PL226649B1 - Sposób modyfikacji nanocząstkami srebra powierzchni krystalitów fosforanu wapnia o strukturze hydroksyapatytu - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób modyfikacji nanocząstkami srebra powierzchni krystalitów fosforanu wapnia o strukturze hydroksyapatytu pochodzenia naturalnego.

Wiadomo powszechnie, że nanocząstki srebra w wykazują szereg pożądanych właściwości fizykochemicznych dzięki, którym znajdują zastosowanie jako materiały lub modyfikatory materiałów w biologii, medycynie, a także wielu innych dziedzinach techniki.

Znanych jest wiele metod otrzymywania srebra koloidalnego, jednak dominujące znaczenie odgrywa metoda redukcji chemicznej, w której poprzez dobór właściwości mieszaniny oksydacyjno-redukcyjnej można kontrolować parametry powstających nanocząstek takie jak rozmiar, kształt czy właściwości powierzchniowe.

Wytwarzanie stabilnych zawiesin (suspensji) srebra koloidalnego, znane jest na przykład z opisów i zgłoszeń patentowych PL 176202(B1), PL 210388(B1), PL 211422(B1), PL 388025(A1), PL 390437(A1). Według tych rozwiązań, uzyskanie suspensji nanocząstek srebra wymaga oprócz źródła jonów srebra także czynnika redukującego, a ponadto użycia związków chemicznych, które dodane w czasie prowadzenia reakcji zapewniają trwałość suspensji na drodze stabilizacji elektrostatycznej bądź sterycznej.

W większości znanych przypadków do wytwarzania suspensji nanocząstek srebra metodą redukcji chemicznej, wykorzystuje się dobrze rozpuszczalne w wodzie sole srebra, jak np. azotan, chlorek, czy octan srebra, a także niekiedy piro- i ortofosforany srebra.

Jako reduktory stosuje się najczęściej borowodorek sodu, cytrynian sodu, hydrazynę, chlorowodorek hydroksyloaminy, kwas askorbinowy, formaldehyd, metanol oraz inne związki posiadające grupy karbonylowe czy hydroksylowe jak np. glukozę.

Synteza nanocząstek srebra wymaga stosowania nie tylko źródła jonów srebra i czynnika redukującego, ale także takiej substancji, która dodana w czasie prowadzenia redukcji zapewni trwałość suspensji liofobowej, na drodze stabilizacji elektrostatycznej lub sterycznej.

W niektórych przypadkach utleniona forma reduktora, dodanego w nadmiarze w stosunku do soli srebra może pełnić rolę stabilizującą, np. synteza z wykorzystaniem borowodorku sodu, cytrynianu trisodu, taniny.

Jednak w większości przypadków stosuje się wielkocząsteczkowe stabilizatory organiczne, zapewniające uzyskiwanie wysokiego stężenia suspensji. Najbardziej powszechnymi związkami, stosowanymi jako czynniki stabilizujące są poliwinylopirolidon (PVP), alkohol poliwinylowy (PVA) i chitosan.

Hydroksyapatyt jest ortofosforanem wapnia najistotniejszym z punktu widzenia zastosowań medycznych, a ceramiczne materiały hydroksyapatytowe, ze względu na wysoki stopień biozgodności, osteokonduktywność, oraz zdolność do tworzenia z żywymi tkankami połączeń chemicznych, są uważane obecnie za jedne z wiodących materiałów w chirurgii kostnej.

Hydroksyapatyt jest szeroko stosowany w medycynie i stomatologii, głównie w formie proszku do wypełnienia ubytków, porowatej ceramiki oraz jako materiał pokryciowy na implantach metalicznych (Janicki T., Sobczak A., Skomro P.: Hydroksyapatyt naturalny jako ścierniwo oczyszczające zastosowane w technice airpolishingu-badania in vitro, Implantoprotetyka, tom X, nr 4 (37), 2009, 30-32).

Bioceramika hydroksyapatytowa charakteryzuje się dobrą biozgodnością i adaptacją w środowisku żywego organizmu, nie działa drażniąco na otaczające tkanki, nie powoduje ostrych i przewlekłych stanów zapalnych, nie przeszkadza w procesach naprawczych tkanki kostnej, a nawet stymuluje jej odbudowę.

Bioceramiczne tworzywo hydroksyapatytowe można zaliczyć do grupy materiałów nietoksycznych i biologicznie aktywnych. Warstwa powierzchniowa hydroksyapatytu reaguje z medium fizjologicznym, co daje możliwość wytworzenia bezpośrednich wiązań chemicznych między implantem a kością (Landi E., Tampieri A., Celotti G., Langenati R., Sandri M., Sprio S.: Nucleation of biomimetic apatite in synthetic body fluids: dense and porous scaffold development. Biomaterials 26, 2005, 2835-2845). Obecność hydroksyapatytu wpływa również na intensywny wzrost kości do porów i zapewnia biologiczną stabilność rekonstruowanych tkanek.

Wiadomo, że hydroksyapatyt można uzyskać z materiałów naturalnych, takich jak szkielety koralowców, kości zwierzęce, ości ryb, skorupy jaj (Barakat, Nasser A.M.; Khil, Myung Seob; Omran, A. M.; Sheikh, Faheem A.; Kim, Hak Yong: Extraction of pure natural hydroxyapatite from the bovine

PL 226 649 B1 bones bio waste by three different methods, Journal of Materials Processing Tech. 209 (7), 2009,

3408-3415).

Jako surowiec pochodzenia naturalnego do pozyskiwania hydroksyapatytu mogą służyć kości zwierzęce, przede wszystkim wieprzowe i wołowe.

W opisie patentowym PL 207 973 (B1) przedstawiono, sposób termicznej obróbki półproduktów mięsno-kostnych z przemysłu mięsnego, pozwalający uzyskać popiół kostny, bez domieszki węgla organicznego, którego główną i jedyną fazą krystaliczną jest hydroksyapatyt. Sposób polega na tym, że półprodukty mięsno-kostne miesza się z popiołem, zawracanym z poprzedniego prażenia, w stosunku wagowym od 1 część kości/1 część popiołu do 1 część kości/10 części popiołu i kalcynuje w temperaturze 650-950°C w czasie 30-120 minut w atmosferze utleniającej.

Srebro i jego związki są toksyczne dla bakterii, wirusów i grzybów, dlatego znajdują one od lat zastosowanie, jako środki dezynfekujące i odkażające. Na działanie antybakteryjne srebra składa się działanie bakteriostatyczne hamujące wzrost mikroorganizmów oraz działanie bakteriobójcze. Te unikalne właściwości srebra sprawiają, że chorobotwórcze mikroorganizmy nie potrafią rozwinąć odporności na działanie cząsteczek srebra, tak jak jest to w przypadku antybiotyków.

Niestety srebro jonowe na zwierzęcych powierzchniach biologicznie aktywnych ulega, dezaktywacji przez redukcję do form nierozpuszczalnych.

Natomiast nanometaliczne srebro jest stabilne i nie reaguje z solami zawartymi w płynach fizjologicznych, przez co ma niezwykłą skuteczność odkażającą. Nanometaliczne srebro nie ulega kumulacji w organizmie ludzkim, przez co wyeliminowane zostaje ryzyko zapadnięcia pacjenta na srebrzycę. Ponadto dzięki rozmiarom cząstek, nanosrebro metaliczne posiada o wiele silniejszą aktywność biochemiczną w porównaniu ze srebrem jonowym, przez co zdecydowanie efektywniej zwalcza ożywioną materię organiczną taką jak bakterie, wirusy i grzyby.

Badania prowadzone przez M. Bostetti i N. Rameshbabu dowodzą zwiększonej skuteczności biomateriałów wszczepiennych zawierających srebro, stosowanych przy urazach ortopedycznych. Srebro i komponenty na bazie srebra są czynnikami antydrobnoustrojowymi skutecznymi w stosunku do wielu rodzajów bakterii w tym Escherichia coli i Staphylococcus aureus (Bostetti M. et al. Silver coated materials for external fixation devices; in vitro biocompatibility and genotoxicity. Biomaterials 23, 2002, 887-892, Rameshbabu N., Sampath Kumar T.S., Prabhakar T.G., Sastry V.S., Murty K. V. G. K.,

Prasad Rao K.: Antibacterial nanosized silver substituted hydroxyapatite: Synthesis and characterization, Journal of Biomedical Materials Research Part A, 2006, 581-591).

Biozgodne, ceramiczne materiały hydroksyapatytowe zawierające srebro zasługują na szczególną uwagę w zastosowaniach medycznych, ze względu na to, że przy wysokiej biobójczości w stosunku do bakterii, wirusów i grzybów charakteryzują się niską toksycznością w stosunku do komórek ludzkich. Likwidują wirusy i bakterie wywołujące choroby równocześnie przyśpieszając gojenie uszkodzonych tkanek oraz wzmacniają układ immunologiczny.

Obecnie podstawową metodą nadawania właściwości bakteriobójczych materiałom hydroksyapatytowym jest tworzenie kompozytów hydroksyapatyt/srebro. W kompozytach tych, srebro oprócz nadania kompozytowi właściwości antybakteryjnych poprawia znacząco szereg niekorzystnych cech mechanicznych hydroksyapatytu, m.in. kruchość. Kompozyt hydroksyapatytowy modyfikowany srebrem metalicznym, spiekany w atmosferze powietrza ma wyższy moduł sprężystości i mniejszą twardość niż czysty hydroksyapatyt. Taki materiał posiada większą porowatość i staje się odporny na złamania. Te właściwości są bardzo przydatne przy zastosowaniu kompozytu hydroksyapatyt/srebro do celów bioaplikacji.

Badania prowadzone przez M. Diaz (Diaz M., Barba F., Miranda M., Guitian F., Torrecillas R.,

Moya J.S.: Synthesis and Antimicrobial Activity of a Silver-Hydroxyapatite Nanocomposite, Journal of Nanomaterials 2009, Article ID 498505, 6 pages) potwierdziły antybakteryjne działanie kompozytu hydroksyapatyt/srebro w stosunku do Staphylococcus aureus, Pneumococcus i Escherichia coli.

W literaturze opisano otrzymywanie kompozytów hydroksyapatyt/srebro metodą mechanochemiczną z mieszaniny proszków: hydroksyapatytowego i tlenku srebra, a następnie spiekaniu w temperaturze 1250°C (X. Zhang, G. H. M. Gubbels, R. A. Terpstra, R. Metselaar Toughening of calcium hydroxyapatite with silver particles, Journal of Materials Science 32 (1997) 235-243).

Znana jest również metoda otrzymywania hydroksyapatytu z zawartością srebra metalicznego w procesie redukcji in situ w obecności hydroksyapatytu pochodzenia kostnego z zastosowaniem polialkoholu winylowego i dimetyloformamidu jako reduktora (R. Nirmala, Faheem A. Sheikh, Muzafar A. Kanjwal, John Hwa Lee, Soo-Jin Park, R. Navamathavan, Hak Yong Kim, Synthesis and characte4

PL 226 649 B1 rization of bovine femur bone hydroxyapatite containing silver nanoparticles for the biomedical applications, J Nanopart Res (2011) 13:1917-1927), oraz metoda żol-żel otrzymywania hydroksyapatytu domieszkowanego srebrem z wykorzystaniem tlenku srebra i kwasu cytrynowego w obecności wody amoniakalnej (M. Sygnatowicz, K. Keyshar, A. Tiwari, Antimicrobal properties silver-doped hydroksyapatite nano-powreds and thin films, Biological and Biomedical Materials, Vol 62, No 7, 65-70, 2010).

Stwierdzono nieoczekiwanie, że istnieje możliwość powierzchniowej modyfikacji krystalitów hydroksyapatytu pochodzenia naturalnego poprzez osadzenie na ich powierzchni nanocząstek srebra metodą redukcji in situ srebra w obecności hydroksyapatytu, co pozwala nadać hydroksyapatytowi właściwości biobójcze w stosunku do bakterii, wirusów i grzybów.

Zgodnie z wynalazkiem, sposób modyfikacji nanocząstkami srebra powierzchni krystalitów fosforanu wapnia o strukturze hydroksyapatytu, w którym w zawiesinie reakcyjnej dokonuje się redukcji jonów srebra w obecności hydroksyapatytu pochodzenia naturalnego z zastosowaniem reduktora oraz wysokocząsteczkowego stabilizatora organicznego, polega na tym, że w zawiesinie hydroksyapatytu, o frakcji sitowej korzystnie poniżej 65 μm, w roztworze wodnym stabilizatora, którym jest poliwinylopirolidon o stężeniu 0,01-15% wag., rozpuszcza się podczas ciągłego mieszania, w temperaturze pokojowej sól srebrową, korzystnie azotan lub chlorek srebra, po czym do zawiesiny tej wprowadza się stopniowo kroplami, przy stałym mieszaniu, wodny roztwór zawierający poliwinylopirolidon w stężeniu 0,01-15% wag. i reduktor, którym jest borowodorek sodu, a po zakończeniu redukcji osad oddziela się, przemywa wodą i suszy.

W sposobie stosuje się sól srebrową w takiej ilości, by stężenie srebra w mieszaninie reakcyjnej wynosiło od 100 ppm do 5000 ppm, stosunek molowy borowodorku sodu do jonów srebra wynosił od 1/10 do 10/1, a udział wagowy hydroksyapatytu w mieszaninie reakcyjnej wynosił od 0,0001 do 0,8.

Wykonano szereg prób otrzymywania opisanym wyżej sposobem hydroksyapatytu modyfikowanego powierzchniowo nanocząstkami srebra, stwierdzając, że w trakcie dozowania przy stałym mieszaniu roztworu zawierającego reduktor, do zawiesiny zawierającej hydroksyapatyt następuje redukcja srebra na powierzchni krystalitów hydroksyapatytu, która nie narusza macierzystej struktury.

Analiza rentgenowska wybranych próbek produktu otrzymanego zgodnie z wynalazkiem wykazała, że jedyną fazą krystaliczną jest hydroksyapatyt, a analiza mikroskopowa jednoznacznie potwierdziła obecność cząstek srebra o wymiarach nanometrycznych na powierzchni hydroksyapatytu.

Sposób według wynalazku jest w pełni przydatny do otrzymywania hydroksyapatytu naturalnego, modyfikowanego powierzchniowo nanocząstkami srebra, nadającego się do wykorzystania jako biozgodne ceramiczne tworzywo, nietoksyczne, biologicznie aktywne, biobójcze w stosunku do bakterii, wirusów i grzybów oraz charakteryzuje się niską toksycznością w stosunku do komórek ludzkich.

Przedmiot wynalazku objaśniono poniżej w kilku przykładach jego realizacji.

P r z y k ł a d 1

W temperaturze otoczenia sporządzono 250 ml roztworu wodnego poliwinylopirolidonu o stężeniu 1% wag., do którego, podczas mieszania mieszadłem magnetycznym, dodano hydroksyapatyt naturalny (pochodzenia kostnego) o frakcji sitowej poniżej 65 μm w ilości 30 g, a następnie w otrzymanej zawiesinie hydroksyapatytowej rozpuszczono 1,1811 g AgNO3.

Sporządzono roztwór reduktora w roztworze stabilizatora, w ten sposób, że w 50 ml 3% wag. wodnego roztworu poliwinylopirolidonu rozpuszczono 0,2628 g NaBH4.

Następnie w temperaturze otoczenia do zawiesiny podczas stałego mieszania wkraplano roztwór reduktora w stabilizatorze. Podczas wkraplania roztworu srebro jonowe ulegało redukcji na powierzchni hydroksyapatytu, wytrącając się w postaci metalicznej, co powodowało zmianę zabarwienia hydroksyapatytu z białej na brunatno-szarą.

Po zakończeniu reakcji redukcji osad odsączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w 110°C.

Otrzymany suchy osad zidentyfikowano metodą rentgenograficzną (z zastosowaniem dyfraktometru Philips X' Pert wyposażonego w monochromator grafitowy PW 1752/00, Cu Ka 1,54, filtr Ni (40 kV, 30 mA)), jako fosforan wapnia o strukturze hydroksyapatytu: Ca10(PO4)3(OH)2.

Analiza chemiczna metodą absorpcyjnej spektrometrii atomowej (z zastosowaniem aparatu AAnalyst 300 Perkin Elmer) wykazała, że osad zawierał 2,06% wag. Ag.

Mikrofotografie SEM potwierdziły modyfikacje powierzchni hydroksyapatytu srebrem. W badaniach zastosowano skaningowy mikroskop elektronowy JEOL.

Na fig. 1 przedstawiono mikrofotografię hydroksyapatytu modyfikowanego srebrem z przykładu 1.

PL 226 649 B1

P r z y k ł a d 2

W temperaturze pokojowej sporządzono 250 ml roztworu wodnego poliwinylopirolidonu o stężeniu 1% wag., do którego podczas mieszania mieszadłem magnetycznym, dodano hydroksyapatyt naturalny (pochodzenia kopalnego) o frakcji sitowej poniżej 65 gm w ilości 30 g, a następnie w otrzymanej zawiesinie hydroksyapatytowej rozpuszczono 0,2348 g AgNO3.

Sporządzono roztwór reduktora w roztworze stabilizatora, w ten sposób, że w 50 ml 1% wag.

roztworu poliwinylopirolidonu rozpuszczono 0,0522 g NaBH4.

Następnie w temperaturze pokojowej do zawiesiny podczas stałego mieszania wkraplano roztwór reduktora ze stabilizatorem. Podczas wkraplania roztworu srebro ulegało redukcji na powierzchni hydroksyapatytu i wytrącając się w postaci metalicznej, co powodowało zmianę zabarwienia hydroksyapatytu z białej na brunatno-szarą.

Po zakończeniu reakcji osad odsączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w 110°C.

Otrzymany suchy osad zidentyfikowano metodą rentgenograficzną (jak w przykładzie 1), jako fosforan wapnia o strukturze hydroksyapatytu: Ca10(PO4)3(OH)2.

Analiza chemiczna (metodą jak w przykładzie 1) wykazała, że osad zawierał 0,46% wag. Ag. Mikroanaliza rentgenowska (metodą jak w przykładzie 1) potwierdziła obecność srebra.

Mikrofotografie SEM potwierdziły modyfikacje powierzchni hydroksyapatytu srebrem.

Na fig. 2 przedstawiono mikrofotografię hydroksyapatytu modyfikowanego srebrem z przykładu 2.

P r z y k ł a d 3

W temperaturze 25°C sporządzono 75 ml roztworu wodnego poliwinylopirolidonu o stężeniu 3% wag., do którego, podczas mieszania mieszadłem magnetycznym, dodano 50 ml H2O oraz hydroksyapatyt naturalny (pochodzenia kostnego) o frakcji sitowej poniżej 65 gm w ilości 3 g, a następnie w otrzymanej zawiesinie hydroksyapatytowej rozpuszczono 0,0787 g AgNO3.

Sporządzono roztwór reduktora w roztworze stabilizatora, w ten sposób, że w 25 ml 3% wag.

roztworu poliwinylopirolidonu rozpuszczono 0,0017 g NaBH4.

W temperaturze 25°C do zawiesiny podczas stałego mieszania wkraplano roztwór reduktora ze stabilizatorem. Podczas wkraplania roztworu srebro ulegało redukcji na powierzchni hydroksyapatytu i wytrącało się powodując zmianę zabarwienia hydroksyapatytu z białej na brunatno-szarą.

Po zakończeniu reakcji osad odsączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w 110°C.

Otrzymany suchy osad zidentyfikowano metodą rentgenograficzną jako fosforan wapnia o strukturze hydroksyapatytu: Ca10(PO4)3(OH)2.

Analiza chemiczna (metodą jak w przykładzie 1) wykazała, że osad zawierał 0,67% wag. Ag. Mikroanaliza rentgenowska (metodą jak w przykładzie 1) potwierdziła obecność srebra.

Mikrofotografie SEM potwierdziły modyfikacje powierzchni hydroksyapatytu srebrem.

Na fig. 3 przedstawiono mikrofotografię hydroksyapatytu modyfikowanego srebrem z przykładu 3.

P r z y k ł a d 4

W temperaturze otoczenia sporządzono 125 ml roztworu wodnego poliwinylopirolidonu o stężeniu 3% wag, do którego, podczas mieszania mieszadłem magnetycznym, dodano hydroksyapatyt naturalny (pochodzenia kostnego) o frakcji sitowej poniżej 65 gm w ilości 3 g, a następnie w otrzymanej zawiesinie hydroksyapatytowej rozpuszczono 0,0996 g AgCl.

Sporządzono roztwór reduktora w roztworze stabilizatora, w ten sposób, że w 25 ml 3% wag.

roztworu poliwinylopirolidonu rozpuszczono 0,0026 g NaBH4.

Następnie w temperaturze otoczenia do zawiesiny podczas stałego mieszania wkraplano roztwór reduktora ze stabilizatorem. Podczas wkraplania roztworu srebro ulegało redukcji na powierzchni hydroksyapatytu i wytrącając się, co powodowało zmianę zabarwienia hydroksyapatytu z białej na brunatno-szarą.

Po zakończeniu reakcji osad odsączono, przemyto kilkakrotnie wodą i wysuszono w 110°C. Otrzymany suchy osad zidentyfikowano metodą rentgenograficzną, jako fosforan wapnia o strukturze hydroksyapatytu: Ca10(PO4)3(OH)2.

Analiza chemiczna (metodą jak w przykładzie 1) wykazała, że osad zawierał 1,04% wag. Ag. Mikroanaliza rentgenowska (metodą jak w przykładzie 1) potwierdziła obecność srebra.

Mikrofotografie SEM potwierdziły modyfikacje powierzchni hydroksyapatytu srebrem.

Na fig. 4 przedstawiono mikrofotografię hydroksyapatytu modyfikowanego srebrem z przykładu 4.

Claims (2)

1. Sposób modyfikacji nanocząstkami srebra powierzchni krystalitów fosforanu wapnia o strukturze hydroksyapatytu, w którym w zawiesinie reakcyjnej dokonuje się redukcji jonów srebra w obecności hydroksyapatytu pochodzenia naturalnego z zastosowaniem reduktora oraz wielkocząsteczkowego stabilizatora, znamienny tym, że w zawiesinie hydroksyapatytu, o frakcji sitowej korzystnie poniżej 65 pm, w roztworze wodnym stabilizatora, którym jest poliwinylopirolidon o stężeniu 0,01-15% wag., rozpuszcza się podczas ciągłego mieszania, w temperaturze pokojowej sól srebrową, po czym do zawiesiny wprowadza stopniowo kroplami, przy stałym mieszaniu, wodny roztwór zawierający poliwinylopirolidon w stężeniu 0,01-15% wag. i reduktor, którym jest borowodorek sodu, a po zakończeniu redukcji osad oddziela się, przemywa wodą i suszy, przy czym stosuje się sól srebrową w takiej ilości, by stężenie srebra w mieszaninie reakcyjnej wynosiło od 100 ppm do 5000 ppm, stosunek molowy borowodorku sodu do jonów srebra wynosił od 1/10 do 10/1, a udział wagowy hydroksyapatytu w mieszaninie reakcyjnej wynosił od 0,0001 do 0,8.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło jonów srebra stosuje się azotan lub chlorek srebra.