PL226054B1 - Nowe pochodne peptydowe, sposob ich otrzymywania, kompozycja farmaceutyczna, kompozycja dezynfekujaca oraz zastosowanie i zestaw - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne peptydowe o wzorze ogólnym 1: DOCA - PABA - KTFAR - NH2; DOCA - RRPK TFAKTFA - NH2. Ujawniono również sposób otrzymywania nowych pochodnych peptydowych, kompozycję farmaceutyczną oraz dezynfekującą zawierającą jako substancję czynną nowe pochodne peptydowe. Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nowych związków peptydowych do wytwarzania produktu leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjną i/lub grzybiczą.

Description

Przedmiotem wynalazku są nowe N_E-trifluoroacetylowe pochodne peptydowe modyfikowane układem steroidowym (resztą kwasu deoksycholowego) oraz sposób ich otrzymywania, kompozycja farmaceutyczna oraz dezynfekująca zawierająca jako substancję czynną nowe pochodne peptydowe. Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nowych związków peptydowych do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjną i/lub grzybiczą.

Kwasy żółciowe odgrywają kluczowe znaczenie w procesach zarówno trawienia, jak i wchłaniania tłuszczów, a także rozpuszczalnych w nich witamin. Jako produkty pochodzące z metabolizmu cholesterolu, utrzymują jego właściwe stężenie w organizmie. Kwasy te rozpatrywane są jako potencjalne nośniki leków metabolizowanych w wątrobie, a także czynniki mogące obniżać zawartość cholesterolu. Prawie 90% zawartości kwasów żółciowych człowieka stanowią drugorzędowy kwas deoksycholowy (ryc. 1) oraz pierwszorzędowe kwasy chenodeoksycholowy i cholowy. W naturze nie mają one postaci kwasów z wolną grupą karboksylową w pozycji 24, ale stanowią koniugaty z glicyną i tauryną. Podczas opracowywania nowych leków, będących pochodnymi tych kwasów zaleca się spełnienie następujących warunków: zachowanie ładunku ujemnego łańcucha bocznego, konformacji ci's pierścieni A i B oraz przynajmniej jednej z aksjalnie położonych grup hydroksylowych w pozycjach 3, 7, 12. Dzięki swojej budowie kwasy te posiadają charakter hydrofobowo-hydrofilowy (amfifilowy). Wykazują cechy detergentów i zdolne są do tworzenia w środowisku wodnym miceli w zakresie stężeń (0,6-10 mM), co przesądza o ich fizjologicznych funkcjach.

Rycina 1. Struktura kwasu deoksycholowego (DOCA)

W literaturze szeroko opisywane są pochodne kwasów żółciowych połączonych z różnego rodzaju związkami zawierającymi grupy aminowe. Pochodne takie nazywane są kationowymi steroidowymi antybiotykami i zostały zaprojektowane w oparciu o amfifilowy charakter polimyksyny B, która należy do grupy kationowych antybiotyków peptydowych (CPAs). Pochodne kwasu cholowego, podobnie jak CPAs charakteryzują się wysokim potencjałem przeciwbakteryjnym, jak również zdolne są do permeabilizacji błony bakterii Gram-ujemnych. Ponadto, wykazują podobieństwo w mechanizmie działania do CPAs. W większości zaprojektowane pochodne mają za zadanie naśladować działanie polimyksyny B lub skwalaminy, wyizolowanej z tkanek żołądka rekina z rodzaju Squalus. Skwalamina to kationowy steroid powstały z połączenia kwasu żółciowego ze spermidyną. Wykazuje działanie przeciwbakteryjne wobec zarówno bakterii Gram-dodatnich, jak i Gram-ujemnych, grzybobójcze, a także wywołuje lizę komórek pierwotniaków. Badania wykazały, że potencjał przeciwbakteryjny tej klasy związków zależny jest od pozycji i natury grup hydroksylowych, jak również podstawionych grup aminowych. Pochodne kwasu deoksycholowego wykazują szczególnie potencjał wobec bakterii Gram-dodatnich, a na jego potencjał wpływa pozytywnie obecność grupy aminowej lub etyloaminowej w pozycji C-3. Projektowanie koniugatów kwasów żółciowych z peptydami mogłoby znacznie ograniczyć ich wrażliwość na biodegradację enzymatyczną, natomiast zwiększyć zdolności przenikania przez błony biologiczne. Na podstawie badań przeprowadzonych na koniugatach kwasu cholowego

PL 226 054 B1 i peptydów zawierających oksoprolinę, będących inhibitorami prolilo-4-hydroksylazy, można wnioskować, że taka forma podania peptydu jedynie częściowo zapobiega jego naturalnemu metabolizmowi. Zaobserwowano, że połączenie szkieletu kwasu deoksycholowego z insuliną (poprzez resztę lizyny) spowodowało wydłużenie czasu jej działania w warunkach fizjologicznych, czego przyczyną jest podatność do agregacji. Koniugaty tego kwasu zdolne są do samoorganizacji, co wynika z ich budowy, głównie z obecności amfifilowego steroidowego rdzenia, jak również grup bocznych.

Tworzenie połączeń układu steroidowego kwasów żółciowych z peptydami pozwala na szeroką skalę zmieniać ich strukturę, jak również właściwości fizyko-chemiczne i biologiczne. Dzięki swoim niezwykłym cechom, takim jak: duża dostępność, sztywność, chiralność i aktywność biologiczna, układy steroidowe mogą być wykorzystywane do projektowania sztucznych enzymów, receptorów, epitopów, związków o aktywności przeciwbakteryjnej czy do poprawy profilu farmakologicznego znanych leków peptydowych. Ponadto, układ steroidowy przyczynia się do ograniczenia elastyczności konformacyjnej przyłączonego łańcucha peptydowego. Fizjologiczne szlaki transportu kwasów żółciowych w krążeniu jelitowo-wątrobowym mogą być wykorzystane do przenoszenia leków o budowie peptydowej. Układ steroidowy może stanowić przydatne narzędzie w projektowaniu swoistych dla wątroby proleków, ukierunkowaniu ich transportu czy zwiększeniu biodostępności słabo wchłanianych leków.

Li i wsp. przeprowadzili syntezę pochodnych kwasu cholowego, w którym grupy hydroksylowe podstawiono grupami guanidynową lub aminową, natomiast karboksylową w pozycji 24 różnymi łańcuchami. Na podstawie badań mikrobiologicznych stwierdzili, że natura grup rozciągających się od węgla w pozycji 17 wpływa znacząco na aktywność związków wobec bakterii Gram-ujemnych. Pochodne posiadające łańcuch hydrofobowy (grupa oktyloaminowa) w pozycjach powyżej węgla C17 (ryc. 2) są bardziej aktywne niż te, które mają mniejsze łańcuchy (np. -OH, -CHCH3(CH2)3O(CH2)CH3,

-CHCH3(CH2)3OH)). Ponadto, zaobserwowali, że związki te były znacznie bardziej aktywne wobec bakterii niż wobec grzybów (np. C. albicans), co może wynikać z faktu, że w warunkach fizjologicznych przyjmują wysoki dodatni ładunek, zatem chętniej oddziałują z negatywnie naładowaną błoną bakterii.

Rycina 2. Struktury pochodnych kwasu cholowego

Bellini i wsp. zsyntezowali 20 pochodnych kwasu deoksycholowego, które zawierają dwie grupy o zasadowym charakterze w pozycjach C24 (benzyloaminowa, morfolinowa, dietanoloaminowa, N-metylopiperazynowa oraz N,N-dietyloetylenodiaminowa) i C3 (aminowa, metyloaminowa, etyloaminowa, benzyloaminowa). Przeprowadzili testy mikrobiologiczne na szczepach bakteryjnych, z których wynika, że najbardziej aktywne były pochodne zawierające 2 grupy benzyloaminowe (BzNH) w pozycji C24 i C3, uzyskując wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost (MIC) wobec szczepu S. aureus 1,95 μg/ml i 0,97 μg/ml dla B. subtilis. Najlepszą aktywność przeciwbakteryjną uzyskano dla związków, w których w pozycji C3 znajdowała się grupa aminowa lub benzyloaminowa, a w pozycji C24 którakolwiek z wyżej wymienionych grup. Ponadto, autorzy zaobserwowali, że najbardziej aktywne wobec bakterii są najbardziej hydrofobowe pochodne. Z danych literaturowych wynika, że wysokim potencjałem przeciwbakteryjnym wobec bakterii Gram-dodatnich (MIC = 5 μg/ml) oraz Gramujemnych (MIC = 25 μg/ml) odznaczał się koniugat kwasu deoksycholowego z jedną resztą lizyny DOCA-K-NH2*2HCl. Nieco mniej aktywny był koniugat zawierający dwie reszty lizyny, a najmniej związek, w którym kwas DOCA zastąpiono dehydroksyholowym. Wysoka aktywność przeciwbakteryjna została potwierdzona także dla analogów zawierających zamiast reszty lizyny, reszty argininy.

PL 226 054 B1

W opisie PL 199271 B (WO 99/52932) ujawniono koniugaty kwasu żółciowego lub soli żółciowej z kwasem tłuszczowym, podobnie jak w PL 205057 B (WO 02/83147) oraz w opisie PL 211438 B (WO 02/83147). Wynalazki te zastrzegają inne związki niż te, które są przedmiotem niniejszego wynalazku.

Nieoczekiwanie okazało się, że opracowano nowe pochodne kwasu deoksycholowego, w którym w pozycji C24 przyłączono krótki łańcuch peptydowy zawierający reszty zasadowych aminokwasów tj. argininy i lizyny, a także resztę niebiałkowego aminokwasu, jakim jest kwas p-aminobenzoesowy (PABA).

Dodatkowo, grupy aminowe znajdujące się w łańcuchu bocznym lizyny zostały poddane trifluoroacetylacji, dzięki czemu uzyskano związki o sekwencjach: DOCA - PABA - K_TFAR - NH₂, DOCA RRPK_tfaK_tfa - NH₂. Na podstawie danych uznano, że trifluoroacetylowanie grupy aminowej w łańcuchu bocznym może spowodować wzrost hydrofobowości związków, a tym samym zwiększenie aktywności przeciwdrobnoustrojowej. Ponadto, wykazano, że trifluoroacetylacja pochodnych steroidowych, w tym kwasu deoksycholowego stanowi cenne narzędzie służące do szybkiej ilościowej identyfikacji tej grupy związków w mieszaninach za pomocą spektroskopii F-NMR, spektrometrii mas oraz chromatografii gazowej.

Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowych pochodnych peptydowych oraz sposobu ich otrzymywania, które mogą być zastosowane do wytwarzania środka leczniczego i/lub środka dezynfekującego o działaniu przeciwbakteryjnym bakterii Gram-dodatnich i/lub Gram-ujemnych oraz przeciwgrzybiczym.

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne peptydowe o wzorze ogólnym:

a) DOCA - PABA - KtfaR - NH2,

b) DOCA - RRPKtfaKtfa - NH2 gdzie:

DOCA - oznacza kwas deoksycholowy, 3a,12a-dihydroksy-53-cholanowy

PABA - oznacza kwas p-aminobenzoesowy, 4-aminobenzoesowy

K_tfaR - oznacza N_E4rifluoroacetylo-L4izylo-L-arginina

RRPK_tfaK_tfa - oznacza L-arginylo-L-arginylo-L-prolylo-N_E4rifluoroacetylo L4izylo-N_e4rifluoroacetylo-L-lizyna.

Ponadto przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nowych związków zdefiniowanych powyżej gdzie otrzymuje się związki w następujących etapach:

a) 30 minutowe spęcznienie żywicy amidowej Fmoc-Rink Amide AM RAM w DCM,

b) deprotekcja osłony Fmoc, blokującej grupę α-aminową w 20% roztworze piperydyny w DMF,

c) przemywanie żywicy kolejno w DMF, DCM/DMF, DMF,

d) przeprowadzenie testu chloranilowego,

e) reakcja acylowania poprzez przyłączenie Fmoc-chronionego aminokwasu,

f) odpłukanie, przemywanie żywicy kolejno w DMF, DCM/DMF, DMF,

g) przeprowadzenie testu chloranilowego,

h) powtarzanie etapów od b) do e) aż do momentu uzyskania pochodnych z zastrzeżenia 1 a) DOCA - PABA - KtfaR - NH2, oraz 1b) DOCA - RRPKtfaKtfa - NH2,

i) odszczepianie gotowej pochodnej 1a) oraz 1b) wraz z usunięciem osłon bocznych z żywicy mieszaniną TFA:wody oczyszczonej:TIS:fenol (95:2:2:1),

j) odsączenie, wytrącenie schłodzonym ciekłym azocie eterem, rozpuszczenie osadu w wodzie destylowanej z 10% CH3COOH, następnie zamrożenie w ciekłym azocie i liofilizacja,

k) analiza i oczyszczanie za pomocą HPLC,

l) spektrometria mas w celu potwierdzenia tożsamości.

Sposób gdzie dla nowej pochodnej z zastrzeżenia 1a przyłącza się następujące aminokwasy arginina, lizyna, PABA, DOCA.

Sposób gdzie dla nowej pochodnej z zastrzeżenia 1b przyłącza się następujące aminokwasy lizyna, lizyna, prolina, arginina, arginina, DOCA.

Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca jako substancję czynną nowy związek 1a lub 1b zdefiniowany powyżej oraz co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik.

Kompozycja ma zastosowanie przeciwbakteryjne i/lub przeciwgrzybicze.

PL 226 054 B1

Kompozycja ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

Kompozycja dezynfekująca zawiera jako substancję czynną nowy związek 1a lub 1b zdefiniowany powyżej oraz co najmniej jeden dopuszczalny chemicznie nośnik.

Kompozycja ma zastosowanie przeciwbakteryjne i/lub przeciwgrzybicze.

Kompozycja jest przeznaczona do stosowania na mikroorganizmy izolowane z powierzchni materiałów medycznych.

Kompozycja ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

Zastosowanie nowych związków 1a lub 1b zdefiniowanych powyżej do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjną i/lub grzybiczą.

Zastosowanie gdzie wytworzony środek leczniczy korzystnie wykazuje działanie przeciwbakteryjne w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i/lub Gram-ujemnych oraz przeciwgrzybicze.

Zastosowanie gdzie ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus ureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

Zestaw do hamowania wzrostu bakteryjnego i/lub grzybiczego, który składa się z dwóch pochodnych peptydowych zdefiniowanych powyżej.

Zestaw, który wykazuje działanie przeciwbakteryjne w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i/lub Gram-ujemnych oraz przeciwgrzybicze.

Zastosowanie ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus ureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:

DOCA - oznacza kwas deoksycholowy, 3a,12a-dihydroksy-53-cholanowy

PABA - oznacza kwas p-aminobenzoesowy, 4-aminobenzoesowy

KtfaR - oznacza N_E-trifluoroacetylo-L-lizylo-L-arginina

RRPK_tfaK_tfa - oznacza L-arginylo-L-arginylo-L-prolylo-N_E-trifluoroacetylo-L-lizylo-N_E-trifluoroacetylo-L-lizyna

Fmoc - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa

DMF - N,N-dimetyloformamid

DCM - dichlorometan

Opis figur:

Fig. 1 - przedstawia chromatogram związku DOCA - PABA - K_TFAR - NH₂

Fig. 2 - przedstawia chromatogram związku DOCA - RRPK_TFAK_TFA - NH₂

Fig. 3 - przedstawia widmo masowe związku o sekwencji: DOCA - PABA - K_TFAR

- NH2

Fig. 4 - przedstawia widmo masowe związku o sekwencji: DOCA - RRPK_TFAK_TFA - NH₂

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia:

P r z y k ł a d 1:

Peptydy otrzymano metodą syntezy na nośniku stałym zgodnie ze strategią Fmoc/tBu (metoda Merrifielda) na nośniku polimerowym, żywicy amidowej Fmoc-Rink Amide AM RAM (osadzenie 0,59 mmol/g, ORPEGEN Peptide Chemicals GmbH, Niemcy). Syntezę rozpoczęto poprzez 30 minutowe spęcznienie żywicy w dichlorometanie (DCM, POCH S.A., Polska). Po upływie czasu żywicę przeniesiono do szklanego naczynka reakcyjnego, a następnie w celu usunięcia (deprotekcji) osłony Fmoc (9-fluorenylometoksykarbonylowa), blokującej grupę α-aminową, wytrząsano dwukrotnie (1 x 5 min., 1 x 10 min.) w 20% roztworze (v/v) piperydyny w N,N-dimetyloformamidzie (DMF, POCH

S.A., Polska). Po tym etapie żywicę przemywano wg następującego schematu:

x 2 min. DMF x 2 min. mieszaniną DMF/DCM (v/v, 1:1) x 2 min. DMF

PL 226 054 B1

Do oceny skuteczności etapu usuwania ugrupowania Fmoc użyto testu chloranilowego na obecność wolnych grup aminowych. Test przygotowano poprzez zmieszanie 4 kropli 2% chloranilu (Sigma Aldrich, Niemcy) w DMF oraz 4 kropli 2% acetaldehydu (Sigma Aldrich, Niemcy) w DMF. Zielone zabarwienie ziaren żywicy świadczyło o obecności wolnej grupy aminowej. Ostatnim etapem była reakcja acylowania, czyli przyłączania pierwszego Fmoc-chronionego aminokwasu (ORPEGEN Peptide Chemicals GmbH, Niemcy) do uprzednio przygotowanej żywicy. Reakcję tę prowadzono metodą aktywnych estrów przez 2 godz. W mieszaninie DMF/DCM (v/v, 1:1). Jako czynnika aktywującego użyto N,N'-diizopropylokarbodiimidu (DIC, IRIS Biotech GmbH, Niemcy), a przeciwracemizacyjnego 1-hydroksybenzotriazolu (HOBt, IRIS Biotech GmbH, Niemcy). Stosunek molowy DIC:Fmoc-AA:HOBt wynosił 1:1:1. Po upływie czasu żywicę przemywano jak powyżej, a następnie wykonywano ponownie test chloranilowy. Brak zabarwienia ziaren świadczył o całkowitym przyłączeniu Fmoc-chronionego aminokwasu do żywicy. W celu wydłużania łańcucha peptydowego etapy powtarzano w kolejności: deprotekcja grupy Fmoc, przemywanie, test chloranilowy, acylacja. Reszty kwasów: deoksycholowego (Sigma Aldrich, Niemcy) i Fmoc-p-aminobenzoesowego (PABA, Bachem AG GmbH, Szwajcaria) przyłączono analogicznie do Fmoc-chronionego aminokwasu. Odszczepianie gotowego związku z żywicy przeprowadzono w czasie ok. 1,5 godz. Na mieszadle magnetycznym, w mieszanie kwasu trifluorooctowego (TFA, IRIS Biotech GmbH, Niemcy) oraz wymiataczy jonowych tj.: wody oczyszczonej, fenolu (IRIS Biotech GmbH, Niemcy) i triizopropylosilanu (TIS, IRIS Biotech GmbH, Niemcy). Stosunek objętościowy mieszaniny wynosił TFA/H2O/TIS/fenol, 95:2:2:1, v/v/v/w. Po upływie czasu żywicę odsączono od mieszaniny, a przesącz wytrącono schłodzonym eterem dietylowym (POCH S.A., Polska). Odwirowany osad (surowy produkt) rozpuszczono w wodzie destylowanej z 10% dodatkiem kwasu octowego (AcOH, POCH S.A., Polska), zamrożono w ciekłym azocie i zliofilizowano (Liofilizator Alpha 102 LD Plus, Christ, Niemcy). Do syntezy użyto następujące L-aminokwasy, które w łańcuchu bocznym także były chronione:

Fmoc-Arg(Pbf)-OH

Fmoc-Lys(Boc)-OH

Fmoc-Pro-OH.

Uzyskany liofilizat surowych związków zanalizowano przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC). Próbki rozpuszczono w niewielkiej ilości wody dejonizowanej z dodatkiem 5% acetonitrylu (ACN, Witko, Polska). Analizy przeprowadzono z użyciem chromatografii Varian Prostar, na kolumnie C18 Phenomenex (4,6 x 150 mm) w metodzie 5-60% w układzie eluentów H2O + 0,1% TFA oraz ACN + 0,1% TFA. Szybkość przepływu wynosiła 2 ml/min., czas analizy 20 minut oraz długość fali 214 nm. Uzyskane związki poddano oczyszczaniu przy użyciu

RP-HPLC na chromatografie Knauer, z wykorzystaniem kolumny C18 Phenomenex Luna (21,2 x 250 mm, 15 μm). Czas oczyszczania wynosił 120 min., szybkość przepływu 8 ml/min., a pozostałe parametry metody były identyczne jak podczas analizy. Uzyskane czyste frakcje związków (powyżej 95%) zliofilizowano (Fig. 1, Fig. 2).

Tożsamość związków potwierdzono za pomocą spektrometrii MALDI-TOF MS (Spektrometr mas MALDI-TOF Biflex III Bruker, Niemcy). Otrzymane widma masowe potwierdziły, że zamiast zaplanowanych związków o sekwencjach: DOCA - PABA - KR - NH2, DOCA - RRPKK - NH2 uzyskano ich N_E-trifluoroacetylowane pochodne: DOCA - PABA - K_TFAR - NH₂, DOCA - RRPK_TFAK_TFA - NH₂. Pochodne powstały jako produkty uboczne syntezy i w przypadku związku DOCA - PABA - K_TFAR - NH₂ były produktem dominującym. Powstały na etapie zdejmowania związku ze stałego nośnika. W wyniku zbyt długiej ekspozycji na TFA, grupa aminowa w łańcuchu bocznym lizyny uległa trifluoroacetylowaniu. Uzyskano związki o następujących strukturach:

PL 226 054 B1

Rycina 6. Struktura przestrzenna związku o sekwencji: DOCA - RRPKtfaKtfa - NH2

Widma masowe uzyskanych nowych pochodnych przedstawiono na Fig. 3 i Fig. 4. Pozostałe parametry fizykochemiczne tych związków przedstawia tabela poniżej:

Tabela 1. Parametry fizykochemiczne uzyskanych pochodnych
Lp.	Sekwencja	Wzór sumaryczny	Obliczona masa molowa [g/mol]	Jon molekularny [M+H]+/ [M+Na]+ [g/mol]	Czas retencji tR [min.]
1	DOCA-PABA-KtfaR-NH2	C45H69N8O7F3	891,0	891,5	16,13
2	DOCA-RRPKtfaKtfa-NH2	C57H94N14O10F6	1249,4	1250,3	12,92
DOCA - kwas deoksycholowy, PABA -	kwas p-aminobenzoesowy, Ktfa - lizyna Ns - trifluoroacetylowana

Otrzymane pochodne poddano testom in vitro, w celu określenia ich przeciwdrobnoustrojowego potencjału, jak również zdolności do hemolizy ludzkich erytrocytów. W tym celu wyznaczono wartości minimalnego stężenia hamującego wzrost patogenów (MIC), wyrażone w μg/ml oraz minimalnego stężenia wywołującego hemolizę ludzkich czerwonych krwinek (MHC) wyrażonego w μg/ml.

P r z y k ł a d 2:

Badania aktywności przeciwbakteryjnej i przeciwgrzybiczej

Badania wykonano na 96-dołkowych polistyrenowych płytkach metodą seryjnych rozcieńczeń na płynnym podłożu w zakresie stężeń 1-512 μg/ml. W przypadku szczepów bakterii użyto pożywkę Mueller-Hinton II Broth (Becton Dickinson, Francja), podczas gdy dla szczepów grzybów bulion Sabo8

PL 226 054 B1 uraud Dextrose Broth (Sigma-Aldrich, Niemcy). Badane związki rozpuszczono w buforze fosforanowym (PBS, POCH S.A., Polska) zawierającym mniej niż 10% (v/v) dimetylosulfotlenku (DMSO, Sigma₅

Aldrich, Niemcy). W pojedynczym dołku płytki gęstość inokulum bakteryjnego wynosiła 5 x 10⁵ CFU/ml ₃ oraz 5 x 10³ CFU/ml w przypadku grzybów. Czas inkubacji wynosił 18 h (37°C) dla bakterii, dla grzybów 2 doby (25°C), po czym wizualnie odczytano uzyskane wyniki, które przedstawiono w tabeli poniżej (tab. 1). Ponadto, wyniki porównano z kontrolą (dołki nie zawierające badanych związków).

Szczepy bakteryjne i grzybów pozyskano z Polskiej Kolekcji Drobnoustrojów Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu. Badania wykonano zgodnie z procedurą CLSI (Clinical and Laboratory Standards Institute) w trzech niezależnych powtórzeniach.

Tabela 2. Aktywność badanych związków wobec szczepów bakterii Gram-dodatnich
Badany związek	S. aureus ATCC 25923	S. epidermidis PCM 2118 ATCC 14990	B. subtilis ATCC 6633
DOCA-PABA-KtfaR-NH2	2	2	4
DOCA-RRPKtfaKtfa-NH2	32	2	2

Tabela 3. Aktywność badanych związków wobec szczepów bakterii Gram-dodatnich
Badany związek	E. coli ATCC 25922	P. mirabilis PCM 543	P. aeruginosa ATCC 9027
DOCA-PABA-KtfaR-NH2	32	32	512
DOCA-RRPKtfaKtfa-NH2	512	64	>512

Tabela 4. Aktywność badanych związków wobec szczepów grzybów
Badany związek	C. albicans ATCC 1023	A. niger ATCC 16404
DOCA-PABA-KtfaR-NH2	64	64
DOCA-RRPKtfaKtfa-NH2	64	64

P r z y k ł a d 3:

Badanie aktywności hemolitycznej związków

Krew pochodząca od zdrowego dawcy została pobrana do fiolek, w których obecny był czynnik przeciwzakrzepowy - kwas etylenodiaminotetraoctowy (EDTA). Krew została poddana odwirowaniu (12 min., 500 x g), a następnie oddzielono niej erytrocyty, które przemyto 3-krotnie roztworem PBS. Związki poddano badaniu w zakresie stężeń 1-512 μg/ml, na 96-dołkowych płytkach. W każdym dołku znajdowało się 50 μΐ badanego związku oraz 50 μΐ zawiesiny czerwonych krwinek w PBS, tak, aby ich końcowe stężenie wynosiło 4% (v/v). Tak przygotowane płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 60 minut, a następnie odczytano wizualnie rezultaty badania. Aktywność hemolityczna związków została porównana z kontrolą pozytywną, którą stanowił 1% roztwór Tritonu X-100 (Sigma-Aldrich, Niemcy). Uzyskane rezultaty w postaci MHC przedstawiono poniżej.

Tabela 5. Aktywność hemolityczna badanych związków
Badany związek	MHC [pg/ml]	MHC [pM]
DOCA-PABA-KtfaR-NH2	16	17,9
DOCA-RRPKtfaKtfa-NH2	512	409,8

Opracowano pochodne kwasu deoksycholowego, które w pozycji C24 zawierają krótki łańcuch peptydowy zbudowany z zasadowych reszt aminokwasów lizyny i argininy. Grupa aminowa (N_s) w łańcuchu bocznym reszty lizyny została poddana trifluoroacetylacji, dzięki czemu uzyskano związki o wzorach: DOCA - PABA - K_tfAR - NH₂, DOCA - RRPK_tfAK_tfA - NH₂. Zarówno analizę, jak i proces

PL 226 054 B1 oczyszczania przeprowadzono za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPLC), a tożsamość otrzymanych pochodnych oceniono przy użyciu spektrometrii mas MALDI-TOF. Następnie, związki poddano testom biologicznym pod kątem ich aktywności przeciwdrobnoustrojowej wobec wybranych szczepów bakterii i grzybów. Dodatkowo, zbadano ich potencjał hemolityczny wobec ludzkich erytrocytów. Uzyskane dane wskazują, że obie pochodne były bardziej aktywne wobec szczepów bakterii Gram-dodatnich (MIC = 2-32 μg/ml) niż wobec szczepów bakterii Gram-ujemnych i grzybów. Szczep E. coli okazał się znacznie bardziej wrażliwy na działanie DOCA - PABA - KtfaR - NH₂ (MIC = 32 pg/ml) niż wobec DOCA - RRPKtfaKtfa - NH₂ (MIC = 512 pg//ml). Oba związki wykazały jednakowy potencjał wobec badanych szczepów grzybów (MIC = 64 pg//ml). Zaobserwowano również, że im wyższa była hydrofobowość związku tym większy był jego potencjał przeciwdrobnoustrojowy i zdolności hemolityczne wobec czerwonych krwinek. Pochodna DOCA - RRPK_tfaK_tfa - NH₂ nie wykazała potencjału hemolitycznego w zakresie działania terapeutycznego (MHC = 512 pg/ml), podczas gdy DOCA - PABA - K_TFAR - NH₂ posiadała potencjał hemolityczny jedynie w zakresie działania wobec bakterii Gram-ujemnych i grzybów (MHC = 16 pg/ml). Dzięki obiecującym właściwościom, związki te mogą znaleźć potencjalne wykorzystanie w terapii infekcji wywoływanych przez lekooporne szczepy bakteryjne.

Literatura

1. Enhsen A., Kramer W., Wess G. Bile acids in drug discovery. DDT 3, 1998, 409-418.

2. Savage P.B., Taotafa U., Ding B., Guan Q. Antibacterial properties of cationic steroid antibiotics. FEMS Microbiol. Lett. 217, 2002, 1-7.

3. Moore K.S., Wehrli S., Roder H., Rogers M., Forrest J.N. Jr., McCrimmon D., Zasloff M. Squalamine: An aminosterol antibiotic from the shark. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 1993, 1354-8.

4. Lee S., Kim K., Kumar T.S., Lee J., Kim S.K., Lee D.Y., Lee Y.K., Byun Y. Synthesis and Biological Properties of Insulin-Deoxycholic Acid Chemical Conjugates. Bioconjug. Chem. 16, 2005, 615-20.

5. Rivera D.G., Vasco A.V., Echemendia R., Concepción O., Perez C.S., Gavin J.A., Wessjohann L.A. A multicomponent conjugation strategy to unique N-steroidal peptides: first evidence of the steroidal nucleus as a β-turn inducer in acyclic peptides. Chem. Eur. J. 20, 2014, 13150-13161.

6. Kramer W., Wess G., Enhsen A., Falk E., Eloffmann A., Neckermann G., Schubert G., Urmann M. Modified bile acids as carriers for peptides and drugs. J. Control Release 46, 1997, 17-30.

7. Li C, Lewis M.R., Gilbert A.B., Noel M.D., Scoville D.H., Allman G.W., Savage P.B. Antimicrobial activities of amine and guanidine functionalized cholic acid derivatives. Antimicrob Agents Chemother. 43, 1999, 1347-9.

8. Bellini A.M., Mencini E., Quaglio M.P., Guarneri M. Antimicrobial activity of basic cholane derivatives. Part IX. Arch. Pharm. (Weinheim) 323, 1990, 201-205.

9. Bellini A.M., Vertuani G., Cavazzini G. Antibacterial activity of the derivatives of dehydro- and deoxy-cholic acids (author's transl.). Ann. Sclavo. 18, 1976, 469-478.

10. Bellini A.M., Vertuani G., Quaglio M.P., Cavazzini G. Bile acid derivatives with antimicrobial activity. Farmaco. Sci. 34, 1979, 967-978.

11. Jung G., Voelter W., Breitmaier E., Bayer E. Fluorine-19 nuclear magnetic resonance spectroscopy of sterol and bile acid trifluoroacetates. Steroids 15, 1970, 275-81.

12. Atherton E., Sheppard R.C. Solid phase peptide synthesis: A practical approach (The practical approach series). Oxford, Oxford University Press, 1989.

Claims (17)

1. Nowe pochodne peptydowe o wzorze ogólnym:

a) DOCA - PABA - KtfaR - NH₂,

b) DOCA - RRPKtfaKtfa - NH₂

PL 226 054 B1 gdzie:

DOCA - oznacza kwas deoksycholowy, 3a,12a-dihydroksy-53-cholanowy

PABA - oznacza kwas p-aminobenzoesowy, 4-aminobenzoesowy

K_tfaR - oznacza N_e-trifluoroacetylo-L-lizylo-L-arginina

RRPK_tfaK_tfa - oznacza L-arginylo-L-arginylo-L-prolylo-N_E-trifluoroacetylo L-lizylo-N_s-trifluoroacetylo-L-lizyna.

2. Sposób otrzymywania nowych związków zdefiniowanych w zastrzeżeniu nr 1, znamienny tym, że otrzymuje się w następujących etapach:

a) 30 minutowe spęcznienie żywicy amidowej Fmoc-Rink Amide AM RAM w DCM,

b) deprotekcja osłony Fmoc, blokującej grupę α-aminową w 20% roztworze piperydyny w DMF,

c) przemywanie żywicy kolejno w DMF, DCM/DMF, DMF,

d) przeprowadzenie testu chloranilowego,

e) reakcja acylowania poprzez przyłączenie Fmoc-chronionego aminokwasu,

f) odpłukanie, przemywanie żywicy kolejno w DMF, DCM/DMF, DMF,

g) przeprowadzenie testu chloranilowego,

h) powtarzanie etapów od b) do e) aż do momentu uzyskania pochodnych z zastrzeżenia 1 a) DOCA - PABA - KtfaR - NH2, oraz 1b) DOCA - RRPKtfaKtfa - NH2,

i) odszczepianie gotowej pochodnej 1a) oraz 1b) wraz z usunięciem osłon bocznych z żywicy mieszaniną TFA:wody oczyszczonej:TIS:fenol (95:2:2:1),

j) odsączenie, wytrącenie schłodzonym ciekłym azocie eterem, rozpuszczenie osadu w wodzie destylowanej z 10% CH3COOH, następnie zamrożenie w ciekłym azocie i liofilizacja,

k) analiza i oczyszczanie za pomocą HPLC,

l) spektrometria mas w celu potwierdzenia tożsamości.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że dla nowej pochodnej z zastrzeżenia 1a przyłącza się następujące aminokwasy arginina, lizyna, PABA, DOCA.

4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że dla nowej pochodnej z zastrzeżenia 1b przyłącza się następujące aminokwasy lizyna, lizyna, prolina, arginina, arginina, DOCA.

5. Kompozycja farmaceutyczna, znamienna tym, że zawiera jako substancję czynną nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz co najmniej jeden dopuszczalny farmaceutycznie nośnik i/lub rozcieńczalnik.

6. Kompozycja według zastrz. 5, znamienna tym, że ma zastosowanie przeciwbakteryjne i/lub przeciwgrzybicze.

7. Kompozycja według zastrz. 6, znamienna tym, że kompozycja ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

8. Kompozycja dezynfekująca, znamienna tym, że zawiera jako substancję nowy związek określony w zastrzeżeniu 1 oraz co najmniej jeden dopuszczalny chemicznie nośnik.

9. Kompozycja według zastrz. 8, znamienna tym, że ma zastosowanie przeciwbakteryjne i/lub przeciwgrzybicze.

10. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że jest przeznaczona do stosowania na mikroorganizmy izolowane z powierzchni materiałów medycznych.

11. Kompozycja według zastrz. 9, znamienna tym, że kompozycja ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

12. Zastosowanie nowych związków określonych w zastrzeżeniu 1 do wytwarzania środka leczniczego do leczenia chorób wywołanych aktywnością bakteryjną i/lub grzybiczą.

13. Zastosowanie według zastrz. 12, znamienne tym, że wytworzony środek leczniczy korzystnie wykazuje działanie przeciwbakteryjne w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i/lub Gram-ujemnych oraz przeciwgrzybicze.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.

PL 226 054 B1

15. Zestaw do hamowania wzrostu bakteryjnego i/lub grzybiczego, znamienny tym, że składa się z dwóch pochodnych peptydowych zdefiniowanych w zastrzeżeniu 1.

16. Zestaw według zastrz. 15, znamienny tym, że wykazuje działanie przeciwbakteryjne w stosunku do bakterii Gram-dodatnich i/lub Gram-ujemnych oraz przeciwgrzybicze.

17. Zastosowanie według zastrz. 16, znamienne tym, że ma korzystne zastosowanie do mikroorganizmów wybranych z grupy Staphylococcus ureus, Staphylococcus epidermidis, Bacillus subtilis, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Pseudomonas aeruginosa, Candida albicans, Aspergillus Niger.