PL226114B1 - Sposob wytwarzania nowych kaset zawierajacych region wielokrotnego klonowania (MCS) oraz sekwencje promotorowe i wzmacniajace do wektorow binarnych przeznaczonych do przejsciowej i stalej ekspresji bialek w roslinach - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych kaset zawierających region wielokrotnego klonowania (MCS) oraz sekwencje promotorowe i wzmacniające do wektorów binarnych przeznaczonych do przejściowej i stałej ekspresji białek w roślinach.

Przedstawiony wynalazek ma zastosowanie w procedurach związanych z wprowadzaniem do roślinnych komórek biorcy, przy udziale bakterii Agrobacterium tumefaciens, sekwencji transgenów oraz ich ekspresji w tych komórkach.

Stosowane w biotechnologii plazmidowe wektory stanowią zmodyfikowane warianty kolistych cząsteczek kwasu dezoksyrybonukleinowego, które obok bakteryjnego chromosomu mogą występować w komórkach niektórych gatunków bakterii. Taki plazmidowy DNA ulega autonomicznej replikacji w komórkach gospodarza, a geny zlokalizowane w obrębie tych cząsteczek DNA nie są niezbędne komórce do przeżycia i często odpowiedzialne są za kodowanie enzymów nadających bakteriom np. odporność na antybiotyki [Khan, S.A., Novick, R.P. (1983) Complete nucleotide sequence of pT181, a tetracycline resistance plasmid from Staphylococcus aureus. Plasmid 10, 251-259; Peng, X., Holz, I., Zillig, W., Garrett R.A., She Q. (2000) Evolution of the family of pRN plasmids and their integrasemediated insertion into the chromosome of the crenarchaeon Sulfolobus solfataricus. J. Mol. Biol. 303, 449-454; McClelland, M., Sanderson, K.E., Spieth, J., et al. (2001) Complete genome sequence of Salmonella enterica serovar typhimurium LT2. Nature 413, 852-856; Okinaka, R.T., Cloud, K., Hampton, O., et al. (1999) Sequence and organization of pXO1, the large Bacillus anthracis plasmid harboring the anthrax toxin genes. J. Bacteriol. 181,6509-6515]. Plazmidy biorą również udział w horyzontalnym transferze genów pomiędzy bakteriami, podczas którego cząstka plazmidowego DNA przekazywana jest z komórki-dawcy do komórki-biorcy [Harrison, E. Brockhurst, M.A. (2012). Plasmidmediated horizontal gene transfer is a coevolutionary process. Trends Microbiol. 20 (6): 262-7). W komórce biorcy taki plazmid ulega autonomicznej replikacji nadając gospodarzowi nowe cechy fenotypu. Wykorzystując powyższe właściwości plazmidów, a mianowicie ich zdolność do wydajnej autonomicznej replikacji w komórkach bakteryjnych, możliwe było opracowanie takich cząsteczek DNA, dzięki którym możliwe jest wprowadzanie sekwencji genów naturalnie niewystępujących w obrębie genomu biorcy [Brown, T. (2006). Gene cloning and DNA analysis: an introduction. Cambridge, MA: Blackwell Pub. ISBN 1-4051-1121-6). W takim przypadku wprowadzony gen, tzw. transgen, ulegał będzie wydajnej replikacji oraz ekspresji w komórkach biorcy. Wytworzenie odporności na żądany antybiotyk kodowany przez plazmid wstępnie selekcjonuje komórki, które przyjęły transgen od tych, które go nie posiadają. Stosowane w biologii molekularnej wektory plazmidowe stanowią modyfikacje swoich wyjściowych wariantów. Każdy wektor plazmidowy charakteryzuje się obecnością genów niezbędnych do jego wydajnej amplifikacji w komórce, przede wszystkim miejsca startu replikacji, tzw. ori replikacji. Ponadto w obrębie wektora znaleźć się mogą sekwencje silnych promotorów do ekspresji genów w komórkach biorcy, geny markerowe związane z nadaniem transformowanym komórkom charakterystycznych cech genotypowych dla łatwej ich identyfikacji i selekcji spośród komórek niestransformowanych. Istotnym jest również umieszczenie w obrębie plazmidu regionów umożliwiających wprowadzanie do wektora dowolnych genów poddawanych klonowaniu (powielaniu). Takie regiony wielokrotnego klonowania (MCS, ang. multi-cloning sites) to sekwencje charakteryzujące się obecnością precyzyjnie wyznaczonych fragmentów DNA specyficznie rozpoznawanych przez odpowiednie enzymy restrykcyjne. Enzymy te generują odpowiednie końce w cząstce DNA umożliwiające połączenie i wprowadzenie w obręb plazmidu sekwencji dowolnej wstawki (insertu). Regiony MCS bardzo często umieszczane są wewnątrz sekwencji genu reporterowego. Jego ekspresja doprowadza do powstania białka enzymatycznego, którego aktywność można określić na podstawie fenotypu transformantów, które przyjęły plazmid. Zatem wprowadzenie transgenu w obręb MCS przerywa ramkę odczytu genu markerowego, przez co nie dochodzi do translacji białka reporterowego, a fenotyp transformantów nie zmienia się. Stanowi to dodatkowe potwierdzenie obecności klonowanego genu w wektorze.

Wektory plazmidowe posiadają ograniczony i charakterystyczny zakres gospodarzy, w których ulegać mogą replikacji, co jest związane z różnymi mechanizmami kontroli powielania tych konstruktów w komórkach biorcy. Ponadto, wektory można modyfikować tak, aby miały one konkretne zastosowanie, np. prowadzenie nadekspresji białka w celu nadania gospodarzowi nowego fenotypu, czy syntezę dwuniciowych cząsteczek RNA indukujących procesy związane z potranskrypcyjnym wyciszaniem ekspresji genów. W kontekście badań prowadzonych z wykorzystaniem systemu roślinnego,

PL 226 114 B1 w celu przeprowadzenia w roślinach ekspresji wybranych białek, wykorzystuje się zmodyfikowane wektory plazmidowe wyizolowane z Agrobacterium tumafaciens lub A. rhizogenes. Te fitopatogeniczne bakterie glebowe porażają wiele gatunków roślin przeprowadzając w zainfekowanych tkankach lokalną spontaniczną transgenezę [Fraley, R.T., Rogers, S.G., Horsch, R.B. (1986) Genetic transformation in higher plants. Crit. Rev. Plant Sci. 4, 1-46]. Proces ten związany jest bezpośrednio z obecnością plazmidu Ti. Plazmid ten koduje geny wirulencji (vir) oraz fragment T-DNA, w obrębie którego występują geny związane z metabolizmem roślinnych cytokinin lub auksyn (regulatorów podziałów komórek). Geny vir zaangażowane są w proces transgenezy, podczas którego fragment T-DNA zostaje wycięty z plazmidu Ti i zintegrowany z genomowym DNA biorcy [Jin, S., Komari, T., Gordon, M.P., Nester, E.W. (1987) Genes responsible for the supervirulence phenotype of Agrobacterium tumefaciens A281. J. Bacteriol. 169, 4417-4425]. Zmodyfikowane Ti-pochodne warianty plazmidów ekspresyjnych zawierają w swojej sekwencji przede wszystkim regiony wirulencji oraz kasetę T-DNA, która zostanie fizycznie włączona w genom gospodarza [Hellens, R.P., Mullineaux, P., Klee, H. (2000) Technical focus: a guide to Agrobacterium binary Ti vectors. Trends Plant Sci. 10, 446-451]. Inne rozwiązanie dotyczy podziału plazmidu Ti na dwa oddzielne plazmidy, kompatybilne względem siebie, z których jeden zawiera sekwencję T-DNA, drugi (pomocniczy) koduje geny vir [Hellens, R.P., Edward, E.A., Leyland, N.R., Bean, S., Mullineaux, P.M. (2000) pGreen: a versatile and flexible binary Ti vector for Agrobacterium-mediated plant transformation. Plant Mol. Biol. 42, 819-832]. W opisanym przypadku manipulacjom genetycznym podlega tylko plazmid z sekwencją T-DNA. Jednakże jego replikacja w A. tumefaciens jest możliwa wyłącznie obecności plazmidu kodującego geny vir [Hoekema, A., Hirsch, P.R., Hooykaas, P.J.J., Schilperoort, R.A. (1983) A binary plant vector strategy based on separation of vir- and T-region of the Agrobacterium tumefaciens Ti-plasmid. Nature 303, 179-180]. Wykorzystując te właściwości T-DNA plazmidu Ti A. tumefaciens możliwym było przygotowanie odpowiednich kaset ekspresyjnych, które umożliwiają przeprowadzenie produkcji białka w komórkach roślinnych. Ekspresyjna kaseta w tym przypadku to zmodyfikowany fragment T-DNA, w obrębie którego zlokalizowano kolejno: silny konstytutywny promotor ulegający aktywacji w komórkach roślinnych, miejsce wielokrotnego klonowania oraz sekwencję sygnału poliadenylacji oraz terminator. Promotor i terminator to sekwencje regulujące transkrypcję umiejscowionego pomiędzy nimi insertu. O wyborze odpowiedniego promotora decyduje kilka czynników, m.in. sposób jego aktywacji (promotory indukowane) czy tkankowa lub organowa specyficzność. Najczęściej stosowanym w biotechnologii promotorem jest sekwencja 35S izolowana z wirusa mozaiki kalafiora (CaMV). Promotor 35S należy do promotorów konstytutywnych, aktywnych zarówno w tkankach roślin jedno- jaki dwuliściennych [Battraw, M.J., Hall, T.C. (1990). Histochemical analysis of CaMV 35S promoter-bglucuronidase gene expression in transgenic rice plants. Plant Mol. Biol. 15: 527-538; Benfey, P.N., Ren, L., Chua, N.-H. (1990). Tissue-specific expression from CaMV 35S enhancer subdomains in early stages of plant development. EMBO J. 9:1677-1684]. Inne promotory konstytutywne to np. promotor genu aktyny (Act2, wyizolowany z Arabidopsis thaliana) czy ubikwityny (Ubi1 z Zea mays). Oprócz sekwencji T-DNA, ekspresyjne wektory plazmidowe posiadają miejsca inicjacji ich replikacji w E. coli oraz A. tumefaciens oraz geny nadające odporność na antybiotyk ww. bakteriom. Zakres wprowadzanych sekwencji transgenów do tego typu wektorów związany jest między innymi z ilością specyficznych miejsc restrykcyjnych zlokalizowanych w obrębie MCS wektora.

Celem wynalazku jest przygotowanie zmodyfikowanych kaset regionu wielokrotnego klonowania binarnych wektorów ekspresyjnych, które to wektory umożliwiają przejściową oraz stałą produkcję białek w roślinach. W wynalazku w wektorze wyjściowym pCAMBIA1381Z podstawiono kasetę pUC8:GUSA dwoma wariantami kasety regionów MCS wektorów ekspresyjnych wzbogaconych o sekwencje dla dodatkowych miejsc restrykcyjnych, oraz tym, iż jedna z tych kaset poprzedzona została sekwencją regionu regulującego (wzmacniającego) translację białka, produkowanego przy użyciu wektora ekspresyjnego posiadającego taką kasetę. Eliminacja sekwencji genu GUSA z wektora wyjściowego miała na celu bezpośrednie połączenie wstawianej kasety polilinkera z sekwencją terminatora transkrypcji znajdującego się w tym wektorze. Opisany wynalazek ma zastosowanie w procedurach związanych z wprowadzaniem do roślinnych komórek biorcy, przy udziale bakterii Agrobacterium tumefaciens, sekwencji transgenów oraz ich ekspresji w tych komórkach. Poszerzony zakres miejsca wielokrotnego klonowania znacznie poprawia możliwości wprowadzania sekwencji żądanych genów mających ulec ekspresji w transformowanych komórkach. Ekspresja taka może mieć charakter przejściowy i lokalny, dotyczący ograniczonych tkanek, lub może przebiegać w sposób stały, we wszystkich komórkach biorcy, w których lokalizuje się wektor.

PL 226 114 B1

Istotą wynalazku jest sposób wytwarzania nowych kaset zawierających region wielokrotnego klonowania (MCS) oraz sekwencje promotorowe i wzmacniające do wektorów binarnych, który przebiega w pięciu etapach: w pierwszym etapie prowadzi się propagację plazmidów wyjściowych oraz pochodnych w systemie bakteryjnym z wykorzystaniem kompetentnych komórek E. coli, w tym celu 100 ng wektora dodaje się do 50 μΐ chemicznie kompetentnych komórek E. coli szczepu TOP10, po czym inkubuje w łaźni lodowej w temperaturze 4°C przez 30 minut, następnie taką mieszaninę komórek ogrzewa się przez 30 sekund w temperaturze 42°C, a dalej szybko schładza do temperatury 4°C, zaś po 2 minutach inkubacji w łaźni lodowej, do komórek dodaje się 3 ml płynnej pożywki SOC, dalej hodowlę miesza się przy 160 rpm w inkubatorze mikrobiologicznym w temperaturze 37°C przez 16-18 godzin, a następnie zawiesinę komórek osadza się na dnie probówek, a plazmidowy DNA izoluje, w drugim etapie przeprowadza się wyłączenie sekwencji pUC8:GUSA z prowektora pCAMBIA1381Z i uzyskanie zmodyfikowanego plazmidu pCAMBIA1381ZAGUS, w tym celu plazmidowy DNA pCAMBIA1381Z, uzyskany wcześniej metodą propagacji w E. coli, poddaje się trawieniu restrykcyjnemu poprzez inkubację z enzymami restrykcyjnymi Ncol oraz BstEII, ograniczających swym zasięgiem MCS pUC8 oraz sekwencję GUSA wektora wyjściowego, przy czym inkubację prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C, a uzyskane produkty trawienia restrykcyjnego rozdziela się metodą elektroforezy w 1% żelu agarozowym zawierający barwnik Midori Green, gdzie elektroforezę prowadzi się w ciągu 90 minut przy napięciu 100 V, dalej DNA wizualizuje się w świetle UV, a następnie wyodrębnia liniową formę wektora o wielkości ok. 10 000 pz, dalej w trzecim etapie uzyskuje się kasety MCS poprzez wykorzystanie dwóch komplementarnych względem siebie syntetyczne oligonukleotydy: CAS1 oraz CAS2, które się syntezuje, a uzyskany liofilizat zawiesza w bidestylowanej wodzie, następnie 1000 pmoli zawiesiny CAS1 miesza się z taką samą ilością CAS2, po czym taką mieszaninę ogrzewa w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut w celu ich denaturacji, dalej mieszaninę wolno schładza się do temperatury 4°C, aż do utworzenia dwuniciowej struktury kasety CAS1/2, kolejno przechodzi się do czwartego etapu gdzie wprowadza się zmodyfikowane kasety MCS do pCAMBIA1381ZAGUS poprzez insercję dwuniciowej kasety MCS do pCAMBIA1381ZAGUS uzyskanej na drodze ligacji 2 nmoli dwuniciowego fragmentu CAS1/2 prowadzonej przez 16 godzin ze zmodyfikowanym wektorem pCAMBIA w obecności 5 jednostek (U) ligazy T4 DNA, następnie dodaje się 2 μl mieszaniny ligacyjnej do transformacji kompetentnych komórek E. coli TOP10, następnie mieszaninę DNA oraz komórki bakteryjne inkubuje się przez 30 minut w łaźni lodowej, a następnie gwałtownie ogrzewa przez 30 sekund w temperaturze 42°C i schładza w łaźni lodowej przez 2 minuty, po czym dodaje się 500 μl płynnej pożywki SOC i przy wytrząsaniu 160 rpm, inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37°C, dalej komórki osadza się na dnie probówki, usuwa supernatant, a osad zawiesza w 150 μl pożywki SOC i rozprowadza na powierzchni zestalonej pożywki LB (0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy; 1% (w/o) trypton; 1% (w/o) NaCI; 1,5% agar (w/o)) wzbogaconej kanamycyną (50 μg/ml, dalej komórki inkubuje się przez 16 godzin w temperaturze 37°C, po czym z wybranych transformantów izoluje się plazmidowy DNA, który poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym Mlul, następnie w piątym etapie wprowadza się do pPW sekwencję podwojonego promotora wirusa mozaiki kalafiora CaMV uzyskaną poprzez amplifikację starterami specyficznie amplifikującymi promotor 35S z lub bez sekwencją liderową Ω wirusa TMV, przy czym łańcuchową reakcję polimerazy PCR prowadzi się w obecności 2,5 U polimerazy DNA izolowanej z Pyrococcus furiosus, 200 ng mieszaniny czterech deoksyrybonukleotydów, 40 ng matrycy DNA oraz odpowiednich starterów w buforze reakcyjnym, dalej uzyskaną mieszaninę reakcyjną wstępnie denaturuje się przez 3 minuty w temperaturze 95°C, a następnie przeprowadza się 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund, 72°C 25 sekund, dalej produkty łańcuchowej reakcji polimerazy PCR rozdziela się w 1% żelu agarozowym, a po elektroforezie DNA izoluje się z żelu, a następnie poddaje trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ncol oraz EcoRI i liguje z wektorem pPW trawionym tymi samymi enzymami.

Korzystnym jest, gdy w trzecim etapie na drodze hybrydyzacji oligonukleotydów CAS1: CAT GGG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA CGC GTA AGC TTG, i CAS2: GTC ACC AAG CTT ACG CGT GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG GGT ACC GAG CTC GAA TTC C, uzyskuje się dwuniciową kasetę DNA CAS1/2, przy czym 1000 pmoli oligonukleotydu CAS1 miesza się z taką samą ilością CAS2, mieszaninę podgrzewa się przez 5 minut w temperaturze 95°C i stopniowo, powoli schładza do 4°C do uzyskania dwuniciowej kasety CAS1/3.

Korzystnym jest również, gdy w etapie czwartym na drodze enzymatycznej ligacji - połączenia kasety CAS1/1 z wektorem pCAMBIA1381ZAGUS uzyskuje się nowy wektor pPW, przy czym reakcję

PL 226 114 B1 prowadzi się w obecności 2 nmoli kasety CAS1/2, wektora pCAMBIA1381ZAGUS oraz 5 jednostek ligazy DNA faga T4, przy czym reakcję prowadzi się w ciągu 16 godzin w temperaturze 4°C, po czym 2 μΐ mieszaniny wykorzystuje się do transformacji komórek E. coli, z których następnie izoluje się żądany plazmidowy DNA pPW.

Korzystnym jest także, gdy w etapie piątym na drodze łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) uzyskuje się kasetę promotora 35S, przy czym reakcję prowadzi się w obecności startera Caprof: GAGCCATGGTCCAATCCCACAAAAATC oraz Caprpr1: ATAGAATTCATGGTAATTGTAAATGTA, gdzie reakcję przeprowadza się wykorzystując startery oraz 200 ng mieszaniny czterech dezoksyrybonukleotydów,

2,5 jednostek polimerazy DNA izolowanej z P. furiosus oraz 40 ng matrycowego DNA, które stanowi dowolny plazmid zawierający sekwencję promotora 35S wirusa CaMV, a proces prowadzi się poprzez podgrzanie mieszaniny przez 3 minuty w temperaturze 95°C, po czym następuje 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund oraz 72°C 25 sekund, następnie, specyficzny produkt amplifikacji trawi się enzymami restrykcyjnymi Ncol i EcoRI i liguje z wektorem pPW, a produkty ligacji stosuje się do transformacji E. coli, po czym żądany wektor izoluje się z transformantów jako plazmidowy DNA pPW18.

Zwłaszcza korzystnym jest, gdy w etapie piątym na drodze łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) uzyskuje się kasetę promotora 35S:omega TMV, przy czym reakcję prowadzi się w obecności startera Caprof: GAGCCATGGTCCAATCCCACAAAAATC oraz Caprpr2: TATGAATTCCGTGTCCTCTCCAAATGA, gdzie reakcję przeprowadza się z wykorzystaniem starterów oraz 200 ng mieszaniny czterech dezoksyrybonukleotydów, 2,5 jednostek polimerazy DNA izolowanej z P. furiosus oraz 40 ng matrycowego DNA, które stanowią dowolny plazmid zawierający sekwencję promotora 35S wirusa CaMV połączoną z sekwencją omega TMV, proces prowadzi się podgrzewając mieszaninę przez 3 minuty w temperaturze 95°C, po czym następuje 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund oraz 72°C 25 sekund, następnie, specyficzny produkt amplifikacji trawi się enzymami restrykcyjnymi Ncol i EcoRI i liguje z wektorem pPW. Produkty ligacji wykorzystuje się do transformacji E. coli, po czym żądany wektor izoluje się z transformantów jako plazmidowy DNA pPW28.

Dzięki zastosowaniu rozwiązania według wynalazku uzyskano następujące efekty technicznoużytkowe: wynalazek stanowi zmodyfikowaną wersję ekspresyjnego wektora plazmidowego wywodzącego się z konstruktu pCAMBIA. Modyfikacja ww. wektora polegająca na wprowadzeniu w obręb wyjściowego konstruktu: 1) sekwencji promotora 35S wirusa mozaiki kalafiora (CaMV), 2) sekwencji liderowej wzmacniacza translacji wirusa TMV oraz 3) dodatkowych miejsc restrykcyjnych. Z sekwencji wektora wyjściowego wycina się sekwencję genu GUSA, co umożliwia wprowadzenie kasety MCS bezpośrednio pomiędzy sekwencje promotora oraz terminatora. Dzięki temu uzyskuje się możliwość klonowania i prowadzenia przejściowej lub stałej ekspresji wybranych genów w systemie roślinnym.

Wynalazek w przykładowym wykonaniu został zilustrowany na rysunkach, gdzie fig. 1 przedstawia plazmid macierzysty pCAMBIA1381Z, w którym zaznaczono miejsce wielokrotnego klonowania, fig. 2 przedstawia produkt hybrydyzacji (CAS1/2) oligonukleotydów CAS1 oraz CAS2, fig. 3 przedstawia wynik przejściowej ekspresji białka GFP w liściu N. benthamiana, gdzie szare pola zlokalizowane w obrębie liścia wskazują miejsca ekspresji białka GFP, fig. 4 przedstawia wynik identyfikacji białka GFP w żelu PAGE, przy czym białko izolowano z liści infiltrowanych zawiesiną A. tumefaciens transformowanych konstruktem pPW28::GFP (K9) oraz z liści nie poddanych infiltracji (K8), fig. 5 przedstawia kasetę promotora 35S CaMV i sekwencję MCS wektora pPW18 (strzałki ograniczają sekwencję promotora, a ramką zaznaczono sekwencję liderową omega TMV oraz MCS), fig. 6 przedstawia schemat wytworzonego wektora pPW18 z uwzględnioną orientacją promotora 35S CaMV i lokalizacją sekwencji liderowej omega TMV, fig. 7 przedstawia produkt amplifikacji sekwencji promotora 35S wraz z regionem omega TMV, fig. 8 przedstawia kasetę promotora 35S CaMV i sekwencję MCS wektora pPW28 (strzałki ograniczają sekwencję promotora, a ramką zaznaczono region MCS), fig. 9 przedstawia schemat wytworzonego wektora pPW28 z uwzględnioną orientacją promotora 35S CaMV, fig. 10 przedstawia produkt amplifikacji sekwencji promotora 35S bez regionu omega TMV.

Sposób wytwarzania nowych kaset zawierających region wielokrotnego klonowania (MCS) oraz sekwencje promotorowe i wzmacniające do wektorów binarnych przeznaczonych do przejściowej i stałej ekspresji białek w roślinach ilustrują przykłady:

Przygotowanie wektorów binarnych pPW28 oraz pPW18

Podstawę do przygotowania wektora ekspresyjnego pPW18 oraz pPW28 stanowił plazmid pCAMBIA1381Z. Wektor ten wywodzi się od zmodyfikowanego plazmidu Ti naturalnie występującego u bakterii Agrobacterium tumefaciens. Wektor jest tak przygotowany, że posiada sekwencje ori regulu6

PL 226 114 B1 jące jego replikację w E. coli oraz A. tumefaciens, niesie gen odporności na kanamycynę (bakterie), sekwencje brzeżne LB oraz RB okalające kasetę transformacji roślin, w obrębie której znajduje się region wielokrotnego klonowania, gen markerowy β-glukuronidazy oraz sekwencja terminatora transkrypcji. W wektorze natomiast brakuje sekwencji promotora transkrypcji rozpoznawanego przez roślinne polimerazy RNA.

PRZYKŁADY

Etap 1. Propagacja plazmidowego DNA

Propagację (namnażanie) plazmidów wyjściowych oraz pochodnych prowadzono w systemie bakteryjnym z wykorzystaniem kompetentnych komórek E. coli. W tym celu 100 ng wektora dodawano do 50 pl chemicznie kompetentnych komórek E. coli szczepu TOP10 i inkubowano w łaźni lodowej (4°C) przez 30 minut. Następnie taką mieszaninę komórek ogrzewano przez 30 sekund w temperaturze 42°C po czym szybko schładzano do temperatury 4°C. Po 2 minutach inkubacji w łaźni lodowej, do komórek dodawano 3 ml płynnej pożywki SOC 2% (w/o) trypton, 0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy, 0,05% (w/o) NaCI, 2,5 mM KCI, 10 mM MgCI2, 10 mM MgSO4, 20 mM glukoza). Hodowlę mieszano (160 rpm) w inkubatorze mikrobiologicznym w temperaturze 37°C przez 16-18 godzin. Następnie zawiesinę komórek osadzano na dnie probówek a plazmidowy DNA izolowano z osadu z zastosowaniem przeznaczonego do tego celu zestawu komercyjnie dostępnych odczynników.

Etap 2. Wyłączenie (eliminacja) sekwencji pUC8:GUSA z prowektora pCAMBIA1381Z i uzyskanie zmodyfikowanego plazmidu pCAMBIA1381ZAGUS

W celu wyłączenia z sekwencji wektora wyjściowego, tj. pCAMBIA1381Z (fig. 1), MSC pUC8 oraz genu markerowego β-glukuronidazy (GUSA), plazmidowy DNA, uzyskany wcześniej metodą propagacji w E. coli, poddano trawieniu odpowiednimi enzymami restrykcyjnymi. Plazmidowy DNA inkubowano w obecności enzymów restrykcyjnych Ncol oraz BstEII ograniczających swym zasięgiem MCS pUC8 oraz sekwencję GUSA wektora wyjściowego. Inkubację prowadzono przez 4 godziny w temperaturze 37°C z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych przeznaczonych do tego celu zestawów odczynników. Produkty trawienia restrykcyjnego rozdzielano metodą elektroforezy w 1% żelu agarozowym wzbogaconym w barwnik Midori Green. Elektroforezę prowadzono w ciągu 90 minut przy napięciu 100 V. DNA wizualizowano w świetle UV. Liniową formę wektora o wielkości ok. 10 000 pz odzyskiwano z żelu wykorzystując komercyjnie dostępne zestawy odczynników. Pomiar stężenia tak uzyskanego preparatu DNA oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali λ=Α260, przy której występuje maksimum ekstynkcji dla kwasów nukleinowych.

Etap 3. Przygotowanie zmodyfikowanej kasety MCS

Do uzyskania kasety MCS wykorzystano dwa komplementarne względem siebie syntetyczne oligonukleotydy: CAS1 oraz CAS2, syntezę których zlecono firmie komercyjnej. Uzyskany liofilizat zawieszano w bidestylowanej wodzie uzyskując końcowe stężenie 100 pM. 10 pl zawiesiny CAS1 mieszano z taką samą ilością CAS2, a następnie ogrzewano w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut w celu ich denaturacji. Po tym czasie mieszaninę wolno schładzano do temperatury 4°C, w celu utworzenia dwuniciowej struktury kasety CAS1/2 (fig. 2). Obecność odtworzonej struktury dwuniciowej potwierdzano metodą elektroforezy w 2% żelu agarozowym wzbogaconym z barwnik Midori Green. Tak przygotowany konstrukt obdarzony był na końcach miejscami restrykcyjnymi EcoRI oraz BstEII komplementarnymi do liniowego plazmidu pCAMBIA1831ZAGUS trawionego ww. enzymami.

Etap 4. Wprowadzenie zmodyfikowanej kasety MCS do pCAMBIA1381ZAGUS.

W celu wprowadzenia dwuniciowej kasety MCS do pCAMBIA1381ZAGUS, 2 pl fragmentu CAS1/2 ligowano przez 16 godzin ze zmodyfikowanym wektorem pCAMBIA w obecności 5 jednostek (U) ligazy T4 DNA. 2 pl mieszaniny ligacyjnej wykorzystano do transformacji kompetentnych komórek E. coli TOP10. W tym celu mieszaninę DNA oraz komórek bakteryjnych inkubowano przez 30 minut w łaźni lodowej, a następnie gwałtownie ogrzewano przez 30 sekund w temperaturze 42°C i schładzano w łaźni lodowej przez 2 minuty, po czym dodawano 500 pl płynnej pożywki SOC i wytrząsając (160 rpm) inkubowano przez 60 minut w temperaturze 37°C. Po tym czasie komórki osadzano na dnie probówki, usuwano supernatant a pelet zawieszano w 150 pl pożywki SOC i rozprowadzano na powierzchni zestalonej pożywki LB (0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy; 1% (w/o) trypton; 1% (w/o) NaCI; 1,5% agar (w/o)) wzbogaconej kanamycyną (50 pg/ml). Komórki inkubowano przez 16 godzin w temperaturze 37°C. Z losowo wybranych transformantów wyizolowano plazmidowy DNA, który poddano trawieniu enzymem restrykcyjnym Mlul w celu potwierdzenia obecności zmodyfikowanej kasety w uzyskanym wektorze pPW. Produkty trawienia restrykcyjnego rozdzielano metodą elektroforezy w 1% żelu agarozowym z Midori Green.

PL 226 114 B1

Etap 5. Wprowadzenie do pPW sekwencji podwojonego promotora wirusa mozaiki kalafiora CaMV

W tym celu na podstawie danych dostępnych w Banku Genów zaprojektowano startery specyficznie amplifikujące promotor 35S z (fig. 5) lub bez (fig. 8) sekwencji liderowej Ω wirusa TMV. Reakcję PCR (łańcuchowa reakcja polimerazy) prowadzono w obecności 2,5U polimerazy DNA izolowanej z Pyrococcus furiosus, 200 ng mieszaniny czterech deoksyrybonukleotydów, 40 ng matrycy DNA oraz odpowiednich starterów (Tab. 1) w buforze reakcyjnym (specyfikacja wg producenta). Mieszaninę reakcyjną wstępnie denaturowano przez 3 minuty w temperaturze 95°C, a następnie przeprowadzono 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund, 72°C 25 sekund. Produkty PCR rozdzielano w 1% żelu agarozowym. Specyficzne produkty amplifikacji (fig. 7 i fig. 10) po elektroforezie DNA izolowano z żelu, a następnie poddano trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ncol oraz EcoRI i ligowano z wektorem pPW trawionym tymi samymi enzymami. Do ligacji wykorzystano 10 ng trawionego wekto ra pPW oraz 60 ng wstawki DNA (insert) oraz 5 U ligazy T4. 2 μΐ mieszaniny ligacyjnej wykorzystano do transformacji kompetentnych komórek E. coli prowadzonej według procedury opisanej w Etapie 4. Z losowo wybranych transformantów izolowano DNA, który następnie sekwencjonowano z użyciem startera terseq. Pozwoliło to na potwierdzenie obecności kasety MCS w wektorze pPW28 oraz pPW18, w którym jednocześnie potwierdzono obecność sekwencji liderowej Ω wirusa TMV (fig. 6 i fig. 9).

Analiza właściwości biologicznych wektora pPW28

W celu potwierdzenia biologicznej aktywności wektora pPW28 przeprowadzono doświadczenie oparte na przejściowej ekspresji w liściu białka zielonej fluorescencji (GFP), którego obecność w tkance można jednoznacznie określić. W tym celu z liści N. benthamiana ze stałą ekspresją białka GFP izolowano całkowity RNA. Całkowity RNA izolowano z wykorzystaniem komercyjnie dostępnych zestawów odczynników, a stężenie uzyskanego preparatu RNA oznaczano spektrofotometrycznie przy długości fali A260. RNA został wykorzystany do syntezy cDNA prowadzonej w obecności

6-nukleotydowych starterów losowych oraz odwrotnej transkryptazy M-MuLV. W tym celu 2 μg całkowitego RNA inkubowano z 200 ng mieszaniny heksamerów (5'NNN NNN3') w temperaturze 65°C przez 10 minut, a następnie schładzano w łaźni lodowej. Do takiej mieszaniny dodawano bufor reakcyjny (specyfikacja wg opisu producenta), 2 μl mieszaniny 10 mM deoksyrybonukleotydów oraz 200 U odwrotnej transkryptazy M-MuLV. Mieszaninę inkubowano przez 10 minut w temperaturze 25°C, 60 minut w 42°C następnie 75°C przez 5 minut. Uzyskany preparat cDNA wykorzystano do reakcji PCR. Gen białka GFP amplifikowano z wykorzystaniem starterów specyficznych vsGFP1 oraz vsGFP2, zaprojektowanych na podstawie danych z Banku Genów (Tab. 1). W tym celu wykonano reakcję PCR prowadzoną w obecności 0,5 μM mieszaniny starterów vsGFP1/2, 2 U polimerazy Pyrococcus furiosus, 200 ng mieszaniny czterech deoksyrybonukleotydów, 1 μl matrycy cDNA w buforze reakcyjnym (specyfikacja wg producenta). Mieszaninę reakcyjną wstępie denaturowano przez 3 minuty w temperaturze 94°C a następnie przeprowadzono 35 cykli: 94°C 20 sekund, 55°C 20 sekund, 72°C 15 sekund. Uzyskany produkt PCR o długości 720 pz trawiono w obecności enzymów EcoRI oraz Pstl i ligowano z wektorem pPW28 trawionym tymi samymi enzymami. 2 μl takiej mieszaniny ligacyjnej wykorzystano do transformacji kompetentnych komórek E. coli. Transformację E. coli przeprowadzono wg procedury opisanej w Etapie 4. Z transformantów wyizolowano plazmidowy DNA, który trawiono EcoRI/Pstl, a następnie sekwencjonowano w celu potwierdzenia obecności genu GFP. Jednocześnie przygotowano konstrukt genetyczny pPW28::2b, w obręb którego wklonowano gen białka 2b wirusa karłowatości orzecha ziemnego (Peanu stunt virus, PSV). Białko 2b jest supresorem wyciszania genów, przez co jego koekspresja z białkiem GFP wzmacnia i stabilizuje ekspresję genu GFP. Przejściowa ekspresja białka GFP w liściach Nicotiana benthamiana

W celu przeprowadzenia przejściowej ekspresji białka GFP w N. benthamiana, do kompetentnych komórek A. tumefaciens wprowadzano wektor pPW28::GFP (oraz pPW28::2b). Procedurę transformacji A. tumefaciens wykonano wg opisu podanego w Etapie 4. Transformanty hodowano w pożywce LB z kanamycyną (50 μg/ml) w temperaturze 28°C przez 16-18 godzin. Następnie bakterie osadzano na dnie probówki i zawieszano do uzyskania końcowego stężenia OD600=1.0. Zawieszone w buforze do infiltracji (10 mM MES pH 5.6, 10 mM MgCI₂, 100 μM acetosyringon) transformanty A. tumefaciens inkubowano przez co najmniej 2 godziny w temperaturze pokojowej, a następnie wykorzystując 2 ml strzykawkę bez igły infiltrowano (wstrzykiwano) pomiędzy górną i dolną blaszkę liścia N. benthamiana.

PL 226 114 B1

Identyfikacja ekspresji GFP w liściach N. benthamiana

Ekspresję GFP w liściu obserwowano 5 dni po infiltracji. Aktywność GFP wstępnie oceniano w świetle UV (lub innym źródle światła niebieskiego), w którym GFP emituje wyraźnie zieloną fluorescencję (fig. 3). W tym celu infiltrowane A. tumefaciens liście tytoniu umieszczono w źródle światła niebieskiego i fotografowano przy 60 sekundowej ekspozycji.

Ponadto obecność GFP dodatkowo analizowano w żelu poliakryloamidowym przygotowanym wg procedury opisanej przez Laemmli (1970). Wykorzystano do tego tkankę infiltrowanych liści, z których izolowano całkowite rozpuszczalne białko. Tkankę macerowano w buforze ekstrakcyjnym (50 mM Tris-HCI pH 8.0, 10 mM EDTA, 10 mM DTT, 18% glicerol) i wirowano 13000 rpm przez 10 minut w temperaturze 4°C. 40 pl supernatantu wprowadzano do studzienek 12% żelu poliakrylamidowego (grubość 1,5 mm, 10 cm x 10 cm) wzbogaconego w SDS. Elektroforezę prowadzono przy stałym napięciu 85 V w ciągu 2 godzin. Obecność GFP, w liściach oraz w żelu, identyfikowano w świetle UV (fig. 4). Identyfikacja w żelu produktu o wielkości około 30 kDa potwierdza obecność białka GFP oraz funkcjonalność wektora pPW28

W wyniku przeprowadzonych modyfikacji wektora wyjściowego (macierzystego, fig. 1) pCAMBIA1381Z przygotowano serię wektorów binarnych pPW, pPW18 oraz pPW28 (fig. 6, 9) umożliwiających przeprowadzenie stałej oraz przejściowej ekspresji białek w roślinach, w rozpatrywanym przypadku w N. benthamiana (fig. 3 i 4). Omawiane wektory charakteryzują się kilkoma zaletami, m.in. 1) szerokim zakresem miejsc restrykcyjnych zlokalizowanych w obrębie MCS, 2) obecnością sekwencji regulatorowej silnego i konstytutywnego promotora 35S z CaMV powyżej MCS, 3) oraz sekwencji wzmacniacza translacji (sekwencja liderowa) z TMV (fig. 6 i 9).

Przykład zastosowania:

Pula dostępnych komercyjnie wektorów binarnych umożliwiających ekspresją białek w tkankach roślin została wzbogacona o dwa kolejne konstrukty genetyczne: pPW18 oraz pPW28. Stanowią one alternatywę do tych plazmidów, które posiadają w obrębie swojej sekwencji ograniczoną ilość miejsc restrykcyjnych umożliwiających klonowanie i ekspresję wybranego transgenu. Wektory serii pPW posiadają kasetę MCS z 12 miejscami rozpoznawanymi przez klasyczne enzymy restrykcyjne wykorzystywane w inżynierii genetycznej. Wektory te stanowią podstawowe narzędzie przeznaczone do badania ekspresji białek, w tym wirusowych determinant patogeniczności, genów reporterowych czy kaset umożliwiających indukcję potranskrypcyjnego wyciszania ekspresji genów. Co więcej, wektor pPW28, pozbawiony jest sekwencji wzmacniającej translację, przez co może być wykorzystany w aplikacjach związanych z identyfikacją oraz badaniem właściwości wirusowych sekwencji wzmacniających syntezę białka. Wektory te zostaną wykorzystane w badaniach opartych na identyfikacji determinant patogeniczności oraz wewnętrznych miejsc wiązania rybosomy (IRES) kodowanych przez nowo opisanego wirusa nekrozy pomidora, ToTV (Tomato tornado virus).

PL 226 114 B1

T a b e l a 1. Startery wykorzystane podczas przygotowania wektorów pPW18 oraz pPW28.

	Sekwencja starterów 5’^ 3'
CAS1	CATGGGAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAG- TCGACCTGCAGGCATGCACGCGTAAGCTTG	Kaseta wielokrotnego klonowania, zawiera
CAS2	GTCACCAAGCTTACGCGTGCATGCCTGCAG- GTCGACTCTAGAGGATCCCCGGGTACCGAGCTCGAATTCC	wprowadzone dodatkowo miejsca restrykcyjne dla: Ncol, Mlul oraz BstEII
Caprof Capror1	GAGCCATGGTCCAATCCCACAAAAATC ATAGAATTCATGGTAATTGTAAATGTA	Amplifikacje sekwencji promotora 35S wirusa CaMV z (lub bez) se-
Capror2	TATGAATTCCGTGTCCTCTCCAAATGA	kwencji liderowej. Zaznaczono miejsca restrykcyjne: Ncol oraz EcoRI
vsGFP1	ATAGAATTCAAAAAAAAAACAATGGTGAGCAAGGGCGAG	Amplifikacja genu białka sGFP. Zaznaczono: miejsca restrykcyjne
vsGFP2	ATACTGCAGTTATTACTTGTACAGCTCGTC	EcoRI Pstl oraz sekwencję wiązania rybosomu, tzw. sekwencja Kozak; oczekiwana długość produktu: 720 pz
v2b1	TGAGAATTCAAAAAAAAAACAATGTCGAGTGTCGAGCAG	Amplifikacja genu białka 2bPSV; zaznaczono miejsca restrykcyjne EcoRI
v2b2	CGCCTGCAGTTATCAGGAATAACTACCCTC	oraz Pstl, sekwencja Kozak; oczekiwana długość produktu: ~300 pz
terseq proseq	CCCGATCTAGTAACATAG CGGATTCCATTGCCCAGC	Startery do sekwencjonowania wektora pPW

Zastrzeżenia patentowe

Claims (5)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób wytwarzania nowych kaset zawierających region wielokrotnego klonowania (MCS) oraz sekwencje promotorowe i wzmacniające do wektorów binarnych, znamienny tym, że przebiega w pięciu etapach:

   w pierwszym etapie prowadzi się propagację plazmidów wyjściowych oraz pochodnych w systemie bakteryjnym z wykorzystaniem kompetentnych komórek E. coli, w tym celu 100 ng wektora dodaje się do 50 μl chemicznie kompetentnych komórek E. coli szczepu TOP10, po czym inkubuje w łaźni lodowej w temperaturze 4°C przez 30 minut, następnie taką mieszaninę komórek ogrzewa się przez 30 sekund w temperaturze 42°C, a dalej szybko schładza do temperatury 4°C, zaś po 2 minutach inkubacji w łaźni lodowej, do komórek dodaje się 3 ml płynnej pożywki SOC, dalej hodowlę miesza się przy 160 rpm w inkubatorze mikrobiologicznym w temperaturze 37°C przez 16-18 godzin, a następnie zawiesinę komórek osadza się na dnie probówek, a plazmidowy DNA izoluje, w drugim etapie przeprowadza się wyłączenie sekwencji pUC8:GUSA z prowektora pCAMBIA1381Z i uzyskanie zmodyfikowanego plazmidu pCAMBIA1381ZAGUS, w tym celu plazmidowy DNA pCAMBIA1381Z, uzyskany wcześniej metodą propagacji w E. coli, poddaje się trawieniu restrykcyjnemu poprzez inkubację z enzymami restrykcyjnymi Ncol oraz BstEII, ograniczających swym zasięgiem MCS pUC8 oraz sekwencję GUSA wektora wyjściowego, przy czym inkubację prowadzi się przez 4 godziny w temperaturze 37°C, a uzyskane produkty trawienia restrykcyjnego rozdziela się metodą elektroforezy w 1% żelu agarozowym zawierający barwnik Midori Green, gdzie elektroforezę prowadzi się w ciągu 90 minut przy napięciu 100 V, dalej DNA wizualizuje się w świetle UV, a następnie wyodrębnia liniową formę wektora

   PL 226 114 B1 o wielkości ok. 10 000 pz, dalej w trzecim etapie uzyskuje się kasety MCS poprzez wykorzystanie dwóch komplementarnych względem siebie syntetyczne oligonukleotydy: CAS1 oraz CAS2, które się syntezuje, a uzyskany liofilizat zawiesza w bidestylowanej wodzie, następnie 1000 pmoli zawiesiny CAS1 miesza się z taką samą ilością CAS2, po czym taką mieszaninę ogrzewa w temperaturze 95°C w ciągu 5 minut w celu ich denaturacji, dalej mieszaninę wolno schładza się do temperatury 4°C, aż do utworzenia dwuniciowej struktury kasety CAS1/2, kolejno przechodzi się do czwartego etapu gdzie wprowadza się zmodyfikowane kasety MCS do pCAMBIA1381ZAGUS poprzez insercję dwuniciowej kasety MCS do pCAMBIA1381ZAGUS uzyskanej na drodze ligacji 2 nmoli dwuniciowego fragmentu CAS1/2 prowadzonej przez 16 godzin ze zmodyfikowanym wektorem pCAMBIA w obecności 5 jednostek (U) ligazy T4 DNA, następnie dodaje się 2 μl mieszaniny ligacyjnej do transformacji kompetentnych komórek E. coli TOP10, następnie mieszaninę DNA oraz komórki bakteryjne inkubuje się przez 30 minut w łaźni lodowej, a następnie gwałtownie ogrzewa przez 30 sekund w temperaturze 42°C i schładza w łaźni lodowej przez 2 minuty, po czym dodaje się 500 μl płynnej pożywki SOC i przy wytrząsaniu 160 rpm, inkubuje się przez 60 minut w temperaturze 37°C, dalej komórki osadza się na dnie probówki, usuwa supernatant, a osad zawiesza w 150 μl pożywki SOC i rozprowadza na powierzchni zestalonej pożywki LB (0,5% (w/o) ekstrakt drożdżowy; 1% (w/o) trypton; 1% (w/o) NaCl; 1,5% agar (w/o)) wzbogaconej kanamycyną (50 μg/ml, dalej komórki inkubuje się przez 16 godzin w temperaturze 37°C, po czym z wybranych transformantów izoluje się plazmidowy DNA, który poddaje się trawieniu enzymem restrykcyjnym Mlul, następnie w piątym etapie wprowadza się do pPW sekwencję podwojonego promotora wirusa mozaiki kalafiora CaMV uzyskaną poprzez amplifikację starterami specyficznie amplifikującymi promotor 35S z lub bez sekwencją liderową Ω wirusa TMV, przy czym łańcuchową reakcję polimerazy PCR prowadzi się w obecności 2,5 U polimerazy DNA izolowanej z Pyrococcus furiosus, 200 ng mieszaniny czterech deoksyrybonukleotydów, 40 ng matrycy DNA oraz odpowiednich starterów w buforze reakcyjnym, dalej uzyskaną mieszaninę reakcyjną wstępnie denaturuje się przez 3 minuty w temperaturze 95°C, a następnie przeprowadza się 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund, 72°C 25 sekund, dalej produkty łańcuchowej reakcji polimerazy PCR rozdziela się w 1% żelu agarozowym, a po elektroforezie DNA izoluje się z żelu, a następnie poddaje trawieniu enzymami restrykcyjnymi Ncol oraz EcoRI i liguje z wektorem pPW trawionym tymi samymi enzymami.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w trzecim etapie na drodze hybrydyzacji oligonukleotydów CAS1: CAT GGG AAT TCG AGC TCG GTA CCC GGG GAT CCT CTA GAG TCG ACC TGC AGG CAT GCA CGC GTA AGC TTG, i CAS2: GTC ACC AAG CTT ACG CGT GCA TGC CTG CAG GTC GAC TCT AGA GGA TCC CCG GGT ACC GAG CTC GAA TTC C, uzyskuje się dwuniciową kasetę DNA CAS1/2, przy czym 1000 pmoli oligonukleotydu CAS1 miesza się z taką samą ilością CAS2, mieszaninę podgrzewa się przez 5 minut w temperaturze 95°C i stopniowo, powoli schładza do 4°C do uzyskania dwuniciowej kasety CAS1/3.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie czwartym na drodze enzymatycznej ligacji - połączenia kasety CAS1/1 z wektorem pCAMBIA1381ZAGUS uzyskuje się nowy wektor pPW, przy czym reakcję prowadzi się w obecności 2 nmoli kasety CAS1/2, wektora pCAMBIA1381ZAGUS oraz 5 jednostek ligazy DNA faga T4, przy czym reakcję prowadzi się w ciągu 16 godzin w temperaturze 4°C, po czym 2 μl mieszaniny wykorzystuje się do transformacji komórek E. coli, z których następnie izoluje się żądany plazmidowy DNA pPW.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie piątym na drodze łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) uzyskuje się kasetę promotora 35S, przy czym reakcję prowadzi się w obecności startera Caprof: GAGCCATGGTCCAATCCCACAAAAATC oraz Caprpr1: ATAGAATTCATGGTAATTGTAAATGTA, gdzie reakcję przeprowadza się wykorzystując startery oraz 200 ng mieszaniny czterech dezoksyrybonukleotydów, 2,5 jednostek polimerazy DNA izolowanej z P. furiosus oraz 40 ng matrycowego DNA, które stanowi dowolny plazmid zawierający sekwencję promotora 35S wirusa CaMV, a proces prowadzi się poprzez podgrzanie mieszaniny przez 3 minuty w temperaturze 95°C, po czym następuje 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund oraz 72°C 25 sekund, następnie, specyficzny produkt amplifikacji trawi się enzymami restrykcyjnymi Ncol i EcoRI i liguje z wektorem pPW, a produkty ligacji stosuje się do transformacji E. coli, po czym żądany wektor izoluje się z transformantów jako plazmidowy DNA pPW18.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że w etapie piątym na drodze łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) uzyskuje się kasetę promotora 35S:omega TMV, przy czym reakcję prowadzi się w obecności startera Caprof: GAGCCATGGTCCAATCCCACAAAAATC oraz Caprpr2: TATGAATTCPL 226 114 B1

   CGTGTCCTCTCCAAATGA, gdzie reakcję przeprowadza się z wykorzystaniem starterów oraz 200 ng mieszaniny czterech dezoksyrybonukleotydów, 2,5 jednostek polimerazy DNA izolowanej z P. furiosus oraz 40 ng matrycowego DNA, które stanowią dowolny plazmid zawierający sekwencję promotora 35S wirusa CaMV połączoną z sekwencją omega TMV, proces prowadzi się podgrzewając mieszaninę przez 3 minuty w temperaturze 95°C, po czym następuje 30 cykli: 94°C 25 sekund, 55°C 25 sekund oraz 72°C 25 sekund, następnie, specyficzny produkt amplifikacji trawi się enzymami restrykcyjnymi Ncol i EcoRI i liguje z wektorem pPW. Produkty ligacji wykorzystuje się do transformacji E. coli, po czym żądany wektor izoluje się z transformantów jako plazmidowy DNA pPW28.