PL227045B1

PL227045B1 - Płyn do przechowywania narządów w czasie zabiegów chirurgicznych, zwłaszcza transplantacji.

Info

Publication number: PL227045B1
Application number: PL400780A
Authority: PL
Inventors: Michał Woźniak; Ryszard Tomasz Smoleński; Narcyz Knap
Original assignee: Blirt Spółka Akcyjna
Priority date: 2012-09-14
Filing date: 2012-09-14
Publication date: 2017-10-31
Also published as: EP2894975A1; EP2894975B1; WO2014042545A1; PL400780A1

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest płyn bioprotekcyjny przeznaczony do przechowywania narządów ludzkich w czasie zabiegów chirurgicznych zwłaszcza w czasie zabiegów transplantacji. Zakres zadań płynu obejmuje perfuzję i przechowywanie w obniżonej temperaturze narządu pobranego od dawcy lub poddawanego procedurze operacyjnej. Możliwość wykonywania transplantacji stanowi jedno z największych osiągnięć medycyny. Rewolucja transplantologiczna, w wyniku której zabieg przeszczepu stał się rutynową metodą leczniczą oferowaną pacjentom ze schyłkową niewydolnością narządu jest wynikiem znaczącej optymalizacji techniki pobierania i przeszczepiania narządów. Opracowano nowe techniki immunosupresji oraz udoskonalono składy płynów do perfuzji i przechowywania narządów. Zatrzymanie krążenia krwi w przeszczepianym narządzie generuje stan ischemii nazywany w transplantologii okresem ciepłego niedokrwienia, w którym występować może nieodwracalne uszkodzenie narządu wykluczające przeszczep. Podstawowym sposobem minimalizacji negatywnych efektów ciepłego niedokrwienia jest hipotermia ograniczająca szybkość metabolizmu generującego deficyt niezbędnych wysokoenergetycznych adenylanów i zwiększającego podaż reaktywnych form tlenu i azotu.

Ze stanu techniki znanych jest wiele receptur płynów do przechowywania narządów. F. Beizer i J. Southard opracowali płyn, który stał się standardowym płynem do perfuzji i przechowywania nerek, wątroby, trzustki i serca (Beizer et al. (1994) Transplant Proc, 26, 550). Płyn ten stosował unikatowy i niestosowany wcześniej składnik pełniący funkcję koloidu osmotycznego, a mianowicie hydroksyetylowaną skrobię - HES. Jest to polimer glukozy o masie cząsteczkowej równej 150.000-350.000 D. W porównaniu z innymi płynami ten znany płyn wykazał znaczącą skuteczność w ochronie nerek i wątroby przechowywanych do przeszczepu (Upadhya i Strasberg (2000) Hepatology, 31, 1115-1122). Płyn do ochrony i przechowywania narządów w czasie transplantacji i innych zabiegów chirurgicznych zgodnie ze stanem wiedzy powinien składać się z substancji osmotycznie i onkotycznie czynnych, elektrolitów, substancji o charakterze przeciwutleniaczy, krioprotektantów, stabilizatorów cytoszkieletu, prekursora syntezy wysokoenergetycznych adenylanów, inhibitora apoptozy i stymulatora procesu regeneracji komórek śródbłonka. W międzynarodowym zgłoszeniu patentowym WO 9618293 ujawniono zrównoważone izotoniczne roztwory jonowe użyteczne w transplantologii. Płyny do przechowywania i perfuzji przeszczepianego narządu zostały opisane w European Surgical Research, vol. 24, nr 6, 1992, str. 339-348, Reckendorfer H. et al.: „Hepatic energy metabolism during hypothermic storage and reperfusion using different protecting solutions”.

Publikacja Mohiuddin i Hilleman CA1305922 dotyczy zastosowania adenozyny lub inozyny do obrazowania obszarów niedokrwienia w mięśniu sercowym. Inozyna jest wymieniona w dokumencie CA1305922 jako metabolit adenozyny bez podania dowodów na możliwości jej zastosowania w zabiegach diagnostycznych. Co więcej, z piśmiennictwa wiadomo, że inozyna nie może być zastosowana w kontekście omawianym w dokumencie CA 1305922 ze względu na brak efektów receptorowych inozyny. Dokument ujawnia stosowanie adenozyny/inozyny do perfuzji mięśnia sercowego w celu jego obrazowania. Dokument nie ujawnia zastosowania inozyny do perfuzji narządów w celu transplantacji.

Zastosowanie kwasu aurynotrikarboksylowego (ATA) do wytwarzania płynu do perfuzji płuc oraz jego działanie ochronne podczas heteroprzeszczepu płuc ze świni do człowieka ujawnione zostało w publikacji Kim et al. „Aurintricarboxylic acid inhibits endothelial activation, complement activation, and von Willebrand factor secretion in vitro and attenuates hyperacute rejection in an ex vivo model of pig-to-human pulmonary xenotransplantation.” Xenotransplantation, vol. 15, no. 4, 2008, pages 246 -256 oraz Pfeiffer et al. „Hyperacute lung rejection in the pig-to-human model III. Platelet receptor inhibitors synergistically modulate complement activation and lung injury” Transplantation, vol. 75, no. 7, 15 April 2003 (2003-04-15) pages 953-959. Zarówno publikacja Kim et al. jak i Pfeiffer et al. dotyczy ochrony przed odrzutem przeszczepów międzygatunkowych, a nie ochrony przed uszkodzeniem w czasie przechowywania narządu do przeszczepu. Kim et al. ujawnia zastosowania ATA do perfuzji płuc w warunkach fizjologicznych nie wspominając o możliwości długotrwałego przechowywania organu w warunkach niefizjologicznych przy obniżonej temperaturze. Pfeiffer et al. bada wpływ czynników vWF GPIB (GP)Ib-V-IX and GPIIb-IIla na reakcję ostrego odrzucenia przeszczepu świńskich płuc. ATA używany jest jako środek heparynizujący (przeciwzakrzepowy) dodawany do ludzkiej krwi przed perfuzją świńskiego płuca. Publikacja nie ujawnia wykorzystania ATA do przechowywania organu przed zabiegiem chirurgicznym.

PL 227 045 B1

Ujawnione w publikacji Wolfgang Walther et al. „Use of the nuclease inhibitor auritricarboxylic acid (ATA) for improved non-viral intratumoral in vivo gene transfer by jet-injection” (The Journal of Gene

Medicine, Volume 7, Issue 4, pages 477-485, April 2005) właściwości kwasu aurinotrikarboksylowego związane są z usprawnieniem techniki transferu genów do tkanek nowotworowych. Proponowany przez Wolfganga Walthera et al. mechanizm działania ATA bazuje na znanym fakcie zdolności

ATA do hamowania aktywności nukleolitycznej.

Występująca w dokumencie Wada Hiromi EP 0 580 444 trehaloza pełni funkcję stabilizatora osmotycznego, na co wskazuje zakres stosowanych stężeń od 50 do 240 mM.

Obecnie stosowane procedury były opracowane co najmniej kilkanaście lat temu i nie w pełni uwzględniają najnowszą wiedzę dotyczącą uszkodzenia w trakcie przeszczepów. W dalszym ciągu pozostaje więc problem stworzenia warunków dla możliwie długiego i bezpiecznego przechowywania narządu przed zabiegiem chirurgicznym. Odrzut transplantowanych organów, przykładowo, odrzut narządu w przypadku przeszczepu wątroby, przyczynia się w pierwszym roku po operacji do wzrostu śmiertelności na poziomie 15-25% (Strasberg S.M. et al. (1994) Hepatology, 20:829). Transplantolog potrzebuje czasu niezbędnego do wykonania rutynowych badań dawcy i biorcy celem podjęcia istotnych decyzji przedoperacyjnych. Powyższy problem stwarza wymóg jak najdłuższego, bezpiecznego przechowywania pobranego narządu.

Celem wynalazku jest dostarczenie udoskonalonego płynu zapewniającego wysoce efektywną ochronę i możliwość przechowywania organów w czasie transplantacji i innych zabiegów chirurgicznych. Celem wynalazku jest dostarczenie roztworu warunkującego skuteczną bioprotekcję organu i regenerację śródbłonka naczyń krwionośnych. Celem wynalazku jest dostarczenie płynu zawierającego substraty umożliwiające regenerację wysokoenergetycznych adenylanów, związki neutralizujące reaktywne formy azotu i tlenu, zapobiegające wewnątrzkomórkowej kwasicy, zmniejszające obrzęki komórki i zapewniające odpowiednie ciśnienie osmotyczne. Celem wynalazku jest dostarczenie płynu ograniczającego skutki uwalniania do krążenia redoksowo czynnego jonu Fe²⁺, a także ograniczającego apoptozę oraz toksyczne efekty nadtlenku wodoru w wyniku czego możliwe jest skuteczne zabezpieczenie narządu przeznaczonego do transplantacji przed szkodliwymi efektami ubocznymi niskiej temperatury i ischemii.

Nieoczekiwanie cele te zrealizowano w poniższym wynalazku.

Przedmiotem wynalazku jest płyn do przechowywania narządów w czasie zabiegów chirurgicznych, zwłaszcza transplantacji, charakteryzujący się tym, że zawiera:

- trehalozę w stężeniu od 1 mM do 50 mM,

- inozynę w stężeniu od 0,1 mM do 5 mM,

- kwas α-ketomasłowy lub jego sole w stężeniu od 0,1 mM do 25 mM,

- kwas aurynotrikarboksylowy lub jego sole w stężeniu od 0,01 mM do 1 mM,

- N-metylonikotynamid lub jego sole w stężeniu od 0,1 mM do 5 mM.

Korzystnie, płyn zawiera kwas laktobionowy lub jego sole, korzystnie w stężeniu od 50 mM do 200 mM.

Korzystnie, płyn zawiera diwodorofosforan potasu, korzystnie w stężeniu od 5 mM do 50 mM.

Korzystnie, płyn zawiera siarczan magnezu, korzystnie w stężeniu od 0,1 mM do 30 mM.

Korzystnie, płyn zawiera polihydroksyetylowaną skrobię, korzystnie w stężeniu od 5 g/l do 100 g/l.

Korzystnie, sole kwasu laktobionowego stanowią sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, zwłaszcza wapnia i magnezu.

Korzystnie, sole kwasu laktobionowego stanowią sole amonowe.

Korzystnie, sole kwasu α-ketomasłowego stanowią sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, zwłaszcza wapnia i magnezu.

Korzystnie, sole kwasu α-ketomasłowego stanowią sole amonowe.

Korzystnie, sole kwasu aurynotrikarboksylowego stanowią sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, zwłaszcza wapnia i magnezu.

Korzystnie, sole kwasu aurynotrikarboksylowego stanowią sole amonowe.

Korzystnie, sole N-nikotynamidu stanowią chlorowodorek, bromowodorek, octan, szczawian, winian, p-toluenosulfonian, pirogronian.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie kwasu aurynotrikarboksylowego lub jego soli do wytwarzania płynu do przechowywania narządów przed lub w czasie zabiegów chirurgicznych, zwłaszcza transplantacji.

PL 227 045 B1

Korzystnie, kwas stosuje się w stężeniu 0,01 mM do 1 mM.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie inozyny do wytwarzania płynu do przechowywania narządów przed lub w czasie transplantacji.

Poszczególne składniki spełniają w składzie płynu według wynalazku niżej wyspecyfikowane funkcje.

Kwas α-ketomasłowy i jego sole z metalami alkalicznymi lub metalami ziem alkalicznych lub sole amonowe w stężeniu od 0,1 mM do 25 mM funkcjonują jako niebiałkowe mimetyki katalazy.

Inozyna w stężeniu od 0,1 mM do 5 mM spełnia funkcję chelatora redoksowo aktywnego żelaza i tym samym inhibitora reakcji Fentona.

Kwas aurynotrikarboksylowego (ATA) jest znany jako barwnik wykorzystywany do oznaczenia glinu w wodzie, tkankach biologicznych i produktach spożywczych. Ponadto jest znanym inhibitorem replikacji DNA poprzez inhibicję aktywności rybonukleaz i topoizomerazy drugiej. Nieoczekiwanie twórcom przedmiotowego rozwiązania udało się wykazać jego szczególne własności i zastosowanie do wytwarzania płynu do przechowywania organów w celu transplantacji. Kwas aurynotrikarboksylowy i jego sole z metalami alkalicznymi i z metalami ziem alkalicznych oraz sól amonowa w stężeniu od 0,01 mM do 1 mM wykazują nieoczekiwane właściwości stabilizatora cytoszkieletu aktynowego oraz stabilizatora puli wysokoenergetycznych guanylanów niezbędnych do prawidłowej funkcji mikrotubul cytoszkieletu komórek śródbłonka naczyniowego, a ponadto wykazują właściwości inhibitora domeny katalitycznej wielorakich form enzymatycznych fosfatazy fosfotyrozynowej CD45. Jest ona jednym z decydujących czynników biorących udział w procesie ostrego odrzucenia przeszczepu oraz w etiopatogenezie choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi (Graft-Versus-Host Disease), co w świetle powyższego czyni kwas aurynotrikarboksylowy i jego sole metali alkalicznych, metali ziem alkalicznych oraz sole amonowe szerokospektralnym substytutem przeciwciał monoklonalnych hamujących aktywność fosfatazy CD45.

Trehaloza w stężeniu od 1 mM do 50 mM wykazuje właściwości krioprotekcyjne, przeciwutleniające i stabilizujące cząsteczki białek i lipidów błon komórkowych, komórek łożyska ludzkiego i śródbłonka naczyń krwionośnych.

N-metylonikotynamid i jego sole w stężeniu od 0,1 mM do 5 mM stanowi prekursor NAD(P)⁺, regulator cyklu komórkowego oraz cząsteczkę wykazującą działanie przeciwzapalne.

Unikatowa kompozycja kwasu α-ketomasłowego i jego soli, inozyny, kwasu aurynotrikarboksylowego i jego soli, trehalozy i N-metylonikotynamidu wg wynalazku warunkuje zdolność do efektywnej bioprotekcji narządu i regeneracji śródbłonka naczyń krwionośnych. Płyn charakteryzuje się cechami zapewniającymi niespodziewanie skuteczną ochronę narządu przeznaczonego do transplantacji przed niekorzystnymi efektami niskiej temperatury i ischemii. Unikatową cechą płynu jest dodatkowa, nieoczekiwana i potwierdzona eksperymentalnie funkcja ochrony i stymulacji procesu regeneracji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych narażonych na stres niedokrwienny, temperaturowy i oksydacyjny.

Skład płynu obejmuje innowacyjne komponenty eliminujące negatywne skutki hipotermii niezbędnej do wydłużonego w czasie przechowywania narządu takie jak spadek stężeń ATP, GTP i indukcja genów proapoptotycznych oraz eliminujące toksyczne efekty uboczne ciepłej reperfuzji przeszczepionego narządu w tym stresu oksydacyjnego związanego z generacją reaktywnych form tlenu.

Unikatowa kompozycja płynu zapewnia ochronę integralności struktury komórek śródbłonka na poziomie molekularnym (stabilizacja cytoszkieletu komórkowego) i komórkowym (ochrona topologii błony komórkowej śródbłonka) oraz maksymalną zdolność do regeneracji komórek śródbłonka w warunkach zimnej ischemii i ciepłej reperfuzji. Kompozycja zapewnia ochronę integralności struktury kwasu deoksyrybonukleinowego (DNA) w warunkach narażenia na toksyczne efekty jonów Fe(II) oraz w obecności jonów Fe(II) i nadtlenku wodoru (warunki naśladujące reperfuzję przeszczepionej nerki).

Biorąc pod uwagę niekorzystne uwarunkowania potencjalnej bioprotekcyjności płynu znanego ze stanu techniki, w postaci zawartości redoksowo czynnej cząsteczki glutationu i znaczących ilości jonów Fe²⁺, zaproponowany skład płynu według wynalazku pozbawiony jest wspomnianych wyżej wad. Płyn według wynalazku jest płynem bioprotekcyjnym i bioregenerującym śródbłonek naczyń. Przeznaczony do płukania oraz bezpiecznego przechowywania narządów płyn według wynalazku w niskiej temperaturze posiada unikatowe właściwości polegające na bioprotekcyjności w warunkach zimnej ischemii i ciepłej reperfuzji, stabilizacji cytoszkieletu i topologii błon komórek śródbłonka oraz potencjalizacji zdolności endoteliocytów do regeneracji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych przeszczepianego narządu.

PL 227 045 B1

Płyn charakteryzuje kompozycja adekwatna dla zapewnienia maksymalnej ochrony narządu przed niekorzystnymi efektami niskiej temperatury i ischemii. Unikatową cechą płynu jest dodatkowa, nieoczekiwana i potwierdzona eksperymentalnie funkcja ochrony i stymulacji procesu regeneracji komórek śródbłonka naczyń krwionośnych narażonych na stres niedokrwienny, temperaturowy i oksydacyjny.

Skład płynu obejmuje innowacyjne komponenty eliminujące:

a) negatywne skutki hipotermii niezbędnej do wydłużonego w czasie przechowywania narządu, takie jak spadek stężeń ATP, GTP i indukcja genów proapoptotycznych,

b) toksyczne efekty uboczne ciepłej reperfuzji przeszczepionego narządu w tym stresu oksydacyjnego związanego z generacją reaktywnych form tlenu.

Unikatowa kompozycja płynu gwarantuje:

a) ochronę integralności struktury komórek śródbłonka na poziomie molekularnym (stabilizacja cytoszkieletu komórkowego) i komórkowym (ochrona topologii błony komórkowej śródbłonka),

b) maksymalną zdolność do regeneracji komórek śródbłonka w warunkach zimnej ischemii i ciepłej reperfuzji,

c) ochronę integralności struktury kwasu deoksyrybonukleinowego w warunkach narażenia na toksyczne efekty jonów Fe(II) oraz w obecności jonów Fe(II) i nadtlenku wodoru (warunki naśladujące zimną ischemię i ciepłą reperfuzję przeszczepionej nerki;

Stadlmann S. et al. (2002) Transplantation, 74, 1800-1803; Yu W. et al. (2012) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 109, 6680-6685).

W dalszej części opisu płyn stanowiący przedmiot niniejszego wynalazku występuje pod nazwą Blirt.

Fig. 1 Wpływ inozyny na generację rodnika hydroksylowego badany przez pomiar hydroksylacji kwasu benzoesowego w buforze fosforanowym zawierającym jony Fe²⁺.

Fig. 2 Wiązanie jonów Fe²⁺ do inozyny (widmo NMR, Varian Gemini 200).

Fig. 3 Wpływ inozyny na degradację plazmidu pBR322 inkubowanego z jonami Fe²⁺ i/lub nadtlenkiem wodoru. Ścieżki na żelu agarozowym to: 1. - kontrola, 2. - Fe²⁺, 3. - Fe²⁺ + 2 mM inozyna, 4. - Fe²⁺ + 2 mM 2'-deoksyinozyna, 5. - Fe²⁺ + H2O2, 6. - Fe²⁺ + H2O2 + 2 mM inozyna, 7. - Fe²⁺ + H2O2 + 2 mM 2'-deoksyinozyna, 8. - Fe²⁺ + H2O2 + 1 mM inozyna.

Fig. 4 Stan energetyczny komórek śródbłonka CPAE eksponowanych na H2O2 przez 24 h.

Fig. 5 Żywotność komórek śródbłonka traktowanych wzrastającym stężeniem H2O2.

Fig. 6 Aktywność enzymatyczna błonowej fosfatazy fosfotyrozynowej CD45 mierzona kolorymetrycznie po 30 min inkubacji w kontroli oraz w płynie Blirt.

Fig. 7 Hodowla inkubowana po 24 h w A). pożywce standardowej, B). znanym płynie, C). płynie

Blirt.

Fig. 8 Kontrola po A). 6 h, B). 12 h, C). 24 h inkubacji.

Fig. 9 Komórki inkubowane w znanym płynie przez A). 6 h, B). 12 h, C). 24 h.

Fig. 10 Komórki inkubowane w płynie Blirt przez A). 6 h, B). 12 h, C). 24 h.

Fig. 11 Korelacja zmian morfologicznych obserwowanych w mikroskopie konfokalnym (3 typowe ujęcia).

Fig, 12 Hodowla komórek śródbłonka naczyniowego inkubowanych przez A). 6 h, B). 12 h, C). 24 h w pożywce standardowej po przeniesieniu do standardowej pożywki na 24 h.

Fig. 13 Hodowla komórek śródbłonka naczyniowego inkubowanych przez A). 6 h, B). 12 h, C). 24 h w znanym płynie po przeniesieniu do standardowej pożywki na 24 h.

Fig. 14 Hodowla komórek śródbłonka naczyniowego inkubowanych przez A). 6 h, B). 12 h, C). 24 h w płynie Blirt po przeniesieniu do standardowej pożywki na 24 h.

Niniejszy wynalazek zilustrowano przykładami realizacji nie ograniczającymi jego zakresu ochrony.

P r z y k ł a d 1.

Skład formulacji płynu.

Przykładowa formulacja farmaceutyczna płynu według wynalazku:

W 1L wody destylowanej rozpuszczono:

a. Kwas laktobionowy (100 mM),

b. Wodorotlenek potasu (100 mM),

PL 227 045 B1

c. Trehalozę dihydrat (30 mM),

d. KH2PO4 (25 mM),

e. MgSO4 heptahydrat (5 mM),

f. Inozynę (3 mM),

g. α-Ketomaślan sodu (5 mM),

h. Polihydroksyetylowaną skrobię (50 g/l),

i. Sól triamonową kwasu aurynotrikarboksylowego (0,2 mM),

j. Chlorowodorek N-metylonikotynamidu (1 mM),

Następnie pH otrzymanego roztworu doprowadza się do pH = 7,4 ±0,1 za pomocą kwasu solnego lub wodorotlenku sodu bądź wodorotlenku potasu. Otrzymany płyn przechowuje się w temperaturze 0 + 5°C.

P r z y k ł a d 2.

2+

Badanie wpływu inozyny na autooksydację jonów Fe²⁺ w buforze fosforanowym i generację rodnika hydroksylowego.

Jony Fe²⁺ w buforze fosforanowym ulegają autooksydacji do jonów Fe³⁺, oddając jeden elektron cząsteczce tlenu, co prowadzi do generacji anionorodnika ponadtlenkowego (O₂'). Anionorodnik ponadtlenkowy dysmutuje do nadtlenku wodoru (H2O2), który w obecności katalitycznych ilości jonów Fe²⁺ generuje rodniki hydroksylowe. Ocenę ilości rodników OH dokonano, analizując produkt reakcji rodnika hydroksylowego z kwasem benzoesowym drogą pomiaru fluorescencji kwasu salicylowego.

Wyniki przedstawione na Fig. 1 wskazują, że inozyna zapobiega generacji rodników OH w buforze fosforanowym zawierającym jony Fe²⁺ tym efektywniej, im jej stężenie jest wyższe.

P r z y k ł a d 3.

Badanie wpływu inozyny na proces uszkodzenia pierścienia deoksyrybozy.

Rodniki hydroksylowe katalizują proces pękania pierścienia deoksyrybozy, który w następstwie tego utlenia się do dialdehydu rybozy. Dialdehyd rybozy z kwasem tiobarbiturowym tworzy barwny addukt (TBARS) (Gutteridge et al. (1987) Biochem. J., 243, 709-714). Jak przedstawiono w Tabeli 1, 1 mM deoksyryboza inkubowana w buforze fosforanowym z jonami Fe²⁺ (100 pM) generuje barwny produkt reakcji o absorbancji 0,280. Natomiast obecność pierścienia purynowego hipoksantyny w deoksyinozynie i inozynie hamuje degradację pierścienia deoksyrybozy (Tabela 1).

T a b e l a 1

Wpływ inozyny na uszkodzenie deoksyrybozy w warunkach stresu oksydacyjnego

Środowisko inkubacyjne	TBARS
100 μM Fe²+ 1 mM deoksyryboza	0,280
100 μM Fe²+ 1 mM deoksyryboza 1 mM inozyna	0,050
100 μM Fe²+ 1 mM deoksyinozyna	0,030
100 μM Fe²+ 1 mM deoksyinozyna 1 mM inozyna	0,000

Uzyskane wyniki wskazują, iż inozyna może wiązać i hamować proces autooksydacji jonów Fe²⁺ generujący toksyczne rodniki hydroksylowe. Badanie wiązania jonów Fe²⁺ do pierścienia purynowego inozyny wykonano metodą magnetycznego rezonansu jądrowego NMR. Obniżenie intensywności sygnałów protonów przy przesunięciu chemicznym 8,15 ppm w widmie NMR inozyny interpretuje się jako efekt wiązania koordynacyjnego jonów metali do atomu azotu N(7) pierścienia purynowego (Singel H., Naumann C., Prijs B.(1974) Eur. J. Biochem, 46, 589-593). Jak widać na Fig. 2 inkubacja inozyny z jonami Fe²+ (1 μΜ) powodowała znaczące zmniejszenie intensywności sygnałów protonów w cząsteczkach inozyny, co pozytywnie weryfikuje interakcję jonów Fe²⁺ z pierścieniem purynowym nukleozydu.

PL 227 045 B1

P r z y k ł a d 4.

2+

Badania protekcyjnego wpływu inozyny na plazmidowy DNA traktowany jonami Fe²⁺ oraz nadtlenkiem wodoru (układ Fentona).

Plazmid bakteryjny pBR322 (stanowiący w tym eksperymencie swoisty model mitochondrialnego DNA) w ilości 100 ng inkubowano w 50 mM buforze fosforanowym (pH = 7,4) z Fe₂SO₄ (5 pM), H₂O₂ (100 μΜ) oraz inozyną (1 mM lub 2 mM) w temperaturze pokojowej przez 60 min. Następnie przeprowadzono rozdział DNA na 1% żelu agarozowym pod napięciem 80 V przez 40 min. Próbka kontrolna plazmidowego DNA (nietraktowana) jest widoczna na żelu jako dominujący prążek względnie szybko migrującej formy superhelikalnej (odpowiadający natywnej formie plazmidu bakteryjnego) oraz śladowy prążek odpowiadający zrelaksowanej formie kolistej, migrujący wolniej. Próbki plazmidu traktowane jonami żelaza (II) i/lub nadtlenkiem wodoru ulegają degradacji, co widać na żelu jako odwrócenie proporcji formy superhelikalnej względem formy zrelaksowanej i świadczy o wolnorodnikowej degradacji plazmidu. Natomiast próbki plazmidu inkubowane z jonami żelaza (II) i/lub nadtlenkiem wodoru w obecności inozyny wyglądają na żelu agarozowym porównywalnie z próbką kontrolną, co świadczy o protekcyjnym wpływie inozyny na potencjalną degradację DNA indukowaną rodnikiem hydroksylowym generowanym w układzie Fentona, jak to pokazano na Fig. 3. Mechanizm protekcji polega najprawdopodobniej na kompleksowaniu żelaza (II) przez inozynę, a tym samym hamowaniu procesu powstawania niezwykle reaktywnego rodnika hydroksylowego.

P r z y k ł a d 5.

Badanie wpływu α-tioglicerolu i trehalozy na oksydację lipidów w błonie komórkowej (komórek trofoblastu łożyska ludzkiego).

Pomiar oksydacji lipidów błon komórkowych łożyska ludzkiego dokonano na błonach komórkowych otrzymanych z frakcji błon mikrosomalnych wirowanych 60 minut przy prędkości 100 000 x g. Frakcję mikrosomalną błon łożyska ludzkiego inkubowano przez 10 minut z 10 mM MgCl2 celem precypitacji błon plazmatycznych komórek trofoblastu. Precypitat wirowano 12 minut przy prędkości 2200 x g. Następnie 4,5 mg błon komórkowych komórek trofoblastu łożyska ludzkiego inkubowano 20 minut w obecności 250 pM wodoronadtlenku kumenu (CumOOH) w obecności lub przy braku przeciwutleniaczy 3 pM α-tioglicerolu i 30 mM trehalozy. Po 20 minutach inkubacji oznaczono poziom markerów peroksydacji lipidów tzn. dialdehydu malonowego (MDA) i 4-hydrokynonenalu (HNA) w probówkach.

Pomiar polega na reakcji odczynnika N-metylo-2-fenyIoindolu z MDA i HNA w temperaturze 45°C. Jedna cząsteczka MDA lub HNA reaguje z dwiema cząsteczkami chromogenu, dając barwny addukt o X_max = 586 nm (Esterbauer M., Schaur R.J., Zollner H. (1999) Free. Rad. Biol. Med., 11,81 -128). Wyniki przedstawiono w Tabeli 2 jako ilość MDA/HNA (w pikomolach) na mg białka błon komórkowych. Jak widać obecność α-tioglicerolu i trehalozy, szczególnie podanych razem (próba 5 w porównaniu do próby 2), chroni lipidy błon plazmatycznych komórek trofoblastu łożyska ludzkiego przed peroksydacją.

T a b e l a 2

Wpływ α-tioglicerolu i trehalozy na oksydację lipidów błon komórkowych

Stężenie błon plazmatycznych (mg)	Stężenie wodoronadtlenku kumenu (μΜ)	Stężenie α-tioglicerolu (μΜ)	Stężenie trehalozy (μΜ)	Poziom MDA/HNA (pmol/ /mg)
4,5	-	-	-	50
4,5	250	-	-	600
4,5	250	3	-	200
4,5	250	-	30	150
4,5	250	3	20	75

Analiza wyników wskazuje na znacząco większą zdolność bioprotekcyjną trehalozy w porównaniu do klasycznego przeciwutleniacza α-tioglicerolu.

PL 227 045 B1

P r z y k ł a d 6.

Badanie właściwości cytoprotekcyjnych płynu Blirt względem komórek śródbłonka naczyń krwionośnych.

Pomiar metabolizmu linii komórek śródbłonka CPAE eksponowanych na nadtlenek wodoru przez 24 godziny metodą AlamarBlue, wykazuje znaczącą komponentę cytoprotekcyjną płynu opisanego w wynalazku w porównaniu ze znanym płynem i standardowym medium komórkowym (Fig. 4).

Przedstawione powyżej wyniki obrazują korzystne skutki działania elementów składowych płynu według wynalazku w warunkach naśladujących reperfuzję przeszczepionego narządu, w trakcie której komórki śródbłonka generują znaczące ilości nadtlenku wodoru. W świetle przeprowadzonych badań eksperymentalnych znany płyn zawiera znaczącą ilość nadtlenku wodoru, więc przeanalizowano procentową zawartość żywych komórek śródbłonka po 24 godzinach inkubacji w znanym płynie oraz w płynie według wynalazku w porównaniu do klasycznego medium komórkowego (kontrola) w obecności wzrastających stężeń H2O2. Analiza żywotności opierała się na barwieniu martwych komórek oranżem akrydyny (Fig. 5).

Analiza wyników eksperymentu wskazuje, iż komórki śródbłonka traktowane przez 24 godziny znanym płynem wykazują aż 30% śmiertelności i największą wrażliwość na wzrastające stężenia H2O2 w zakresie od 25 μΜ do 100 μΜ. Komórki śródbłonka inkubowane w płynie według wynalazku wykazują ponad 90% żywotności i wybitnie zredukowaną wrażliwość na nadtlenek wodoru w porównaniu do znanego płynu. Pozwala to rekomendować α-ketomaślan sodu i kwas aurynotrikarboksylowy jako składniki niezbędne dla przeżycia szoku reperfuzyjnego (przeszczep narządu) przez komórki śródbłonka naczyniowego.

P r z y k ł a d 7.

Badanie wpływu płynu Blirt na aktywność enzymatyczną błonowej fosfatazy fosfotyrozynowej CD45 będącej molekularnym mediatorem ostrego odrzucenia przeszczepu oraz choroby przeszczep przeciwko gospodarzowi.

Wykazano eksperymentalnie, że płyn Blirt znacząco hamuje aktywność enzymatyczną błonowej fosfatazy fosfotyrozynowej CD45 (Fig. 6). Enzym inkubowano przez 30 min. w roztworze zbuforowanej soli fizjologicznej (PBS), pH = 7,4 (kontrola) oraz w płynie Blirt. Pomiar aktywności enzymatycznej wykonano kolorymetrycznie, dodając do mieszaniny inkubacyjnej p-NPP (para-nitrofosforan fenylu) jako substrat dla fosfatazy i mierząc absorbancję fali o długości λ = 405 nm. Wyniki doświadczenia wykazały istotne zmniejszenie aktywności enzymatycznej fosfatazy fosfotyrozynowej CD45 w porównaniu z kontrolą.

P r z y k ł a d 8.

Badanie przeżywalności komórek śródbłonka przechowywanych w płynie Blirt.

Do oznaczenia przeżywalności komórek zastosowano linię komórkową CPAE - unieśmiertelnioną linię śródbłonka naczyniowego Bos taurus oraz mikroskopię konfokalną ze znakowaniem szkieletu aktynowego falloidyną. Falloidyna w cytoplazmie wiąże aktynę w formie F (spolimeryzowana) i zapobiega jej depolimeryzacji inhibując aktywność ATPazy tego białka. W efekcie w cytoplazmie znacznie zmniejsza się ilość monomerów aktynowych, a stabilizowane są wszystkie formy wyższe od G-aktyny. Wykorzystuje się falloidynę związaną z barwnikami fluorescencyjnymi (najczęściej zielonym lub czerwonym). Produkt ten w ilościach nanomolarnych (nmol/kg) umożliwia wydajne znakowanie, identyfikację i oznaczanie ilościowe F-aktyny w kulturach komórkowych. Ma to znaczenie w badaniu funkcji mikrotubul w różnych fazach cyklu komórkowego. Barwienie Falloidyna - FITC pozwala na ocenę szkieletu aktynowego.

Do jałowych płytek 6-dołkowych wkładano jałowe szkiełka nakrywkowe (10 x 10 mm). Komórki posiano i po 24 h poddawano działaniu badanych płynów 6/12/24 godz. Po ustalonych czasach inkubacji komórki płukano ciepłym buforem PBS i utrwalano zimnym 4% paraformaldehydem rozpuszczonym wcześniej w buforze PBS (1 ml/dołek) przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano 3-krotnie buforem PBS. W celu permabilizacji komórki poddawano działaniu 0.1% Triton-X100 w buforze PBS przez 10 min (2 ml/dołek) w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano 2-krotnie buforem PBS. W celu wybarwienia szkieletu aktynowego komórki inkubowano z Falloidyna - FITC przez 60 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano 3-krotnie buforem PBS i pozostawiano w temperaturze 4°C do czasu analizy pod mikroskopem konfokalnym.

PL 227 045 B1

T a b e l a 3

Analiza ilościowa uszkodzonych komórek hodowli

	Komórki nieuszkodzone	Komórki częściowo uszkodzone	Komórki uszkodzone
Kontrola 6 h	99%	1%	brak
Kontrola 12 h	97%	3%	brak
Kontrola 24 h	97%	3%	brak
Znany płyn 6 h	2%	20%	78%
Znany płyn 12 h	brak	15%	85%
Znany płyn 24 h	brak	5%	95%
Płyn Blirt 6 h	20%	70%	10%
Płyn Blirt 12 h	8%	65%	27%
Płyn Blirt 24 h	5%	60%	35%

Wyniki eksperymentów (Fig. 7-11) wykazują zwiększenie przeżywalności komórek śródbłonka inkubowanych w płynie Blirt w porównaniu do znanego płynu.

P r z y k ł a d 9.

Badanie zdolności komórek śródbłonka do regeneracji

Zdolność do regeneracji komórek śródbłonka badano po preinkubacji ze znanym płynem oraz z płynem według wynalazku oraz ekspozycji na medium standardowe zawierające białka surowicy. W badaniu zastosowano linię komórkową: CPAE - unieśmiertelniona linia śródbłonka naczyniowego (Bos taurus). Badanie wykonano z zastosowaniem mikroskopii konfokalnej - znakowanie szkieletu aktynowego falloidyną. Falloidyna w cytoplazmie wiąże aktynę w formie F (spolimeryzowana) i zapobiega jej depolimeryzacji inhibując aktywność ATPazy tego białka. W efekcie w cytoplazmie znacznie zmniejsza się ilość monomerów aktynowych, a stabilizowane są wszystkie formy wyższe od G-aktyny. Wykorzystuje się falloidynę związaną z barwnikami fluorescencyjnymi (najczęściej zielonym lub czerwonym). Produkt ten w ilościach nanomolarnych (nmol/kg) umożliwia wydajne znakowanie, identyfikację i oznaczanie ilościowe F-aktyny w kulturach komórkowych. Ma to znaczenie w badaniu funkcji mikrotubul w różnych fazach cyklu komórkowego. Barwienie Falloidyna - FITC pozwala na ocenę szkieletu aktynowego.

Do jałowych płytek 6-dołkowych wkładano jałowe szkiełka nakrywkowe (10 x 10 mm). Komórki wysiewano na płytki i po 24 godz. poddawano działaniu badanych płynów 6/12/24 godz. Po odpowiednich czasach inkubacji z badanymi płynami, zbierano płyny znad hodowli i po przepłukaniu komórek buforem PBS dodawano standardową pożywkę do hodowli (medium) na 24 godz. Następnie komórki płukano ciepłym buforem PBS i utrwalano zimnym 4% paraformaldehydem rozpuszczonym wcześniej w buforze PBS (1 ml/dołek) przez 10 min w temperaturze pokojowej. Następnie płukano 3-krotnie buforem PBS. W celu permabilizacji komórki poddawano działaniu 0.1% Triton-X100 w buforze PBS przez 10 min (2 ml/dołek) w temperaturze pokojowej. Następnie płukano 2-krotnie buforem PBS. W celu wybarwienia szkieletu aktynowego komórki inkubowano z Falloidyna - FITC przez 60 min w ciemności w temperaturze pokojowej. Następnie komórki płukano 3-krotnie buforem PBS i pozostawiano w temperaturze 4°C do czasu analizy pod mikroskopem konfokalnym.

Regeneracja komórek endotelium po 24 godz. inkubacji w medium po wcześniejszej inkubacji z płynami transplantacyjnymi była widoczna jedynie w płynie według wynalazku zarówno obserwując morfologię pod mikroskopem świetlnym jak i szkielet aktynowy pod mikroskopem fluorescencyjnym co świadczy o tym, że ATA jest aktywatorem pro-przeżyciowym działającym jak insulinowy czynnik wzrostu, a więc także inhibitorem apoptotycznej śmierci komórkowej, umożliwiając przetrwanie uszkodzonemu endotelium i stymulując jego naprawę. (Fig. 12-14).

P r z y k ł a d 10.

Pomiary stężenia ATP i GTP w komórkach śródbłonka

Za pomocą wysokosprawnej chromatografii cieczowej określano poziom komórkowego ATP, ADP, AMP, GTP, GDP, NAD postępując według poniższej procedury. Komórki posiano na płytkach

PL 227 045 B1 dołkowych i po 24 godz. poddawano działaniu badanych płynów 6/12/24 godz. Po ustalonych czasach inkubacji zbierano płyn znad hodowli i umieszczano w probówkach wirowniczych typu eppendorf (a). Hodowlę zalewano 0.4 M HCIO₄ (200 μΐ/dołek). Płytki pokrywano parafilmem i zamrażano w temp. -80°C przez 24 godz. Płyny znad hodowli (a) odwirowywano (2000 obr./min) przez 5 min w temperaturze pokojowej. Osad zalewano 0.4 M HCIO₄ (100 μl/probówkę) i zamrażano w temp. -80°C przez 24 godz. Następnie płytki i probówki rozmrażano na lodzie. Płyn z dołków dodawano do odpowiednich probówek i wirowano (14.000 obr./min) przez 5 min w temperaturze 4°C (b) Na opróżnione dołki nalewano 0.5 M NaOH (300 μl/dołek) i pozostawiano 24 godz. w temperaturze pokojowej do późniejszej analizy ilości białka (c). Żwirowane płyny (b) przenoszono do nowych probówek i zobojętniano 3 M K₃PO₄ przez 10 min, uzyskiwano pH = 5.5 + 6 (temperatura 4°C). Osady z pkt.6 zalewano 0.5 M NaOH (200 μl/probówkę) i pozostawiano min. 24 godz. w temperaturze pokojowej do późniejszej analizy ilości białka. Płyn z pkt. 7 przenoszono do probówek do HPLC (50 μl/probówkę) i poddawano analizie. Pozostały płyn zamrażano w temperaturze -20°C.

T a b e l a 4

Stężenia ATP i GTP wyrażone w nmol/płytka

	ATP	GTP
Kontrola 6 h	0,508	0,0909
Kontrola 12 h	0,752	0,1385
Kontrola 24 h	0,839	0,1508
Znany płyn 6 h	1,983	0,3492
Znany płyn 12 h	0,242	0,0836
Znany płyn 24 h	0,077	0,0000
Płyn Blirt 6 h	1,028	0,4350
Płyn Blirt 12 h	0,379	0,3011
Płyn Blirt 24 h	0,183	0,2540

Uzyskane wyniki wskazują na selektywną protekcję poziomu komórkowego GTP przez składniki płynu według wynalazku. Kwas aurynotrikarboksylowy stabilizuje cytoszkielet poprzez stabilizację poziomu GTP.

Analiza porównawcza parametrów bioprotekcyjności znanego płynu oraz płynu według wynalazku wskazuje na znacznie ograniczone właściwości bioprotekcyjne i relatywnie wysoką cytoto ksyczność elementów składowych znanego płynu. Płyn według wynalazku odznacza się natomiast wysoką bioprotekcyjnością, unikatową stabilizacją cytoszkieletu i topologii błon komórkowych oraz nieoczekiwaną zdolnością do stymulacji procesów regeneracji śródbłonka naczyniowego. Unikatowy skład płynu stanowi kompleksową alternatywę dla płynu znanego ze stanu techniki pod względem cytoprotekcji na poziomie molekularnym i komórkowym.

Płyn wg wynalazku znajduje zastosowanie do przechowywania narządów przeznaczonych do transplantacji lub innych zabiegów chirurgicznych. Płyn może znaleźć także zastosowanie obejmujące podanie płynu w formie infuzji do tętnicy w ilości 0,25-1 l w czasie pobierania narządów takich jak nerki, serce, płuca, wątroba, trzustka, rogówka, tętnice lub żyły do zespoleń naczyniowych do przeszczepów. Po infuzji płyn stanowić będzie środowisko, w którym pobrane narządy transportowane będą do miejsca wszczepienia. Płyn może również znaleźć zastosowanie w czasie innych zabiegów, w czasie których występuje odwracalne niedokrwienie narządowe, np. operacje na otwartym sercu. W czasie takich zabiegów płyn według wynalazku byłby podawany na początku zabiegu. Zastosowanie płynu według wynalazku byłoby połączone z hipotermią ok. 20 + 28°C w czasie zabiegów na otwartym sercu lub 3 + 8°C w czasie transportu narządów do przeszczepów.

Claims

1. Płyn do przechowywania narządów w czasie zabiegów chirurgicznych, zwłaszcza transplantacji, znamienny tym, że zawiera:

- trehalozę w stężeniu od 1 mM do 50 mM,

- inozynę w stężeniu od 0,1 mM do 5 mM,

- kwas α-ketomasłowy lub jego sole w stężeniu od 0,1 mM do 25 mM,

- kwas aurynotrikarboksylowy lub jego sole w stężeniu od 0,01 mM do 1 mM,

- N-metylonikotynamid lub jego sole w stężeniu od 0,1 mM do 5 mM.

2. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera kwas laktobionowy lub jego sole, korzystnie w stężeniu od 50 mM do 200 mM.

3. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera diwodorofosforan potasu, korzystnie w stężeniu od 5 mM do 50 mM.

4. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera siarczan magnezu, korzystnie w stężeniu od 0,1 mM do 30 mM.

5. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że zawiera polihydroksyetylowaną skrobię, korzystnie w stężeniu od 5 g/l do 100 g/l.

6. Płyn według zastrz. 2, znamienny tym, że sole kwasu laktobionowego stanowią sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, zwłaszcza wapnia i magnezu.

7. Płyn według zastrz. 2, znamienny tym, że sole kwasu laktobionowego stanowią sole amonowe.

8. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że sole kwasu α-ketomasłowego stanowią sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, zwłaszcza wapnia i magnezu.

9. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że sole kwasu α-ketomasłowego stanowią sole amonowe.

10. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że sole kwasu aurynotrikarboksylowego stanowią sole metali alkalicznych lub sole metali ziem alkalicznych, zwłaszcza wapnia i magnezu.

11. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że sole kwasu aurynotrikarboksylowego stanowią sole amonowe.

12. Płyn według zastrz. 1, znamienny tym, że sole N-nikotynamidu stanowią chlorowodorek, bromowodorek, octan, szczawian, winian, p-toluenosulfonian, pirogronian.

13. Zastosowanie kwasu aurynotrikarboksylowego lub jego soli do wytwarzania płynu do przechowywania narządów przed lub w czasie zabiegów chirurgicznych, zwłaszcza transplantacji.

14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że kwas stosuje się w stężeniu 0,01 mM do 1 mM.

15. Zastosowanie inozyny do wytwarzania płynu do przechowywania narządów przed lub w czasie transplantacji.