PL226255B1 - Zastosowanie medyczne N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso- 2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu - Google Patents
Zastosowanie medyczne N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso- 2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamiduInfo
- Publication number
- PL226255B1 PL226255B1 PL395785A PL39578511A PL226255B1 PL 226255 B1 PL226255 B1 PL 226255B1 PL 395785 A PL395785 A PL 395785A PL 39578511 A PL39578511 A PL 39578511A PL 226255 B1 PL226255 B1 PL 226255B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- carbothioamide
- pyrazole
- dihydro
- oxo
- phenyl
- Prior art date
Links
- QCZDDXXPSQTIRC-UHFFFAOYSA-N 5-amino-n-ethyl-3-oxo-4-phenyl-1h-pyrazole-2-carbothioamide Chemical compound O=C1N(C(=S)NCC)NC(N)=C1C1=CC=CC=C1 QCZDDXXPSQTIRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 18
- 241000606766 Haemophilus parainfluenzae Species 0.000 claims description 24
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 claims description 21
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- 229940047650 haemophilus influenzae Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 8
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 4
- 239000004599 antimicrobial Substances 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 14
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 7
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 6
- 241000894007 species Species 0.000 description 6
- 241000606790 Haemophilus Species 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000032770 biofilm formation Effects 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 210000002345 respiratory system Anatomy 0.000 description 5
- 239000001974 tryptic soy broth Substances 0.000 description 5
- 210000003501 vero cell Anatomy 0.000 description 5
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 4
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 3
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 3
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 3
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 201000009906 Meningitis Diseases 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 206010014665 endocarditis Diseases 0.000 description 2
- 230000008029 eradication Effects 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000000034 method Methods 0.000 description 2
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 2
- 239000007758 minimum essential medium Substances 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 2-(3,5-diphenyl-1h-tetrazol-1-ium-2-yl)-4,5-dimethyl-1,3-thiazole;bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1N1N(C=2C=CC=CC=2)N=C(C=2C=CC=CC=2)[NH2+]1 NBWRJAOOMGASJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010053555 Arthritis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 201000004569 Blindness Diseases 0.000 description 1
- 206010007882 Cellulitis Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 206010010741 Conjunctivitis Diseases 0.000 description 1
- 206010011878 Deafness Diseases 0.000 description 1
- 206010059866 Drug resistance Diseases 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000004575 Infectious Arthritis Diseases 0.000 description 1
- 208000036626 Mental retardation Diseases 0.000 description 1
- 208000016285 Movement disease Diseases 0.000 description 1
- 206010031252 Osteomyelitis Diseases 0.000 description 1
- 206010033078 Otitis media Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 208000037581 Persistent Infection Diseases 0.000 description 1
- 206010035664 Pneumonia Diseases 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 208000009911 Urinary Calculi Diseases 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 206010003246 arthritis Diseases 0.000 description 1
- 210000003445 biliary tract Anatomy 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 1
- 201000001883 cholelithiasis Diseases 0.000 description 1
- 230000001332 colony forming effect Effects 0.000 description 1
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000000249 desinfective effect Effects 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 1
- 208000001606 epiglottitis Diseases 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 208000001130 gallstones Diseases 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 150000003278 haem Chemical class 0.000 description 1
- 230000010370 hearing loss Effects 0.000 description 1
- 231100000888 hearing loss Toxicity 0.000 description 1
- 208000016354 hearing loss disease Diseases 0.000 description 1
- 125000005842 heteroatom Chemical group 0.000 description 1
- 239000007943 implant Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000012913 medium supplement Substances 0.000 description 1
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 description 1
- 244000005706 microflora Species 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 210000000214 mouth Anatomy 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 210000001989 nasopharynx Anatomy 0.000 description 1
- 230000007918 pathogenicity Effects 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000004303 peritoneum Anatomy 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 208000008423 pleurisy Diseases 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 201000001223 septic arthritis Diseases 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 208000027765 speech disease Diseases 0.000 description 1
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000820 toxicity test Toxicity 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 108010050327 trypticase-soy broth Proteins 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 208000008281 urolithiasis Diseases 0.000 description 1
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000001018 virulence Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu jako substancji o niskiej toksyczności, hamującej namnażanie i tworzenie biofilmu przez pałeczki z gatunków Haemophilus influenzae i H. parainfluenzae.
Substancja o aktywności będącej przedmiotem wynalazku znana jest z publikacji [Pitucha i wsp., Heteroatom Chemistry, 2010, 21(4), 215-221]. W artykule tym wykazano na przykładzie szczepów referencyjnych bakterii, rosnących w warunkach tlenowych, że związek będący przedmiotem wynalazku wykazuje działanie przeciwbakteryjne.
Nieoczekiwanie okazało się, że pochodna będąca przedmiotem wynalazku może znaleźć nowe zastosowanie do wytwarzania preparatów przeciwdrobnoustrojowych przeznaczonych do eradykacji zakażeń wywołanych pałeczkami hemofilnymi, zwłaszcza patogennym gatunkiem H. influenzae i oportunistycznym H. parainfluenzae, tworzącym biofilm.
Bakterie z rodzaju Haemophilus są niewielkimi Gram-ujemnymi pałeczkami o dużych wymaganiach wzrostowych. Diagnostyka zakażeń wywołanych przez te drobnoustroje jest trudna, m.in. ze względu na problemy w izolacji i hodowli oraz powszechność występowania niektórych gatunków jako składnika mikroflory układu oddechowego. Dominującym gatunkiem wchodzącym w skład flory fizjologicznej jamy nosowo-gardłowej osób zdrowych jest H. parainfluenzae. Znacznie rzadziej organizm ludzki, zwłaszcza błony śluzowe dróg oddechowych dzieci poniżej 5 r.ż., kolonizuje najbardziej patogenny wśród pałeczek hemofilnych gatunek H. influenzae, zwłaszcza szczepy z polisacharydową otoczką typu b (Hib). Bakterie te mogą być czynnikiem etiologicznym wielu chorób, począwszy od przewlekłych zakażeń układu oddechowego po niebezpieczne dla życia infekcje, jak zapalenie nagłośni czy opon mózgowo-rdzeniowych (śmiertelność szacuje się tu na około 5-7%). Chorobom tym mogą towarzyszyć powikłania: utrata słuchu, zaburzenia mowy, opóźnienie rozwoju umysłowego, zaburzenia ruchowe, utrata wzroku. Po wprowadzeniu do powszechnego użycia szczepionki zapadalność na choroby inwazyjne wywołane wśród dzieci przez tę bakterię znacząco się obniżyła. H. influenzae może powodować również zapalenie płuc, przy którym śmiertelność dochodzi do 30% i która może wystąpić głównie u osób w podeszłym wieku oraz z towarzyszącymi chorobami. Inne schorzenia wywoływane przez Hib to: zapalenie szpiku kostnego, zapalenie stawów, posocznica, ropowica tkanki podskórnej, ropnie. Obecnie w etiologii wielu zakażeń rośnie znaczenie nie typujących się szczepów bezotoczkowych H. influenzae (NTHi - non-typeable Haemophilus influenzae) oraz innych gatunków, uznawanych do tej pory za komensalne, zwłaszcza H. parainfluenzae.
Gatunek H. parainfluenzae zasiedla głównie jamę ustną i drogi oddechowe zdrowych ludzi. Bakteria ta, chociaż rzadko, bywa izolowana jako czynnik etiologiczny infekcji o zróżnicowanym przebiegu i nieokreślonych rokowaniach, m.in.: zapalenia wsierdzia, opłucnej, ropni i ropniaków o różnej lokalizacji, zapalenia spojówek, dróg żółciowych, otrzewnej, szpiku kostnego, septycznego zapalenia stawów, posocznicy, zapalenia ucha środkowego, a także infekcji układu moczowo-płciowego. Sporadycznie gatunek ten bywa odpowiedzialny za infekcje pediatryczne górnych i dolnych dróg oddechowych, zapalenia wsierdzia lub opon mózgowych. Wprawdzie choroby, których przyczyną jest H. parainfluenzae rozwijają się niezwykle rzadko, jednak ostatnio odnotowuje się rosnącą częstość ich występowania.
Do czynników ważnych dla chorobotwórczości wielu bakterii zaliczany jest biofilm - wysoko zorganizowana struktura, która niczym wielokomórkowy organizm poszukuje optymalnej strategii przetrwania. Stanowi on podstawową formę życia bakterii (w naturze ponad 95-99% drobnoustrojów rośnie jako biofilm), może występować na powierzchni zębów, na ścianach naczyń krwionośnych i pęcherza, na kamieniach moczowych lub żółciowych, a także na biomateriałach - cewnikach, implantach, sztucznych zastawkach serca lub soczewkach kontaktowych. Infekcje związane z tą formą życia mikroorganizmów często mają nawracający charakter i cechują się znaczną opornością na środki przeciwdrobnoustrojowe. Fizyczna bliskość bakterii w biofilmie sprzyja ponadto wymianie genów warunkujących zjadliwość i lekooporność drobnoustrojów. Pałeczki hemofilne posiadają zdolność do tworzenia biofilmu zarówno na powierzchniach naturalnych jak i sztucznych, wykonanych np. z polistyrenu.
Przedmiotem wynalazku jest nowe zastosowanie N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5- dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu jako substancji przeciwdrobnoustrojowej o aktywności względem biofilmu H. influenzae i H. parainfluenzae.
Związek może znaleźć zastosowanie jako substancja aktywna do wytwarzania preparatów przeciwdrobnoustrojowych do eradykacji pałeczek hemofilnych biofilmu na etapie jego tworzenia, jako
PL 226 255 B1 czynników etiologicznych odpowiedzialnych za choroby infekcyjne oraz w preparatach odkażających, hamujących zdolność tych bakterii do tworzenia biofilmu, m.in. na biomateriałach.
Pochodna będąca przedmiotem wynalazku aktywnie hamuje namnażanie pałeczek hemofilnych oraz ich wzrost w formie biofilmu, znanego czynnika warunkującego zakażenia m.in. endogenne i oportunistyczne, trudne w diagnostyce i leczeniu.
Celem oceny aktywności przeciwbakteryjnej N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu używano trzech szczepów referencyjnych, pochodzących z kolekcji ATCC: H. influenzae ATCC 10211, H. parainfluenzae ATCC 7901, H. parainfluenzae ATCC 51505 oraz 24 szczepów H. parainfluenzae i 9 szczepów H. influenzae, pochodzących ze zbiorów Katedry i Zakładu Mikrobiologii Farmaceutycznej z Pracownią Diagnostyki Mikrobiologicznej Uniwersytetu Medycznego w Lublinie. Dla każdego szczepu przygotowywano zawiesinę bakteryjną (inokulum) o gęstości wyjściowej 0.5 w skali McFarlanda - 150 x 106 CFU (Colony Forming Units)/mL w 0.85% NaCl. Roztwór podstawowy badanego związku o stężeniu 50 mg/mL otrzymywano po rozpuszczeniu pochodnej w DMSO (dimetylu sulfotlenek).
Będące przedmiotem wynalazku nowe zatosowanie N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu, jako związku o niskiej toksyczności, aktywnego względem pałeczek hemofilnych oceniano metodą mikrorozcieńczeń badanej pochodnej w podłożu bulionowym tryptozowo-sojowym (TSB, Tripticasein Soy Broth, Biocorp) z dodatkiem suplementu HTMS (Haemophilus Test Medium Suplement, Oxoid), zawierającego NAD i hem - ważne dla tej grupy bakterii czynniki wzrostowe. Aktywność przedwbakteryjną wobec Haemophilus spp. oceniano w oparciu o wartość MIC (minimal inhibitory concentration - najmniejsze stężenie hamujące), definiowaną jako najniższe stężenie badanego związku w podłożu, przy którym wzrokowo nie obserwowano wzrostu bakterii w porównaniu z ich namnażaniem na podłożu kontrolnym. Zdolność do hamowania tworzenia biofilmu przez pałeczki Haemophilus spp. oceniano w oparciu o wartość MBIC (minimal biofilm inhibitory concentration - najmniejsze stężenie hamujące biofilm), definiowaną jako najniższe stężenie badanego związku w podłożu, przy którym wzrokowo nie obserwowano tworzenia biofilmu przez bakterie w porównaniu z powstawaniem tej struktury w podłożu kontrolnym.
P r z y k ł a d 1
Wpływ N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu na namnażanie pałeczek Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae.
Zdolność namnażania pałeczek hemofilnych badano w podłożu TSB + HTMS. Używano 96-dołkowych mikropłytek, w których metodą seryjnych rozcieńczeń roztworu wyjściowego w podłożu bulionowym uzyskiwano podwójne rozcieńczenia N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu w zakresie stężeń końcowych od 0,12 do 31,25 pg/mL. Następnie do każdego dołka dodawano po 2 pL zawiesiny drobnoustrojów o gęstości 0,5 w skali McFarlanda. Do studzienek, które stanowiły tło, wprowadzano bulion TSB + HTMS w ilości 200 pL, natomiast do studzienek kontrolnych, gdzie był obserwowany wzrost bakterii, wprowadzano podłoże bulionowe w ilości 198 pL, następnie dodawano po 2 pL zawiesiny bakteryjnej. Całkowita objętość płynu w każdym dołku wynosiła 200 pL. Tak przygotowane mikropłytki inkubowano w temperaturze 35 ± 2°C przez 18 godzin w atmosferze wzbogaconej w około 5% CO2 (zgodnie z wymaganiami dla bakterii mikroaerofilnych). Po inkubacji odczytywano wartość MIC wzrokowo i spektrofotometrycznie (BioTek ELx800) przy długości fali λ = 570 nm (OD570), po odjęciu wartości OD570 dla substancji zawieszonej w bulionie bez dodatku bakterii.
P r z y k ł a d 2
Wpływ N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu na tworzenie biofilmu przez pałeczki Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae
Po sprawdzeniu intensywności namnażania badanych bakterii w podłożu bulionowym TSB + + HTMS bez i z dodatkiem analizowanej pochodnej, znad hodowli zlewano bulion, po czym ostrożnie czterokrotnie przepłukiwano płytkę z hodowlą wodą destylowaną, następnie do każdej studzienki dodawano po 190 pL 0,85% chlorku sodu i po 10 pL 2% fioletu krystalicznego (Color Gram 2 R1-F, bioMerieux) tak, aby końcowe stężenie barwnika wynosiło 0,1%. Płytki pozostawiano na 15 minut celem wybarwienia się komórek, następnie przepłukiwano wodą destylowaną, aby pozbyć się nadmiaru barwnika. W celu wywołania reakcji do każdej ze studzienek dodawano po 200 pl alkoholu izopropylowego (Color Gram 2 R3-F, bioMerieux), pozostawiano w temperaturze pokojowej na 10 min, aby umożliwić dyfuzję barwnika do alkoholu, następnie płytki umieszczono w czytniku BioTek ELx800 i odczytywano wyniki przy fali o długości λ = OD570.
PL 226 255 B1
W badaniach dotyczących aktywności N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu wobec pałeczek z rodzaju Haemophilus spp. wykazano po raz pierwszy (Tabela 1), że pochodna będąca przedmiotem wynalazku hamowała namnażanie szczepów referencyjnych obydwu gatunków pałeczek hemofilnych - H. parainfluenzae ATCC 7901 (MIC = 0,24 gg/mL), H. parainfluenzae ATCC 51505 (MIC = 7,82 gg/mL) i H. influenzae ATCC 10211 (MIC = 0,98 gg/mL) oraz szczepów klinicznych H. parainfluenzae (MIC = 0,24-31,25 gg/mL; wartość średnia MIC = 15,72 gg/mL) i H. influenzae (MIC = 0,24-31,25 gg/mL; wartość średnia MIC = 9,47 gg/mL). W nieco wyższych stężeniach analizowana pochodna wykazywała również zdolność hamowania tworzenia biofilmu przez wszystkie wymienione szczepy pałeczek hemofilnych - H. parainfluenzae ATCC 7901 (MBIC = 3,91 gg/mL), H. parainfluenzae ATCC 51505 (MBIC = 31,25 gg/mL) i H. influenzae ATCC 10211 (MBIC > 31,25 gg/mL) oraz szczepów klinicznych H. parainfluenzae (MBIC = 0,49 do > 31,25 gg/mL; wartość średnia MIC = 34,76 gg/mL oraz 7 szczepów o wartości MBIC dla biofilmu > 31,25 gg/mL) i H. influenzae (MBIC = 1,95 do > 31,25 gg/mL; wartość średnia MBIC = 21,48 gg/mL oraz 6 szczepów o wartości MBIC dla biofilmu > 31,25 gg/mL). Uzyskane wartości MIC wskazują, że w użytym zakresie stężeń większą wrażliwość na pochodną będącą przedmiotem wynalazku wykazywały komórki p l a n kto idalne gatunku H. influenzae w porównaniu z komórkami gatunku H. parainfluenzae. Odwrotna sytuacja wystąpiła w przypadku wzrostu pałeczek hemofilnych w postaci biofilmu - niższe stężenia N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu hamowały tworzenie biofilmu przez oportunistyczny gatunek H. parainfluenzae w porównaniu ze stężeniami potrzebnymi do zahamowania wzrostu w tej formie patogennego gatunku H. influenzae.
T a b e l a 1
Wpływ N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu na namnażanie (MIC) i tworzenie biofilmu (MBIC) przez pałeczki Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae
| Szczep | Stężenie pochodnej (gg/mL) | Liczba szczepów (n) | |
| Namnażanie MIC (gg/mL) | Biofilm MBIC (gg/mL) | ||
| Haemophilus parainfluenzae ATCC 7901 | 0,24 | 1 | 0 |
| 3,91 | 0 | 1 | |
| Haemophilus parainfluenzae ATCC 51505 | 7,82 | 1 | 0 |
| 31,25 | 0 | 1 | |
| Haemophilus influenzae ATCC 10211 | 0,98 | 1 | 0 |
| >31,25 | 0 | 1 | |
| Haemophilus parainfluenzae | n = 24 | n = 24 | |
| 0,24 | 1 | 0 | |
| 0,49 | 0 | 1 | |
| 1,95 | 1 | 0 | |
| 3,91 | 2 | 3 | |
| 7,82 | 5 | 0 | |
| 15,63 | 9 | 5 | |
| 31,25 | 6 | 8 | |
| >31,25 | 0 | 7 | |
| Haemophilus influenzae | n = 9 | n = 9 | |
| 0,24 | 1 | 0 | |
| 0,49 | 2 | 0 | |
| 0,98 | 2 | 0 | |
| 1,95 | 0 | 1 | |
| 3,91 | 1 | 0 | |
| 15,63 | 1 | 0 | |
| 31,25 | 2 | 2 | |
| >31,25 | 0 | 6 |
PL 226 255 B1
P r z y k ł a d 3
Wpływ N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu na przeżywalność komórek Vero
W badaniu zastosowano hodowlę komórek Vero z European Collection of Cell Cultures (ECACC - 84113001). Do hodowli komórek użyto podłoże MEM (Minimum Essential Medium Eagle, Sigma) z dodatkiem 10% surowicy (Sigma) oraz penicyliny (100 U/mL) i streptomycyny (100 μg/mL) (Polfa-Tarchomin, Polska). Hodowlę poddawano inkubacji w temperaturze 37°C w atmosferze 5% CO2. Po uzyskaniu jednolitej warstwy (monolayer), komórki odklejano od podłoża za pomocą 0,25% roztworu trypsyny (Sigma). Zawieszano ponownie w świeżym podłożu hodowlanym z dodatkiem 10% surowicy. Zawiesinę o gęstości 2 x 104 komórek na dołek rozlewano do plastikowych 96-dołkowych płytek (NUNC) po 100 μL na dołek i prowadzono inkubację przez 24 godziny. Tak przygotowane hodowle komórek stosowano w badaniu cytotoksyczności.
Pochodną będącą przedmiotem wynalazku rozpuszczano w DMSO (Sigma) celem uzyskania stężenia wyjściowego 50 mg/mL. Substancję rozcieńczano w podłożu hodowlanym z dodatkiem 2% surowicy do stężeń końcowych w zakresie 3,15-500 μg/mL. Z 24-godzinnej hodowli usuwano podłoże i dodawano badane substancje w odpowiednim stężeniu. Do kontroli hodowli komórek dodawano tylko płyn hodowlany z dodatkiem 2% surowicy. Jednocześnie badano cytotoksyczn ość DMSO jako rozpuszczalnika. Komórki poddane działaniu N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu inkubowano w 37°C w obecności 5% CO2 przez 48 godzin.
Cytotoksyczność pochodnej będącej przedmiotem wynalazku badano metodą mikroskopową poprzez ocenę morfologii komórek oraz przy użyciu testu formazanowego MTT (bromek [3(4,5-dimetyltiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazolowy]) według Takenouchi i Munekata. Test ten jest ilościowym kolorymetrycznym testem toksyczności, którego podstawą jest przekształcanie soli tetrazoliowych o zabarwieniu żółtym - MTT do fioletowo zabarwionego, nierozpuszczalnego w wodzie formazanu. Proces ten zachodzi w mitochondriach żywych komórek. Po rozpuszczeniu formazanu organicznym detergentem, stężenie barwnika mierzy się ilościowo. Po 48 godzinach inkubacji z badaną pochodną, do hodowli komórkowych dodawano po 10 μL roztworu MTT o stężeniu 5 mg/mL na dołek i inkubowano dalej przez 4 godziny w 37°C. Następnie dodawano po 100 μL wodnego roztworu zawierającego 50% dimetyloformamidu oraz 20% SDS i po całonocnej inkubacji dokonywano odczytu absorbancji w czytniku do płytek 96-dołkowych (Organon Teknika) przy długości fali λ = 540 i λ = 620 nm.
Z otrzymanych pomiarów wyliczano % żywych komórek w hodowlach poddawanych działaniu badanej substancji, przyjmując absorpcję roztworu w komórkach kontrolnych za 100%. Miarą cytotoksyczności analizowanej pochodnej jest stężenie związku, przy którym ilość żywych komórek w hodowli in vitro została zredukowana do 50% w stosunku do komórek kontrolnych.
Zgodnie z otrzymanymi wynikami, w oparciu o definicję, stężenie cytotoksyczne N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu wobec komórek Vero wynosiło powyżej 200 μg/mL, co oznacza, że pochodna będąca przedmiotem wynalazku nie jest toksyczna dla komórek eukariotycznych w zakresach stężeń o działaniu przeciwbakteryjnym zarówno dla komórek planktoidalnych jak i dla struktury biofilmu tworzonego przez pałeczki hemofilne.
T a b e l a 2
Wpływ N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu na żywotność komórek Vero wyrażony jako procent żywych komórek w stosunku do hodowli kontrolnej.
| Stężenia substancji (pg/mL) | % żywych komórek Vero | |
| N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H- pirazolo-1-karbotioamid | DMSO | |
| 1 | 2 | 3 |
| 500 | 37,95 ± 7,7 | 97,95 ± 0,4 |
| 200 | 82,15 ± 5,7 | 98,65 ± 0,6 |
| 100 | 89 ± 6,6 | 99,05 ± 0,6 |
| 50 | 93,55 ± 4,2 | 99,75 ± 0,4 |
| 25 | 97,4 ± 1,7 | 100 ± 0,0 |
| 12,5 | 98,05 ± 1,8 | 100 ± 0,0 |
PL 226 255 B1 cd. tabeli 2
| 1 | 2 | 3 |
| 6,25 | 98,75 ± 2,0 | 100 ± 0,0 |
| 3,15 | 100 ± 0,0 | 100 ± 0,0 |
| 0 (kontrola) | 100 ± 0,0 | 100 ± 0,0 |
Uzyskane wyniki, wskazujące na nową aktywność pochodnej N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu wobec pałeczek Haemophilus influenzae i H. parainfluenzae pozwalają oczekiwać, że będzie ona stanowiła związek wyjściowy w wytwarzaniu środków lub leków o niskiej toksyczności i dobrej aktywności, profilaktycznej lub terapeutycznej w infekcjach wywołanych pałeczkami hemofilnymi.
Claims (1)
1. Zastosowanie N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso-2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu, związku o wzorze 1, przedstawionego na rysunku, jako substancji przeciwdrobnoustrojowej do wytwarzania środka profilaktycznego lub leku do zwalczania biofilmu Haemophilus influenzae i Haemophilus parainfluenzae na etapie jego tworzenia.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395785A PL226255B1 (pl) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Zastosowanie medyczne N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso- 2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL395785A PL226255B1 (pl) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Zastosowanie medyczne N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso- 2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL395785A1 PL395785A1 (pl) | 2012-09-10 |
| PL226255B1 true PL226255B1 (pl) | 2017-07-31 |
Family
ID=46800545
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL395785A PL226255B1 (pl) | 2011-07-28 | 2011-07-28 | Zastosowanie medyczne N-etylo-3-amino-4-fenylo-5-okso- 2,5-dihydro-1H-pirazolo-1-karbotioamidu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL226255B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL424896A1 (pl) * | 2018-03-15 | 2019-09-23 | Politechnika Łódzka | Zastosowanie polimerowych pochodnych N-acetylocysteiny |
-
2011
- 2011-07-28 PL PL395785A patent/PL226255B1/pl unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL424896A1 (pl) * | 2018-03-15 | 2019-09-23 | Politechnika Łódzka | Zastosowanie polimerowych pochodnych N-acetylocysteiny |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL395785A1 (pl) | 2012-09-10 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kıvanç et al. | Effects of hexagonal boron nitride nanoparticles on antimicrobial and antibiofilm activities, cell viability | |
| OmerOglou et al. | The role of microbiota-derived postbiotic mediators on biofilm formation and quorum sensing-mediated virulence of Streptococcus mutans: A perspective on preventing dental caries | |
| Tempera et al. | Microbiological/clinical characteristics and validation of topical therapy with kanamycin in aerobic vaginitis: a pilot study | |
| Crislip et al. | Candidiasis | |
| Wunnoo et al. | Rhodomyrtone inhibits lipase production, biofilm formation, and disorganizes established biofilm in Propionibacterium acnes | |
| Jiang et al. | Inhibitory activity in vitro of probiotic lactobacilli against oral Candida under different fermentation conditions | |
| US20170071990A1 (en) | Compositions containing boric acid and a mixture of lactobacillus | |
| KR20130046898A (ko) | 식물성유산균발효액을 함유하는 질염 및 요로감염 예방 및 치료용 약학 조성물 | |
| Ghezelbash et al. | Comparative inhibitory effect of xylitol and erythritol on the growth and biofilm formation of oral Streptococci | |
| Coetzee et al. | The use of topical, un-buffered sodium hypochlorite in the management of burn wound infection | |
| BR112019011015A2 (pt) | uso de uma composição, formulação e seu uso, lubrificante vaginal prebiótico e uso de uma cápsula vaginal simbiótica | |
| Anand et al. | Anticandidal synergistic activity of green tea catechins, antimycotics and copper sulphate as a mean of combinational drug therapy against candidiasis | |
| Qiu et al. | Clotrimazole and econazole inhibit Streptococcus mutans biofilm and virulence in vitro | |
| AL-Khikani et al. | Evaluating the antibacterial activity of potassium aluminium sulphate (alum) combined with other antibiotics | |
| Arasu et al. | Antibacterial activity of peptides and bio-safety evaluation: in vitro and in vivo studies against bacterial and fungal pathogens | |
| Babaiwa et al. | Antimicrobial and time-kill kinetics of the aqueous extract of Citrullus lanatus (Thunb.) seeds | |
| CN111182895A (zh) | 用于治疗和/或预防微生物感染的葡萄糖酸衍生物 | |
| Stoodley et al. | Bioenergetics of simultaneous oxygen and nitrate respiration and nitric oxide production in a Pseudomonas aeruginosa agar colony biofilm | |
| AU2002334074A1 (en) | Allicin | |
| EP1435928A1 (en) | Allicin | |
| CN117017966A (zh) | 衣康酸二甲酯在抑制大肠杆菌和沙门氏菌中的应用 | |
| WO2017003403A1 (ru) | Применение декаметоксина как фармацевтически активного вещества для лечения заболеваний желудочно-кишечного тракта и кишечных инфекций перорально | |
| Galice et al. | Effect of subinhibitory concentration of chlorhexidine on Streptococcus agalactiae virulence factor expression | |
| AU2006229642A1 (en) | A method for preventing and/or treating vaginal and vulval infections | |
| Saric et al. | Evaluation of antimicrobial potential of different commercial Grapefruit seed extracts |