PL225740B1 - Zastosowanie mieszaniny tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu- -3-aminopirydyny z fotouczulaczem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do stosowania w przeciwnowotworowej terapii fotodynamicznej - Google Patents

Abstract

Ujawniono zastosowanie mieszaniny tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny z fotouczulaczem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do stosowania w przeciwnowotworowej terapii fotodynamicznej. Przy czym jako fotouczulacze stosuje się pochodne protoporfiryny IX takie jak porfimer, jak również ich specyficzne leki prekursorowe takie jak kwas aminolewulinowy, jego farmaceutycznie dopuszczalne sole lub jego estry: metylowy, etylowy lub heksylowy. Mieszanina tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny oraz fotouczulacza jest czynnikiem aktywnym kompozycji farmaceutycznej, wykazującym efekt synergiczny i zwiększoną skuteczność terapii.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie mieszaniny tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny z fotouczulaczem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do stosowania w przeciwnowotworowej terapii fotodynamicznej.

Według raportu Światowej Organizacji Zdrowia (dane na rok 2008; WHO factsheet N297) ponad 13% wszystkich zgonów na świecie wywołanych jest przez nowotwory, co plasuje takie schorzenia na drugim miejscu po chorobach układu krążenia pod względem chorób potencjalnie śmiertelnych. Pomimo dużych nakładów finansowych oraz wielu badań, w wyniku których opracowano liczne środki farmaceutyczne oraz metody terapeutyczne, wciąż wiele postaci nowotworów pozostaje nieuleczalnych. Opracowanie nowych, skutecznych leków oraz sposobów leczenia tego typu schorzeń jest jednym z najpoważniejszych wyzwań dzisiejszej nauki. Zdecydowana większość znanych dotychczas metod leczenia nowotworów to metody inwazyjne. Wynikiem zastosowania takich terapii są często niekorzystne skutki uboczne. Na przykład najpowszechniej stosowane obecnie chirurgiczne metody terapii obarczone są poważnym ryzykiem dla zdrowia, a nawet życia pacjenta. Podobnymi zagrożeniami obarczone są także znane obecnie metody chemoterapii oraz radioterapii. Metody te są obecnie dynamicznie rozwijane, przy czym duże nadzieje wiąże się zarówno z opracowywaniem nowych chemoterapeutyków jak i z nowymi technologiami terapii przeciwnowotworowych. Przykładem takiej technologii, która rozwija się ostatnio szczególnie dynamicznie jest terapia fotodynamiczna (PDT). Idea PDT sprowadza się do zastosowania fotouczulacza, który wykazuje zdolność pochłaniania dawki energii promienistej, w wyniku czego generowane są reaktywne formy tlenu o działaniu toksycznym wobec komórek nowotworowych, czego konsekwencją jest wywołanie ich śmierci (J. Gołąb et al., Cancer J Clin 2011; 61,250-281). W terapii tej wykorzystuje się fakt zwiększonej akumulacji fotouczulacza w komórkach nowotworowych, co pozwala również na stosowanie jej w diagnostyce. Jako fotouczulacz można stosować syntetyczne związki lub wykorzystać naturalne szlaki metaboliczne do generowania biogennego związku - protoporfiryny IX (PpIX). Osiąga się to podając kwas 5-aminolewulinowy, który jest metabolizowany do protoporfiryny, związku niezbędnego we właściwym cyklu rozwojowym komórki (Gołąb et al., Molecules 2011,16, 4140-4164; Musiol et al, Curr. Pharm. Design, 2011, 17, 3548-3559). PpIX jest w komórkach źródłem hemu, ważnej grupy prostetycznej wielu enzymów oraz głównego składnika hemoglobiny. Komórki nowotworowe często wykazują nadregulację tych szlaków metabolicznych oraz zwiększone wchłanianie substratów. W efekcie dochodzi w nich do akumulacji fotouczulacza, który można wykorzystać w trakcie diagnozy lub właściwej terapii.

Ważnym wydaje się być fakt, że cykl metaboliczny odpowiedzialny za wytwarzanie cytochromu a więc i protoporfiryny IX uzależniony jest od właściwej dostępności jonów żelaza w komórkach. Uważa się, że metabolizm żelaza jest istotnym czynnikiem różnicującym prawidłowo rozwijające się k omórki od komórek nowotworowych, tak więc wiele nowych przeciwnowotworowych środków terapeutycznych wykorzystuje ten mechanizm w celu uzyskania selektywnego transportu leku. Przykładem mogą być tzw. chelatory żelaza. W praktyce terapeutycznej znane i stosowane są leki tego typu jak deferoksamina (DFA) lub deferipron (DFP), jednak ich efektywność i co za tym idzie zastosowania w terapii przeciwnowotworowej są stosunkowo niewielkie. Opisano także chelatory żelaza o wysokiej aktywności przeciwnowotworowej. Przykładem są tiosemikarbazony. Na przykład w pracy M. Serda et al, Bioorg. Med. Chem. Lett., 2012, 22, 5527 opisano chelatory żelaza o aktywności przeciwnowotworowej wykazujące jednocześnie wpływ na metabolizm żelaza w komórkach nowotworowych. Związki tiosemikarbazonowe ujawniono także w patentach WO2010000008, CN102210698, WO2012079128.

Szczególne znaczenie wśród chelatorów żelaza zyskuje tiosemikarbazon 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny (zwany również Triapina, 3-AP) przedstawiony wzorem 1. Związek ten został opisany między innymi w zgłoszeniu patentowym US20120135002 jako aktywny składnik preparatów przeci wnowotworowych, do wytwarzania kompozycji farmaceutycznych wraz z innymi aktywnymi i nieaktywnymi składnikami. Otrzymywanie tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny opisuje zgłoszenie WO/1998/051670. Mechanizm działania tego chelatora żelaza polega na hamowaniu reduktazy rybonukletydowej oraz regulacji metabolizmu żelaza. Obecnie tiosemikarbazon 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny znajduje się w II fazie badań klinicznych obejmującej szerokie spektrum nowotworów.

Zgodnie z opisanym powyżej mechanizmem tworzenia PpIX zdolność 3-AP do kompleksowania jonów żelaza może pozytywnie wpłynąć na skuteczność terapii fotodynamicznej. Dotychczas brak jednak jakichkolwiek doniesień na temat tego typu zastosowań leku. Z przeprowadzonych przez twórców

PL 225 740 B1 niniejszego wynalazku badań wynika, że tiosemikarbazon 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny stosowany w połączeniu z wybranymi fotouczulaczami, zwłaszcza z kwasem 5-aminolewulinowym wykazuje efekt synergiczny i zwiększoną skuteczność terapii fotodynamicznej. Synergia pomiędzy dwoma lub większą liczbą leków podanych jednocześnie oznacza aktywność wyższą niż suma aktywności poszczególnych składników. Przeciwnie do synergii wyróżnia się antagonizm - gdzie poszczególne leki zmniejszają wzajemnie swoją aktywność. Znany jest również efekt addytywny gdzie aktywność leków podanych jednocześnie jest równa sumie poszczególnych składników. Zjawisko synergii nie daje się przewidzieć ani modelować na drodze teoretycznej. Leki działające synergicznie mogą mieć takie same lub różne mechanizmy działania, różna może być ich dawka. Poznanie możliwości wykorzystania działania synergicznego wymaga zaprojektowania i przeprowadzenia odpowiednich badań, co stało się celem twórców niniejszego wynalazku.

Istotę wynalazku stanowi zastosowanie mieszaniny tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny z fotouczulaczem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do stosowania w przeciwnowotworowej terapii fotodynamicznej, przy czym jako fotouczulacze stosuje się pochodne protoporfiryny IX takie jak porfimer, jak również ich specyficzne proleki, takie jak kwas aminolewulinowy, jego farmaceutycznie dopuszczalne sole lub jego estry: metylowy, etylowy lub heksylowy. Mieszanina tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny oraz fotouczulacza jest czynnikiem aktywnym kompozycji farmaceutycznej wykazującym efekt synergiczny i zwiększoną skuteczność terapii.

Korzystnie, jako składniki nieaktywne kompozycji farmaceutycznej stosuje się spoiwa i/lub lepiszcza i/lub nośniki i/lub rozpuszczalniki i/lub rozdrabniacze i/lub utrwalacze i/lub dodatki poprawiające smak, zapach lub wygląd.

Korzystnie, jako spoiwa i lepiszcza stosuje się gumę arabską, skrobię kukurydzianą lub żelatynę.

Korzystnie, jako środki poprawiające smak stosuje się sacharozę, laktozę, glukozę, glicerynę, ksylitom lub ekstrakty ziołowe lub owocowe takie jak ekstrakt mięty pieprzowej, ekstrakt wiśniowy lub cytrynowy.

Korzystnie, jako środki poprawiające zapach stosuje się miętę pieprzową, maślan butylu, mleczan etylu, izowalerian etylu lub butanian geranylu.

Korzystnie, jako środki poprawiające wygląd stosuje się barwniki, w tym czerwień koszenilową, tlenek tytanu, tlenek żelaza czerwony.

Korzystnie, jako środki rozdrabniające stosuje się skrobię ziemniaczaną lub skrobię kukurydzianą.

Korzystnie, w kompozycji farmaceutycznej stosuje się ciekłe nośniki lub rozpuszczalniki takie jak woda, etanol, olej parafinowy, olej roślinny lub poliglikol etylenowy.

Korzystnie, w kompozycji farmaceutycznej występującej w postaci syropu stosuje się roztwory sacharozy, gliceryny lub ksylitolu, barwniki oraz stabilizatory i konserwanty takie jak parabeny, przeciwutleniacze takie jak kwas askorbinowy.

Rozwiązanie według wynalazku zostanie bliżej objaśnione na poniższym przykładzie.

P r z y k ł a d

Kompozycja farmaceutyczna.

Kompozycję farmaceutyczną w postaci roztworu przygotowano rozpuszczając kwas aminolewulinowy oraz tiosemikarbazon 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny w DMSO i rozcieńczając w wodnym roztworze buforu fosforanowego dla zachowania warunków izotonicznych, w ilościach odpowiednich do otrzymania stężeń 10 mM ALA oraz 50 ąM tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny.

Aktywność farmakologiczna kompozycji składającej się z tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny (3-AP) oraz kwasu 5-aminolewulinowego.

Komórki nowotworu jelita grubego (HCT 116+/+) wysiano na 3 cm szalki Petriego (Nunc), (15-10 komórek/szalkę) 24 h przed badaniem, po czym usunięto medium i komórki przemyto PBS (Immuniq). Kompozycję farmaceutyczną z przykładu podano w takiej ilości aby osiągnąć odpowiednie stężenia (1 mM dla kwasu ALA oraz dla tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny odpowiednio 1, 2, 4, 8 oraz 16 ąM) oraz pożywkę DMEM (bez FBS i czerwieni fenolowej). Szalki inkubowano przez 24 h po czym medium hodowlane zastąpiono roztworem PBS i komórki naświetlano światłem o długości 630 nm przez czas potrzebny dla uzyskania odpowiedniej dawki (1,14; 2,28; 4,56; 9,12; 18,24 J/cm ). Następnie odlano bufor a komórki w normalnym medium hodowlanym były inkubowane przez następne 24 h. Przeżywalność komórek określono standardowym testem MTS 130 ąL of theCellTiter 96® AQueous One Solution - MTS (Promega) z odczytem przy 490 nm. Interakcje farmakologiczne obliczono za pomocą metody Chou-Talay (Compusyn).

PL 225 740 B1

	Dawka światła (J/cm2) przy stężeniu kwasu 5-aminolewulinowego wynoszącym 1 mM/ frakcja komórek przeżywających*
Dawka 3-AP pM	0	1.14	2.28	4.56	9.12
0		0.01	0.03	0.26	0.55
1	0.00	0.00
2	0.05		0.04
4	0.02			0.06
8	0.30				0.73

* Frakcję komórek przeżywających obliczono przy pomocy równania:

gdzie D oznacza dawkę tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny oraz światła, D_m oznacza dawkę tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny lub światła powodującą zniszczenie 50% komórek, m oznacza kształt krzywej opisującej zależność dawki - odpowiedzi farmakologicznej, /u oznacza ilość nieuszkodzonych komórek.

Uzyskane wyniki wskazują na synergiczne działanie tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny oraz kwasu 5-aminolewulinowego. Indeks interakcji obliczony przy pomocy programu CompuSyn dla 95% skuteczności przeciwnowotworowej wynosi 0,6 a więc kompozycja wykazuje działanie bardziej skuteczne niż poszczególne jej składniki. Wysoką 95%-ową skuteczność przeciwnowotworową względem komórek HCT-116 uzyskuje się stosując kompozycję farmaceutyczną według wynalazku przy dawce tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny 8-krotnie niższej niż dla samego 3-AP.

Claims (1)

1. Zastrzeżenie patentowe

   Zastosowanie mieszaniny tiosemikarbazonu 2-karbaldehydu-3-aminopirydyny z fotouczulaczem do wytwarzania kompozycji farmaceutycznej przeznaczonej do stosowania w przeciwnowotworowej terapii fotodynamicznej, w charakterze czynnika aktywnego wykazującego efekt synergiczny i zwiększoną skuteczność terapii, przy czym jako fotouczulacze stosuje się pochodne protoporfiryny IX takie jak porfimer, jak również ich specyficzne proleki, takie jak kwas aminolewulinowy, jego farmaceutyc znie dopuszczalne sole lub jego estry: metylowy, etylowy lub heksylowy.