PL226270B1 - Sposób oczyszczania surowej heparyny o niskiej aktywności - Google Patents

Description

Wynalazek dotyczy sposobu oczyszczania heparyny surowej o niskiej aktywności, zawierającej znaczne ilości zanieczyszczeń pochodzenia zwierzęcego i mineralnego oraz heparyny odpadowej.

Heparyna jest sulfonowanym mukopolisacharydem o średniej masie cząsteczkowej około 16,5 tysiąca. W swojej budowie zawiera siarkę, jako ugrupowanie sulfoamidowe lub jako ester kwasu siarkowego. Posiada silnie ujemny ładunek elektryczny, co powoduje, że tworzy kompleksy z białkami, szczególnie protaminą.

Heparyna znajduje szerokie zastosowanie w lecznictwie, gdzie wykorzystywane jest jej działanie przeciwko krzepliwości krwi. Stosowana jest leczniczo i zapobiegawczo w chorobach zakrzepowo-zatorowych i zakrzepach tętnicowych, na przykład w stanach przedzawałowych i zawałach.

Wydziela się ją głównie z niektórych organów zwierzęcych (np. płuca) lub śluzu jelitowego. Sposoby wydzielania z surowca zwierzęcego polegają na dłuższym bądź krótszym okresie moczenia świeżych lub mrożonych organów zwierzęcych w wodnych roztworach soli o różnym składzie. W każdym przypadku chodzi o możliwie ilościowe przeprowadzenie do roztworu heparyny znajdującej się w surowcu zwierzęcym.

Proces wytwarzania (wydzielania i oczyszczania) heparyny można zasadniczo podzielić na dwa etapy. Etap pierwszy to ekstrakcja heparyny do roztworu wodnego. Jest kilka sposobów prowadzenia ekstrakcji. Przykładowo w polskim opisie patentowym nr PL 95 201 stosuje się do ekstrakcji wodny

20-28% roztwór NaCl z dodatkiem 2,5% CaCl₂ w temperaturze 50-70°C. Po czym przeprowadza się proces odbiałczania i filtrowania.

Etap drugi polega na wydzielaniu heparyny (o różnej aktywności biologicznej), z roztworu i otrzymaniu czystego produktu suchego. Sposoby wydzielania heparyny z ekstraktów można również podzielić na dwie grupy technologiczne. Grupa pierwsza polega na wytrącaniu heparyny z ekstraktu w formie nierozpuszczalnych związków kompleksowych, które odsącza się i przerabia dalej różnymi metodami. Przykładowo w polskim opisie patentowym nr PL 61 042 przewiduje się dodawanie do ekstraktu bromku laurylopirydynowego, który tworzy nierozpuszczalny kompleks z heparyną. Inna metoda polega na wydzielaniu heparyny przy użyciu sorbetów syntetycznych bądź mineralnych. Przykładowo w polskim opisie patentowym nr PL 162 607 sposób polega na wydzieleniu heparyny z ekstraktu wodnego poprzez jej sorpcję na kolumnach wypełnionych syntetyczny m sorbentem jonowymiennym. Następnie zasorbowany produkt desorbuje się stosując roztwory solanki o różnym stężeniu.

Znane są również metody sorbowania heparyny z ekstraktu metodą periodyczną w mieszalniku.

W każdym przypadku należy następnie heparynę zdesorbować i wydzielić w postaci suchej.

Obecnie na rynku dostępna jest również tzw. heparyna surowa, o niskiej aktywności biologicznej, uzyskiwana jako substancja zasorbowana na nośniku, najczęściej mineralnym, na przykład ziemi krzemionkowej bez dalszego jej przerobu. Substancja ta o aktywności zazwyczaj niższej od 100 j/mg może być użyta do niektórych zastosowań, jak na przykład w diagnostyce oraz w sztucznej hodowli tkanek. Nie może być jednak użyta w lecznictwie, co jest jej głównym zastosowaniem.

Surową, niskoaktywną heparynę oczyszcza się zazwyczaj metodą krystalizacji z roztworów wodno-alkoholowych lub też przeprowadza się do roztworów wodnych i oczyszcza jednym ze znanych sposobów, jak wytrącanie kompleksów bądź sorpcja i powtórne wydzielanie.

Metody te dają dobre wyniki, uzyskuje się heparynę odpowiadającą normie jednakże najczęściej związane są ze znacznymi jej stratami.

Sposób według wynalazku umożliwia uzyskiwanie heparyny o bardzo wysokiej aktywności, z dużą wydajnością, powyżej 95% ilości zawartej w produkcie wyjściowym. Polega on na zastosowaniu selektywnej sorpcji i desorpcji.

Sposób oczyszczania heparyny surowej lub odpadowej, z zastosowaniem sorpcji polega na tym, że heparynę surową lub odpadową rozpuszcza się w wodnym roztworze solanki o zawartości NaCl nie mniejszej niż 9%, a nie wyższej niż 30%, po czym odsącza się substancje nie rozpuszczone, a roztwór doprowadza się do pH powyżej 3,5 i kontaktuje w sposób ciągły lub periodyczny z makroporowatą żywicą sorpcyjną o charakterze niejonowym lub żywicą anionowymienną z zablokowaną grupą funkcyjną, a następnie po oddzieleniu sorbentu z roztworu, wytrąca się heparynę przez rozcieńczanie go alkoholem alifatycznym C1-C3 lub acetonem. W opisanych wyżej warunkach następuje sorpcja głównie zanieczyszczeń z minimalną tylko sorpcją heparyny.

Korzystnie roztwór heparyny kontaktuje się z sorbentem w sposób ciągły, przepuszczając go przez kolumnę lub zespół kolumn połączonych szeregowo.

PL 226 270 B1

Korzystnie roztwór heparyny po oczyszczeniu na sorbencie i zalkalizowaniu do pH od 9 do 11, kontaktuje się z substancją utleniającą, najkorzystniej z nadtlenkiem wodoru. Proces ten przeprowadza się w temperaturze pokojowej bądź nie przekraczającej 80°C. W omawianej metodzie warunkiem powodzenia jest odpowiednie stężenie chlorku sodu oraz pH w poszczególnych operacjach. Na przykład stosowanie zbyt niskiego stężenia NaCl powoduje duże straty heparyny. Natomiast zbyt duże stężenie soli powoduje jej wytrącanie równocześnie z heparyną powodując obniżenie jej aktywności.

Dodatkowym zanieczyszczeniem występującym bardzo często w heparynie surowej lub odpadowej są bakterie chorobotwórcze bądź pirogeny (substancje gorączkotwórcze). Przy metodzie oczyszczania opisanej powyżej bakterie i pirogeny pozostają w wydzielonej wysokoaktywnej heparynie. Ich obecność w produkcie przeznaczonym do injekcji jest niedopuszczalna. W takich przypadkach w sposobie według wynalazku można zastosować dwa sposoby ich usuwania. Sposób pierwszy polega na tym, że roztwór heparyny surowej bądź odpadowej po oczyszczeniu jej na sorbencie, jak opisano wyżej, filtruje się dodatkowo przez specjalne filtry bakteriologiczne, po czym prowadzi się wytracanie i uzyskuje heparynę całkowicie jałową o wysokiej aktywności. Drugi sposób polega na tym, że po oczyszczeniu heparyny na kolumnach wytrąca się heparynę alkoholem i po odsączeniu i ewentualnym wysuszeniu, w razie konieczności produkt rozpuszcza się ponownie w wodzie destylowanej i poddaje dodatkowemu filtrowaniu. Z przefiltrowanego roztworu wydziela się jałową heparynę przez jej wytrącenie alkoholem lub przez odparowanie wody w warunkach jałowych np. przez liofilizację.

Pr zyk ła d 1

W przykładzie użyto heparynę surową o aktywności 93 j/mg stanowiącą twarde grudki, o zabarwieniu beżowym. Produkt ten rozpuszczono w wodnym roztworze chlorku sodu o zawartości 20% NaCl.

₃

Surową heparynę rozpuszczono w ilości 4,5 g na 100 cm³ solanki, w ten sposób uzyskano roz₃ twór zawierający około 4500 j/cm³ heparyny. Po rozpuszczeniu powstał roztwór o zabarwieniu herbaty (transmitancja na spektrofotometrze wynosiła 41 przy λ = 450), zawierający substancje nierozpuszczalne. Ciecz z osadem przesączono, a klarowny roztwór doprowadzono do pH równego 9,0 i przepuszczono przez kolumnę wypełnioną niejonowym, makroporowatym sorbentem syntetycznym, o powierzchni niepolarnej, o nazwie handlowej Amberlit XAD-16. Po przepuszczeniu przez kolumnę uzyskano wyciek o zabarwieniu lekko słomkowym, transmitancji równej 78 (długość fali λ wynosiła 450) w odniesieniu do wody. Następnie roztwór zalkalizowano dodatkowo do pH równego 10.8 i ogrzano do 70°C, po czym dodano 30% wodny roztwór nadtlenku wodoru, w ilości 0,5 cm ₃ na 100 cm³. Temperaturę 70°C utrzymywano przez 15 minut, następnie pozostawiono do schłodzenia do temperatury pokojowej. Po tym czasie transmitancja roztworu wynosiła 94 w odniesieniu do wody. Z roztworu tego wydzielono heparynę rozcieńczając go metanolem w stosunku 1:1,5 przy stałym mieszaniu. Wydzielony osad odsączono i przemyto czystym metanolem. Po wysuszeniu uzyskano produkt o aktywności 210 j/mg, o barwie śnieżnobiałej, z wydajnością 96% w stosunku do ilości w produkcie wyjściowym.

Przykła d 2

W przykładzie użyto heparynę surową o aktywności 109 j/mg stanowiącą gruzełkowaty proszek, o zabarwieniu zielonkawo-beżowym. Produkt ten rozpuszczono w wodnym roztworze chlorku sodu ₃ o zawartości 10% NaCl. Po rozpuszczeniu powstał roztwór o zawartości 3800 j/cm³ heparyny. Po odsączeniu osadu, uzyskano klarowny przesącz o transmitancji wynoszącej 62 (λ = 450), o pH 8,2.

Roztwór ten bez zmiany pH przepuszczono przez kolumnę wypełnioną średniopolarnym, makroporowatym sorbentem syntetycznym Amberlit XAD-4. Po przepuszczeniu przez kolumnę uzyskano wyciek o zabarwieniu słomkowym i transmitancji równej 92. Roztwór ten po stwierdzeniu obecności pirogenów, przefiltrowano znanym sposobem przez filtry bakteriologiczne. Następnie z roztworu tego wytrącono heparynę rozcieńczając go alkoholem etylowym w ilości 2 części objętościowe etanolu na 1 część objętościową roztworu. Wytrącony osad odsączono i przemyto czystym etanolem. Po wysuszeniu uzyskano biały proszek o aktywności 201 j/mg, całkowicie jałowy. Wydajność procesu wynosiła 94%.

Przykła d 3

W przykładzie użyto surową heparynę taką samą jak w przykładzie 1. Produkt rozpuszczono w roztworze chlorku sodu o zawartości 18% NaCl. Powstał roztwór, który po przesączeniu miał barwę ₃ mierzoną w procentach transmitancji równą 49 (λ = 450), zawierający 3100 j/cm³ heparyny.

Klarowny roztwór zakwaszono do pH = 5,5 i przepuszczono przez kolumnę wypełnioną niejonowym sorbentem, makroporowatym, średniopolarnym o nazwie Amberlit XAD-7HP. Po przepuszczeniu

PL 226 270 B1 przez kolumnę uzyskano wyciek o transmitancji równej 82 w odniesieniu do wody. Następnie roztwór 33 zalkalizowano do pH = 10,5 i dodano 30% roztwór nadtlenku wodoru w ilości 1 cm³ na 100 cm³ roztworu i po wymieszaniu, pozostawiono go na okres 16 godzin w temperaturze pokojowej. Po tym czasie transmitancja roztworu wynosiła 98 w odniesieniu do wody. Z roztworu tego wytrącono heparynę podobnie jak w przykładzie 1. Po wysuszeniu uzyskano produkt o aktywności 218 j/mg o barwie śnieżnobiałej i wydajności 95%. Produkt ten rozpuszczono ponownie w wodzie destylowanej w ilości ₃ g heparyny na 100 cm³ wody. Uzyskany roztwór przefiltrowano na filtrach bakteriologicznych (znanym sposobem). Po usunięciu pirogenów roztwór odparowano do sucha w warunkach sterylnych, pod zmniejszonym ciśnieniem. Uzyskano produkt o aktywności 218 j/mg całkowicie apirogenny.

Pr zyk ła d 4

W przykładzie użyto heparynę odpadową o aktywności 58 j/mg, rozpuszczono ją w wodnym roztworze chlorku sodowego o zawartości 13% NaCl. Po odwirowaniu osadu, klarowny roztwór o za₃ wartości 2430 j/cm³ zakwaszono do pH = 3,7. Do roztworu tego o transmitancji równej 53, znajdującego się w mieszalniku otwartym wsypano makroporowaty, słaboalkaliczny sorbent amonitowy, z zablokowaną grupą funkcyjną, o nazwie handlowej Amberlit IRA 60(Cl). Sorbent ten wsypano w ilości dcm³ na 100 dcm³ roztworu. Całość mieszano wolno przez dwie godziny. Po tym czasie odsączono sorbent, a klarowny roztwór o transmitancji równej 87 zalkalizowano do pH równego 9,5, ogrzano do temperatury 50°C i dodano 30% roztwór nadtlenku wodoru w ilości 0,8 cm³ na 100 cm³ roztworu. Całość ogrzewano przez 25 minut przy ciągłym mieszaniu. Po ostygnięciu roztworu do temperatury pokojowej wykazywał on transmitancję równą 95. Z roztworu wytrącono heparynę, rozcieńczając go acetonem, w ilości 2 objętości na 1 objętość roztworu.

Po przemyciu i wysuszeniu osadu uzyskano heparynę o aktywności 171 j/mg z wydajnością 92% w stosunku do ilości znajdującej się w produkcie wyjściowym użytym w cyklu oczyszczania.

Claims (4)

1. Sposób oczyszczania heparyny surowej lub odpadowej z zastosowaniem sorpcji, znamienny tym, że heparynę surową lub odpadową rozpuszcza się w wodnym roztworze solanki o zawartości chlorku sodu nie mniejszej niż 9%, a nie wyższej niż 30%, po czym odsącza lub odwirowuje substancje nie rozpuszczone, a klarowny roztwór doprowadza do kwasowości powyżej pH 3,5 i kontaktuje się w sposób ciągły lub periodyczny z makroporowatą żywicą syntetyczną, niejonową, niepolarną lub średniopolarną, bądź makroporowatą lub żelową żywicą anionitową, z zablokowanymi grupami funkcyjnymi, a następnie po oddzieleniu sorbentu w przypadku konieczności usunięcia bakterii i/lub pirogenów roztwór przesącza się znanym sposobem przez filtry bakteriologiczne, po czym z roztworu wytrąca się heparynę przez rozcieńczanie go alkoholem alifatycznym C1-C3 lub acetonem.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór heparyny kontaktuje się z sorbentem w sposób ciągły, przepuszczając go przez kolumnę lub zespół kolumn, korzystnie połączonych szeregowo lub przez mieszanie w mieszalniku metodą periodyczną.

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że roztwór heparyny surowej lub odpadowej po oczyszczeniu na sorbencie i zalkalizowaniu do pH powyżej 9 kontaktuje się na gorąco lub na zimno ze środowiskiem utleniającym, najkorzystniej z nadtlenkiem wodoru, po czym wytrąca heparynę dodatkowo oczyszczoną.

4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że suchą lub wilgotną heparynę oczyszczoną sposobem według wynalazku rozpuszcza się ponownie w wodzie destylowanej i po usunięciu z roztworu bakterii i/lub pirogenów wytrąca się ponownie heparynę alkoholem C1-C3 lub wodę odparowuje się sterylnie pod zmniejszonym ciśnieniem.