwdrobnoustrojową mają bakteriocyny. Związki te pod wieloma względami przypominają antybiotyki. W odróżnieniu od nich są jednak całkowicie bezpieczne dla człowieka i zwierząt oraz nie inicjują powstawania form opornych drobnoustrojów. Z uwagi na dużą specyficzność działania bakteriocyny nie zakłócają naturalnej równowagi ekosystemu jelitowego. Większość bakteriocyn posiada bowiem wąski zakres aktywności i działa jedynie na kilka grup drobnoustrojów. Takiej wybiórczości działania nie wykazują antybiotyki.

Zdolność syntezy bakteriocyn aktywnych względem drobnoustrojów patogennych dla ryb mają jednak tylko niektóre szczepy bakterii Carnobacterium. Podkreślić należy, że właściwości probiotyczne są rzadkie i szczepo-specyficzne. Znane są od lat efekty probiotyczne mikroorganizmów, ale do produkcji probiotyków mogą być użyte tylko wyselekcjonowane i sprawdzone pod względem działania szczepy. Oznacza to, że w danym gatunku bakterii tylko nieliczne szczepy wyróżniają się aktywnością probiotyczną.

Woda jest idealnym środowiskiem dla rozwoju drobnoustrojów. Rozmnażaniu się mikroorganizmów sprzyja skażenie wody resztkami pasz i kału rybiego. Mikroorganizmy unoszące się w wodzie są pobierane przez ryby i łatwo przenikają do ich układu pokarmowego. Wśród mikroorganizmów wodnych często występują drobnoustroje chorobotwórcze. Drobnoustroje te za pośrednictwem wody, zwłaszcza silnie zanieczyszczonej wnikają do układu pokarmowego ryb i stają się przyczyną poważnych chorób ryb, często o wysokiej śmiertelności. Jak dotąd walka z patogenami rybimi polegała na traktowaniu ryb antybiotykami (erytromycyną, josamycyną, spiramycyną, tetracyklinami i gentamycyną). Terapia antybiotykowa jest jednak kosztowna i niekorzystna dla środowiska. Alternatywą dla leczenia ryb antybiotykami jest stosowanie probiotyków. W odróżnieniu od antybiotyków, ich działanie może mieć charakter zarówno leczniczy, jak prewencyjny, co ze względów praktycznych jest dużo korzystniejsze.

W chowie organizmów wodnych (ryby, mięczaki, stawonogi) preparaty probiotyczne są stosowane od kilkunastu lat, w celu modyfikowania jakości wody, jako środowiska ich życia oraz wprowadzania pożytecznej mikroflory do ich przewodu pokarmowego. Współczesna koncepcja probiotyków została opracowana 35 lat temu przez Parkera, który probiotyki zdefiniował jako organizmy lub

PL 224 877 B1 substancje, przyczyniające się do zachowania równowagi mikrobiologicznej w przewodzie pokarmowym. Rozwój badań nad zastosowaniem probiotyków w żywieniu organizmów wodnych, w tym ró wnież ryb, jest bezpośrednią konsekwencją poszukiwania alternatywy dla wycofanych z przemysłu paszowego antybiotykowych stymulatorów wzrostu. Działanie wielu probiotyków jest zbliżone do efektów stosowania antybiotyków paszowych. Zarówno probiotyki jak i antybiotyki, mogą być wykorzystywane jako narzędzia regulacji liczebności bakterii patogennych. Probiotyki, w odróżnieniu do antybiotyków nie niszczą jednak natywnej mikroflory przewodu pokarmowego organizmów wodnych a tylko ją stabilizują.

W ostatnich latach w wytwarzaniu pasz stosuje się coraz szerszą paletę dodatków paszowych - substancji lub związków, których zadaniem jest uzyskiwanie jak najlepszych efektów pro dukcyjnych w chowie zwierząt. Zastosowanie każdego z dodatków paszowych musi uwzględniać bezpieczeństwo zdrowia ludzi (konsumentów), zdrowia zwierząt i ich dobrostanu, a także wpływ na środowisko. Przyjęty schemat procedury autoryzacji probiotyków w akwakulturze obejmuje badania in vitro dotyczące: wytwarzania substancji hamujących, konkurencji o składniki pokarmowe, czynników oporności i zdo lności do adhezji oraz badania in vivo pod kątem zdolności do kolonizacji przewodu pokarmowego i ewentualnych zmian histopatologicznych.

Kolejny etap badań obejmuje przeprowadzenie eksperymentalnych pasaży przeciwko szczepom patogennym, które ostatecznie decydują o potwierdzeniu właściwości probiotycznych. Probiotyk otrzymany według powyższego schematu przed wprowadzeniem do obrotu musi zostać oficjalnie zarejestrowany, a dodatkowo podmiot ubiegający się o zarejestrowanie przeprowadza analizę opłacalności wytwarzania probiotyku w skali komercyjnej.

Szczepy probiotyczne wykazują różne mechanizmy działania na swego gospodarza - działają antagonistycznie wobec patogenów, zasiedlają powierzchnie przewodu pokarmowego, zwiększają oporność ryb na choroby, zwiększają efektywność trawienia składników pokarmowych i aktywują układ odpornościowy zwierząt.

Wymienione efekty działania drobnoustrojów probiotycznych są tylko częścią potwierdzonych doświadczalnie ich pozytywnych właściwości. Większość komercyjnych preparatów probiotycznych dla ryb opiera się na wykorzystaniu bakterii z rodzaju Bacillus, Pseudomonas, Yibrio oraz Lactobacillus.

Szczep Carnobacterium divergens S1 będący aktywnym składnikiem probiotyku według wynalazku jest przedmiotem zgłoszenia patentowego P.369984 (opubl. 20-03-2006). Zgodnie z wymogami traktatu budapesztańskiego dotyczącego procedur patentowych został on zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p.

Bakterie C. divergens należą do mikroflory naturalnie występującej w przewodzie pokarmowym ryb. Szczep C. divergens S1 jest także składnikiem ekosystemu jelitowego ryb. Został on wyizolowany z przewodu pokarmowego łososia morskiego. Szczegółową charakterystykę gatunku Carnobacterium divergens przedstawił Holzapfel i Gerber (1984) oraz Collins i wsp. (1987). Taksonomiczna linia tego gatunku wywodzi się z klasy Bacilli, rzędu Lactobacillales, rodziny Carnobacteriacae i rodzaju Carnobacterium.

Ważną cechą szczepu C. divergens S1 jest zdolność syntezy bakteriocyny - diwercyny, która działa bakteriobójczo na chorobotwórcze dla człowieka Listeria monocytogenes, Enterococcus fecalis i Clostidium. Nieoczekiwanie stwierdzono, że szczep C. divergens SI wykazuje również aktywność antagonistyczną wobec chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Yibrio angillarum i Edwardsiella tarda. Aktywność przeciwdrobnoustrojowa jest określana w testach biologicznych, a jej miarą są jednostki aktywności wyrażające odwrotność najniższego stężenia substancji przeciwdrobnoustrojowych działających antagonistycznie na rozwój organizmów patogennych.

W fermowym chowie ryb słodkowodnych to właśnie wymienione bakterie są główną przyczyną śmiertelności narybku. Odkrycie to legło u podstaw niniejszego wynalazku i zostało wykorzystane do opracowania na bazie szczepu C. divergens S1 nowego probiotyku. Bakterie, będące aktywnym składnikiem probiotyku według wynalazku w przewodzie pokarmowym ryb słodkowodnych efektywnie wytwarzają kwas mlekowy i bakteriocynopodobne pozakomórkowe metabolity, które wyraźnie ograniczają rozwój bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum i Edwardsiella tarda. W konsekwencji tego probiotyk według wynalazku zwiększa przeżywalność narybku oraz odporność młodocianych ryb na infekcje bakteryjne, ograniczając tym samym poważne straty jakie następują w obsadach ryb, zwłaszcza w pierwszym roku hodowli. Stosowanie probiotyku według wynalazku wpływa także pozytywnie na efekty produkcyjne chowu ryb: zwiększa dzienne przyrosty masy ciała, poprawia współczynnik wydajności wzrostowej białka oraz obniża współczynnik pokarmowy. Odnotowane korzyści są następstwem kolonizacji jelit przez bakterie C. divergens S1 i/lub efektem

PL 224 877 B1 działania przeciwdrobnoustrojowego metabolitów tych bakterii. Probiotyk według wynalazku, może być więc stosowany do ochrony ryb słodkowodnych, zwłaszcza narybku przed bakteriami chorobotwórczymi, zwiększenia ich przeżywalności, poprawy tempa wzrostu oraz wykorzystania pasz. Probiotyk zawierający C. divergens S1 i/lub ich metabolity może być podawany rybom jako samodzielny preparat. Preparat ten może być wprowadzany bezpośrednio do wody. Może być on również składnikiem pasz, suplementów paszowych i/lub premiksów. Działanie prozdrowotne mają również martwe komórki C. divergens S1, które w tym przypadku mogą być traktowane jako naturalny nośnik substancji przeciwdrobnoustrojowych. Substancje te redukują w ekosystemie jelitowym ryb słodkowodnych liczebność chorobotwórczych dla nich bakterii.

W specjalistycznej literaturze naukowej wymienia się gatunek C. divergens jako składnik probiotyków dla ryb morskich, głównie łososia atlantyckiego, pstrąga tęczowego i dorsza. Na podstawie wyników testów żywieniowych wskazuje się, że dodatek C. divergens do stałej paszy, wyprodukowanej na bazie odpadów rybich z dorsza, redukuje śmiertelność narybku dorsza. Efekt ten jest następstwem działania probiotyku na chorobotwórcze bakterie Vibrio anguillarum.

W literaturze krajowej wyniki badań nad wpływem dodatku bakterii Carnobacterium divergens do pasz dla karpia opisali badacze z Uniwersytetu Przyrodniczego w Poznaniu (Mazurkiewicz i wsp. 2007). Zastosowali oni jednak szczepy bakterii C. divergens, które nie miały właściwości probiotycznych, a co za tym idzie nie wykazywały prozdrowotnego działania. Ta sama grupa badawcza testowała również działanie komercyjnego preparatu Biosaf i wykazała, że karpie, którym podawano ten probiotyk miały większe przyrosty masy ciała (Przybył i wsp. 2006). Jak dotąd w literaturze światowej brak jest innych opisów dotyczących produkcji i stosowania w hodowli ryb słodkowodnych probiotyków zawierających Carnobacterium divergens. Istnieje natomiast kilka opisów patentowych dotyczących wykorzystania innych mikroorganizmów jako składników probiotyków przeznaczonych dla ryb.

W patencie US 7,708,988 przedstawiono kompozycję probiotyczną oraz opisano jej terapeutyczne zastosowanie. Kompozycja probiotyczna według tego patentu zawierała w swoim składzie bakterie Bacillus coagulans i/lub inne bakterie fermentacji mlekowej i była przeznaczona do zwalczania patogenów jelitowych. Zastrzeżono, że składniki mikrobiologiczne, mogą być stosowane jako niezależne preparaty lub w połączeniu z antybiotykami, składnikami fungistatycznymi, anty-drożdżowymi i anty-wirusowymi. Osobnymi zastrzeżeniami objęto także doskonalenie genetyczne posiadanych szczepów bakteryjnych i poszukiwanie nowych szczepów.

Probiotykowi o działaniu prozdrowotnym na ryby jest poświęcony także patent US 6,878,373. Wynalazek ten odnosi się do nowej formuły probiotycznej dla ochrony ryb przed patogenami z rodzaju Vibrio, Pseudomonas, Streptococcus i Aeromonas. Opisuje on metodę kontroli rozwoju bakterii patogennych oraz ograniczania śmiertelności ryb zarówno słodkowodnych, jak i morskich. Zastrzega on ponadto stosowanie opracowanej formuły probiotycznej w celu poprawy stanu higienicznego wody w zbiornikach hodowlanych.

W hiszpańskim patencie 2 216 704 do otrzymania probiotyków zastosowano nowy szczep bakteryjny Roseobacter PP-154. Stosowanie probiotyku na jego bazie zmniejszyło śmiertelność narybku ryb, a także małż i krewetek. W patencie zastrzeżono szczep oraz sposób jego wykorzystania do pr odukcji preparatu bakteryjnego. Zastrzeżono, że preparat jest przeznaczony dla ferm morskich i ma postać liofilizatu, a jego działanie jest konsekwencją aktywności wobec bakterii chorobotwórczych z rodzaju Vibrio, Tenacibaculum maritimum, Photobacterium damsela i Pseudomonas anguilliseptica.

W celu kontroli ilości patogenów w przewodzie pokarmowym ryb zastosowano także bakterie Bacillus coagulans. Rozwiązanie to jest opisane w patencie US 7,708,988. Dotyczy ono wykorzystania jednego lub więcej szczepów Bacillus coagulans. Szczepy te wykazują działanie terapeutyczne. Kolonizują przewód pokarmowy ryb i hamują w nim wzrost mikroorganizmów chorobotwórczych, m. in. patogenów opornych na antybiotyki. Patent ten obejmuje również przeciwdrobnoustrojowe związki wytwarzane przez Bacillus coagulans. W ramach niego zastrzeżono także selektywne ulepszanie i izolację bakterii probiotycznych wytwarzających kwas mlekowy oraz przeciwdrobnoustrojowe metabolity.

Jako probiotyk zastosowano także szczep Bacillus subtilis VKM B2287 wykazujący zdolność oddziaływania na chorobotwórcze bakterie Staphylococcus, Escherichia coli, Enterobacteria, Citrobacteria i Aeromonas. Zastosowanie to opisano w patencie RU2246537. Na bazie szczepu B. subtilis VKM B2287 opracowano profilaktyczny preparat dla zwierząt hodowlanych, drobiu i ryb o nazwie Subtilis+.

W patencie RU 2 223 643 C2 opisano z kolei inny probiotyczny szczep Bacillus subtilis VKM V2250 D. Szczep ten wprowadzano do ikry, do młodych larw oraz do paszy dla narybku. Dzięki temu uzyskano lepszą przeżywalność narybku i większą odporność młodych ryb.

PL 224 877 B1

W kolejnym patencie RU 2186576 C2, jako aktywny szczep wykorzystano modyfikowane genetycznie bakterie Bacillus subtilis VKPM V-4759. Do bakterii tych wklonowano gen kodujący alfa-interferon. Preparat (o nazwie subaline) zawierający tak udoskonalone bakterie podawano rybom wraz z paszą przez 5 dni w dawce 700 bilionów spor na 1 tonę paszy. Dzięki temu poprawiono wygląd skóry i skrzeli ryb, ustabilizowano funkcjonowanie ich przewodu pokarmowego i zredukowano zagrożenie ze strony bakterii patogennych.

Kolejnym probiotykiem opartym na bakteriach z gatunku Bacillus subtilis jest preparat opisany w patencie RU 2 376 755. Do jego opracowania wykorzystano szczep B. subtilis B-1895. Szczep ten dodawano do wysoko białkowej paszy w ilości 0,05-0,15%, którą następnie wykorzystywano w żywieniu ryb.

W patencie amerykańskim US 6,797,266 zastosowano natomiast probiotyczny szczep Lactobacillus casei strain KE01. Preparat na jego bazie ograniczał wzrost enteropatogennych bakterii Escherichia coli, Salmonella enetriditis, Yersinia i Listeria monocytogenes. W zastrzeżeniach patentowych podano skład tego preparatu oraz jego przeznaczenie, które obejmowało zwierzęta hodowlane, ptactwo i ryby.

Jedną z form oddziaływania na zdrowie ryb jest też zasilanie wody w zbiornikach hodowlanych w wybrane grupy mikroorganizmów. Aplikację taką opisano w patencie US7736509. Dokładniej, zastrzeżono rozwiązanie polegające na wprowadzaniu do wody probiotycznych bakterii, drożdży, grzybów, dafni, mikroalg, które z jednej strony stanowiły pokarm dla ryb, a z drugiej strony wytrącały zawiesiny zawierające fosforany. Opisy korzystnego wpływu probiotyków na ryby można także znaleźć w literaturze naukowej. Przykładowo, podanie rybom Epinephelus gigas (ang. grouper, poi. granik wielki - ryba z rodzaju Epinephelus) paszy zawierającej probiotyczny szczep drożdży Saccharomyces cerevisiae P13 w ilości 10⁷ jtk/kg, zwiększyło dzienne przyrosty masy, poprawiło wykorzystanie paszy, pobudziło ich system immunologiczny i zwiększyło odporność (Chiu i wsp. 2010). Podobne zmiany zaobserwowano także po podaniu tej samej rybie paszy zawierającej probiotyczny szczep bakterii Lactobacillus plantarum 7-40 (Son i wsp. 2009). W literaturze naukowej opisano także efekty żywienia karpi paszą z dodatkiem szczepu Lactobacillus acidophilus LAD oraz drożdży browarnianych Saccharomyces cerevisiae SCD. Uzyskano zwiększenie wzrostu narybku i polepszenie składu mikroflory jelitowej (Dhanaraj i wsp. 2010).

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolity zdeponowane w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, w ilości co najmniej 10⁶ komórek bakterii C. divergens S1 , najkorzystniej powyżej 10⁸, korzystnie w formie żywej lub martwej i w ilości takiej, że w 1 gramie suchej masy ich ilość przekracza 100 jednostek aktywności przeciwdrobnoustroj owych metabolitów bakterii C. divergens SI, korzystnie umieszcza się na nośniku jakim jest piasek i/albo żwir i/albo nośniki organiczne zmieszane ze składnikami paszowymi i/lub pełnoporcjowe mieszanki paszowe lub premiksy, a biomasa jest korzystnie utrwalona metodą suszenia lub zamrażania.

Uzyskany probiotyk jest stosowany, jako środek profilaktyczny, leczniczy lub stymulujący wzrost ryb słodkowodnych, szczególnie narybku karpia, pstrąga tęczowego, suma europejskiego i ryb jesiotrowatych oraz mięczaków i skorupiaków, szczególnie słodkowodnych małż i raków.

Przy czym uzyskany probiotyk można zastosować do obróbki ikry, albo wprowadza się go do basenów hodowlanych, gdzie poprawia stan sanitarny wody.

Korzystnie gdy probiotyk ma postać wybraną spośród: zawiesiny, granulatu, proszku, postać otoczkowaną, żelu, pasty, albo emulsji.

Probiotyk ogranicza aktywność, wzrost lub przeżywalność chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella tarda, Listeria monocytogenes i niektórych Clostridium sp.

Probiotyk według wynalazku stosuje się jako środek chroniący przed zakażeniem, środek leczniczy lub stymulujący wzrost ryb słodkowodnych, szczególnie narybku karpia, pstrąga tęczowego, suma europejskiego i ryb jesiotrowatych oraz mięczaków i skorupiaków, szczególnie słodkowodnych małż i raków.

Probiotyk zwiększa przeżywalność narybku oraz juwenilnych form ryb poprzez zwiększanie odporności na infekcje bakteryjne juwenilnych form ryb oraz mięczaków i skorupiaków, przy czym poprawiają się wyniki podchowu ryb oraz wykorzystanie paszy.

PL 224 877 B1

Probiotyk obok komórek szczepu bakterii C. divergens S1 i/lub ich metabolitów, zawiera inne dopuszczalne składniki, zwłaszcza nośniki lub substancje aktywne biologicznie.

Przy czym w pierwszym korzystnym przykładzie wykonania do sterylnej pożywki ciekłej, umieszczonej w bioreaktorze, wprowadza się inoculum bakterii Carnobacterium divergens SI w ilości 2x10⁶ jtk/ml. Proces hodowli bakterii prowadzi się w temp. 36°C przy pH 7,0 utrzymywanym na stałym poziomie przy pomocy NaOH, z łagodnym mieszaniem pożywki. Hodowlę prowadzi się przez 20 godzin. Następnie separuje się komórki bakteryjne poprzez ich odwirowanie przy 5.000 obr/min przez 15 minut. Zawiesinę komórek wprowadza się do roztworu zawierającego zagęszczoną pożywkę h odowlaną, pozbawioną soli mineralnych, o ciśnieniu osmotycznym na poziomie 1500 mOsm/kg, którą następnie inkubuje się przez 45 minut przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 28°C, celem zwiększenia przeżywalności komórek w czasie suszenia. Następnie komórki odwirowuje się i inkubuje w roztworze, do którego dodaje się maltodekstrynę, białko mleka, kwas askorbinowy i dwutlenek krzemu. Całość miesza się i suszy w suszami rozpyłowej otrzymując preparat probiotyczny w formie sproszkowanej i otoczkowanej, zawierający 10⁸ jtk/g. Preparat ten wprowadza się do paszy wykonanej metodą prasowania wysokociśnieniowego w takiej ilości, aby w 1 gramie finalnej paszy liczebność probiotycznych bakterii wynosiła 10⁶ jtk. Probiotyczną paszą karmi się narybek karpia Cyprinus carpio. W testach klinicznych i hodowlanych stwierdzono, że przeżywalność karpi w wodzie skażonej Aeromonas hydrophila i Vibrio angillarum wzrosła o 80%, a dzienne przyrosty były większe o 18%.

W drugim korzystnym przykładzie wykonania szczep bakterii Carnobacterium divergens S1 wprowadza się do pożywki zawierającej sacharozę, hydrolizat mąki kukurydzianej, pepton kazeinowy, ekstrakt drożdżowy i zestaw soli mineralnych w ilości 10⁴ jtk/ml. Przy czym uprzednio pożywkę sterylizuje się w bioreaktorze w 121°C przez 15 min i schładza do 30°C. Proces hodowli bakterii prowadzi się w temp. 30°C przy pH 6,7, utrzymywanym przy pomocy Ca(OH)₂, przy łagodnym mieszaniu pożywki. Hodowlę prowadzono przez 18 godzin. Następnie prowadzi się separację komórek bakteryjnych przy użyciu mikrofiltra membranowego o porowatości 0,45 pm metodą filtracji krzyżowej. Zawiesinę komórek miesza się z czynnikami krioochronnymi i suszy metodą liofilizacji. W wyniku suszenia otrzymuje się preparat probiotyczny w formie sproszkowanej, zawierający 3x10⁹ jtk/g. Preparat ten wprowadza się do mieszanki paszowej w takiej ilości, aby w gotowej paszy liczebność probiotycznych bakterii wynosiła 7x10⁸ jtk/g. Paszę prasuje się wysokociśnieniowo, a po wysuszeniu granulat pokrywa się filmem hydrofobowym składającym się z mieszaniny olejów: rybnego i rzepakowego w proporcji 50:50. Tak przygotowaną paszą probiotyczną karmi się narybek pstrąga tęczowego Oncorchynhus mykiss. W testach klinicznych i hodowlanych stwierdzono, że przeżywalność pstrągów w wodzie skażonej bakteriami Aeromonas salmonicide, Edwardsiella tarda i Vibrio angillarum wzrosła o 60%, a dzienne przyrosty narybku były większe o 15%.

W trzecim korzystnym przykładzie wykonania szczep bakterii Carnobacterium divergens S1 wprowadza się do sterylnej pożywki A MRS wzbogaconej w hydrolizat enzymatyczny mąki żytniej w ilości 10⁶ jtk/ml. Pożywkę uprzednio sterylizuje się przez filtrację w mikrofiltrze membranowym o porowatości 0,45 pm i wprowadza się ją do bioreaktora wysterylizowanego parą wodną. Proces hodowli bakterii prowadzi się w temp. 30°C przy pH 7,0 z korektą pH przy pomocy NaOH, przy łagodnym mieszaniu pożywki. Hodowlę prowadzi się przez 15 godzin, po czym kulturę bakteryjną razem z odfermentowaną pożywką zagęszcza się na mikrofiltrze membranowym redukując objętość o 60% w stosunku do objętości początkowej. Uzyskana gęstwa bakteryjna zawiera 7x10⁹ komórek/ml. Następnie gęstwę komórkową razem z odfermentowaną pożywką natryskuje się na wysuszoną paszę granulowaną w proporcji gęstwy komórkowej do suchej paszy, jak 1:5. Po dokładnym wymieszaniu paszę dosusza się metodą konwekcyjną powietrzem o temperaturze nieprzekraczającej 50°C, po czym granulat natłuszcza się olejem rybnym w ilości 2% masy paszy w procesie natłuszczania ciśnieniowego. Analiza wykazała, że tak przygotowana pasza zawierała 8x10⁶ jtk/g oraz miała aktywność przeciwko patogennym bakteriom Aeromonas hydrophila na poziomie 150 jednostek aktywności/g. Gotową paszą karmi się narybek sterleta Acipenser ruthenus i jesiotra syberyjskiego Acipenser baeri. W testach klinicznych i hodowlanych stwierdzono, że w wyniku podawania paszy probiotycznej zwiększyła się przeżywalność narybku oraz poprawiło wykorzystanie paszy.

W czwartym korzystnym przykładzie wykonania wysterylizowaną pożywkę zawierającą sacharydy, aminokwasy, peptony, ekstrakt drożdżowy i sole mineralne szczepi się kulturą Carnobacterium dirergens S1 w ilości 4x10⁶ jtk/ml i hoduje się przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 32°C przez 18 godzin, korygując pH pożywki za pomocą węglanu wapnia (sproszkowanej kredy). Po zakończeniu hodowli całą pożywkę wraz z bakteriami zagęszcza się przez mikrofiltrację membranową, dodaje się

PL 224 877 B1 mączkę rybną, rozdrobnioną śrutę sojową, rozdrobnioną śrutę rzepakową, mąkę pszenną, zestaw witamin i kwas askorbinowy, a następnie całość dokładnie miesza się w mieszalniku kubicznym. Tak przygotowany roztwór poddaje się suszeniu w suszarni fluidyzacyjnej wyposażonej w granulator. W ten sposób uzyskuje się granulowany preparat zawierający 2,3x10⁷ komórek/g, który bezpośrednio podaje się narybkowi jesiotra rosyjskiego Acipenser gueldenstaedti. W wyniku jego stosowania zwiększono przeżywalność narybku oraz przyspieszono wzrost ryb.

W piątym korzystnym przykładzie wykonania w sterylnej pożywce ciekłej hoduje się probiotyczny szczep bakterii Carnobacterium divergens S1. Pod koniec logarytmicznej fazy wzrostu pożywkę poddaje się wirowaniu przy 6.000 obr/min przez 15 minut i uzyskuje się pastę bakteryjną zawierającą 10⁹ bakterii/g. Pastę tę przechowuje się w chłodni w 4°C przez trzy dni, po czym sporządza się zawiesinę komórkową i miesza się ją z zapłodnioną i pozbawioną kleistości ikrą szczupaka Esox lucius w takiej ilości aby mieszanina z ikrą zawierała 3x10⁸ jtk/ml. Pastę bakteryjną miesza się z ikrą szczupaka także w trakcie jej inkubacji w odstępach dwudniowych. W wyniku tego działania wykazano, że ilość żywego wylęgu pozyskanego tą metodą w stosunku do wylęgu pozyskanego z ikry nieobrabianej bakteriami była istotnie większa.

W szóstym przykładzie wykonania w sterylnej pożywce ciekłej hoduje się probiotyczny szczep bakterii Carnobacterium divergens S1, a po zakończeniu hodowli, po upływie 24 godzin, komórki wiruje się przy 4.000 obr/min przez 10 minut i uzyskaną gęstwę komórkową miesza się z piaskiem i żwirem. Po upływie 6 godzin piasek i żwir z zaadsorbowanymi bakteriami umieszcza się na dnie zbiornika hodowlanego dla dwóch gatunków małży: szczeżui pospolitej Anodonta anatina i szczeżui spłaszczonej Pseudoanodonta complananta. W testach klinicznych i hodowlanych stwierdzono, że w wyniku takiego działania zwiększyła się przeżywalność małży słodkowodnych.

W siódmym korzystnym przykładzie wykonania w sterylnej pożywce ciekłej hoduje się probiotyczny szczep bakterii Carnobacterium divergens S1, a po zakończeniu hodowli, po upływie 24 godzin, komórki wiruje się przy 4.000 obr/min przez 10 minut i uzyskaną gęstwę komórkową wprowadza się bezpośrednio do wody. W testach klinicznych i hodowlanych stwierdzono, że w zbiorniku hodowlanym znacznie poprawił się stan sanitarny wody.

Większość probiotyków opisanych w literaturze oraz będących przedmiotem zgłoszeń patentowych jest przeznaczonych dla ryb morskich. Hodowla ryb słodkowodnych z uwagi na ograniczoną objętość zbiorników wodnych jest natomiast dużo trudniejsza. Wiąże się ona z wieloma problemami natury sanitarno-higienicznej. Duże skażenie zbiorników hodowlanych mikroorganizmami patogennymi powoduje znaczne straty, szczególnie w narybku, który jest wyjątkowo wrażliwy, oraz doda tkowo spowalnia wzrost ryb. Te niekorzystne zjawiska mogą być wyeliminowa ne lub ograniczone poprzez stosowanie preparatów probiotycznych.

Niniejszy wynalazek ma więc głębokie uzasadnienie praktyczne. Wpisuje się on w pełni w strategię poprawy efektywności chowu, zdrowotności i dobrostanu ryb.

Probiotyk o składzie według wynalazku może być wprowadzany bezpośrednio lub za pośrednictwem różnych nośników do pasz dla ryb i do wody i spełnia wszystkie kryteria stawiane preparatom bakteryjnym:

- jest zdolny do natychmiastowej inplantacji w przewodzie pokarmowym,

- kolonizuje przewód pokarmowy poprzez zasiedlanie kosmków jelitowych i ścian przewodu pokarmowego lub może być zdolny do wzrostu bezpośrednio w treści pokarmowej,

- konkuruje z bakteriami patogennymi i syntetyzuje substancje antagonistyczne - bakteriocyny,

- utrzymuje pH w przewodzie pokarmowym na optymalnym poziomie,

- jest odporny na podwyższoną temperaturę stosowaną w technologii produkcji pasz.

Wynalazek opisany jest szczegółowo w poniższych przykładach, które jednak nie wyczerpują wszystkich jego możliwości realizacyjnych.

Przykła d 1

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, w ilości 10⁸ jtk/g, wprowadza się do sterylnej pożywki ciekłej umieszczonej w bioreaktorze, wprowadzono inoculum bakterii Carnobacterium divergens S1 w ilości 2x10⁶ jtk/ml. Proces hodowli bakterii przebiegał w temp. 36°C przy pH 7,0 utrzymywanym na

PL 224 877 B1 stałym poziomie przy pomocy NaOH, z łagodnym mieszaniem pożywki. Hodowlę prowadzono przez 20 godzin. Następnie przeprowadzono separację komórek bakteryjnych poprzez ich odwirowanie przy 5.000 obr/min przez 15 minut. Zawiesinę komórek wprowadzono do roztworu zawierającego zagęszczoną pożywkę hodowlaną, pozbawioną soli mineralnych, o ciśnieniu osmotycznym na poziomie 1500 mOsm/kg, którą następnie inkubowano przez 45 minut przy łagodnym mieszaniu w temperaturze 28°C, celem zwiększenia przeżywalności komórek w czasie suszenia. Następnie komórki odwirowano i inkubowano w roztworze, do którego dodano maltodekstrynę, białko mleka, kwas askorbinowy i dwutlenek krzemu. Całość dobrze wymieszano i wysuszono w suszarni rozpyłowej. W wyniku suszenia otrzymano preparat probiotyczny w formie sproszkowanej i otoczkowanej, zawierający 10⁸ jtk/g. Preparat ten wprowadzono do paszy wykonanej metodą prasowania wysokociśnieniowego w takiej ilości, aby w 1 gramie finalnej paszy liczebność probiotycznych bakterii wynosiła 10⁶ jtk. Probiotyczną paszą stymulującą wzrost ryb słodkowodnych karmiono narybek karpia Cyprinus carpio. Stwierdzono, że przeżywalność karpi w wodzie skażonej Aeromonas hydrophila i Vibrio angillarum wzrosła o 80%, a dzienne przyrosty były większe o 18%.

P r z y k ł a d 2

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu RolnoSpożywczego pod numerem KKP 2012p, wprowadza się w ilości 10⁴ jtk/ml do pożywki zawierającej sacharozę, hydrolizat mąki kukurydzianej, pepton kazeinowy, ekstrakt drożdżowy i zestaw soli mineralnych. Pożywka ta była uprzednio sterylizowana w bioreaktorze w 121°C przez 15 min i schłodzona do 30°C.

Proces hodowli bakterii przebiegał w temp. 30°C przy pH 6,7, utrzymywanym przy pomocy Ca(OH)₂, przy łagodnym mieszaniu pożywki. Hodowlę prowadzono przez 18 godzin. Następnie przeprowadzono separację komórek bakteryjnych przy użyciu mikrofiltra membranowego o porowatości 0,45 pm metodą filtracji krzyżowej. Zawiesinę komórek mieszano z czynnikami krioochronnymi i suszono metodą liofilizacji. W wyniku suszenia otrzymano preparat probiotyczny w formie sproszkowanej, zawierający 3x10⁹ jtk/g. Preparat ten wprowadzono do mieszanki paszowej w takiej ilości, aby w gotowej paszy liczebność probiotycznych bakterii wynosiła 7x10⁸ jtk/g. Paszę upostaciowano w procesie prasowania wysokociśnieniowego, a po wysuszeniu granulat pokryto filmem hydrofobowym składającym się z mieszaniny olejów: rybnego i rzepakowego w proporcji 50:50. Tak przygotowaną paszą probiotyczną o działaniu profilaktycznym karmiono narybek pstrąga tęczowego Oncorchynhus mykiss. Stwierdzono, że przeżywalność pstrągów w wodzie skażonej bakteriami Aeromonas salmonicide, Edwardsiella tarda i Vibrio angillarum wzrosła o 60%, a dzienne przyrosty narybku były większe o 15%.

P r z y k ł a d 3

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, w ilości 10⁶ jtk/ml wprowadza się do sterylnej pożywki % MRS wzbogaconej w hydrolizat enzymatyczny mąki żytniej. Pożywka ta była uprzednio sterylizowana przez filtrację w mikrofiltrze membranowym o porowatości 0,45 pm i wprowadzona do bioreaktora wysterylizowanego parą wodną. Proces hodowli bakterii przebiegał w temp. 30°C przy pH 7,0 z korektą pH przy pomocy NaOH, przy łagodnym mieszaniu pożywki. Hodowlę prowadzono przez 15 godzin, po czym kulturę bakteryjną razem z odfermentowaną pożywką zagęszczoną na mikrofiltrze membranowym redukując objętość o 60% w stosunku do objętości początkowej. Uzyskana gęstwa bakteryjna zawierała 7x10⁹ komórek/ml. Następnie gęstwę komórkową razem z odfermentowaną pożywką natryskiwano na wysuszoną paszę granulowaną w proporcji gęstwy komórkowej do suchej paszy, jak 1:5. Po dokładnym wymieszaniu paszę dosuszano metodą konwekcyjną powietrzem o temperaturze nieprzekraczającej 50°C, po czym granulat natłuszczono olejem rybnym w ilości 2% masy paszy w procesie natłuszczania ciśnieniowego. Analiza wykazała, że tak przygotowana pasza zawierała 8x10⁶ jtk/g oraz miała aktywność przeciwko patogennym bakteriom Aeromonas hydrophila na poziomie 150 jednostek aktywności/g. Gotową paszą karmiono narybek sterleta Acipenser ruthenus i jesiotra syberyjskiego

PL 224 877 B1

Acipenser baeri w celu poprawy wyników howu. Badania wykazały, że w wyniku podawania paszy probiotycznej zwiększyła się przeżywalność narybku oraz poprawiło wykorzystanie paszy.

P rz y k ła d 4

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, w ilości 4x10⁶ jtk/ml dodano do sterylizowanej pożywki zawierającej sacharydy, aminokwasy, peptony, ekstrakt drożdżowy i sole mineralne i hodowano przy ciągłym mieszaniu w temperaturze 32°C przez 18 godzin, korygując pH pożywki za pomocą węglanu wapnia (sproszkowanej kredy). Po zakończeniu hodowli całą pożywkę wraz z bakteriami zagęszczano przez mikrofiltrację membranową, dodawano mączkę rybną, rozdrobnioną śrutę sojową, rozdrobnioną śrutę rzepakową, mąkę pszenną, zestaw witamin i kwas askorbinowy, a następnie całość dokładnie wymieszano w mieszalniku kubicznym. Tak przygotowany roztwór poddawano suszeniu w suszami fluidyzacyjnej wyposażonej w granulator. W ten sposób uzyskano granulowany preparat zawierający 2,3x10⁷ komórek/g, który bezpośrednio podawano narybkowi jesiotra rosyjskiego Acipenser gueldenstaedti. W wyniku jego stosowania zwiększono przeżywalność narybku oraz przyspieszono wzrost ryb.

P r z y k ł a d 5

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, hoduje się w sterylnej pożywce ciekłej. Pod koniec logarytmicznej fazy wzrostu pożywkę poddawano wirowaniu przy 6.000 obr/min przez 15 minut uzyskując pastę bakteryjną zawierającą 10⁹ bakterii/g. Pastę tę przechowywano w chłodni w 4°C przez trzy dni, po czym sporządzano zawiesinę komórkową i mieszano ją z zapłodnioną i pozbawioną kleistości ikrą szczupaka Esox lucius w takiej ilości, aby mieszanina z ikrą zawierała 3x10⁸ jtk/ml. Pastę bakteryjną mieszano z ikrą szczupaka także w trakcie jej inkubacji w odstępach dwudniowych uzyskując formę żelu. W wyniku tego działania wykazano, że ilość żywego wylęgu pozyskanego tą metodą w stosunku do wylęgu pozyskanego z ikry nieobrabianej bakteriami była istotnie większa.

P rz y k ła d 6

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, hoduje się w sterylnej pożywce ciekłej, a po zakończeniu hodowli, co miało miejsce po upływie 24 godzin, komórki wirowano przy 4.000 obr/min przez 10 minut i uzyskaną gęstwę komórkową mieszano z piaskiem i żwirem. Po upływie 6 godzin piasek i żwir z zaadsorbowanymi bakteriami umieszczano na dnie zbiornika hodowlanego dla dwóch gatunków małży: szczeżui pospolitej Anodonta anatina i szczeżui spłaszczonej Pseudoanodonta complananta. Wykazano, że w wyniku takiego działania zwiększyła się przeżywalność małży słodkowodnych.

Przykład 7

Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, jakie polega na tym, że szczep bakterii Carnobacterium divergens zdeponowany w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, hodowano w sterylnej pożywce ciekłej, a po zakończeniu hodowli, co miało miejsce po upływie 24 godzin, komórki wirowano przy 4.000 obr/min przez 10 minut i uzyskaną gęstwę komórkową wprowadzano bezpośrednio do wody, mieszając część gęstwy z olejem rzepakowym do formy emulsji. Badania wykazały, że w zbiorniku hodowlanym znacznie poprawił się stan sanitarny wody.

PL 224 877 B1

Literatura

1. Balcazar J.L 2003. Evaluation of probiotic bacterial strains in Litopenaeus vannamei. Final Report, National Center for Marinę and Aąuaculture Research, Guayaąuil, Ecuador.

2. Balcazar J.L., de Blas I., Ruiz-Zarzuela I., Vendrell D., Muząuiz J.L. 2004. Probiotics: a tool for the futurę of fish and shellfish health management. J. Aąuacult. Trop. 19, 239-242.

3. Chiu C-H., Cheng C-H., Gua W-R., Guu Y-K., Cheng W., 2010. Dietary administration of the probiotic, Saccharomyces cerevisiae PI 3, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper, Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunology 29, 1053-1059.

4. Collins M.D, Farrow J.A.E., Phillips B.A, Feresu S., Jones D, 1987. Classification of Lactobacillus divergens, Lactobacillus piscicola, and some catalase-negative, asporogenous, rod-shaped bacteria from poultry in a new genus, Carnobacterium. Int. J. Syst. Bacteriol., 37, 310-316.

5. Dali W., Moriarty D.J.W. 1983. Functional aspects of nutrition and digestion. In: Mantel L.H. (Ed.) The biology of crustacean, vol. 5, Internal Anatomy and Physiological Regulation. Academic Press.

6. Dalmin G., Kathiresan K., Purushothaman A. 2001. Effect of probotics on bacterial population and health status of shrimp in culture pond ecosystem. Indian J. Exp. Boil. 39, 939-942.

7. Dhanaraj M., Haniffa M.A., Arun Singh S.V., Arockiaraj A.J., Ramakrishnan C.M., Seetharaman S., Arthimanju R. 2010. Effect of probiotics on growth performance of koi carp (Cyprinus carpio). J. Appl. Aąuacult. 22, 202-209.

8. Direkbusarakom S., Yoshimizu M., Ezura Y., Ruangpan L., Danayadol Y. 1998. Vibrio spp. the dominant flora in shrimp hatchery against some fish pathogenic viruses. J. Mar. Biotechnol. 6, 266267.

9. FAO/WHO, 2001. Report of a joint FAO/WHO expert consultation on evaluation of health and nutritional properties of probotics in food including powder milk with live lactic acid bacteria. Cordoba, Argentina.

10. Fuller R. 1989. Probotics in man and animals. J. Appl. Bacteriol. 66, 365-378.

11. Gatesoupe F.J., Zambonino Infante J.L., Cahu C., Quazuguel P. 1997. Early weaning of seabass larvae, Dicentrarchus labrcoc: the effect on microbiota, with particular attention to iron supply and exoenzymes. Aąuaculture 158, 117-127.

12. Gildberg A., Mikkelsen H., Sandaker E., Ringo E. 1997. Probiotic effect of lactic acid bacteria in the feed on growth and survival of fry of Atlantic cod (Gadus morhua). Hydrobiologia 352, 279-285.

13. Girones R., Jofre J.T., Bosh A. 1989. Isolation of marinę bacteria with antiviral properties. Can. J. Microbiol. 35, 1015-1021.

14. Hamid A., Sakata T., Kakimoto D. 1978. Microflora in the alimentary tract of grey mullet: 2. A comparison of the mullet intestinal microflora in fresh and sea water. Buli. Jpn. Soc. Sci. Fish. 44, 53-57.

15. Holzapfel WH., Gerber ES7, 1984. Lactobacillus divergens sp. nov., a new heterofermentative Lactobacillus species producing L(+)-lactate. Syst. Appl. Microbiol. 4, 522-534.

16. Kamei Y., Yoshimizu M., Ezura Y., Kimura T. 1988. Screening of bacteria with antiviral activity from fresh water salmonid hatcheries. Microbiol. Immunol. 32, 67-73.

17. Mazurkiewicz J., Przybył A., Sip A., Grajek W., 2007. Effect of Carnobacterium divergens and Enterococcus hirae as probiotic bacteria in feed for Common carp, Cyprinus carpio L. Arch. Pol. Fish 15, 79-92.

18. Nikoskelainen S., Ouwehand A., Bylund G., Salminen S., Lilius E.M. 2001. Immune enhancement in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) by potential probiotic bacteria (Lactobacillus rhamnosus). Fish Shellfish Immunol. 15, 443-452.

19. Parker R.B. 1974. Probiotics. The other half of the antibiotics story. Anim. Nutr. Health. 29: 4-8.

20. Przybył A., Mazurkiewicz J., Rożek W., 2006. Zastosowanie probiotyków i prebiotyków w żywieniu karpi. Aparatura Badawcza i Dydaktyczna 11 (1), 65-70.

21. Ringo E., Gatesoupe F.-J. 1998. Lactic acid bacteria in fish: a review. Aąuaculture 160, 177-203.

22. Ringo E., Strom E., Tabacheck J. 1995. Intestinal microflora of salmonids: a review. Aąuacult. Res. 26, 773-789.

23. Robertson R, ODowd C., Burrells C., Williams R, Austin B. 2000. Use of Carnobacterium sp. as a probiotic for Atlantic salmon (Salmo salar L.) and rainbow trout (Oncorhynchus mykiss Walbaum). Aąuaculture 185, 235-243.

PL 224 877 B1

24. Sakai M., Yoshida T., Astuta S., Kobayashi M. 1995. Enhancement of resistance to vibriosis in rainbow trout, Oncorhynchus mykiss (Walbaum) by oral administration of Clostridium butyricum bacteria. J. Fish. Dis. 18, 187-190.

25. Sakata T. 1990. Microflora in the digestive tract of fish and self-fish. In: Lesel R. (Ed.), Microbiology in Poecilotherms, pp. 171-176. Elsevier, Amsterdam.

26. Seeto G.S., Ververs P.C., Clements K.D., Slaytor M. 1996. Carbohydrate utilisation by microbial synbionts in the marinę herbivorous fishes Odax exanomelas and Crinodus lophodon. J. Comp. Physiol. 165B, 571-579.

27. Son V.M., Chang C-C., Wu M-C., Guu Y-K., Chiu C-H., 2009. Dietary administration of the probiotic, Lactobacillus plantarum, enhanced the growth, innate immune responses, and disease resistance of the grouper, Epinephelus coioides. Fish Shellfish Immunology 26, 691-698.

28. Strand H.K., Dalmo R.A. 1997. Absorption of immunomodulating p(1,3)-glucan in yolk sac larvae of Atlantic halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.). J. Fish Disea. 20, 41 -49.

29. Strom E., Ringo E. 1993. Changes in bacterial flora in developing cod, Gadus morhua (L.), larvae after inoculation of Lactobacillus plantarum in the water.

30. Sugita H., Miyajima C., Deguchi Y. 1991. The vitamin Bn-producing ability of the intestinal microflora of the river fish. Aąuaculture 92, 267-276.

31. Sugita H., Shibuya K., Shimooka H., Deguchi Y. 1996. Antibacterial abilities of intestinal bacteria in freshwater cultured fish. Aąuaculture 145, 195-203.

32. Vine N.G., Leukes W.D., Kaiser H. 2004. In vitro growth characteristics of five candidate aąuaculture probiotics and two fish pathogens grown in fish intestinal mucus.

33. FEMS Microbiol. Lett. 231, 145-152.

34. Wang X., Li H., Zhang X., Li Y., Ji W., Xu H. 2000. Microbial flora in the digestive tract of adult penaeid shrimp (Penaeus chinensis). J. Ocean. Univ. Qingdao 30, 493-498.

35. Watanabe K., Sezaki K., Yazawa K., Hino A. 1992. Nutritive fortification of the rotifer Brachionus plicatilis with eicosapentaenoic acid-producing bacteria. Nippon Suisan Gakkaishi 58, 271 -276.

Claims (12)

1. Zastosowanie szczepu bakterii Carnobacterium divergens oraz jego metabolitów, zdeponowanego w Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego pod numerem KKP 2012p, do wytwarzania probiotyku dla ryb, mięczaków i skorupiaków słodkowodnych do ograniczenia aktywności, wzrostu lub przeżywalności chorobotwórczych bakterii Aeromonas hydrophila, Aeromonas salmonicida, Vibrio angillarum, Edwardsiella Tarda, przy czym probiotyk zawiera szczep Carnobacterium divergens i/lub jego metabolity, w ilości co najmniej 10⁶ komórek bakterii C. divergens S1 , najkorzystniej powyżej 10⁸.

2. Zastosowanie według zastrz. 1, znamienne tym, że bakterie Carnobacterium divergens i/lub jego metabolity zawarte w probiotyku są w formie żywej lub martwej i w ilości takiej, że w 1 gramie suchej masy ich ilość przekracza 100 jednostek aktywności przeciwdrobnoustrojowych metabolitów bakterii C. divergens S1.

3. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, znamienne tym, że bakterie Carnobacterium divergens i/lub jego metabolity umieszczone są na nośniku jakim jest piasek i/albo żwir i/albo nośniki organiczne zmieszane ze składnikami paszowymi i/lub pełnoporcjowe mieszanki paszowe lub premiksy, a biomasa jest utrwalona metodą suszenia lub zamrażania.

4. Zastosowanie według zastrz. 3, znamienne tym, że uzyskany probiotyk jest stosowany, jako środek profilaktyczny, leczniczy lub stymulujący wzrost ryb słodkowodnych, szczególnie narybku ka rpia, pstrąga tęczowego, suma europejskiego i ryb jesiotrowatych oraz mięczaków i skorupiaków, szczególnie słodkowodnych małż i raków.

5. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, znamienne tym, że probiotyk stosuje się do obróbki ikry.

6. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienne tym, że stosowany probiotyk ma postać zawiesiny.

7. Zastosowanie według zastrz. 1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienne tym, że stosowany probiotyk ma postać granulatu.

PL 224 877 B1

8. Zastosowanie według zastrz. ny probiotyk ma postać proszku.

9. Zastosowanie według zastrz. ny probiotyk ma postać otoczkowaną.

10. Zastosowanie według zastrz. ny probiotyk ma postać żelu.

11. Zastosowanie według zastrz. ny probiotyk ma postać pasty.

12. Zastosowanie według zastrz. ny probiotyk ma postać emulsji.

1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5,

1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5,

1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5,

1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5,

1 albo 2, albo 3, albo 4, albo 5, znamienne tym, że stosowaznamienne tym, że stosowaznamienne tym, że stosowaznamienne tym, że stosowaznamienne tym, że stosowaDepartament Wydawnictw UPRP

Cena 4,92 zł (w tym 23% VAT)