PL227489B1 - Substancja czynna o aktywnościach immunostymulujących oraz przeciwprzerzutowych pochodząca z lizatu bakteriofagowego - Google Patents

Description

Przedmiotem wynalazku jest substancja czynna pochodzenia bakteryjnego (LOS-OH E. coli B) o działaniu immunostymulującym i przeciwprzerzutowym pochodząca z lizatów b akteri ofagowy ch.

Nowotwór, szybka nieuregulowana, patologiczna proliferacja nieprawidłowych komórek, jest drugą po chorobach układu krążenia, najczęstszą przyczyną zgonów ludzi. Szacuje się, że choroby nowotworowe są przyczyną około 20% wszystkich zgonów (z jakiejkolwiek przyczyny) w Polsce (OECD, 2011). Obecnie szacuje się, iż jedna na trzy kobiety i jeden na 2 mężczyzn w Stanach Zjednoczonych zachoruje na raka (Bloom, 2011) Do najczęstszych nowotworów na świecie należą, w kolejności umieralności: u mężczyzn - nowotwory płuc, żołądka, wątroby, okrężnicy i odbytnicy, przełyku, prostaty oraz u kobiet - nowotwory piersi, płuc, żołądka, okrężnicy i odbytnicy oraz szyjki macicy.

Chociaż istnieje wiele rodzajów terapii przeciwnowotworowych, dzięki którym można wpływać na wzrost guza, w wielu przypadkach efekt terapeutyczny nie jest trwały. Za ogromną większość zgonów związanych z chorobami nowotworowymi (nawet do 90%), odpowiedzialne są: oporność na leki i nieusuwalne zmiany przerzutowe. Ponieważ wciąż wiedza na temat mechanizmów złożonego proc esu przerzutowego jest bardzo ograniczona, również ograniczone są możliwości zapobiegania rozwojowi przerzutów. Nawet czas wystąpienia przerzutów jest trudny do przewidzenia, ponieważ może upłynąć długi czas, czasami dekady, zanim przerzuty rozwiną się (Bragado, 2012). Jako przykład może posłużyć rak piersi: u około 30% kobiet z rozpoznaniem wczesnego stadium choroby następuje progresja do przerzutujących raków piersi, dla których opcje terapeutyczne są ograniczone. Kontynuując ten przykład, w pierwszej linii chemioterapii raka piersi są obecnie zalecane schematy terapeutyczne oparte na taksanach i antybiotykach antracyklinowych. Dają one zwykle 30-70% wskaźniki odpowiedzi, jednakże odpowiedź jest często nietrwała, a czas do progresji wynosi od 6 do 10 miesięcy. Pacjenci, u których wystąpi progresja choroby lub oporność na stosowaną chemioterapię, mogą być leczeni innymi lekami chemioterapeutycznymi, ale wskaźniki odpowiedzi w takim przypadku są na ogół niskie (od 20 do 30%); mediana czasu trwania odpowiedzi wynosi poniżej 6 miesięcy (Rivera, 2010).

Obecne strategie leczenia przeciwnowotworowego oparte są głównie na chemio- i radioterapii, które są często nieefektywne i powodują poważne skutki uboczne. Obiecujący przełom związany z terapiami biologicznymi został ograniczony tylko do niektórych rodzajów nowotworów i zastosowania ukierunkowanych specyficznych przeciwciał.

W związku z tym, istnieje znaczna potrzeba opracowania nowych środków i nowych strategii terapeutycznych, omijających typowe mechanizmy oporności na lek. Bezpośredni wpływ na komórki przerzutów jest bardzo trudny. Szansą na ograniczenie możliwości przerzutowania może być modulowanie mechanizmów odpornościowych organizmu gospodarza, które są wykorzystywane przez komórki przerzutujące do rozprzestrzeniania się i wnikania do odległych narządów czy tkanek (Mina, 2011).

Twórcy niniejszego wynalazku wykazali we wcześniejszych badaniach, że preparaty bakteriofagowe mogą działać przeciwnowotworowo i przeciwprzerzutowo u myszy obarczonych mysim rakiem płuc LLC lub czerniakiem B16. W trakcie prowadzonych badań, potwierdzili wiązanie bakteriofaga T4 do eukariotycznych komórek nowotworowych oraz prawidłowych komórek krwi. Efekt przeciwprzerzutowy bakteriofaga T4 obserwowano po podaniu dootrzewnowym zarówno pełnych lizatów jaki i oczyszczonych preparatów bakteriofagowych (Dabrowska, 2004). Ponadto oczyszczone preparaty spowalniały wzrost guzów pierwotnych czerniaka BI6, a efekt był uzależniony od dawki i sposobu podania (Dabrowska, 2005). Badano również wpływ łącznego stosowania preparatów bakteriofaga T4 i cytostatyków na rozwój nowotworów eksperymentalnych. Analizie poddano związki o różnym mechanizmie działania na komórki nowotworowe, takie jak.: cyklofosfamid, cisplatynę oraz 5-fluorouracyl. Zaobserwowano synergizm we współdziałaniu BPT4 i cyklofosfamidu. Nie zaobserwowano natomiast wpływu BPT4 na aktywność przeciwnowotworową i przeciwprzerzutową pozostałych cytostatyków. Zróżnicowany efekt oddziaływania różnych związków o działaniu przeciwnowotworowym wynika prawdopodobnie z różnic w mechanizmie ich działania przeciwnowotworowego. Jest to jednak niewątpliwie ważny cykl doświadczeń pozwalający na stwierdzenie, iż preparaty bakteriofagowe mogą być stosowane u pacjentów chorych na choroby nowotworowe, nie wpływając niekorzystnie na efekt leczenia przeciwnowotworowego (Szczaurska-Nowak, 2009). Zbadano także wpływ preparatów bakteriofagowych na migrację komórek nowotworowych in vitro. Preparaty bakteriofagów T4 i HAP wykazywały aktywność hamującą migrację komórek mysiego czerniaka B16 i ludzkiego czerniaka Hs294T (Dabrowska, 2008).

PL 227 489 B1

Twórcy niniejszego wynalazku od lat prowadzili badania nad identyfikacją substancji czynnej/nych wśród składników mieszanin powstałych w wyniku lizy bakterii E. coli B przez bakteriofaga T4, odpowiedzialnych za obserwowany efekt przeciwnowotworowy (Szczaurska-Nowak, 2008). Badania nad wyjaśnieniem obserwowanych efektów pozwalają przypuszczać, że za aktywność przeciwnowotworową odpowiadać mogą zarówno składniki pochodzenia fagowego jak i bakteryjnego, powstające podczas lizy powodowanej przez bakteriofagi (składniki nieoczyszczonych preparatów bakteriofagowych). Istnieją przesłanki wskazujące na prawdopodobną rolę samych bakteriofagów w wywołaniu obserwowanych efektów przeciwnowotworowych i przeciwprzerzutowych. Wstępne badania nad oddziaływaniem preparatów bakteriofagowych z komórkami eukariotycznymi wskazują na proces wiązania się bakteriofaga z integrynami β3, jako jeden z możliwych mechanizmów aktywności przeciwprzerzutowej bakteriofaga T4 (Dabrowska, 2004). Wykazaliśmy, że kapsydowe białko bakteriofaga T4 (gp24) zawiera w swojej sekwencji motyw KGD, będący homologicznym do motywu RGD i zdolnym do wiązania receptorowych integryn β3. Jest prawdopodobne, iż zdolność bakteriofaga do oddziaływania z komórkami eukariotycznymi może wynikać z jego zdolności do oddziaływania z integryną β3. Wykazano wcześniej, iż bakteriofagi mają zdolność do wiązania się do komórek nowotworowych zdolnych do ekspresji integryny avβ3. Ponadto, zastosowanie czynników blokujących integryny z grupy β3 (przeciwciała anty^3, oraz syntetyczny peptyd zawierający sekwencję KGD, stanowiący ligand dla integryn z tej grupy) powodowało obniżenie zdolności bakteriofagów do wiązania się do komórek nowotworowych (Dabrowska, 2004). Udział receptorów integrynowych w wiązaniu bakteriofagów badano w testach na komórkach krwi izolowanych z krwi pacjenta obarczonego trombastenią Glanzmamfa (mutacja powodująca zablokowanie funkcji integryny allbj© i/lub αvβ3). Wykazano, że zarówno płytki krwi, jak i limfocyty pacjenta z trombastenią nie są zdolne do oddziaływań z cząsteczkami wirusa bakteryjnego na poziomie porównywalnym z komórkami osoby zdrowej. W celu potwierdzenia roli tego mechanizmu w aktywności przeciwprzerzutowej bakteriofagów wykonana została transfekcja komórek czerniaka B16 siRNA (short interfering RNA) dla zablokowania ekspresji receptora β3. Wykazano, że bakteriofag T4 nie wpływa na liczbę przerzutów w płucach myszy obarczonych komórkami czerniaka B16, charakteryzującymi się obniżoną o 55% ekspresją powierzchniową podjednostki integryny β3. Jednocześnie zaobserwowano istotną redukcję liczby przerzutów u myszy obarczonych nietransfekowanymi komórkami B16. Wyselekcjonowany został szczep bakteriofagów pochodzących od T4, zdolny do silniejszego wiązania z komórkami nowotworowymi (nazwany HAP1). Oba szczepy: rodzicielski T4 oraz linia HAP1 istotnie hamowały liczbę eksperymentalnych przerzutów czerniaka B16 (podawanego dożylnie) w płucach myszy. Jednakże preparaty bakteriofaga HAP1 wykazywały silniejsze działanie przeciwnowotworowe niż preparaty T4, zarówno w przypadku guzów jak i przerzutów. W genomie HAP1 została wykryta mutacja nieobecna w genomie T4: w genie hoc faga HAP1 znajduje się mutacja typu non-sens, która uniemożliwia powstanie funkcjonalnego białka Hoc i w kapsydzie HAP1 gpHoc jest nieobecne (Dabrowska i wsp. 2007).

Bakteriofag T4 jest niezwykle rozpowszechniony w środowisku oraz w organizmach żywych. Należy do mikroorganizmów zasiedlających jelita wielu zwierząt oraz człowieka. Najważniejszym gospodarzem tego bakteriofaga jest Escherichia coli, symbiotycznie występująca u większości ssaków, dlatego bakteriofag ten jest tak powszechny. Jego znaczenie odnosi się zarówno do regulacyjnego wpływu, jaki wywiera na florę jelitową u ludzi i zwierząt, jak i do potencjalnej użyteczności w dziedzinie biotechnologii. T4 jest jednym z najlepiej opisanych bakteriofagów. Znana jest pełna sekwencja jego genomu. Dość dobrze udało się również scharakteryzować złożoną strukturę jego kapsydu. Wszystkie te cechy spowodowały, że stał się on modelem do badań mechanizmów infekcyjnych bakteriofagów, dając rozbudowany i szczegółowy opis tego skomplikowanego procesu (figura, 2010).

Skład nieoczyszczonych preparatów bakteriofagowych sugeruje, że za aktywność przeciwnowotworową mogą również odpowiadać składniki pochodzenia bakteryjnego, powstające podczas lizy powodowanej przez bakteriofagi. Składowymi substancji czynnej o działaniu przeciwnowotworowym mogą być amfifilowe glikolipidy bakteryjne takie jak np. zmodyfikowane lipopolisacharydy (LPS, endotoksyna) w przypadku bakterii Gram-ujemnych lub inne elementy budulcowe bakterii (np.: peptydoglikan, lipoproteiny, kwasy lipotejchojowe, bakteryjne poryny, kwasy nukleinowe i ich fragmenty - CpG DNA). Wszystkie te cząsteczki będące produktami rozpadu komórek bakteryjnych, określane są jako wzorce molekularne patogenów (PAMP, pathogen associated molecular patterns) i należą do kluczowych aktywatorów mechanizmów odporności wrodzonej (receptory Toll-podobne, TLR, Toll-likereceptors), jak również odporności nabytej układu odpornościowego (Aderem, 2000).

PL 227 489 B1

Charakterystyczną cechą większości bakterii Gram-ujemnych jest obecność zakotwiczonych w ich zewnętrznej błonie, termostabilnych, amfifilowych makrocząsteczek zwanych ze względu na swoją budowę lipopolisacharydarni (LPS). LPS warunkuje stabilność, prawidłowe funkcjonowanie komórki bakteryjnej, chroni przed obronnymi mechanizmami zainfekowanego makroorganizmu oraz jest ważnym czynnikiem wirulencji bakterii w przypadku posocznicy oraz wstrząsu septycznego. Pojedyncza cząsteczka LPS składa się z trzech odrębnych regionów: lipidu A, oligosacharydu rdzenia oraz łańcucha O-swoistego (antygenu O). Z medycznego punktu widzenia LPS nazywany jest endotoksyną ponieważ jego pojawieniem się w krwi obiegu związane są stany chorobowe takie jak posocznica oraz wstrząs septyczny. Lipid A stanowi region rozpoznawany przez receptory na komórkach układu odpornościowego. Bakterie E. coli B posiadają szorstki typ LPS (R-LPS), nazywany ze względu na brak antygenu O w swojej strukturze - lipooligosacharydem (LOS). Dostępne informacje na temat oddziaływania białek bakteriofagowych z endotoksynami na powierzchni bakterii są wciąż niepełne (Prehm, 1976, Andres, 2010, 2012, 2013).

Nie można wykluczyć, że obserwowany efekt przeciwnowotworowy preparatów bakteriofagowych jest wypadkową oddziaływania kilku substancji pochodzenia bakteryjnego lub ich kompleksów, z cząsteczkami pochodzenia bakteriofagowego, wpływających niezależnie na rozwój nowotworu lub wzajemnie modulujących swoją aktywność. Wstępne badania prowadzono porównując efekty nieoczyszczonych preparatów bakteriofagowych z efektami przeciwnowotworowymi wywoływanymi przez zastosowanie preparatów bakteriofagowych o różnym stopniu czystości, jak również oczyszczonych składników ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych, takich jak, LPS, modyfikowane cząsteczki LPS i MPL E. coli. Obie cząsteczki, LPS oraz MPL, należą do grupy potencjalnych elementów poszukiwanej substancji czynnej. Przeprowadzono wstępne badania w toku których wykazano, że fragmenty LPS posiadające w swej strukturze lipid A potęgują przeciwprzerzutową aktywność zarówno preparatu bakteriofaga T4 jak i LPS. Zaobserwowano także silne działanie przeciwprzerzutowe, gdy LPS stosowano łącznie z polimyksyną B lub surowicą anty-LPS (zarówno surowica, jak i antybiotyk kompleksują LPS). LPS, polimyksyną ani surowica stosowane pojedynczo nie miały wpływu na liczbę powstających przerzutów czerniaka B16 ani na aktywność przeciwprzerzutową bakteriofaga T4.

Lipopolisacharydy oraz lipidy A stosowano w terapii przeciwnowotworowej już od IX w. W roku 1891 lekarz William Coley zaobserwował, że zakażenie bakteryjne przedłuża czas przeżycia pacjentów z mięsakiem kości (sarcoma). Podawał on swoim pacjentom nadsącze z hodowli bakterii Streptococcus pyogenes i Serratia mercescens (tzw. toksyny Coley'a), uzyskując poprawę stanu chorych. W świetle dzisiejszego stanu wiedzy wydaje się, że głównym czynnikiem odpowiedzialnym za lecznicze działanie toksyn Coley'a była indukcja wzmożonego wytwarzania w organizmach pacjentów czynnika martwicy nowotworu (TNF) (McCarthy, 2006), a także niektórych interleukin jak: IL-1, IL-12, IL-15 i IL18.0d czasu badań Cooley'a (1891-1936) próbowano zastosować różne preparaty biologiczne, głównie oparte na modyfikowanych substancjach pochodzenia bakteryjnego, w celu wzmocnienia odpowiedzi immunologicznej organizmu. Mechanizm działania tych preparatów związany był z aktywacją makrofagów, komórek śródbłonka naczyniowego, zwiększeniem nacieków komórkowych w guzie i środowisku okołonowotworowym, indukcją wydzielania cytokin lub pobudzeniem komórek działających nieswoiście cytotoksycznie na komórki nowotworowe.

Pomimo faktu, że lipopolisacharydy (LPSs, endotoksyny) bakteryjne badane są jako potencjalne czynniki przeciwnowotworowe o działaniu immunomodulatorowym od wielu lat, nie powiodła się jednak koncepcja stosowania LPS w leczeniu ludzi obarczonych nowotworem ze względu na jego ogólną toksyczność i słaby efekt przeciwnowotworowy (Goto, 1996). Podstawy toksyczności LPS są dobrze poznane, a za główną przyczynę słabych efektów przeciwnowotworowych uważa się zjawisko tolerancji na LPS, powstające w wyniku wielokrotnego podawania dawek LPS lub lipidu A (Rockwell, 2010). Istnienie tego zjawiska wywołało pewne wątpliwości co do użyteczności LPS/lipidu A oraz ich analogów w terapii nowotworów. W większości prób klinicznych z udziałem pacjentów chorych na nowotwór i z wykorzystaniem LPS, nie udało się utrzymać występującego początkowo efektu przeciwnowotworowego (Rockwell, 2010). Prowadzone badania jednoznacznie potwierdziły, że za obserwowany efekt tolerancji na LPS/lipid A odpowiedzialny jest lipid A LPS. W celu przekształcenia LPS w formę mniej toksyczną od lat projektuje się i syntezuje różne analogi lipidów A (Reisser, 2010). Badania przeprowadzone nad odpowiednio zmodyfikowanymi lipidami A wykazały, że w wyniku modyfikacji traciły one częściowo lub całkowicie toksyczne właściwości, działając jednocześnie jako antagoniści LPS (przykładem może być monofosforylowany lipid A (MPL) (Persing, 2002). MPL otrzymywany jest z lipidu A wyniku usunięcia grupy fosforanowej z pozycji C-l proksymalnej GlcN. Dzięki analizie

PL 227 489 B1 właściwości pochodnej lipidu A - MPL (ang. monofosforyl lipid A) opisanej przez Cluff C. i współpr. 2005, stwierdzono, że możliwe jest oddzielenie korzystnego wpływu tej cząsteczki na układ immunologiczny, od jej toksyczności (Cluff, 2005). Wykazano, że MPL oddziałuje z komórkami poprzez receptor TLR4 (ang. Toll like receptor) (Vasselon T., 2002). LPS i MPL mają podobne właściwości immunostymulujące, jednak ta druga cząsteczka jest co najmniej 100 razy mniej toksyczna (Cluff, 2005).

Udowodniono, że MPL jest bezpiecznym i adjuwantem w szczepionkach, ponieważ posiada zdolność do aktywowania komórek prezentujących antygen (APC) oraz indukowania kaskady cytokin (Baldridge, 1999). Znane są również inne przykłady pochodnych lipidu A, takie jak Tolerin, ONO-4007, DT-5461 i SDZ MRL 953 (Rockwell, 2010). Są to syntetyczne pochodne lipidu A. SDZ MRL 953 i ONO-4007 to triacylowane analogi lipidu A. DT-5461 to tetraacylowany lipid A (Reisser, 2010). Znane są wyniki nielicznych prób klinicznych fazy I z udziałem pacjentów chorych na nowotwór (Bardou, 2010) leczonych MPL lub wymienionymi powyżej analogami lipidów A. MPL oraz inne analogi lipidów

A były bezpieczne i dobrze tolerowane przez pacjentów. Próby z wykorzystaniem MPL z S. minnesota ₂ lub S. typhimurium (dawki i.v. 10250 μg/m powierzchni ciała) nie wykazały efektu przeciwnowotworowego w grupie leczonych pacjentów. Podobne negatywne wyniki uzyskano w próbach klinicznych fazy I z użyciem opisanych wcześniej analogów SDZ MRL 953, ONO-4007, ONO-174. Pomimo dobrej tolerancji pacjentów na te związki oraz obserwowanego zwiększonego stężenia IL-6 i TNFa, nie obserwowano efektu przeciwnowotworowego. Natomiast analogi wykazywały w badaniach klinicznych fazy I pozytywne efekty w zapobieganiu wstrząsowi septycznemu oraz infekcjom bakteryjnym. Zidentyfikowano również kilka dokumentów związanych z zastosowaniem cząsteczek LPS jako preparatów przeciwnowotworowych. Przykładem jest de-O-acylowany lipooligosacharyd głęboko szorstkiego mutanta Salmonella minnesota 1167-R595 (LOS typu Re, lipid A podstawiony dwoma cząsteczkami Kdo) (CAI 171786A1). LOS mutanta Neisseria meningitides LgtB zawierający trój cukrowy rdzeń zewnętrzny połączony z fragmentem lipidu A o zredukowanej toksyczności (de-O-acetylacja, m.in. w wyniku działania hydrazyny) zaproponowano jako adjuwant dla szczepionek, który charakteryzuje zwiększona aktywność immunostymulująca, zwiększone wiązanie do receptora komórek dendrytycznych (W02005107798A1). Dokument CZ290331B1 opisuje disacharyd glukozaminy uzyskany z lipidu A Echerichia coli 011LB4, który poddano O-deacylacji w pozycjach 3 i 3' w wyniku hydrolizy alkalicznej (0.2 M NaOH, 37° C, 1.5 godz.). Disacharyd ten wykazuje niższą endocytotoksyczność, lecz ma zachowaną aktywność biologiczną taką jak aktywność immunomodulująca i przeciwnowotworowa. Należy nadmienić, że LPS E. coli 0:111 jest gładkim LPS złożonym z lipidu A, oligocukru rdzenia i łańcucha O-swoistego. Wykazano, że dLPS jest mniej toksyczny niż monofosforylowany lipid A (MPL) i ma działanie immunostymulujące. De-O-acylowany LOS E. coli J5 zastrzeżono jako szczepionkę przeciwko infekcjom wywoływanym przez Gram-ujemne bakterie (WO 199529662). Dokument EP2664345(A2) opisuje szczepionkę składającą się antygenu pochodzącego od patogenu oraz deacylowanego, nietoksycznego lipooligosacharydu (LOS) szorstkiego szczepu Escherichia coli CIA05 (KCCM 10374). LOS inaktywowano poprzez hydrolizę alkaliczną (2 N NaOH, 140 min., 60°C). Pochodna LOS pełniła w opisanej technologii funkcję adjuwantu, który wywołuje dojrzewanie komórek dendrytycznych. Dokument US20120100169(A1) opisuje szczepionkę przeciwko rakowi szyjki macicy, która zawiera antygeny wirusopodobne L1 (VLP) ludzkiego wirusa HPV (papillomavirus) oraz deacylowany, nietoksyczny LOS Escherichia coli, preferencyjnie szczepu KCCM 10374, stosowany jako adjuwant. LOS deacylowano w wyniku hydrolizy alkalicznej (0.2 N NaOH, 140 min., 60°C). Szczepionka ta wywołuje odpowiedź immunologiczną typu TH1 i Th2 przeciwko HPV. Przykłady wykorzystujących de-O-acylowane LOS jako adjuwanty w szczepionkach przeciwbakteryjnych lub przeciwwirusowych opisano także w dokumentach US4929604A, EP306496B1, US8506971 B2, US6531131 B1. Użycie O-deacylowanych pochodnych LPS jako antygenów szczepionkowych opisano w WO 1993013797 A2 (koniugaty zdetoksyfikowanego LPS Vibrio cholerae z białkami, takim jak toksyna cholery), EP2481419A2 (szczepionka przeciwko Neisseria), US20120164145A1 (szczepionka przeciwko Helicobacter pylon) i inne. Kwasy tłuszczowe w pochodnych LOS, LPS i lipidach A usuwane są zazwyczaj przy użyciu NaOH, hydrazyny lub enzymatycznie z wykorzystaniem hydrolazy acyloksyacylowej. Podsumowując, O-deacylowane LOS stosowano jako składniki antygenu glikokoniugatowego lub adiuwanty w szczepionkach przeciwbakteryjnych i w preparatach przeciwnowotworowych.

Przedmiot wynalazku został określony w załączonych zastrzeżeniach.

Spis figur:

Fig. 1. Struktury LOS (A) i LOS-OH (B) E. coli B. * Cząsteczka LOS-OH pozbawiona jest fofsoetanolaminy (PEtn).

PL 227 489 B1

Fig. 2. Średnia liczba doświadczalnych przerzutów czerniaka B16 w płucach myszy traktowanych preparatami powstałymi po lizie komórek bakterii E .coli B obserwowana 21-go dnia eksperymentu. *p = 0,035765 w stosunku do kontroli, test U Manna-Withneya.

Fig. 3. Widma MALDI-TOF frakcji FB użytej w badaniach in vivo, wykazującej aktywność przeciwprzerzutową (A), syntetycznego LOS-OH (B) i LOS (C) E. coli B.

Fig. 4. Widmo ESI-MS de-O-acylowanej pochodnej - LOS-OH A. coli B.

Fig. 5. Liczba doświadczalnych przerzutów czerniaka B16 w płucach myszy C57BL/6 traktowanych LOS lub LOS-OHsynt E. coli B. Analizę wykonywano w płucach pobranych w 14. i 21. dniu doświadczenia. Wykres przedstawia średnią liczbę przerzutów w płucach, pobranych od 5 myszy z każdej grupy (14. i 21. Dzień doświadczenia). *p<0,05 w porównaniu do kontroli, Test U Manna-Whitneya.

Fig. 6 Liczba doświadczalnych przerzutów czerniaka B16 w płucach myszy C57BL/6 traktowanych LOS lub LOS-OH E. coli B oceniano w 21. dniu doświadczenia. Na godzinę przed dożylnym ₅ podaniem komórek nowotworowych B16 (2 x 10⁵ kom./mysz), myszom podawano dootrzewnowo preparaty LOS i LOS-OH E. coli B, w dawkach 250 i 2500 μg/kg masy ciała. Podanie preparatów powtarzano 4-krotnie - godzinę przed wszczepieniem komórek oraz w 1., 7. i 14. dniu doświadczenia. Wykres przedstawia średnią liczbę przerzutów w płucach pobranych od 9-10 myszy dla poszczególnych grup w 21 dniu doświadczenia. *p<0.05 w porównaniu do kontroli, **p<0.05 w porównaniu do LOS E. coli B 2500 μg/kg, ***p<0.05 w porównaniu do LOS E. coli B 250 μg/kg.

Fig. 7. Wpływ preparatów LOS i LOS-OH E. coli B na zdolność komórek J774A.1 do produkcji IL-6 i TNF-α. Komórki o gęstości 1 x 10⁶/ml stymulowano LOS oraz LOS-OH A. coli B w stężeniu 10, 1 i 0,1 μg/ml przez 4 (dla TNF-α) lub 24 (dla IL-6) godz. Kontrolę (K) stanowiły komórki niestymulowane. Po tym czasie zbierano nadsącza hodowlane, w których oznaczano stężenie cytokin za pomocą testu ELISA.

Fig. 8. Wpływ preparatów LOS i LOS-OH E. coli B na stymulację komórek BM-DC do produkcji cytokin. Komórki o gęstości lxl0⁶/ml inkubowano w obecności LOS i LOS-OH A. coli B w stężeniach 10 i 1 μg/ml przez 24 godz. Kontrolę stanowiły komórki niestymulowane. Nadsącza zbierano znad hodowli i oceniano stężenie IL-6, IL-10 i IL-12 za pomocą testu ELISA.

Fig. 9. A, B - Ocena aktywności biologicznej ex vivo preparatu LOS-OH E. coli B w porównaniu do LOS na splenocyty uzyskane od myszy zdrowych. Komórki (2 mln/ml) stymulowano przez 24 i 48 godzin LOS i LOS-OH E. coli B w stężeniu 1 μg/ml. W zbieranych nadsączach oceniano poziom produkcji IL-6 i IFN-γ za pomocą testu ELISA. Jako kontroli użyto komórek niestymulowanych. C - Ocena odsetka komórek IL-10+ wśród limfocytów CD19+ po stymulacji LOS i LOS-OH A. coli B. Komórki śledzionowe pobrane od zdrowych myszy inkubowano z badanymi preparatami przez 24 i 48 godzin. Na ostatnie 6 godzin stymulacji dodawano brefeldynę A (10 γg/ml) i monenzynę (2 μΜ/ml). Kontrolę stanowiły komórki niestymulowane LOS i LOS-OH E. coli B. Komórki barwiono przeciwciałami anty-CD19 znakowanymi APC, permeabilizowano i inkubowano z przeciwciałami anty-IL-10 skoniugowanymi z PerCP-Cy5.5.

Fig. 10. Odsetek limfocytów T CD4+ (A), CD8+ (B), komórek CD49b+ (komórek NK) (C), komórek CD19+ (limfocytów B) (D) wśród splenocytów pobranych od myszy obarczonych czerniakiem B16 i traktowanych LOS lub LOS-OH E. coli B. Komórki śledzionowe pobrano w 21. dniu doświadczenia (przykład 6). Splenocyty znakowano przeciwciałami anty-CD4 skoniugowanymi z APC (allofikocyjanina), anty-CD8 skoniugowanymi z PE-Cy7 (tandem fluorochromów fikoerytryny i cyjaniny 7), antyCD49b skoniugowanych z PE (fikoerytryna) anty-CD19 skoniugowanymi z FITC (izotiocyjanian fluoresceiny). Kontrolę stanowiły komórki śledzionowe pobrane od myszy nietraktowanych, obarczonych nowotworem. Wykresy przedstawiają średnie wartości uzyskane w wyniku analizy komórek pochodzących od 3 myszy w każdej grupie.

Fig. 11. Poziom produkcji IL-6 (A), IFN-γ (B), IL-10 (C) w nadsączach znad 48 godzinnej hodowli splenocytów stymulowanych ConA. Komórki śledzionowe pobrane 21. dnia doświadczenia hodowano w gęstości 2xl0⁶/ml i w obecności ConA (0,5 μg/ml). Do oceny stężenia tej cytokiny wykorzystano immunoenzymatyczny test ELISA. Wykres przedstawia średnie wartości uzyskane od 3 myszy z każdej grupy.

Fig. 12. Poziom produkcji IL-6 (A), IFN-γ (B), IL-10 (C) W nadsączach znad 48 godzinnej hodowli splenocytów stymulowanych LOS E. coli B. Komórki śledzionowe pobrane 21. dnia doświadczenia hodowano w gęstości 2 x 10⁶/ml i w obecności LOS E. coli B (1 μg/ml). Do oceny stężenia tej cytokiny wykorzystano immunoenzymatyczny test ELISA. Wykres przedstawia średnie wartości uzyskane od 3 myszy z każdej grupy.

PL 227 489 B1

SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU

Niniejszy wynalazek dotyczy substancji czynnej pochodzenia bakteryjnego wykazującej aktywności immunostymulujące i przeciwprzerzutowe, jej identyfikacji, izolacji, analizy strukturalnej i sposobu otrzymywania. Wskazana substancja czynna została wyizolowana z preparatu bakteriofagowego (lizatu bakteriofagowego), stanowiącego mieszaninę produktów rozpadu bakteriofaga T4, bakterii

Gram-ujemnej - Escherichia coli B oraz podłoża hodowlanego. Zidentyfikowana substancja czynna to de-O-acylowany lipooligosacharyd (LOS-OH) E. coli B o strukturze przedstawionej na Fig. 1. LOS-OH E. coli B zbudowany jest z oligocukru rdzenia, posiadającego nową strukturę, połączonego wiązaniem kowalencyjnym z dwucukrem >6)-p-D-Glcp;N4P-(16)-a-D-GlcpN1P lipidu A, który podstawiony jest w pozycji N2 i N2' kwasami R-3-hydroksytetradekanowym [14:0(3-OH)].

Nowa substancja czynna, tj. LOS-OH E. coli B, będąca przedmiotem niniejszego wynalazku, została zidentyfikowana w fazie organicznej (faza butanolowa, FB) otrzymanej podczas ekstrakcji lizatu bakteriofagowego (przykłady 1,2, 3). Zidentyfikowanie pochodnej LOS-OHis. E. coli B w lizacie bakteriofagowym wskazuje na aktywny udział w tej modyfikacji czynnika obecnego na jednym z etapów cyklu litycznego bakteriofaga. Dodatkowo charakter modyfikacji LOS E. coli B wskazuje na czynnik o aktywności de-O-acylazy, bowiem struktura LOS-OH różni się od natywnego LOS brakiem wszystkich pierwszorzędowych, estrowo związanych kwasów tłuszczowych (fig. 1). Substancję czynną wyizolowano bezpośrednio z lizatu bakteriofagowego (przykłady 1 i 3), którego istotną wadą są zanieczyszczenia w postaci kompletnych cząsteczek LOS, które są pirogenami. Po przeprowadzeniu analizy strukturalnej LOS i LOS-OH okazało się, że w formie czystej LOS-OH można uzyskać w wyniku hydrazynolizy LOS E. coli B (przykład 4). Zarówno frakcja lizatu FB zawierająca LOS-OH, jak i syntetyczny LOS-OH, uzyskany z oczyszczonych preparatów LOS E. coli B, wykazywały właściwości przeciwprzerzutowe w eksperymentach in vitro, ex vivo oraz in vivo (przykłady 2 i 5-8). Obie cząsteczki posiadają unikatową strukturę dotychczas nie zidentyfikowaną w naturalnych preparatach bakterii Gram-ujemnych, która różni się od postulowanej we wcześniejszych badaniach struktury o jedną resztę glukozy (Prehem, 1976) (przykłady 3 i 4).

Aktywności biologiczne izolowanego z lizatu LOS-OH oraz syntetycznego LOS-OH określano za pomocą rutynowych testów in vitro i ex vivo przeznaczonych do wykrywania właściwości przeciwprzerzutowych oraz zdolności do stymulacji komórek układu odpornościowego zaangażowanych w procesy nowotworzenia. Zgodnie z opisem zawartym poniżej w sekcji doświadczalnej, aktywność przeciwprzerzutową i przedwproliferacyjną LOS-OH w warunkach in vivo badano stosując model mysi ludzkiego czerniaka B16 oraz porównywano, w przypadku niektórych doświadczeń, do chemicznych czynników przeciwnowotworowych, takich jak cisplatyna. Frakcja butanolowa (FB) lizatu bakteriofaga T4 zawierająca m. in. zidentyfikowany LOS-OH E. coli B wykazywała w doświadczeniu in vivo efekt przedwprzerzutowy. W płucach pobranych od myszy obarczonych czerniakiem B16 po podaniu wybranych frakcji lizatu bakteriofagowego wykazała istotne statystycznie (p=0,035765) obniżenie liczby przerzutów w grupie myszy, które otrzymały FB w dawce 100EU. Zidentyfikowana w fazie FB po ekstrakcji lizatu bakteriofaga T4 substancja czynna okazała się być de-O-acylowaną, w pozycjach 03 i 03', pochodną LOS E. coli B (fig. 1), w przypadku której możliwe było otrzymanie formy syntetycznej, bezpośrednio z oczyszczonego LOS E. coli B (bez ingerencji bakteriofaga T4). Zarówno frakcja lizatu FB zawierająca LOS-OH, jak i syntetyczny LOS-OH, uzyskany z oczyszczonych preparatów LOS E. coli B, wykazywały właściwości przeciwprzerzutowe w eksperymentach in vitro, ex vivo oraz in vivo (przykłady 2 i 5-8). Obie cząsteczki posiadają unikatowa strukturę dotychczas nie zidentyfikowaną w naturalnych preparatach bakterii Gram-ujemnych, która różni się od postulowanej we wcześniejszych badaniach struktury o jedną resztę glukozy (Prehm, 1976) (przykłady 3 i 4). Otrzymana pochodna, LOS-OH E. coli B (LOS-OHsynt), została wykorzystana w badaniach in vitro, ex vivo (przykłady 8, 9) oraz in vivo (przykłady 5, 6, 7). Uzyskane wyniki wskazują na wpływ preparatu LOS-OH_synt na zmniejszenie potencjału przerzutowego komórek nowotworowych.

Przeprowadzone doświadczenia in vivo na modelu mysim wykazały, że zastosowanie zarówno LOS-OH, jak i LOS E. coli B jako terapeutyków o działaniu przeciwprzerzutowym powoduje zahamowanie przyrostu liczby przerzutów w płucach myszy obarczonych czerniakiem BI6. Toksyczność cząsteczek LOS, wyklucza je jako potencjalne terapeutyki w działaniu przeciwprzerzutowym. Natomiast użycie zmodyfikowanej pochodnej LOS tj. LOS-OH E. coli B wydają się doskonałym terapeutykiem w prowadzonych badaniach. Współczynnik przyrostu liczby przerzutów dla 21. dnia doświadczenia podano w tabeli 1. Współczynnik przyrostu liczby przerzutów dla 21. dnia doświadczenia obliczono na podstawie poniższego wzoru:

PL 227 489 B1

Lp21.dnia - dnia - liczba przerzutów w danej grupie w 21. dniu doświadczenia,

Lp14. dnia - liczba przerzutów w danej grupie w 14. dniu doświadczenia.

T a b e l a 1. Współczynnik przyrostu liczby przerzutów w płucach myszy obarczonych czerniakiem B16 i traktowanych LOS lub LOS-OH E. coli B. Obliczone w oparciu od dane z przykładu 5.

Preparaty	Współczynnik przyrostu liczby przerzutów
kontrola	2,74
LOS 25 pg/kg	1,73
LOS 250 pg/kg	1,63 7,,.70:-.:7,:77:---77 '-7-7-:-· 777.:7 - : : - . . 7:77 : 7 -7-7-7:- 7-7 ’77':77-’-7 7'
LOS-OH 25 pg/kg	2,40
LOS-OH 250 pg/kg	1.33

Podsumowanie średnich wyników uzyskanych po analizie wpływu podania preparatów na aktywację immunokompetentnych komórek u myszy obarczonych czerniakiem B16 pobranych 21. dnia doświadczenia zebrano w tabeli 2. Przedstawiono różnice w odsetku populacji CD4⁺, CD8⁺, CD49b⁺ oraz CD19⁺ wśród splenocytów. Porównano także profil produkowanych cytokin przez komórki śledzionowe po stymulacji konkanawaliną A oraz LOS E. coli B.

T a b e l a 2. Porównanie aktywności komórek immunokompetentnych pochodzących od myszy obarczonych czerniakiem B16 i traktowanych LOS lub LOS-OH E. coli B, pobranych 21. dnia doświadczenia.

Odsetek komórek śledzionowych	Produkcja cvtokin po stymulacji mitogenanii
	CD4+ [%|	CD8+ [%|	CD49b+ [%]	CD 19+ [%l	IL-6 [ng/ml] LOS ConA	IFN-y [ng/ml] LOS ConA	IL-10 [ng/ml] LOS ConA
zdrowa	17,71	13,20	5,32	61.42	0,10	||	2,47	0,02	0,33	3,86
kontrola	14,36	10,55	4,60	67,28	0,12	0.33	2,84	0,12	0.24	2,+5
LOS 25 pg/kg	14,4+	11.58	4,36	66.51 :: 3 ? $	0,04	0,25 B 7'3'	1,68	0.03	0-20	1 ' 1,52
LOS 250 pg/kg	15,44	12,27	4,22	65.50	0,21	0,29	7.02	0,18	0,50	2,61
LOS-OH 25 pg/kg	13.38 i'.,,! m.’ r ‘>T rf t·,; .··- .	9,97	3,91	69,67 .	0,20	0,46	i 7 :/7 : :-	0,12 7 L:-:·... ·..·	0,73	3,19
LOS-OH 250 pg/kg	15,74	12,55	5,17	62,76	0,25	0,25	7,67	0,29	0,6+	2,15

Obecność rozwijającego się w organizmie nowotworu powoduje zmiany w wielkości poszczególnych populacji komórek śledzionowych oraz w profilu produkowanych przez te komórki cytokin. Wśród splenocytów pobranych od myszy obarczonych czerniakiem B16 wykazano obniżenie odsetka limfocytów T CD4⁺, CD8⁺ i komórek NK (CD49b⁺) oraz wzrost odsetka limfocytów B (CD19⁺) w stosunku do

PL 227 489 B1 myszy zdrowych. Analizując profil produkowanych cytokin przez komórki otrzymane od myszy zdrowych i kontrolnych, można stwierdzić niewielki wzrost produkcji IL-6 i IFN-γ oraz obniżenie produkcji IL-10 zarówno po stymulacji ConA, jak i LOS E. coli B przez komórki śledzionowe pobrane od myszy obarczonych czerniakiem.

Czterokrotne podanie preparatów LOS i LOS-OH E. coli B w dawce 250 μg/kg masy ciała hamowało rozwijanie się kolonii komórek nowotworowych w płucach myszy obarczonych czerniakiem B16. Najniższy współczynnik przyrostu liczby przerzutów w tych grupach koreluje ze wzrostem odsetka limfocytów T CD4⁺ i CD8⁺ oraz obniżeniem odsetka komórek CD19⁺ (limfocytów B), a także wyższą produkcją IL-6, IL-10 po stymulacji LOS i IFN-γ po stymulacji ConA i LOS E. coli B w porównaniu do myszy którym nie podawano preparatów. Efekt działania LOS-OH w porównaniu do LOS E. coli B (w dawkach 250 μg/kg) jest nieznacznie silniejszy. Dodatkowo w grupie myszy traktowanych LOS-OH E. coli B w dawce 250 μg/ml wykazano wzrost odsetka komórek NK.

Przedstawione wyniki pokazują, że LOS-OH E. coli B wykazuje aktywności immunostymulatorowe i przeciwprzerzutowe, co czyni go kandydatem do zastosowania jako lek przeciwprzerzutowy lub adjuwant w szczepionkach przeciwnowotworowych.

P r z y k ł a d y

P r z y k ł a d 1. Identyfikacja frakcji lizatu bakteriofaga T4 o działaniu przeciwprzerzutowym (LOS-OH E. coli B)

Hodowle szczepu E. coli B, który został zdeponowany zgodnie z traktatem budapesztańskim pod numerem dostępu B/00085 dnia 23 lutego 2015 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej PAN we Wrocławiu, prowadzono w fermentorze w obj. 9.5 L (BioFlo 415) na płynnym podłożu LB, wzbogaconym w glukozę, wyciąg drożdżowy oraz hydrolizat kazeiny. Zastosowano następujące parametry fermentacji: hodowla 24-godz., 37°C, mieszanie 200, napowietrzanie 5, pH ~ 7.0. Po 24 h do hodowli dodano faga (miano 6.x 109 - 2.2 x1011 pfu - plaque forming unit). Do wyizolowania substancji czynnej z lizatu bakteriofagowego o działaniu przeciwprzerzutowym wykorzystano elementy technologii opisanej w krajowym zgłoszeniu patentowym P 382800) (Boratyński, zgłoszenie patentowe, 2007) oraz międzynarodowym zgłoszeniu patentowym PCT PL 2008000045 (Boratyński, PCT 2008000045). Zastosowano ekstrakcję dwufazową lizatu bakteriofagowego (nazywanego frakcją wodną, FW) z użyciem butanolu jako substancji organicznej (nazwanej fazą butanolową, FB), do której wyekstrahowane zostały hydrofobowe cząsteczki, takie jak LOS E. coli B oraz jego pochodne. Do ekstrakcji użyto 400 ml lizatu bakteriofagowego oraz 300 ml butanolu (stosunek 4:3). Po przeprowadzonej ekstrakcji obie fazy rozdzielono. Fazę FW liofilizowano natomiast FB wysuszono na wyparce, a następnie zliofilizowano. We wszystkich otrzymanych frakcjach sprawdzono poziom endotoksyn (tabela 3) za pomocą komercyjnie dostępnego testu LAL, zgodnie z instrukcją producenta (Pierce LAL Chromogenie Endotoxin Quantitition Kit, Thermo Scientific, USA). Aktywność przeciwprzerzutową preparatów otrzymanych po ekstrakcji sprawdzono w badaniach in vivo wykorzystując model przerzutowania mysiego czerniaka B16, a wszystkie doświadczenia przeprowadzono na myszach szczepu C57B1/6 (przykład 2). Frakcje wykazujące najwyższe aktywności przeciwprzerzutowe i antproliferacyjne poddawano analizie składu przy pomocy spektrometrii mas MALDI-TOF (przykład 3). W oparciu o wyniki analiz MALDI-TOF MS, LOS-OH E. coli B zidentyfikowano w fazie FB (fig. 3A) Widmo masowe LOS-OH izolowanego z lizatu bakteriofagowego (fig. 3A), a jego interpretacje opisano w przykładzie 3.

P r z y k ł a d 2: Ocena aktywności przeciwprzerzutowej we frakcjach wodnych i butanolowych lizatu bakteriofagowego.

Badania przeprowadzono wykorzystując model przerzutowania mysiego czerniaka B16. Wszystkie doświadczenia przeprowadzono na myszach szczepu C57B1/6 (5-6 myszy/grupę). Frakcje lizatów bakteriofagowych (wg. Tabeli 1) podano zwierzętom jednokrotnie, dootrzewnowo (i.p.) na godzinę przed dożylnym (i.v.) wszczepieniem komórek nowotworowych czerniaka B16, cisplatynę w dawce 10 mg/kg masy ciała podano 4 dnia po wszczepieniu komórek nowotworowych. Test LAL wykorzystano do ustalenia poziomu endotoksyn obecnych w badanych frakcjach. Poziom endotoksyn, jaki podano zwierzętom wynosił 2.5 lub 100 EU/mysz. W grupie kontrolnej zamiast preparatów bakteriofagowych lub cisplatyny zastosowano PBS. W 21 dniu eksperymentu myszy uśmiercono, płuca pobrane od zwierząt zważono, po czym utrwalono w 4% zbuforowanym roztworze formaliny, następnie policzono widoczne ogniska przerzutowe. Wyniki doświadczenia w postaci średniej liczby przerzutów czerniaka B16 w płucach badanych myszy przedstawiono na fig. 2. Przeprowadzona ocena liczby przerzutów w płucach pobranych od myszy obarczonych czerniakiem B16 po podaniu wybranych frakcji lizatu

PL 227 489 B1 bakteriofagowego wykazała istotne statystycznie (p=0,035765) obniżenie liczby przerzutów w grupie myszy, które otrzymały FB w dawce 100EU. Mniejsza zawartość LOS w FB, jak również w FW wykazywały jedynie tendencję do obniżania liczby przerzutów.

T a b e l a 3. Poziom endotoksyn obecnych w badanych preparatach określony za pomocą testu LAL. Obecność LOS i LOS-OH A. coli B potwierdzona przy pomocy spektrometrii mas (fig. 3) oraz immunoblotingu z wykorzystaniem surowicy anty-OSJ5.

Faza	Miano w teście LAL	Obecność LOS i LOS-OH dotblot/widnio masowe
FW	135 EU/ml	NIE
FB	3.4xl()7 EU/ml	TAK

P r z y k ł a d 3. Identyfikacja substancji czynnej (LOS-OH) we frakcjach lizatu bakteriofaga T4.

W celu identyfikacji LOS oraz pochodnych LOS we frakcjach FW i FB, które wpływały na obniżenie liczby przerzutów wykorzystano dotBloting oraz spektrometrię mas MALDI-TOF. Podczas analizy dotblot, wykorzystano królicze poliklonalne surowice, otrzymane w wyniku immunizacji królików koniugatem oligocukru rdzenia LOS E. coli J5 (OSJ5) z toksoidem tężcowym (anty-OSJ5-TT) (Lukasiewicz, 2002). Zawarte w surowicy przeciwciała pozwalają na detekcję oligocukru rdzenia typu J5 i jak się okazało reagują krzyżowo z podobną strukturą charakterystyczną dla LOS E. coli B. W związku z tym zastosowano je do identyfikacji fragmentów oraz kompletnych cząsteczek LOS E. coli B w poszczególnych frakcjach lizatu bakteriofaga T4. Wyniki immunoblotingu pokazały, że podczas ekstrakcji lizatu bakteriofagowego pełne oraz zmodyfikowane cząsteczki LOS E. coli B ekstrahowane są do fazy FB, co korelowało z przeprowadzoną równocześnie analizą poszczególnych frakcji za pomocą komercyjnego testu LAL (tabela 3).

Obecność cząsteczek LOS i LOS-OH E. coli B sprawdzano w wytypowanej frakcji FB za pomocą spektrometrii mas MALDI-TOF. Użyto matrycy 2,4,6- trójhydroksyacetofenonu (THAP) w stężeniu 200 mg/ml, rozpuszczonej w metanolu i zmieszanej z roztworem nitrocelulozy (30 mg/ml w mieszaninie aceton/propanol 1:1). Przygotowaną matrycę zmieszano z roztworem nitrocelulozy w proporcji 4:1. Próbkę fazy FB (1 mg/ml), LOS i LOS-OH E. coli B rozpuszczono w 50% metanolu z 5 mM EDTA, a następnie odsolono przy użyciu żywicy jonowymiennej DOWEX 50WX8 przekształconej do formy amonowej. Następnie próbki zmieszano z matrycą (1:1), a do mieszaniny dodano 100 mM zasadowego cytrynianiu amonu (1:1). Widma analizowano w trybie negatywnym wykorzystując aparat AutoflexIII (Bruker, Germany). Figura 3 przedstawia widmo MALDI frakcji FB, która w badaniach in vivo wykazała właściwości przeciwprzerzutowe oraz widmo syntetycznego LOS-OHSYNT oraz LOS E. coli B. Na widmie masowym frakcji FB (fig. 3A) obserwowano jony o m/z 2211.31 Da [M_los-_oh-H]^-, m/z 2233.71 Da [M_LOS-_OH-H+Na]^- odpowiadające cząsteczce LOS-OH (LOS E. coli B pozbawionemu czterech reszt pierwszorzędowych i drugorzędowych estrowo związanych kwasów tłuszczowych oraz fosfoetanolaminy). Na widmie obserwowano również charakterystyczne jony o m/z 1716.95 oraz 1976.07 Da, które pochodzą od cząsteczki lipidu A wskazując na obecność w badanej frakcji natywnych cząsteczek LOS. Jony o m/z 1213.57, m/z 953, 13, m/z 923,71 odpowiadają fragmentom cukrowym cząsteczek LOS oraz LOS-OH.

P r z y k ł a d 4. Otrzymywanie syntetycznej formy LOS-OH E. coli B

Zidentyfikowana w fazie FB po ekstrakcji lizatu bakteriofaga T4 substancja czynna okazała się być de-O-acylowaną, w pozycjach 03 i 03', pochodną LOS E. coli B, w przypadku której możliwe było otrzymanie formy syntetycznej, bezpośrednio z oczyszczonego LOS E. coli B (bez ingerencji bakteriofaga T4). Hodowlę E. coli B prowadzono zgodnie z opisem w przykładzie 1, a uzyskaną masę bakteryjną po odwirowaniu, przemyciu i liofilizacji poddano ekstrakcji zgodnie z metodą opisaną dla szorstkich LOS (Galanos, 1969), w celu otrzymania LOS E. coli B wykorzystywanego jako kontrola w in vitro i in vivo. W skrócie, zabite i zliofilizowane bakterie E. coli B (20 g) zawieszano w 100 ml mieszaniny fenol/chloroform/eter naftowy (t.w. 40-60°C) (2/5/8, v/v/v), a następnie rozbijano przez 3 minuty za pomocą sondy ultradźwiękowej do uzyskania homogennej mieszaniny. Następnie mieszaninę rozdzielano przez wirowanie (15 min. przy 3500 x g/4°C). Zbierano supernatant, a do osadu dodano 80 ml mieszaniny fenol/chloroform/eter naftowy (t.w. 40-60°C) i homogenizowano za pomocą sondy ultradźwiękowej (3 minuty). Ponownie mieszaninę rozdzielono przez wirowanie (15 min. przy 3500 x g/4°C). SupernatanPL 227 489 B1 ty po wirowaniach połączono i wysuszono. Wysuszony supernatant ogrzano do temperatury pokojowej i dodano kroplami wodę mQ. Obserwowano wytrącanie się LOS.

Pozostawiono mieszaninę na 10 minut do całkowitego wytrącenia LOS. Mieszaninę wirowano (15 min./3500 x g/4°C). Zlano supernatant do którego ponownie dodano kroplami wodę mQ dla sprawdzenia czy wytrącony został cały LOS. Probówkę z osadem odwrócono dnem do góry w celu całkowitego wysuszenia. Do osadu dodano 10 ml 80% fenolu, zamieszano i wirowano (15 min. przy 3500 x g/4°C). Supernatant odlano i ponownie dodano do osadu 10 ml 80% fenolu i wirowano (15 min. 3500 x g/4°C). Następnie po wysuszeniu do osadu dodano 10 ml eteru dietylowego, rozbito mieszaninę za pomocą sondy ultradźwiękowej, wirowano (15 min./3500 x g/4°C). Przemywanie eterem dietylowym powtórzono dwukrotnie. Do osadu dodano wodę mQ i zliofilizowano. Uzyskany surowy preparat LOS oczyszczano od białek i kwasów nukleinowych poprzez ultrawirowanie (105 000 x g, 4 godziny/4°C). Supernatant po ultrawirowaniu zlano, pozostawiając osad zawierający zagregowany LOS. Oczyszczony LOS zawieszano w wodzie i liofilizowano. Wydajność ekstrakcji LOS względem suchej masy bakteryjnej wynosiła ok. 2%. Po przeprowadzonych ekstrakcjach LOS E. coli B był sprawdzany za pomocą spektrometrii MALDI-TOF w celu potwierdzenia poprawności struktury. Struktura wyizolowanego LOS E. coli B została przedstawiona na figurze 1. Unikatowa struktura LOS E. coli B zidentyfikowana została za pomocą spektroskopii NMR oraz spektrometrii mas MALDI-TOF. Przedstawiona struktura LOS E. coli B różni się od opublikowanej wcześniej przez Prehma i wsp. (Prehm, 1976), a różnica wynika z braku jednej reszty glukozy w oligocukrze rdzenia, co jest zgodna z wynikami otrzymanymi prze użyciu spektrometrii mas oraz NMR (tabela 4).

T a b e l a 4. Wartości przesunięć chemicznych dla atomów ¹H oraz ¹³C składników oligosacharydu rdzenia LOS E. coli B.

Reszta	Hl/Cl	H2/C2	H3 (H3a„H3e,)/C3	H4/C4 H5/C5 H6,6'/C6 H7,7’/C7	hs, sycą
ppm
->5-a-Kdo	nd	95.5	1.84, 2.19 33.4	4.07 65.5	4.10 73.1	3.77 71.7	3.63 69.0	3.46, 3.83 53.8
->3-L-a-D-Hepp	5.11 99.8	3.96 70.9	4.04 77.3	4.551 71.6	4.14 71.3	4.04 68.6	3.65 62.9
>3,7-L-a-u-Hep	5.06 102.7	4.31 69.4	3.96 73.6	3.95 65.4	3.59 72.7	4.11 68.1	3.54, 3.70 69.4
L-a-D-Hepp	4.89 100.0	3.88 70.0	3.79 70.5	3.79 66.1	3.53 71.3	3.97 68.7	3.59 63.1
a-D-GIcp	5.21 100.3	3.48 71.9	3.73 73.0	3.34 69.7	3.80 72.2	3.68,3.88 60.4
Gly	168.0	3.93 40.2
PEtn	3.23 40.0	4.14 62.4

Oligocukier rdzenia LOS E. coli B, zbudowany z dwóch cząsteczek α-Kdo, trzech L.D-Hepp, α-D-Glcp oraz pirofosfoetanolaminy (PPEtn), podstawia kowalencyjnie lipid A zbudowany z disacharydu 3-D-GlcpN4P-(1 ^6)-a-D-GlcpN1P podstawionego pierwszorzędowymi: amidowo związanymi resztami kwasów 14:0(3-OH) i estrowo związanymi resztami dwóch kwasów 14:0(3-OH) oraz drugorzędowymi resztami kwasów: 12:0 oraz 14:0. Widmo masowe pełnej cząsteczki LOS E. coli B otrzymano w sposób opisany w przykładzie 3. Widmo LOS E. coli B posiadało charakterystyczny jon o m/z 1796.17 Da, który odpowiada masie utworzonego podczas analizy masowej (źródło jonów) fragmentu lipidu A zbudowanego z sześciu reszt kwasów tłuszczowych, dwóch reszt glukozamin oraz dwóch grup fosforanowych (fig. 1 dla LOS). Jon o m/z 3178.87 Da odpowiada masie kompletnej cząsteczki LOS a jon o m/z 3055.02 Da cząsteczce LOS pozbawionej reszty fosfoetanolaminy (PEtn).

Z otrzymanego LOS E. coli B otrzymano de-O-acylowaną pochodną - LOS-OH_synt, stosując reakcję hydrazynolizy przy użyciu bezwodnej hydrazyny (Patel, 1993). Bezwodną hydrazynę otrzymano zgodnie z opublikowaną metodą (Fukada, 1993). Do 50 mg LOS E. coli B dodano wygrzana pipetą 4 ml bezwodnej hydrazyny. Reakcje prowadzono w szczelnie zamkniętej probówce, w 37°C przez 30 min., a następnie mieszaninę reakcyjną wkroplono do acetonu (schłodzonego w -20°C) doprowadzając do

PL 227 489 B1 wytrącenia się LOS-OH E. coli B. Mieszaninę wirowano (-10°C, 15000 x g, 20 min), a następnie otrzymany osad liofilizowano. Struktur otrzymanej pochodnej analizowano przy pomocy spektrometrii

ESI-MSⁿ (fig. 4, tabela 3). Cząsteczka LOS E. coli B pozbawiona została za pomocą metod chemicznych wszystkich estrowo związanych reszt kwasów tłuszczowych oraz grupy fosforanowej (fig. 1). Otrzymana pochodna, LOS-OH E. coli B (LOS-OH_synt), została wykorzystana w badaniach in vitro, ex vivo (przykłady 8, 9) oraz in vivo (przykłady 5, 6, 7).

Tabela 3. Populacje cząsteczek obserwowanych w widmie ESI MS przygotowanej pochodnej LOS-OHsynt E. coli B.

Obserwowany jon [M-4H]4	Masa obliczona (monoizotopowa)	Interpretacja
534.54'	2142.0	M-(2xl4:0(3-OH)+14:0+12:0)-Hep
540.2'·	2164.8	M-(2xl4:0(3-OH)+14:0+12:0)-Hep+Na
551.74'	2210.8	M-(2xl4:0(3-OH)+14:0+12:0)-PEtn
557.24'	2232.8	M-(2xl4:0(3-OH)+14:0+12:0)-PEtn+Na
571.74'	2290.8	M-(2xl4:0(3-OH)+14:0+12:0)-Etn
577.24	2312.8	M-(2xl 4:0(3 -OH )+14:0+12:0)-Etn+Na
582.51-	2334.0	M-(2xl4:0(3-OH)+14:0+12:0)
588.24-	2356.8	M-(2xl4:0(3OH)+14:0+12:0)+Na
592.24'	2435.6	M-(14:0(3-OH)+14:0+12:0)-PEtn

M = kompletna struktura LOS E. coli B przedstawiona na Fig. 1 (M= 3178.5 Da).

P r z y k ł a d 5: Badanie aktywności przeciwprzerzutowej LOS-OH_synt na modelu przerzutowania mysiego czerniaka B16.

W eksperymentalnym modelu przerzutowania mysiego czerniaka B16, sprawdzono aktywność przeciwprzerzutową LOS oraz LOS-OH_Synt E. coli B. W tym celu, myszom szczepu C57BL/6 dożylnie ₅ ^SYNT podano komórki czerniaka B16 (3 x 10⁵ kom./mysz) godzinę po pierwszym podaniu preparatów. Preparaty podawano dootrzewnowo w czterech powtórzeniach: godzinę przed podaniem komórek nowotworowych, a następnie 1., 7. i 14. dnia doświadczenia (Schemat 1). W 14. i 21. dniu doświadczenia od myszy pobrano materiał biologiczny (płuca, śledziony) do dalszych analiz prowadzonych ex vivo (przykład 6). Płuca zważono, po czym utrwalono w 4% zbuforowanym roztworze formaliny, następnie policzono widoczne ogniska przerzutowe. Na figurze 5 przedstawiono średnią liczbę przerzutów komórek czerniaka B16 w płucach myszy C56BL/6 (5 myszy w grupie) po 3 lub 4 podaniach preparatów (LOS lub LOS-OH E. coli B). W 14. dniu doświadczenia najwyższą liczbę przerzutów odnotowano w grupie kontrolnej oraz grupie otrzymującej LOS 250 μg/kg, natomiast najniższą liczbę przerzutów wykazano w grupie traktowanej 250 μg/kg preparatu LOS-OH E. coli B. W 21. dniu doświadczenia również największy wpływ na zmniejszenie liczby przerzutów miała dawka LOS-OH E. coli B wynosząca 250 μg/kg (p=0,007291 w porównaniu do kontroli, Test U Manna-Whitneya). Uzyskane wyniki wskazują na wpływ preparatu LOS-OH_Synt na zmniejszenie potencjału przerzutowego komórek nowotworowych. Efekt podania preparatów na odpowiedź ogólnoustrojową oceniono na podstawie charakterystyki funkcjonalnej splenocytów pobranych (w 14. i 21. dniu) od myszy biorących udział w doświadczeniu (grupy traktowane LOS i LOS-OH_Synt E. coli B) (przykład 8).

Schemat 1. Schemat doświadczenia opisanego w przykładzie 5

PL 227 489 B1

P r z y k ł a d 6: Badanie aktywności LOS-OH E. coli B

W przykładzie 7 badano wpływ LOS E. coli B oraz LOS-OH_synt na aktywność przeciwprzerzutową, zależną od zastosowanej dawki preparatu w eksperymentalnym modelu przerzutowania czerniaka ₅

B16 u myszy. Myszom szczepu C57BL/6 (7-8 tygodni) dożylnie podano komórki czerniaka B16 (2 x 10⁵ kom./mysz) oraz preparaty LOS i LOS-OH (w dwóch dawkach: 250 oraz 2500 μg/kg masy ciała), wg. schematu dawkowania przedstawionego na Schemacie 2. Przeprowadzono ocenę liczby doświadczalnych przerzutów w płucach myszy obarczonych czerniakiem B16 i traktowanych preparatami, a wyniki przedstawiono na fig. 6. Uzyskane wyniki poddano analizie statystycznej przy użyciu testu Manna-Whitneya, która wykazała istotne statystycznie różnice w liczbie przerzutów pomiędzy: (I) kontrolą a grupami otrzymującymi LOS E. coli B 2500 μg/kg (P=0,001086) oraz LOS-OH E. coli B 250 μg/kg (P=0,027284); (II) Grupą otrzymującą LOS E. coli B 2500 μg/kg a grupami otrzymującymi LOS E. coli B 250 μg/kg (P=0,000444), LOS-OH E. coli B 2500 μg/kg (P=0,000280) oraz 250 μg/kg (P=0,000276); (III) Grupą otrzymującą LOS E. coli B 250 μg/kg a grupą otrzymującą LOS-OH E. coli B 250 μg/kg (P=0,012412).

Schemat 2. Schemat doświadczenia opisanego w Przykładzie 7. Myszom szczepu C57BL/6 podano d ożylnie komórki czerniaka B16 (2 x 10⁵ kom./mysz). Preparaty LOS i LOS-OH E. coli B w dawkach 250 i 2500 μg/ml podawano czterokrotnie: godzinę przed podaniem komórek nowotworowych oraz 1., 7. i 14. dnia doświadczenia. W 14. i 21. dniu

P r z y k ł a d 7: Ocena wpływu LOS-OH E. coli B na pobudzenie aktywności biologicznej komórek odpornościowych w warunkach hodowli in vitro oraz ex vivo (zdrowe zwierzęta).

Do zbadania aktywności biologicznej LOS-OH E. coli B wobec komórek układu immunologicznego wykorzystano komórki linii J774A. 1 pochodzenia makrofagowego (TIB-67™, ATCC®, Manassas, VA), komórki dendrytyczne pochodzenia szpikowego (BM-DC) oraz splenocyty pobrane od zdrowych myszy C57BL/6. Celem testów funkcjonalnych wykorzystujących zarówno komórki mieloidalne, jak i limfoidalne, było określenie różnic w produkcji cytokin po stymulacji preparatem LOS-OH E. coli B. Jako kontroli użyto preparat LOS E. coli B. Wszystkie komórki hodowano w warunkach standardowych (37°C, 5% CO₂ i 95% wilgotności powietrza), w plastikowych butelkach lub na 6 dołkowych płytkach firmy Costar (NY, USA). Komórki J774A.1 hodowano w medium hodowlanym DMEM ATCC z dodatkiem 10% FBS w niewielkiej gęstości nie krócej niż 7 dni. Hodowlę utrzymywano od 3-5 tygodni. Hodowlę komórek BM-DC, o początkowej gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml, prowadzono przez 8 dni w medium hodowlanym RPMI 10% FBS (MH) z dodatkiem GM-CSF (40 ng/ml) oraz IL-4 (10 ng/ml). Komórki dokarmiono dwukrotnie. Szóstego dnia komórki zdejmowano z butelek hodowlanych przy użyciu roztworu trypsyny z EDTA, zawieszano w MH z dodatkiem 10% FBS oraz GM-CSF (40 ng/ml) i IL-4 (5 ng/ml) i po doprowadzeniu do gęstości 1 x 10⁶ komórek/ml na 12-dołkowe płytki. Śledziony pobierano od zdrowych myszy szczepu C57BL/6 i zamrażano. Przed założeniem testu zawiesinę komórek śledzionowych rozmrażano i zawieszano w RPMI z 10% FBS doprowadzając do gęstości 2 x 10⁶/ml.

Aktywacja komórek linii J774A.1. Komórki zdejmowano z płytek poprzez wielokrotne pipetowanie, odpłukiwano, zawieszano w odpowiednim medium hodowlanym, doprowadzając do gęstości lxl0⁶/ml i nakładano na 24-dołkowe (Costar, NY, USA). Do hodowli dodawano po 50 μl odpowiedniego rozcieńczenia stymulatorów, tak aby ich końcowe stężenia w dołku wynosiły kolejno 10, 1; 0.1 oraz 0.01 pg/ml. Po 4 i 24 godz. inkubacji zbierano nadsącza znad hodowli. Oceniano poziom stężenia cytokin: TNF-α (4 godz.) i IL-6 (24 godz.) w nadsączach znad hodowli komórek stymulowanych LOS

PL 227 489 B1 i LOS-OH E. coli B (fig. 7). Kontrolę stanowiły komórki niestymulowane. Zaobserwowano, zależne od dawki, różnice w produkcji obu cytokin w zależności od użytego preparatu i zastosowanego stężenia stymulatora. Wykazano, że LOS E. coli B ma większą zdolność pobudzenia komórek do produkcji IL-6 i TNF-α w porównaniu z LOS-OH E. coli B. Najwyższą produkcję IL-6 i TNF-α zaobserwowano po stymulacji LOS (10 μg/ml) i była ona ponad dwukrotnie wyższa niż po dodaniu LOS-OH E. coli B w tym samym stężeniu. Jedynie komórki inkubowane w 10 μg/ml LOS-OH były zdolne do produkcji badanych cytokin. Dlatego też do kolejnych testów ex vivo prowadzonych na komórkach BM-DC zastosowano 2 najwyższe stężenia LOS i LOS-OH E. coli B, tj. 10 i 1 μg/ml.

Aktywacja komórek linii BM-DC. Do przygotowanych dzień wcześniej hodowli komórek (1 x 10⁶/ml) dodawano preparaty LOS i LOS-OH E. coli B doprowadzając do końcowych stężeń wynoszących 10 i 1 μg/ml. Inkubację BM-DC z badanymi preparatami w stężeniach 10 i 1 μ^ prowadzono przez 24 godz., po czym zbierano nadsącza znad hodowli, w których oceniano poziom stężenia IL-6, IL-10 oraz IL-12 za pomocą testu ELISA (fig. 8) (Becton Dickinson, USA). Jako kontrolę wykorzystano komórki niestymulowane.

Aktywacja splenocytów. Splenocyty hodowano przez 24 i 48 godz. w obecności LOS i LOS-OH E. coli B (1 μg/ml). We wszystkich zebranych nadsączach poziom produkcji cytokin (IL-6, IFN-γ) analizowano za pomocą testu ELISA (Becton Dickinson, USA) (fig. 9). Wykazano zróżnicowanie poziomu produkcji zależne zarówno od czasu hodowli jak i rodzaju stosowanego preparatu. W wyniku 24 godzinnej inkubacji nie stwierdzono IFN-γ. Jednak w 48-godzinnych nadsączach wykazano obecność IFN-γ, a najwyższe stężenie cytokiny odnotowano po inkubacji z LOS-OH E. coli B (60 pg/ml). W przypadku IL-6, wzrost produkcji cytokiny stwierdzono jedynie po stymulacji preparatem LOS E. coli B. Jej wielkość wynosiła od 100 pg/ml (po 24 godz.) do 250 pg/ml (po 48 godzinnych hodowli). Zastosowanie LOS-OHE. coli B nie indukowało produkcję tej cytokiny.

Dodatkowo, przeprowadzono analizę odsetka komórek zdolnych do produkcji IL-10 wśród limfocytów CD19⁺ (fig. 10C). Komórki stymulowano LOS i LOS-OH przez 24 i 48 godz. i poddano procedurze barwienia białek wewnątrzcytoplazmatycznych. Metoda barwienia białek wewnątrzcytoplazmatycznych. 6 godzin przed zakończeniem hodowli dodawano brefeldynę A (10 μg/ml) i monenzynę (2 μΜ) w celu zatrzymania produkowanych białek wewnątrz komórek. Splenocyty zdejmowano z dołków, odwirowano i barwiono przeciwciałami anty-CD19 skoniugowanymi z APC (allofikocyjanina) (eBioscience, USA) przez 30 min. Następnie komórki permeabilizowano poprzez całonocną inkubację z odczynnikiem Fixation/Permabilization (eBioscience, USA). Próbki odpłukano we Flow Cytometry Staining Buffer (eBioscience, USA), a na peletkę dodawano przeciwciało anty-CD16/CD32 (Fc Block, (eBioscience, USA)), w celu zablokowania receptora dla fragmentów Fc przeciwciał. Inkubowano 15 min, po czym dodawano przeciwciał anty-IL-10 skoniugowanych z PerCP-Cy5,5 (tandem fluorochromów) (eBioscience, USA). Barwione komórki dwukrotnie odpłukano i analizowano w cytometrze przepływowym FACSCalibur (Becton Dickinson, USA). Po krótszym czasie inkubacji (24 godz.) odsetek komórek IL-10⁺ wśród limfocytów CD19⁺ nie wykazywał znaczących różnic i wynosił dla LOS (10.0%), dla LOS-OH E. coli B (5,2%). Przedłużona do 48 godz. stymulacja spowodowała istotne zróżnicowanie odsetka komórek pozytywnych. Hodowla w obecności LOS wyindukowała 28,1% komórek IL-10⁺ wśród CD19+, natomiast zastosowanie LOS-OH E. coli B nieznacznie podnosiło odsetek tych komórek (6,3%). Kontrolę stanowiły splenocyty niestymulowane, wśród których komórki IL-10⁺ stanowiły 6,7% i 9,8% populacji komórek CD19+ odpowiednio po 24 i 48 godzinach stymulacji. Wnioski: Preparat LOS-OH E. coli B okazał się dużo słabszym stymulatorem komórek odpornościowych w porównaniu z LOS. Wprawdzie w wysokich dawkach (np. 10 μg/ml) jego aktywność była porównywalne z aktywnością preparatu LOS E. coli B, jednak tracił zdolność do aktywacji już w stężeniu 1 μg/ml.

P r z y k ł a d 8: Wpływ podania LOS-OH E. coli B na aktywację immunokompetentnych komórek u myszy obarczonych czerniakiem B16.

Doświadczenie stanowiło rozszerzenie o badania ex vivo dla próbek śledziony otrzymanych w przykładzie 6. W celu sprawdzenia wpływu LOS-OH E. coli B na aktywność komórek śledzionowych, przeprowadzono analizę fenotypu powierzchniowego komórek pobranych od myszy obarczonych czerniakiem B16 i poddanych terapii (przykład 6). Efekt działania badanych preparatów na stopień pobudzenia odpowiedzi przeciwnowotworowej określono na podstawie zmian aktywności komórek śledzionowych pobranych od myszy 21. dnia doświadczenia. Ocenę przeprowadzano na podstawie zmian fenotypowych 4 głównych populacji splenocytów (CD4, CD8, CD19 oraz CD49b) oraz ich zdolności do wytwarzania cytokin.

PL 227 489 B1

Analiza zmian fenotypowych populacji splenocytów CD4, CD8, CD19 oraz CD49b. Komórki śledzionowe rozmrażano i zawieszano w PBS z 2,5% FBS doprowadzając zawiesinę do gęstości 2 x 10⁶ komórek/ml. W probówkach umieszczano po 50 μl zawiesiny komórkowej i dodawano 50 μl roztworu odpowiednio rozcieńczonych przeciwciał.

Zastosowano przeciwciała anty-CD4 (APC) (Becton Dickinson, USA), anty-CD8 (PE-Cy7) (Becton Dickinson, USA), anty-CD49b (FITC) (Becton Dickinson, USA) oraz anty-CD19 (PE) (Becton Dickinson, USA). Inkubację prowadzono przez 45 min. w temperaturze 4°C. Reakcję zatrzymano dodając po 2 ml PBS z 2,5% FBS, wirowano i odrzucano nadsącza. Komórki zawieszano w 200 μl PBS z 2,5% FBS i analizowano w cytometrze przepływowym.

Średnie wartości odsetka komórek CD4+ dla trzech myszy w każdej grupie zamieszczono na fig. 10A. Z przedstawionych danych wynika, że odsetek komórek CD4⁺ obniżył się we wszystkich grupach myszy obarczonych nowotworem, w porównaniu do grupy myszy zdrowych (17,71 ± 4,95%). Odsetek komórek u myszy kontrolnych (obarczonych nowotworem, nietraktowanych preparatami) wynosił 14,36 ± 1,34%. Zastosowanie zarówno LOS, jak i LOS-OH E. coli B w dawce 250 μg/kg masy ciała nieznacznie podniosło odsetek komórek CD4⁺, który wyniósł odpowiednio 15,44 ± 1.12% lub 15,74 ± 2,02%. Podobny odsetek otrzymano dla grupy otrzymującej LOS E. coli B w dawce 25 μg/kg masy ciała. Jedynie po zastosowaniu preparatu LOS-OH E. coli B w dawce 25 μg/kg masy ciała, zaobserwowano nieznaczne obniżenie odsetka limfocytów T CD4⁺ (13,38 ± 0,55%). Jednak w żadnej z grup myszy obarczonych czerniakiem liczebność komórek CD4⁺ nie osiągnęła wartości stwierdzonej dla myszy zdrowych, a podanie LOS-OH A. coli B w dawce 250 μg/kg masy ciała nie korelowało ze zmniejszoną liczbą przerzutów. Jednak obniżenie odsetka splenocytów CD4⁺ może wpłynąć na zdolność całej populacji do wspomagania tworzącej się odpowiedzi przeciwprzerzutowej.

Średnie odsetki limfocytów T CD8+ w grupach badanych przedstawiono na fig. 10B. Odsetek komórek CD8+ wśród splenocytów pobranych od myszy z grupy kontrolnej wynosi 10,50 ± 0,66%. Jednak najniższy odsetek komórek CD8⁺, w grupach myszy obarczonych nowotworem i/lub traktowanych preparatami w stosunku do myszy zdrowych (13,20 ± 3,07%), wykazano po podaniu LOS-OH E. coli B w dawce 25 μg/kg (9,97 ± 0,76%). Zastosowanie zarówno LOS, jak i LOS-OH E. coli B w dawce 250 μg/kg spowodowało najmniejsze obniżenie się odsetka komórek pozytywnych (odpowiednio 12,27 ± 1,26% oraz 12,55 ± 0,38%). Tak więc, mimo podobnych tendencji w zmianach wielkości populacji komórek CD8+, jedynie zastosowanie wysokiej dawki LOS-OH E. coli B powiązane było z obniżeniem się liczby przerzutów.

Porównanie zmian w odsetku komórek CD49b+ wśród splenocytów uzyskiwanych od myszy obarczonych czerniakiem i traktowanych LOS lub LOS-OH E. coli B przedstawiono na fig. 10C. Zaobserwowano niewielkie obniżenie odsetka komórek NK wśród splenocytów pobranych od myszy obarczonych nowotworem w stosunku do myszy zdrowych. Jednak wszystkie zmiany mieściły się w przedziale od 3,91 ± 0,37% (po podaniu LOS-OH, 25 μg/kg masy ciała) do 5,17 ± 0,07% (po podaniu LOSOH, 250 μg/kg masy ciała). Tak jak w przypadku poprzednich subpopulacji również po podaniu wysokich dawek preparatu zaobserwowano najwyższy odsetek komórek CD49b⁺.

Limfocyty B są główną populacją komórek w śledzionie w warunkach prawidłowych. W związku z tym interesujące było określenie, czy podawanie myszom obarczonym czerniakiem B16 preparatu LOS-OH E. coli B spowoduje zróżnicowanie odsetka komórek CD19+. Na fig. 10D przedstawiono wyniki analizy zmian w odsetku komórek CD19+ w zależności od rodzaju i dawki podanych preparatów. U myszy zdrowych odsetek ten wynosił 61,42 ± 8,77%. Wzrost odsetka limfocytów B wśród komórek śledzionowych pobranych od myszy obarczonych czerniakiem B16 i/lub traktowanych preparatami zaobserwowano po podaniu 25 μg/kg masy ciała LOS-OH E. coli B (69,69 ± 1,03%), wykazywał odwrotną tendencję w stosunku do odsetka limfocytów T i NK. Podobnie jak w przypadku zastosowania 250 μg/kg preparatu LOS-OH E. coli B, któremu towarzyszył najniższy odsetek limfocytów B (62,8 ± 1,03%).

Podsumowując, mimo, że zaobserwowano jedynie tendencje w zmianach wielkości ocenianych populacji splenocytów to można sugerować, że podanie wysokiej dawki LOS-OH E. coli B indukowało wzrost odsetka komórek CD4⁺, CD8⁺ i CD49b⁺ w porównaniu do kontroli i obniżenie odsetka komórek CD19⁺. Porównanie wyników otrzymanych po zastosowaniu obu preparatów podkreśliło, że zmiany w odsetku populacji komórek śledzionowych zależą od rodzaju zastosowanego preparatu.

Analiza zdolności do wytwarzania cytokin przez splenocyty aktywowane ConA. Zawiesinę splenocytów o gęstości 2 mln/ml 10% RPMI, stymulowano za pomocą konkanawaliny A (Con A, mitogen limfocytów T) lub LOS E. coli B, (odpowiednik stymulatora limfocytów B). LOS E. coli B zastosowano w stężeniu 1 μg/ml, natomiast ConA w stężeniu 0,5 μg/ml. Inkubację prowadzono przez 48

PL 227 489 B1 godz. Po tym czasie znad hodowli zbierano nadsącza, w których oceniano stężenie IL-6, IFN-γ oraz IL-10 za pomocą testów ELISA (Becton Dickinson, USA; eBioscience, USA). Przeprowadzano ocenę poziomu produkcji IL-6 i IFN-γ (produkowany głownie przez limfocyty Th 1) oraz IL-10 wiązanej zwykle z działaniem immunosupresyjnym.

Splenocyty pobrane od myszy zdrowych, stymulowane ConA wykazywały produkcję IL-6 (fig. 11A) na poziomie 0,1 ng/ml. Komórki uzyskane od myszy obarczonych nowotworem nie wykazywały zdolności do wydzielania tej cytokiny w większych ilościach. Więcej nawet, podanie LOS E. coli B w dawce 25 μg/kg zmniejszyło poziom produkcji tej cytokiny. Dopiero zastosowanie LOS E. coli B w dawce 250 μg/kg lub LOS-OH E. coli B w dawce 25 μg/kg spowodowało wzrost produkcji IL-6 do ok. 0,2 ng/ml. Najwyższy poziom IL-6 wykazano po podaniu 250 μg/kg LOS-OH E. coli B. Uzyskane wyniki sugerują wpływ wysokiej dawki LOS-OH E. coli B na zwiększenie się produkcji cytokiny prozapalnej w systemowej odpowiedzi odpornościowej widoczne nawet w aktywacji komórek śledzionowych.

Poziom produkcji IFN-γ (fig. 11B) przez splenocyty otrzymane od myszy zdrowych i stymulowane ConA, wynosił 2,47 ng/ml. Zaobserwowano natomiast znaczny wzrost produkcji IFN-γ po zastosowaniu zarówno 250 pg/kg LOS E. coli B (7,00 ng/ml), jak i obu dawek LOS-OH A. coli B: 6,13 ng/ml i 7,67 ng/ml (odpowiednio dla 25 i 250 μg/kg). Użycie niskiej dawki LOS E. coli B nie wpłynęło na zwiększenie produkcji tej cytokiny. Niezwykle ważne w tym miejscu wydaje się podkreślenie zależności między niewielkim wzrostem odsetka splenocytów zdolnych do produkcji IFN-γ a pierwotnym (in vivo) pobudzeniem tych komórek do wytwarzania tej cytokiny po stymulacji ex vivo. Przedstawione na fig. 12B dane pokazują, że wysoka dawka LOS-OH A. coli B wydaje się wystarczająca, aby (pośrednio lub nawet bezpośrednio) wyindukować odpowiedź komórkową, która jest przypuszczalnie odpowiedzialna za obniżenie się liczby przerzutów w płucach u traktowanych myszy.

Stymulowane Con A komórki otrzymane od myszy obarczonych czerniakiem B16 i poddanych działaniu LOS 250 μg/kg, LOS-OH E. coli B 25 μg/kg lub LOS-OH 250 μg/kg okazały się zdolne do produkcji niewielkich ilości IL-10 (odpowiednio 0,5 ng/ml, 0,73 ng/ml lub 0,64 ng/ml). Tak jak w przypadku produkcji IFN-γ i IL-6, jedynie splenocyty w tych grupach wykazały większą zdolność do wytwarzania IL-10. Ta zwiększona reaktywność splenocytów uzyskanych od myszy traktowanych obiema dawkami LOS-OH E. coli B wskazuje na udział limfocytów T w pobudzeniu odpowiedzi przeciwko komórkom czerniaka oraz na fazę odpowiedzi in vivo w momencie pobrania materiału. Należy zwrócić uwagę, na wprawdzie niewielkie, ale widoczne odwrotne tendencje w produkcji cytokin w zależności od zastosowanej dawki LOS E. coli B (fig. 11).

Uzyskane wyniki sugerują, że zastosowanie wysokiej dawki LOS-OH E. coli B wpływa na zwiększenie poziomu produkcji IL-6 (cytokiny prozapalnej). Wydaje się, że taka ilość IL-6 jest wystarczająca do wyindukowania odpowiedzi komórkowej, odpowiedzialnej za obniżenie liczby przerzutów w płucach myszy traktowanych. Zwiększona reaktywność splenocytów, uzyska nych od myszy traktowanych dwoma różnymi dawkami LOS-OH E. coli B, przejawia się zdolnością tych komórek do produkcji IL-10. Wskazuje to na udział limfocytów T w pobudzeniu odpowiedzi przeciwko komórkom czerniaka in vivo w momencie pobrania materiału.

Profil produkowanych cytokin przez splenocyty po stymulacji LOS E. coli B. Analiza fenotypu splenocytów wykazała zmiany w odsetku zarówno limfocytów T, jak i komórek CD19⁺ zależne od rodzaju i dawki zastosowanego preparatu. Analiza profilu produkowanych cytokin po stymulacji Con A komórek śledzionowych wykazała znaczną produkcję IFN-γ i jedynie niewielką - IL-10. Kolejnym etapem badań było zatem określenie reaktywności badanych splenocytów wobec LOS E. coli B, który może być uznany za stymulator limfocytów B. Stężenie cytokin oceniano za pomocą testów immunoenzymatycznych ELISA. Na fig. 12A przedstawiono zestawienie wyników otrzymanych po analizie stężenia IL-6.

Poziom produkcji IL-6 przez komórki śledzionowe pobrane od myszy zdrowej wynosił około 0,2 ng/ml i był najniższy spośród wszystkich badanych grup. W grupach myszy obarczonych nowotworem i traktowanych preparatami znaczące różnice w produkcji zaobserwowano po podaniu in vivo LOS-OH E. coli B. Najmniejsze stężenie tej cytokiny stwierdzono w nadsączach znad komórek uzyskanych od myszy otrzymujących 250 mg/kg m.c. (0,25 ng/ml), podczas gdy po zastosowaniu niższej dawki produkcja IL-6 wzrosła do 0,45 ng/ml. Obniżenie zdolności splenocytów do produkcji cytokiny prozapalnej pod wpływem działania LOS E. coli B oceniane w nadsączach znad hodowli zawierających zwiększony odsetek limfocytów B może sugerować zależne od dawki pobudzenie określonej populacji komórek śledzionowych w myszach traktowanych LOS-OH E. coli B.

PL 227 489 B1

Produkcja IFN-γ przez komórki śledzionowe stymulowane in vitro za pomocą LOS E. coli B mieściła się w zakresie od 0 do 0,29 ng/ml (fig. 12B). Komórki myszy zdrowej nie wykazywały produkcji tej cytokiny na poziomie czułości testu, podczas gdy zastosowanie LOS-OH E. coli B w dawce 250 μg/kg masy ciała powodowało nieznaczny wzrost produkcji tej cytokiny do wysokości 0,29 ng/ml. Splenocyty pobrane od myszy z pozostałych grup produkowały tę cytokinę w ilościach śladowych. Wykazywane niskie stężenie IFN-γ w hodowli splenocytów wydaje się zjawiskiem wtórnym, ale podkreślającym znaczący udział podawania LOS-OH E. coli B w dawce 250 μg/kg na aktywację odpowiedzi komórkowej.

Produkcja IL-10 przez komórki śledzionowe stymulowane LOS E. coli B pobrane od myszy obarczonych nowotworem i traktowane preparatami jest znacznie niższa niż w produkcja tej cytokiny przez splenocyty otrzymane od myszy zdrowych (3,8 ng/ml). Zróżnicowanie poziomu produkcji IL-10 wydaje się w znacznym stopniu związane z indywidualną odpowiedzią traktowanych myszy. Jednak w tym przypadku splenocyty od myszy otrzymujących LOS-OH E. coli B w dawce 250 mg/kg należały do grupy istotnie reagującej na stymulację. Kolejną grupą pokazującą znaczną wrażliwość na stymulację LOS E. coli B ex vivo okazała się grupa otrzymująca 25 μg/kg tego preparatu in vivo. Zwraca uwagę wzrastająca tendencja do produkcji IL-10 w grupie myszy otrzymującej niższą dawkę LOS-OH E. coli B (zarówno po stymulacji in vitro za pomocą ConA, jak i LOS) oraz znaczne obniżenie zdolności splenocytów do produkcji IL-10 ex vivo po zastosowaniu wysokiej dawki LOS-OH A. coli B (fig. 12C).

LITERATURA

Aderem A., Ulevitch R. J., Toll-like receptors in the induction of the innate immune response. (2000) Nature, 406 (6797), 782-7.

Andres D, Gohlke U, Broeker NK, Schulze S, Rabsch W, Heinemann U, Barbirz S, Seckler R. An essential serotype recognition pocket on phage P22 tailspike protein forces Salmonella enterica serovar Paratyphi A O-antigen fragments to bind as nonsolution conformers. Glycobiology. 2013 Apr;23(4):486-94.

Andres D, Roske Y, Doering C, Heinemann U, Seckler R, Barbirz S. Tail morphology controls DNA release in two Salmonella phages with one lipopolysaccharide receptor recognition system. Mol Microbiol. 2012 Mar;83(6): 1244-53.

Andres D, Baxa U, Hanke C, Seckler R, Barbirz S. Carbohydrate binding of Salmonella phage P22 tailspike protein and its role during host cell infection. Biochem Soc Trans. 2010 Oct;38(5): 1386-9.

Andres D, Hanke C, Baxa U, Seul A, Barbirz S, Seckler R. Tailspike interactions with lipopolysaccharide effect DNA ejection from phage P22 particles in vitro. J Biol Chem. 2010 Nov 19;285(47):36768-75.

Bragado P, Sosa MS, Keely P, Condeelis J, Aguirre-Ghiso JA. Microenvironments dictating tumor cell dormancy. Recent Results Cancer Res. 2012;195:25-39.

Bloom E. et al (2011): The Global Economic Burden of Noncommunicable Diseases. Geneva: World Economic Forum.

Baldridge J., Crane R. (1999) Monofosforyl lipid A (MPL) formulations for the next generations of vaccines. Methods 19, 103-107.

Bardou M. i Reisser D. Antitumoral effects of lipids A, colinical studies. Lipid A in Cancer Therapies Preclinical Results in: Lipid A in Cancer Therapy, series: Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 667. Jeannin, Jean-Francois (Ed.). 2010.

Boratyński J., Szermer-Olearnik B., Dabrowska-Weber B., Górski A. Sposób uzyskiwania preparatów bakteriofagowych zawierających śladową zawartość endotoksyn. Zgłoszenie patentowe nr 382800 z dnia 29-06-2007.

PL 227 489 B1

Boratyński J., Szermer-Olearnik B., Dabrowska-Weber B., Górski A. Method of obtainig bacteriophage preparation. Międzynarodowe zgłoszenie patentowe PCT PL 2008000045 z dnia 26-06-2008

Cluff C., Baldridge J., Stover A., Evans J., Johnson D., Lacy, M., Clawson V., Yorgensen V., Johnson C., Livesay M., Hershberg R., Persing D. (2005) Synthetic Toll-like receptor 4 agonist stimulate innate resistance to infectious challenge. Infect Immun. 73 (5), 3044-3052.

Dabrowska K., Opolski A., Wietrzyk J., Nevozhay D., Szczaurska K., Switala-Jelen K., Górski A. (2005) Activity of bacteriophages in murine tumor models depends on the route of phage administration. Oncology Research 15, 183-187.

Dabrowska K., Skardzinski G., Kurzepa A., Wietrzyk J., Jończyk P., Owczarek B., Żaczek M., Switala-Jelen K., Pozniak G., Weber-Dabrowska B., Górski A. The effect of bacteriophages T4 and HAP1 on in vitro meloma migration. EMBO Meeting Cellular Signaling and Molecular Medicine, May 29-Jun 4, 2008, Cavtat/Dubrovnik, Croatia, Abstracts and Program Book, p. 212

Dabrowska K., Opolski A., Wetrzyk J., Switala-Jelen K., Boratyński J., Nasulewicz A., Lipińska L., Chybicka M., Kujawa M., Zabel M., Dolinska-Krajewska E., Piasecki B., Weber-Dabrowska B., Rybka J., Salwa J., Wojdat E., Nowaczyk M., Górski A. (2004)

Antitumor activity of bacteriophages in murine experimental cancer models caused possibly by inhibition of beta3 integrin signaling pathway. Acta Virol. 48, 241-248.

Dabrowska K. S. G., Kurzepa A., Wietrzyk J., Jończyk P., Owczarek B., Żaczek M., SwitalaJelen K., Pozniak G., Weber-Dabrowska B., Górski A. . (2008) The effect of bacteriophages T4 and HAP1 on in vitro meloma migration. In EMBO Meeting Cellular Signaling and Molecular Medicine, p. Abstracts and Program Book, p. 212.

Fukada, M., Kabata, A., Glycobiology, Practical Approach. 1993, New York: Oxford University Press Inc.

Galanos C, Lϋderitz O, Westphal O. A new method for the extraction of R lipopolysaccharides. Eur JBiochem. 1969 Jun;9(2):245-9.

Goto S., Sakai S., Kera J., Suma Y., Soma G., Takeuchi S. (1996) Intradermal administration of lipopolysaccharide in treatment of human cancer. Cancer Immunol. Immunother. 23, 135-139.

Figura G., Budynek P., Dąbrowska K. (2010) Bakteriofag T4: molekularne aspekty infekcji komórki bakteryjnej, rola białek kapsydowych. Postępy Hig Med Dosw (online), 64, 251-261.

Lukasiewicz J, Jachymek W, Niedziela T, Malik-Gebicka M, Dzieciatkowska M, Ługowski C. Comparison of serological specificity of anti-endotoxin sera directed against whole bacterial cells and core oligosaccharide of Escherichia coli J5-tetanus toxoid conjugate. Acta Biochim Pol. 2002;49(3):721-34.

McCarthy MM, DiVito KA, Sznol M, Kovacs D, Halaban R, Berger AJ, Flaherty KT, Camp RL, Lazova R, Rimm DL, Kluger HM. Expression of tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand receptors 1 and 2 in melanoma. Clin Cancer Res. 2006 Jun 15; 12(12):3 856-63.

Mina LA, Sledge GW Jr. Rethinking the metastatic cascade as a therapeutic target. Nat Rev Clin Oncol. 2011 Jun;8(6):325-32.

OECD (2011), Health at a Glance 2011 : OECD Indicators, OECD Publishing

Patel, T., Bruce, J., Merry, A., Bigge, C., Wormald, M., Jaques, A., Parekh, R. Use of hydrazine to release in intact and unreduced form both N- and O-linked oligosaccharides from glycoproteins. Biochemistry, 1993, 32(2), 679-693

PL 227 489 B1

Prehm P, Jann B, Jann K, Schmidt G, Stirm S. On a bacteriophage T3 and T4 receptor region within the cell wall lipopolysaccharide of Escherichia coli B. 1976, J. Mol. Biol. 101 (2), 277-281.

Persing D. H., Coler R. N., Lasy M. J., Johnson D. A., Baldrige J. R., Hershberg R. M., Reed

S. G. (2002) Taking toll: lipid A mimetics as adjuvants and immunomodulators. Trends Microbiol. 10, S32-37.

Reisser D i Jeannin, J.F. Lipid A in Cancer Therapies Preclinical Results in: Lipid A in Cancer Therapy, series: Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 667. Jeannin, Jean-Francois (Ed.). 2010.

Rivera El, Gomez H. Chemotherapy resistance in metastatic breast cancer: the evolving role of ixabepilone. Breast Cancer Res. 2010;12 Suppl 2:S2. doi: 10.1186/bcr2573.

Rockwell, Cheryl E.; Morrison, David. C.; Qureshi, Nilofer. Lipid A-Mediated Tolerance and Cancer Therapy in: Lipid A in Cancer Therapy, series: Advances in Experimental Medicine and Biology, Vol. 667. Jeannin, Jean-Francois (Ed.). 2010.

Szczaurska-Nowak K., Dabrowska K., Celka M., Kurzepa A., Nevozhay D., Wietrzyk J., SwitalaJelen K., Syper D., Pozniak G., Opolski A., Radzikowski C. (2008) Combined treatment of mice with cytostatic agents and bacteriophage T4. Anticancer Res. 29(6), 2361-2370.

Szczaurska-Nowak K., Dabrowska K., Celka M., Kurzepa A., Nevozhay D., Wietrzyk J., SwitalaJelen K., Syper D., Pozniak G., Opolski A., Górski A. and Radzikowski C. (2009) Antitumor effect of combined treatment of mice with cytostatic agents and bacteriophage T4. Anticancer Res 29, 2361-70.

Vasselon T, Detmers PA. Toll receptors: a central element in innate immune responses. Infect Immun. 2002 Mar;70(3): 1033-41.

Claims (9)

1. Związek o wzorze 1 :

gdzie:

R1 oznacza 14:0(3-O-14:0) albo H,

R2 oznacza 14:0(3-OH) albo 14:0(3-O-12:0),

R3 oznacza H albo 14:0(3-OH),

R4 oznacza 14:0(3-OH).

2. Związek według zastrz. 1, gdzie R1 oznacza H, R2 oznacza 14:0(3-OH), R3 oznacza H, a R4 oznacza 14:0(3-OH).

3. Związek według zastrz. 1, gdzie R1 oznacza 14:0(3-0-14:0), R2 oznacza 14:0(3-O-12:0), R3 oznacza 14:0(3-OH), a R4 oznacza 14:0(3-OH).

4. Sposób otrzymywania związku LOS-OH określonego w zastrz. 2, znamienny tym, że

a) namnaża się komórki szczepu bakteryjnego E. coli B,

PL 227 489 B1

b) uzyskane komórki bakteryjne oddziela się i poddaje liofilizacji,

c) prowadzi się ekstrakcję związku określonego w zastrz. 3,

d) związek otrzymany w etapie c traktuje się bezwodną hydrazyną i wytrąca z mieszaniny reakcyjnej, zwłaszcza w nadmiarze acetonu, uzyskując związek określony w zastrz 2.

5. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że w etapie c) prowadzi się ekstrakcję mieszaniną fenol/chloroform/eter naftowy oraz wytrącanie wodą, a następnie przemywanie kolejno fenolem i eterem dietylowym oraz wytrącanie wodą.

6. Związek określony w zastrz. 2 do stosowania jako lek.

7. Związek określony w zastrz. 2 do stosowania w zapobieganiu lub leczeniu nowotworów.

8. Związek do stosowania według zastrz. 5 w zapobieganiu przerzutom.

9. Związek do stosowania według zastrz. 5 jako składnik szczepionek przeciwnowotworowych, zwłaszcza jako adjuwant.