PL227742B1 - Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie - Google Patents
Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie Download PDFInfo
- Publication number
- PL227742B1 PL227742B1 PL399613A PL39961312A PL227742B1 PL 227742 B1 PL227742 B1 PL 227742B1 PL 399613 A PL399613 A PL 399613A PL 39961312 A PL39961312 A PL 39961312A PL 227742 B1 PL227742 B1 PL 227742B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- acid
- mmol
- amino
- val
- pro
- Prior art date
Links
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 88
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 48
- 239000002253 acid Substances 0.000 title claims description 37
- YCWSUKQGVSGXJO-NTUHNPAUSA-N nifuroxazide Chemical group C1=CC(O)=CC=C1C(=O)N\N=C\C1=CC=C([N+]([O-])=O)O1 YCWSUKQGVSGXJO-NTUHNPAUSA-N 0.000 title claims description 9
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 114
- -1 mercaptomethyl Chemical group 0.000 claims description 105
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 70
- 150000001875 compounds Chemical group 0.000 claims description 68
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 51
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 51
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 36
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 35
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 35
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 35
- 108010016626 Dipeptides Proteins 0.000 claims description 28
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-diisopropylethylamine Substances CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N alpha-aminobutyric acid Chemical compound CCC(N)C(O)=O QWCKQJZIFLGMSD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 22
- 239000004305 biphenyl Substances 0.000 claims description 16
- 235000010290 biphenyl Nutrition 0.000 claims description 16
- ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N phenylbenzene Natural products C1=CC=CC=C1C1=CC=CC=C1 ZUOUZKKEUPVFJK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- PUJDIJCNWFYVJX-UHFFFAOYSA-N benzyl carbamate Chemical compound NC(=O)OCC1=CC=CC=C1 PUJDIJCNWFYVJX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 12
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims description 11
- FKTCUAKAAIDOCJ-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-[4-(diaminomethylideneamino)phenyl]acetic acid Chemical compound OC(=O)C(N)C1=CC=C(N=C(N)N)C=C1 FKTCUAKAAIDOCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 10
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 10
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 10
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N phosphorus trichloride Chemical compound ClP(Cl)Cl FAIAAWCVCHQXDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000004215 Carbon black (E152) Substances 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000066 S-methyl group Chemical group [H]C([H])([H])S* 0.000 claims description 8
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 claims description 8
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 8
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 claims description 8
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 claims description 8
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 claims description 8
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 8
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 8
- 125000000956 methoxy group Chemical group [H]C([H])([H])O* 0.000 claims description 8
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 8
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 claims description 6
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 6
- 230000008878 coupling Effects 0.000 claims description 6
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 claims description 6
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 claims description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 claims description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 229940122055 Serine protease inhibitor Drugs 0.000 claims description 2
- 101710102218 Serine protease inhibitor Proteins 0.000 claims description 2
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 claims description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 2
- WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=CC=C1 WLJVXDMOQOGPHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 239000003001 serine protease inhibitor Substances 0.000 claims description 2
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims 2
- 150000007860 aryl ester derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N phosphorous acid Chemical compound OP(O)O OJMIONKXNSYLSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 193
- 239000000047 product Substances 0.000 description 185
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 151
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 88
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 86
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 78
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 74
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 69
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 69
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 69
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 66
- 239000003921 oil Substances 0.000 description 61
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 56
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 55
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 50
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 50
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 48
- 238000000425 proton nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 46
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 42
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 41
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 41
- UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N diisopropylamine Chemical compound CC(C)NC(C)C UAOMVDZJSHZZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 38
- HGCAUCAWEADMPM-UHFFFAOYSA-N (1-azaniumyl-3-methylbutyl)-hydroxyphosphinate Chemical compound CC(C)CC(N)P(O)(O)=O HGCAUCAWEADMPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 36
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 36
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 34
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 34
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 33
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 30
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 29
- IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N Dimethyl sulfoxide Chemical compound [2H]C([2H])([2H])S(=O)C([2H])([2H])[2H] IAZDPXIOMUYVGZ-WFGJKAKNSA-N 0.000 description 28
- 238000001394 phosphorus-31 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 28
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 28
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 26
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 26
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 25
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 24
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 24
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 24
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 24
- JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 2-phenylethanimidamide Chemical compound NC(=N)CC1=CC=CC=C1 JTNCEQNHURODLX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 23
- 229910000343 potassium bisulfate Inorganic materials 0.000 description 23
- 238000004809 thin layer chromatography Methods 0.000 description 23
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 22
- HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N Trichloro(2H)methane Chemical compound [2H]C(Cl)(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-MICDWDOJSA-N 0.000 description 21
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 21
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 21
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 20
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 20
- 108090000617 Cathepsin G Proteins 0.000 description 19
- 102000004173 Cathepsin G Human genes 0.000 description 19
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 19
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 19
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 19
- LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 4-[[1-[[1-[2-[[1-(4-nitroanilino)-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamoyl]pyrrolidin-1-yl]-1-oxopropan-2-yl]amino]-1-oxopropan-2-yl]amino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound OC(=O)CCC(=O)NC(C)C(=O)NC(C)C(=O)N1CCCC1C(=O)NC(C(=O)NC=1C=CC(=CC=1)[N+]([O-])=O)CC1=CC=CC=C1 LKDMKWNDBAVNQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- DGSLPJDIFKVSIB-UHFFFAOYSA-N (1-azaniumyl-2-methylpropyl)-hydroxyphosphinate Chemical compound CC(C)C(N)P(O)(O)=O DGSLPJDIFKVSIB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 16
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 16
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 15
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 15
- 230000014759 maintenance of location Effects 0.000 description 15
- VYZJKVAPUFDXTQ-UHFFFAOYSA-N NC(C1C2=CC=CC=C2)OP1(O)=O Chemical compound NC(C1C2=CC=CC=C2)OP1(O)=O VYZJKVAPUFDXTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 14
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 14
- 239000002274 desiccant Substances 0.000 description 14
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 14
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 14
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 14
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 14
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 14
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 14
- 239000003039 volatile agent Substances 0.000 description 14
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 13
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 13
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 13
- 229940043279 diisopropylamine Drugs 0.000 description 13
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 13
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 13
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 13
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 13
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 13
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 13
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 13
- UAEPDDGDPAPPHZ-UHFFFAOYSA-N 1-aminobutylphosphonic acid Chemical compound CCCC(N)P(O)(O)=O UAEPDDGDPAPPHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 12
- 108010067372 Pancreatic elastase Proteins 0.000 description 12
- 102000016387 Pancreatic elastase Human genes 0.000 description 12
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;hydrate Chemical compound O.CC#N PBCJIPOGFJYBJE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 12
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 3-azaniumyl-2-hydroxypropanoate Chemical compound NCC(O)C(O)=O BMYNFMYTOJXKLE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 11
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 11
- ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N (2s)-1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]pyrrolidine-2-carboxylic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O ZQEBQGAAWMOMAI-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 10
- UIQSKEDQPSEGAU-UHFFFAOYSA-N 1-Aminoethylphosphonic Acid Chemical compound CC(N)P(O)(O)=O UIQSKEDQPSEGAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 108090000317 Chymotrypsin Proteins 0.000 description 10
- 229960002376 chymotrypsin Drugs 0.000 description 10
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 10
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 10
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 10
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 10
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 10
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 10
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 9
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 9
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 9
- 125000001160 methoxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])OC(*)=O 0.000 description 9
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052721 tungsten Inorganic materials 0.000 description 9
- OFQJMBVXCZFBPC-UHFFFAOYSA-N 1-diphenoxyphosphoryl-2-methylpropan-1-amine Chemical class C=1C=CC=CC=1OP(=O)(C(N)C(C)C)OC1=CC=CC=C1 OFQJMBVXCZFBPC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 8
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 8
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 8
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 8
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 8
- KBDLEVJSRJXEGL-UHFFFAOYSA-N 1-diphenoxyphosphoryl-3-methylbutan-1-amine Chemical class C=1C=CC=CC=1OP(=O)(C(N)CC(C)C)OC1=CC=CC=C1 KBDLEVJSRJXEGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 108090000624 Cathepsin L Proteins 0.000 description 7
- 102000004172 Cathepsin L Human genes 0.000 description 7
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 6
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 6
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 230000003448 neutrophilic effect Effects 0.000 description 6
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 6
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 6
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 6
- SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N (2s)-3-methyl-2-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]butanoic acid Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OC(C)(C)C SZXBQTSZISFIAO-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 5
- ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 ZKQOUHVVXABNDG-IUCAKERBSA-N 0.000 description 5
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 5
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 5
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 5
- 125000006267 biphenyl group Chemical group 0.000 description 5
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 5
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 5
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 125000004080 3-carboxypropanoyl group Chemical group O=C([*])C([H])([H])C([H])([H])C(O[H])=O 0.000 description 4
- YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutanal Chemical compound CC(C)CC=O YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000194108 Bacillus licheniformis Species 0.000 description 4
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 4
- CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N Hydrogen bromide Chemical compound Br CPELXLSAUQHCOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 4
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 4
- NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N Val-Pro-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](N)C(C)C NHXZRXLFOBFMDM-AVGNSLFASA-N 0.000 description 4
- 108010054813 diprotin B Proteins 0.000 description 4
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 4
- DTUQWGWMVIHBKE-UHFFFAOYSA-N phenylacetaldehyde Chemical compound O=CCC1=CC=CC=C1 DTUQWGWMVIHBKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HVLLSGMXQDNUAL-UHFFFAOYSA-N triphenyl phosphite Chemical compound C=1C=CC=CC=1OP(OC=1C=CC=CC=1)OC1=CC=CC=C1 HVLLSGMXQDNUAL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FQCNOURLMNHAQN-UHFFFAOYSA-N (1-azaniumyl-2-phenylethyl)-hydroxyphosphinate Chemical class OP(=O)(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 FQCNOURLMNHAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 3
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical compound OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N Tert-Butanol Chemical compound CC(C)(C)O DKGAVHZHDRPRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N Val-Pro-Phe Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](Cc1ccccc1)C(O)=O QIVPZSWBBHRNBA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 3
- 229940125773 compound 10 Drugs 0.000 description 3
- 239000012531 culture fluid Substances 0.000 description 3
- ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N jdtic Chemical compound C1([C@]2(C)CCN(C[C@@H]2C)C[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H]2NCC3=CC(O)=CC=C3C2)=CC=CC(O)=C1 ZLVXBBHTMQJRSX-VMGNSXQWSA-N 0.000 description 3
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 3
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 3
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 3
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- LKCYIBRBFGMNAP-IHRRRGAJSA-N (3aS,4S,6aR)-4-(10-amino-5-oxodecyl)-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-2-one Chemical compound C(CCCC[C@@H]1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)(=O)CCCCCN LKCYIBRBFGMNAP-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 2
- HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 2,3-dimethylpyridine Chemical compound CC1=CC=CN=C1C HPYNZHMRTTWQTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)pyridine-3-carbonitrile Chemical compound ClCC1=NC=CC=C1C#N FALRKNHUBBKYCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YWCIQVCLMJYZBD-UHFFFAOYSA-N 2-tert-butylbutanedioic acid Chemical compound CC(C)(C)C(C(O)=O)CC(O)=O YWCIQVCLMJYZBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000007469 Actins Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 2
- 102000005927 Cysteine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108010005843 Cysteine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 101000933179 Homo sapiens Cathepsin G Proteins 0.000 description 2
- AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N Isopropylaldehyde Chemical compound CC(C)C=O AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 2
- AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AWJGUZSYVIVZGP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VXFJYXUZANRPDJ-WTNASJBWSA-N Trandopril Chemical compound C([C@@H](C(=O)OCC)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](C[C@H]2CCCC[C@@H]21)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 VXFJYXUZANRPDJ-WTNASJBWSA-N 0.000 description 2
- QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N Val-Pro-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O QSPOLEBZTMESFY-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- 229940124277 aminobutyric acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 2
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 2
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 2
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- ZZGDDBWFXDMARY-SVBPBHIXSA-N benzyl n-[(2s)-1-[[(2s)-5-(diaminomethylideneamino)-1-[(4-methyl-2-oxochromen-7-yl)amino]-1-oxopentan-2-yl]amino]-1-oxo-3-phenylpropan-2-yl]carbamate Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)NC1=CC=2OC(=O)C=C(C=2C=C1)C)NC(=O)OCC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 ZZGDDBWFXDMARY-SVBPBHIXSA-N 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 2
- ZJULYDCRWUEPTK-UHFFFAOYSA-N dichloromethyl Chemical compound Cl[CH]Cl ZJULYDCRWUEPTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000052896 human CTSG Human genes 0.000 description 2
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 2
- 125000001972 isopentyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229940100595 phenylacetaldehyde Drugs 0.000 description 2
- 108010053725 prolylvaline Proteins 0.000 description 2
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 2
- 229940014800 succinic anhydride Drugs 0.000 description 2
- DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N tert-butoxycarbonyl anhydride Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)OC(=O)OC(C)(C)C DYHSDKLCOJIUFX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- BOTYHMCAJVDDHD-UHFFFAOYSA-N tert-butyl n-[ethylsulfanyl-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]methylidene]carbamate Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NC(/SCC)=N/C(=O)OC(C)(C)C BOTYHMCAJVDDHD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N thiourea Chemical compound NC(N)=S UMGDCJDMYOKAJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N triphenylphosphine Chemical compound C1=CC=CC=C1P(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 RIOQSEWOXXDEQQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000003679 valine derivatives Chemical class 0.000 description 2
- NOQKPEWLSMCOFU-UHFFFAOYSA-N (1-amino-2-methylbutyl)phosphonic acid Chemical compound CCC(C)C(N)P(O)(O)=O NOQKPEWLSMCOFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N (1s,3r,4e,6e,8e,10e,12e,14e,16e,18s,19r,20r,21s,25r,27r,30r,31r,33s,35r,37s,38r)-3-[(2r,3s,4s,5s,6r)-4-amino-3,5-dihydroxy-6-methyloxan-2-yl]oxy-19,25,27,30,31,33,35,37-octahydroxy-18,20,21-trimethyl-23-oxo-22,39-dioxabicyclo[33.3.1]nonatriaconta-4,6,8,10 Chemical compound C1C=C2C[C@@H](OS(O)(=O)=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2.O[C@H]1[C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@H]1/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/C=C/[C@H](C)[C@@H](O)[C@@H](C)[C@H](C)OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)CC[C@@H](O)[C@H](O)C[C@H](O)C[C@](O)(C[C@H](O)[C@H]2C(O)=O)O[C@H]2C1 PCTMTFRHKVHKIS-BMFZQQSSSA-N 0.000 description 1
- UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N (3S)-3-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[5-[(3aS,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]-3-methylbutanoyl]amino]-3-(4-hydroxyphenyl)propanoyl]amino]-4-[1-bis(4-chlorophenoxy)phosphorylbutylamino]-4-oxobutanoic acid Chemical compound CCCC(NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](Cc1ccc(O)cc1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CCCCC1SC[C@@H]2NC(=O)N[C@H]12)C(C)C)P(=O)(Oc1ccc(Cl)cc1)Oc1ccc(Cl)cc1 QFLWZFQWSBQYPS-AWRAUJHKSA-N 0.000 description 1
- SWXXKWPYNMZFTE-UHFFFAOYSA-N (c-ethylsulfanylcarbonimidoyl)azanium;bromide Chemical compound Br.CCSC(N)=N SWXXKWPYNMZFTE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DLGBEGBHXSAQOC-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxy-5-methylbenzoic acid Chemical compound CC1=CC=C(O)C(C(O)=O)=C1 DLGBEGBHXSAQOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 3-Methylbutanoic acid Natural products CC(C)CC([O-])=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- OAKURXIZZOAYBC-UHFFFAOYSA-M 3-oxopropanoate Chemical compound [O-]C(=O)CC=O OAKURXIZZOAYBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 4-nitrobenzaldehyde Chemical compound [O-][N+](=O)C1=CC=C(C=O)C=C1 BXRFQSNOROATLV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010041397 CD4 Antigens Proteins 0.000 description 1
- 101150041968 CDC13 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 1
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 1
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 1
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000043131 MHC class II family Human genes 0.000 description 1
- 108091054438 MHC class II family Proteins 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N Pro-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 FELJDCNGZFDUNR-WDSKDSINSA-N 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N Trifluoroethanol Chemical compound OCC(F)(F)F RHQDFWAXVIIEBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Natural products NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XBJKAZATRJBDCU-GUBZILKMSA-N Val-Pro-Ala Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O XBJKAZATRJBDCU-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N [benzotriazol-1-yloxy(dimethylamino)methylidene]-dimethylazanium Chemical compound C1=CC=C2N(OC(N(C)C)=[N+](C)C)N=NC2=C1 CLZISMQKJZCZDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N bromoethane Chemical compound CCBr RDHPKYGYEGBMSE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N butyric aldehyde Natural products CCCC=O ZTQSAGDEMFDKMZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 238000010411 cooking Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 239000010779 crude oil Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N diisononyl phthalate Chemical group CC(C)CCCCCCOC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCCCCCCC(C)C HBGGXOJOCNVPFY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002121 endocytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 125000004185 ester group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 125000002795 guanidino group Chemical group C(N)(=N)N* 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N isovaleric acid Chemical compound CC(C)CC(O)=O GWYFCOCPABKNJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009916 joint effect Effects 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L mercury dichloride Chemical compound Cl[Hg]Cl LWJROJCJINYWOX-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 239000010502 orange oil Substances 0.000 description 1
- 239000012044 organic layer Substances 0.000 description 1
- NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N p-methoxyphenol Chemical compound COC1=CC=C(O)C=C1 NWVVVBRKAWDGAB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 150000003009 phosphonic acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012451 post-reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000000341 threoninyl group Chemical group [H]OC([H])(C([H])([H])[H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07F—ACYCLIC, CARBOCYCLIC OR HETEROCYCLIC COMPOUNDS CONTAINING ELEMENTS OTHER THAN CARBON, HYDROGEN, HALOGEN, OXYGEN, NITROGEN, SULFUR, SELENIUM OR TELLURIUM
- C07F9/00—Compounds containing elements of Groups 5 or 15 of the Periodic Table
- C07F9/02—Phosphorus compounds
- C07F9/28—Phosphorus compounds with one or more P—C bonds
- C07F9/38—Phosphonic acids [RP(=O)(OH)2]; Thiophosphonic acids ; [RP(=X1)(X2H)2(X1, X2 are each independently O, S or Se)]
- C07F9/40—Esters thereof
- C07F9/4003—Esters thereof the acid moiety containing a substituent or a structure which is considered as characteristic
- C07F9/4025—Esters of poly(thio)phosphonic acids
- C07F9/405—Esters of poly(thio)phosphonic acids containing nitrogen substituent, e.g. N.....H or N-hydrocarbon group which can be substituted by halogen or nitro(so), N.....O, N.....S, N.....C(=X)- (X =O, S), N.....N, N...C(=X)...N (X =O, S)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
- C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/573—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for enzymes or isoenzymes
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/914—Hydrolases (3)
- G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
- G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
- G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
- G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
- G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
- G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/55—Design of synthesis routes, e.g. reducing the use of auxiliary or protecting groups
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Pathology (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku są pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie w diagnostyce medycznej.
Z publikacji Oleksyszyn J., Subotkowska L., Mastalerz P., Synthesis, 1979, 985; Oleksyszyn J., Powers J.C., Biochemistry, 1991, 30, 485 znane są difenylowe estry kwasów 1-aminoalkanofosfonowych będące strukturalnymi analogami aminokwasów wykazujące zdolność hamowania proteolitycznej aktywności enzymów z rodziny proteaz serynowych. W publikacjach Boduszek B., Brown A.D., Powers J.C., J Ezym. Inhib. 1994, 8, 147-158; Sieńczyk M., Oleksyszyn J., Bioorg Med Chem Lett., 2006, 16, 2886; Joossens J., Ali O.M., El-Sayed I., Surpateanu G., Van der Veken P., Lambeir A.M., Setyono-Han B., Foekens J.A., Schneider A., Schmalix W., Haemers A., Augustyns K., J Med Chem., 2007, 50, 6638; Sieńczyk M., Podgórski D., Błażejewska A., Kulbacka J., Saczko J., Oleksyszyn J., Bioorg Med Chem., 2011, 19, 1277; Sieńczyk M, Winiarski Ł., Kasperkiewicz P., Psurski M., Wietrzyk J., Oleksyszyn J. Bioorg Med Chem Lett., 2011, 21, 1310 opisano kilka przykładów fosfonowych analogów aminokwasów, z grupy estrów diarylowych kwasów 1 -aminoalkanofosfonowych, które zawierają w swej strukturze podstawione aromatyczne pierścienie fenylowe jako grupy estrowe.
Katepsyny są enzymami niezbędnymi w procesowaniu antygenów w ścieżce głównego układu zgodności tkankowej klasy II (MHC II). Za proteolityczny potencjał odpowiadają obecne w przestrzeni endocytarnej trzy klasy proteaz - cysteinowe, aspartylowe i serynowe. Wspólne działanie powyższych proteaz prowadzi do wytworzenia peptydów antygenicznych będących fragmentami antygenów, które po połączeniu z białkami MHC II prezentowane są receptorom CD4 limfocytów T (CD4+). Jednakże detekcja proteazy serynowej - katepsyny G w limfocytach B oraz komórkach dendrytycznych jest ograniczona za względu na konieczność używania dużych ilości lizatów komórkowych. Stosując dostępne handlowo niskocząsteczkowe sondy molekularne do wykrywania aktywnej enzymatycznie katepsyny G niezbędne jest stosowanie około 20 gg lizatu w celu określenia obecności aktywnej katepsyny G.
Dotychczas nie zostały opisane w literaturze pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych według wynalazku, które posiadają właściwości nieodwracalnych i specyficznych inhibitorów proteaz serynowych będących jednocześnie niskocząsteczkowymi sondami molekularnymi, które stosuje się do wykrywania i obrazowania aktywnych enzymatycznie form enzymów tej kl asy. Jako specyficzny marker pozwalający na detekcję kompleksów aktywna proteaza-inhibitor stosuje się biotynę. Opisane dotychczas w publikacjach naukowych sondy należące do tej klasy związków nie uwzględniają obecności/wprowadzenia podstawników w obrębie aromatycznych grup estrowych, przez co ich właściwości inhibitorowe są słabsze niż pochodne będące przedmiotem wynalazku.
Istotą wynalazku są pochodne estrów diarylowych kwasów 1 -aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl.
Sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1 -aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl polega na tym, że fosforyn triarlowy, otrzymany z fenolu zawierającego podstawnik w pozycji para oraz chlorku fosforu (III) w acetonitrylu, poddaje się amidoalkilowaniu przy użyciu karbaminianu benzylu, fosforynu triarlowego oraz aldehydu, takiego jak aldehyd octowy, propionowy, izomasłowy, fenylooctowy, p-nitrobenzoesowy lub izowalerianowy. Następnie prowadzi się syntezę bromowodorków estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, w których odblokowuje się ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz) a w kolejnym etapie poddaje się reakcji z aminokwasem z zablokowaną grupą α-aminową w obecności odczynnika sprzęgającego. Z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy blokującej tert-butoksykarbonylowej (t-Boc) uzyskuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1 -aminoalkanoPL 227 742 B1 fosfonowego, który poddaje się reakcji w obecności odczynnika sprzęgającego w sposób analogiczny do przedstawionego powyżej z kolejnym aminokwasem z zablokowaną grupą α-aminową, biotyną lub jej pochodną.
Korzystnie jako odczynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (HBTU) w obecności N,N'-diizopropyloetyloaminy (DIEA).
Zastosowanie pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogic zny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl do wytwarzania leku będącego inhibitorem proteaz serynowych.
Zastosowanie in vitro pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl, jako niskocząsteczkowych sond molekularnych do wykrywania aktywnych katalitycznie form enzymów.
Zastosowanie diagnostyczne pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oparte jest na nieodwracalnym sposobie ich wiązania z miejscem aktywnym docelowej proteazy, co pozwala na wyeliminowanie wyników pozytywnych, których źródłem są nieaktywne katalitycznie formy enzymów, co obserwuje się przy zastosowaniu przeciwciał. Dodatkową zaletą jest wysoka specyficzność działania wobec proteaz serynowych i brak reakcji z proteazami innych klas np. proteazami cysternowymi. Po związaniu w miejscem aktywnym docelowej proteazy połączenie pochodnych z białkiem nie ulega rozerwaniu podczas gotowania w obecności dodecylosiarczanu sodu oraz β-merkaptoetanolu, dzięki czemu pozwala na obrazowanie kompleksów metodą western blotting. W tym celu, jako czynnika detekcyjnego używa się koniugatów streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Czułość metody pozwala na wykrycie aktywnych form docelowych enzymów w zakresie już od kilku do kilkudziesięciu ng, zarówno w materiale biologicznym takim jak ludzkie komórki krwinek jednojądrzastych krwi obwodowej, PBMC czy hodowli komórek bakteryjnych np. Bacillus subtilis, jak i w oczyszczonych preparatach białkowych w celu potwierdzenia aktywności wyizolowanych enzymów. Co więcej, zdolność detekcji jest wyższa niż przy zastosowaniu specyficznych wobec enzymów przeciwciał oraz jest znacznie tańsza niż metody immunodetekcyjne.
Przedmiot wynalazku przedstawiony jest w przykładach wytwarzania estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych i określeniu ich właściwości inhibitorowych oraz zastosowaniu w detekcji aktywnych enzymatycznie form wybranych proteaz.
P r z y k ł a d 1
Sposób wytwarzania estru di-4-metyltiofenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-2-metylo-propanofosfonowego (Bt-V al-Pro-Val (O-C6H4-4-S,-CH3)2, przedstawionego wzorem 1.
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu tri-4-tiometylofenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,2 g (30 mmol) 4-tiometylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-metylopropanofosfonowego.
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)2-metylo-propanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-tiometylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,1 ml (12 mmol) aldehydu iso-butylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w tempera4
PL 227 742 B1 turze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 1,92 g surowego produktu (36% wagowo). Wzór sumaryczny: C26H30NO5PS2. Masa cząsteczkowa: 531,62 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19.45 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 7.41-6.99 (m, 13H), 5.19-5.06 (m, 3H), 4.65-4.44 (m, 1H), 2.45 (s, 3H, SCH3), 2.44 (s, 3H, SCH3), 1.63-1.50 (m, 3H). Analiza MS m/z 503.10/504.18 (M+H)+. Temperatura topnienia: 103°C.
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-metylo-propanofosfonowego (3,76 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,70 g (95% wagowo) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C18H25BrNO3PS2. Masa cząsteczkowa: 477,02 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 15,87 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-de, ppm): δ 1,14 (dd, J=6,9/11,6; 6H, 2xCH3), 2,35 (m, 1H, CH), 4,1 (m, 1H, CHP), 7,07-7,32 (m, 8H, Ar-H), 8,66 (s, 3H, NH3+). Temperatura topnienia: 147°C.
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,95 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-yloN,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotn ie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,07 g (90% wagowo). Wzór sumaryczny: C28H39O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 594,20 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCh, δ [ppm]): δ 18,59 (s). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCh, ppm): δ 7,24-7,00 (m, 8H), 4,80-4,63 (m, 1H), 4,43-4,27 (m, 1H), 3,52-3,24 (m, 2H), 2,46-2,43 (m, 6H), 2,33-2,06 (m, 2H), 2,03-1,86 (m, 2H), 1,86-1-74 (m, 1H), 1,72-1,59 (m, 1H), 1,44 (s, 9H), 1,15-0,96 (m, 6H). Rf = 0,41 (CHCh:AcOEt; 4:1, v/v).
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego (1,0 g, 1,68 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w p ostaci oleju o masie 0,98 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 produktu TFA*Pro-ValP(OC6H4-4-S-CH3)2 (m=0,98 g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37 g (1,66 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmola) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi
PL 227 742 B1 do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,04 g (90% wagowo). Wzór sumaryczny: C33H48N3O7PS2. Masa cząsteczkowa: 693,85 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 17.94 (s, 47%), 17.56 (s, 53%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCfe, δ [ppm]): δ 7,25-7,04 (m, 8H), 5,28-5,10 (m, 1H), 4,78-4,68 (m, 1H), 4,67-4,45 (m, 1H), 4,35-4,20 (m, 1H), 3,84-3.43 (m, 2H), 2,49-2.43 (m, 6H), 2,43-1,76 (m, 7H,), 1,49-1,36 (m, 9H), 1,15-0,82 (m, 12H). Rf = 0,21 (CHCfe: AcOEt; 4:1, v/v).
Etap 7. Usunięcie grupy t-butoksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego (1,0 g, 1,44 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzys kany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,94 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biot ynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt (TFA*Val-Pro-ValP(OC6H4-4-S,-CH3)2 (0,94 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluoroctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,54 g, (38% wagowo). Wzór sumaryczny: C38H54N5O7PS3. Masa cząsteczkowa: 820,03 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 23,44 min. Analiza HRMS m/z 842,2820/842,2745 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 2
Sposób wytwarzania estru difenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-2-metylopropanofosfonowego, (Bt-Val-Pro-ValP(O-C6H5)2, przedstawionego wzorem 2.
Etap 1. Otrzymywanie estru difenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-metylopropanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne zawierającej fosforyn trifenylowy (3,10 g, 10 mmol) dodaje się karbaminian benzylu (1,51 g, 10 mmol) i 1,1 ml (10,5 mmola) aldehydu iso-butylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 4 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej, a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,11 g surowego produktu (48% wagowo). Wzór sumaryczny: C24H26NO5P. Masa cząsteczkowa: 439,44 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 17,81 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCfe, ppm): δ 1,11 (d, J=6,8 Hz, 6H), 4,41-4,47 (m, 1H), 4,72 (s, 1H), 5,13 (d, J=10,6 Hz, 1H), 5,27 (d, J=4,1 Hz, 2H), 7,06-7,40 (m, 15H). Temperatura topnienia: 107°C.
Etap 2. Otrzymywanie bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru difenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-metylo-propanofosfonowego (4,55 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
PL 227 742 B1
Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,34 g (76% wagowo) bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C16H21BrNO3P. Masa cząsteczkowa: 386,22 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w DMSO-cfe δ [ppm]): δ 14,74 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 1,20 (dd, J=7,0/22,9 Hz, 6H), 2,39-2,49 (m, 1H), 4,15 (dd, J=4,8/15,4 Hz, 1H), 7,05-7,46 (m, 10H), 8,74 (s, 3H, NH3+). Temperatura topnienia: 171°C.
Etap 3. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,77g (2 mmol) bromowodorku estru difenylowego kwasu
1- amino-2-metylo-propanofosfonowego otrzymanego w Etapie 2 i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne ro zpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,95 g (95% wagowo). Wzór sumaryczny: C26H35O6N2P. Masa cząsteczkowa: 502,54 g/mol. Widmo P NMR (121 MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 17,45 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 7,36-7,08 (m, 10H), 4,84-4,63 (m, 1H), 4,45-4,26 (m, 1H), 3,57-3,23 (m, 2H), 2,53-2,33 (m, 2H), 2,31-2,04 (m, 2H), 1,98-1,87 (m, 1H), 1,83-1,64 (m, 1H), 1,45 (s, 9H), 1,16-0,98 (m, 6H). Rf = 0,56 (CHCfeAcOEt; 4:1, v/v).
Etap 4. Usunięcie grupy t-Boc z dipeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru difenylowego kwasu 1 -amino2- metylo-propanofosfonowego (2,05 g, 2 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 1,88 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Etap 5. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 4 produktu TFA*Pro-ValP(OC6H5)2 (0,83 g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37 g (1,66 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmola) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-yloW,W,W',W'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę oct anową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,92 g (92% wagowo). Wzór sumaryczny: C31H44N3O7P. Masa cząsteczkowa: 601,67 g/mol. Widmo 31P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 17,40 (s, 46%), 17,07 (s, 54%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): 7,32-7,09 (m, 10H), 5,39-5,15 (m, 1H), 4,82-4,70 (m, 1H), 4,70-4,45 (m, 1H), 4,34-4,18 (m, 1H), 3,84-3,41 (m, 2H), 2,50-1,75 (m, 7H), 1,48-1,38 (m, 9H), 1,15-0,81 (m, 12H). HRMS m/z 624,2815/624,2795 (M+Na+). Rf = 0,19 (CHCfeAcOEt; 4:1, v/v).
PL 227 742 B1
Etap 6. Usunięcie grupy t-Boc z tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 5 pochodną tripeptydową estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego (1,0 g, 1,66 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,88 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylopropanofosfonowego.
Etap 7. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu
1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Powstały w Etapie 6 produkt (TFA*Val-Pro-ValP(OC6H5)2 (0,82 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,29 g, (29% wagowo). Wzór sumaryczny: C36H50N5O7PS. Masa cząsteczkowa: 727,85 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 18,81 min. Analiza HRMS m/z 750,3066/750,1553 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 3
Sposób wytwarzania estru difenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego, (Bt-V al-Pro-PheP(O-C6H5)2, przedstawionego wzorem 3.
Etap 1. Otrzymywanie estru difenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się fosf oryn trifenylowy (3,1 g, 10 mmol), 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,45 g (12 mmol) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość ro zpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,73 g surowego produktu (56% wagowo). Wzór sumaryczny: C28H26NO5P. Masa cząsteczkowa: 487,48 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 18,46 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCh, ppm): δ 2,98-3,48 (m, 2H), 4,82-4,85 (m, 1H), 4,88 (s, 2H), 5,15 (d, J=10,17 Hz, 1H), 7,06-7,29 (m, 20H). Temperatura topnienia: 124,5-125,5°C.
Etap 2. Otrzymywanie bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru difenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego (4,10 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,67 g (94% wagowo) bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C20H21BrNO3P. Masa cząsteczkowa: 434,26 g/mol. Widmo P NMR (121 MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 15,31 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, ppm): δ 2,48-2,49 (m, 2H), 4,50-4,55 (m, 1H), 7,04-7,41 (m, 15H), 8,78 (s, 3H).
Etap 3. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,86 g (2 mmol) bromowodorku estru difenylowego kwasu
1-amino-2-fenyloetanofosfonowego otrzymanego w Etapie 2 i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol).
PL 227 742 B1
Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazo\-1-y\o-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent ch\oroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,70 g (64% wagowo). Wzór
Od sumaryczny: Ο30Η35Ο6Ν2Ρ. Masa cząsteczkowa: 550,58 g/mol. Widmo P NMR (121 MHz, roztwór w CDC\3, δ [ppm]): δ 18,56 (s, 49%), 18.29 (s, 51%). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCh, ppm): δ 1,22-1,25 (m, 6H), 1,36-1,98 (m, 6H, 3xCH2), 3.41-3.43 (m, 3H, CH2, CH), 4.19-4.21 (m, 1H, NH), 5.18-5.19 (m, 1H, CHP), 7.04-7.67 (m. 15H, aromat.).
Etap 4. Usunięcie grupy t-Boc z dipeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru difenylowego kwasu 1-amino2-fenyloetanofosfonowego (0,92 g, 1,68 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o m asie 0,69 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-feny\oetanofosfonowego.
Etap 5. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 4 produktu TFA*Pro-Phe (OC6H5)2 (0,91 g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37g (1,66 mmo\) Boc-Va\-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmol) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmo\) heksaf\uorofosforanu O-benzotriazo\-1-y\o-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczys zcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako e\uent ch\oroform/octan ety\u w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,25 g (23% wagowo). Wzór sum aOd ryczny: C35H44N3O7P. Masa cząsteczkowa: 649,71 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 17,35 (s). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): δ 0,68-0,72 (m, 6H), 1,20 (s, 9H), 1,50-1,79 (m, 6H), 2,832,86 (m, 1H), 3,14-3,39 (m, 3H), 3,99-4,02 (m, 1H), 5,04-5,06 (m, 1H), 5,16 (s, 1H), 6,87-7,07 (m, 15H).
Etap 6. Usunięcie grupy t-butoksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 5 pochodną tripeptydową estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego (0,96 g, 1,48 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trif\uoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. N astępnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej ro zpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,77 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru difeny\owego kwasu 1-amino-2-feny\oetanofosfonowego.
Etap 7. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu
1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Powstały w Etapie 6 produkt (TFA*Val-Pro-PheP(OC6H5)2 (0,88 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 m\ NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do miePL 227 742 B1 szaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,42 g, (36% wagowo). Wzór sumaryczny: C40H50N5O7PS. Masa cząsteczkowa: 775,89 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 26,36 min. Analiza HRMS m/z 776,3247/776,1211 (M+H)+.
P r z y k ł a d 4
Sposób wytwarzania estru di-4-metyltiofenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)etanofosfonowego (Bt-Yal-Pro-Ala (O-C6H4-4-S-CH3)2, przedstawionego wzorem 4.
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu tri-4-tiometylofenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,2 g (30 mmol) 4-tiometylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-etanofosfonowego.
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)etanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-tiometylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,11 ml (20 mmol) aldehydu octowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 3,07 g surowego produktu (61% wagowo). Wzór sum aryczny: C24H26NO5PS2. Masa cząsteczkowa: 503,57 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,48 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 1,17-1,22 (d, J=9,0 Hz, 3H), 2,45 (s, 6H), 4,49-4,63 (dd, J=9,0/15,0 Hz ,1H), 5,08-5,17 (m, 3H), 6,99-7,35 (m, 13H). Temperatura topnienia: 103°C. Współczynnik Rf = 0,65 (CHCl3:AcOEt, 4:1, v/v).
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-etanofosfonowego (3,97 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,70 g (95% wagowo) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C16H21BrNO3PS2. Masa cząsteczkowa: 450,35 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 16,85 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, ppm): δ 1,49-1,59 (m, 3H), 2,48 (s, 6H), 4,21-4,30 (m, 1H), 7,14-7,32 (m, 8H), 8,76 (s, 3H). Temperatura topnienia: 176°C. Współczynnik Rf = 0,31 (CHCl3:AcOEt, 4:1, v/v).
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,90 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,W',W'-tetrametylouroniowego.
Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu.
PL 227 742 B1
Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,88 g (78% wagowo). Wzór
Od sumaryczny: C26H35O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 566,67 g/mol. Widmo P NMR (121MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,61 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 1,19-1,24 (d, J=15,0 Hz, 3H), 1,40 (s, 9H), 1,46-1,89 (m, 5H), 2,00 (s, 6H), 3,31-3,40 (m, 2H), 4,28-4,31 (d, J=6,0 Hz, 1H), 4,80-4,82 (dd, J=2,7/3,9 Hz, 1H), 6,98-7,21 (m, 8H). Współczynnik Rf = 0,22 (CHCh:AcOEt, 4:1, v/v).
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego (0,95 g, 1,68 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,75 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 produktu TFA*Pro-AlaP(OC6H4-4-S-CH3)2 (0,93g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37 g (1,66 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmol) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluor ofosforanu O-benzotriazol-1-yloW,W,W',W'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,82 g (74% wagowo). Wzór
Od sumaryczny: C31H44N3O7PS2. Masa cząsteczkowa: 665,80 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,30 (s, 55%), 19,74 (s, 45%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): δ 0,81-1,12 (m, 10H), 1,43 (s, 9H), 1,50-1,57 (m, 2H), 1,75-2,05 (m, 3H), 2,44 (s, 6H), 3,45-3,79 (m, 2H), 4,19-4,32 (m, 1H), 4,33-4,52 (m, 1H), 4,71-4,88 (m, 1H), 5,10-5,27 (m, 1H), 6,98-7,21 (m, 8H). Współczynnik Rf = 0,18 (CHCl3:AcOEt, 1:1, v/v).
Etap 7. Usunięcie grupy t-butoksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymana w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego (0,96 g, 1,44 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,81 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt (TFA*Val-Pro-AlaP(OC6H4-4-S,-CH3)2 (0,90 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (W-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-yloW,W,W',W-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie
PL 227 742 B1 produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układ zie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,42 g, (39% wagowo). Wzór sumaryczny: C36H50N5O7PS3. Masa cząsteczkowa: 791,98 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 19,62 min. Analiza HRMS m/z 814,2508/814,2501 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 5
Sposób wytwarzania estru di-4-O-metylofenylowego kwasu W-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego, (Bt-Val-Pro-LeuP(O-C6H4-4-O-CH3)2, przedstawionego wzorem 5.
Etap 1, Otrzymywanie fosforynu tri-4-metoksyfenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 3,72 g (30 mmol) 4-metoksylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez 4 godziny w temperaturze wrzenia.
Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-metoksyfenylowego kwasu W-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego.
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metoksyfenylów ego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)3-metylo-butanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-metoksyfenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,30 ml (12 mmol) aldehydu izowalerianowego (3-metylo-butylowego). Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,41 g surowego produktu (47% wagowo). Wzór sumaryczny: C27H32NO7P. Masa cząsteczkowa: 513,52 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCh, δ [ppm]): δ 19.51 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 7.43-6.70 (m, 13H), 5.25-5.06 (m, 3H), 4.63-4.45 (m, 1H), 3.77 (s, 3H), 3.75 (s, 3H), 1.90-1.67 (m, 3H), 0.97 (d, J=5.7 Hz). Analiza MS m/z 514,19/514,20 (M+H)+. Temperatura topnienia: 116-118°C.
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,34 g estru di-4-metoksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-3-metylo-butanofosfonowego (4,55 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,84 g (88% wagowo) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C19H27BrNO5P. Masa cząsteczkowa: 460,30 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 13,70 (s). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 0,93-0,97 (m, 6H), 1,92-2,20 (m, 3H), 3,66 (d, J=3.5 Hz, 6H), 4.01 (t, J=5.6 Hz, 1H), 6,62-7,37 (m, 8H), 8,97 (s, 3H). Temperatura topnienia: 159°C.
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,92 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-butanofosfonowego otrzymanego w Etapie 2 i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe
PL 227 742 B1 suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,04 g (90% wagowo). Wzór sumaryczny: C29H41O8N2P. Masa cząsteczkowa: 576,62 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,00 (s). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 0,85-0,90 (m, 6H), 1,37 (s, 9H), 1,65-1,90 (m, 7H), 3,50-3,55 (m, 2H), 3,60 (d, J=3,5 Hz, 6H), 4,30-4,34 (m, 1H), 5,20-5,25 (m, 1H), 6,72-7,19 (m, 8H). Temperatura topnienia: 96°C.
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego (0,97 g, 1,68 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,84 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 produktu TFA*Pro-LeuP(OC6H4-4-O-CH3)2 (0,95 g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37g (1,66 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmol) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,84 g (75% wagowo). Wzór sumaryczny: C34H50N3O9P. Masa cząsteczkowa: 675,75 g/mol. Widmo 31P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,83 (s, 55%), 19,55 (s, 45%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 0,92-0,98 (m, 12H), 1,36 (s, 9H), 1,60-2,10 (m, 8H), 3,62-3,68 (m, 2H), 3,69 (s, 6H), 4,22-4,25 (m, 1H), 4,44-4,47 (m, 1H), 4,59-4,81 (m, 1H), 5,28 (d, J=9,3 Hz, 1H), 6,70-7,19 (m, 4H). Temperatura topnienia: 62°C. HRMS m/z 698,3182/698,3039 (M+Na)+.
Etap 7. Usunięcie grupy t-butoksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4-metoksy fenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego (1,0 g, 1,48 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,92 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-metoksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt (TFA*Val-Pro-LeuP(OC6H4-4-O-CH3)2 (0,92 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluoroctowego stosując kolumnę C-18.
PL 227 742 B1
Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,30 g, (28% wagowo). Wzór sumaryczny: C39H56N5O9PS. Masa cząsteczkowa: 801,93 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 26,22 min. Analiza HRMS m/z 824,3434/824,1826 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 6
Sposób wytwarzania estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego, (Bt-V al-Pro-Phe (O-C6H4-4-S-CH3)2, przedstawionego wzorem 6.
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu tri-4-tiometylofenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,2 g (30 mmol) 4-tiometylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego.
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)2-fenyloetanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-tiometylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,45 g (12 mmol) aldehydu fenylooctowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,37 g surowego produktu (41% wagooh wo). Wzór sumaryczny: C30H30NO5PS2. Masa cząsteczkowa: 579,67 g/mol. Widmo P NMR (121MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 18,98 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 2,40 (d, J=6.5 Hz, 6H), 2,90-3,36 (m, 2H), 4,70-4,79 (m, 1H), 4,93 (s, 2H), 5,07 (d, J=10.9 Hz, 1H), 6,69-7,28 (m, 18H). Temperatura topnienia: 97-99°C.
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego (3,45 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzym uje się 1,63 g (90% wagowo) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C22H25BrNO3PS2. Masa cząsteczkowa: 526,45 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 15.55 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-de, ppm): δ 2,35 (d, J=7,4 Hz, 6H), 3,23-3,28 (m, 2H), 4,44-4,48 (m, 1H), 6,90-7,36 (m, 13H), 8,76 (s, 3H).
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 1,05 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego otrzymanego w Etapie 3 i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1 -ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu.
Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w sto14
PL 227 742 B1 sunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,91 g (71% wagowo). Wzór sumaryczny: C32H39O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 642,77 g/mol. Widmo P NMR (121 MHz, roztwór w CDCl3 δ [ppm]): δ 18,24 (s), 18,16 (s). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 1.40 (s, 9H), 1,65-1,90 (m, 4H), 2,35 (s, 6H), 3,40-3,54 (m, 4H), 4,124,15 (m, 1H), 5,00-5,10 (m, 1H), 5,19 (s, 1H), 6,94-7,18 (m, 13H). Temperatura topnienia: 49-52°C.
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego (1,08 g, 1,68 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w p ostaci oleju o masie 0,92 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 produktu TFA*Pro-PheP(OC6H4-4-S-CH3)2 (1,06 g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37 g (1,66 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmol) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1 -ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,93 g (76% wagowo). Wzór sumaryczny: C37H48N3O7PS2. Masa cząsteczkowa: 741,90 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 18,30 (s, 55%), 18.26 (s, 45%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): δ 0,88-0,92 (m, 6H), 1,37 (s, 9H), 1,65-1,80 (m, 5H), 2,35-2,40 (m, 6H), 3,15-3,17 (m, 2H), 3,50-3,55 (m, 2H), 4,99 (s, 1H), 4,16-4,18 (m, 1H), 5,11-5,13 (m, 1H), 5,16 (s, 1H), 6,79-7,01 (m, 8H). HRMS m/z 764,2569/764.2250 (M+Na)+.
Etap 7. Usunięcie grupy t-butoksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego (1,1 g, 1,48 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,83 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt (TFA*Val-Pro-PheP(OC6H4-4-S-CH3)2 (1,00 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (W-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N’,N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,42 g, (36% wagowo). Wzór sumaryczny: C42H54N5O7PS3. Masa cząsteczkowa: 868,08 g/mol. Czas retencji
PL 227 742 B1 (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 22,58 min. Analiza HRMS m/z 890,2820/890,2310 (M+H)+.
P r z y k ł a d 7
Sposób wytwarzania estru difenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego (Bt-Val-Pro-Leu (O-C6H5)2, przedstawionego wzorem 7.
Etapl. Otrzymywanie estru difenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne zawierającej fosforyn trifen ylowy (3,10 g, 10 mmol) dodaje się karbaminian benzylu (1,51 g, 10 mmol) i 1,1 ml (10,5 mmola) aldehydu iso-pentylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 4 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej, a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,45 g surowego produktu (54% wagowo). Wzór sumaryczny: C25H28NO5P. Masa cząsteczkowa: 453,17 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,82 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 0,91 (d, J=5,6 Hz, 6H), 1,62-1,81 (m, 3H), 4,45-4,58 (m, 1H), 4,93 (d, J=10,4 Hz, 1H), 5,02 (d, J=12,2 Hz, 2H), 5,09 (d, J=12,2 Hz, 2H), 7,01-7,27 (m, 15H).
Etap 2. Otrzymywanie bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru difenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-metylo-butanofosfonowego (4,41 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,46 g (83% wagowo) bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C17H23BrNO3P. Masa cząsteczkowa: 399,06 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 15,61 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 0,90-0,94 (m, 6H), 1,79-1,84 (m, 3H), 4,32-4,35 (m, 1H), 7,37-8,02 (m, 10H), 8,73 (s, 3H).
Etap 3. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,80 g (2 mmol) bromowodorku estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-butanofosfonowego otrzymanego w Etapie 2 i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trz ykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne ro zpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,93 g (90% wagowo). Wzór sumaryczny: C27H37O6N2P. Masa cząsteczkowa: 516,24 g/mol. Widmo P NMR (121MHz, roztwór w CDCfe, δ [ppm]): δ 18,78 (s), 18,79 (s). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 0,89 (d, J=3.6, 6H), 1,36 (s, 9H), 1,36-1,79 (m, 6H), 2,73-2,78 (m, 3H), 3,27-3,33 (m, 1H), 4,24-4,26 (m, 1H), 4,87 (d, J=5.9 Hz, 1H), 6,97-7,28 (m, 10H).
Etap 4. Usunięcie grupy t-Boc z dipeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego (0,83 g, 1,6 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie
PL 227 742 B1 i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o m asie 0,81 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Etap 5. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
P
Do powstałego w Etapie 4 produktu TFA*Pro-Leu (OC6H5)2 (0,81 g; 1,51 mmol) dodaje się 0,33 g (1,51 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,52 ml (3,76 mmola) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,63 g (1,66 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczys zcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,86 g (93% wagowo). Wzór sum aOd ryczny: C32H46N3O7P. Masa cząsteczkowa: 615,31 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): 18.63 (s, 40%), 18.84 (s, 60%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCh, δ [ppm]): 0,83-0,97 (m, 12H), 1,26-1,28 (m, 2H), 1,44 (s, 9H), 1,80-1,85 (m, 1H), 1,90-2,00 (m, 2H), 2,10-2,20 (m, 2H), 3,69-3,73 (m, 2H), 4,18-4,20 (m, 1H), 4,40-4,56 (m, 1H), 4,85-4,92 (m, 1H), 5,29 (s, 1H), 6,81-7,42 (m, 10H); HRMS m/z 638.2971/638.2974 (M+Na)+.
Etap 6. Usunięcie grupy t-Boc z tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 5 pochodną tripeptydową estru difenylowego kwasu 1-amino-2-metylo-propanofosfonowego (0,80 g, 1,30 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,79 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Etap 7. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
P
Powstały w Etapie 6 produkt TFA*Val-Pro-Leu (OC6H5)2 (0,79 g, 1,26 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,31 g, 1,26 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,54 ml (3,15 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,53 g (1,39 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,29 g, (29% wagowo). Wzór sumaryczny: C37H52N5O7PS. Masa cząsteczkowa: 741,33 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 19,80 min. Analiza HRMS m/z 764,3223/764,3000 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 8
Sposób wytwarzania estru di-4-metyltiofenylowego kwasu N-(prolilobiotynylo-1-amino)-3-meP tylo-butanofosfonowego (Bt-Pro-Leu (O-C6H4-4-S-CH3)2, przedstawionego wzorem 8.
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu tri-4-tiometylofenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,2 g (30 mmol) 4-tiometylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-3-metylo-butanofosfonowego.
PL 227 742 B1
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-l-amino)3-metylo-butanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-tiometylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,3 ml (12 mmol) aldehydu iso-pentylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,35 g surowego produktu (43% wagowo). Wzór sumaryczny: C27H32NO5PS2. Masa cząsteczkowa: 545,65 g/mol. Widmo P NMR (121MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 20,37 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCl3, ppm): δ 0,98 (d, J=5,8 Hz, 6H), 1,61-2,16 (m, 3H), 2,47 (s, 6H), 4,61-4,63 (m, 1H), 5,06-5,17 (m, 2H), 5,18 (s, 1H), 6,90-7,30 (m, 13H).
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-3-metylo-butanofosfonowego (3,67 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,63 g (90% wagowo) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C19H27BrNO3PS2. Masa cząsteczkowa: 492,43 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 15,55 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, ppm): δ 0,92-1,11 (m, 6H), 1,15-2,01 (m, 3H), 2,35 (s, 6H), 4,44-4,46 (m, 1H), 6,90-7,36 (m 8H), 8,76 (s, 3H).
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,98 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,W,W'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składn iki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,12 g (92% wagowo). Wzór sumaryczny: C29H41O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 608,75 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 19,00 (s, 43%), 18,83 (s, 57%). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 0,85-0,87 (m, 6H), 1,37 (s, 9H), 1,65-1,90 (m, 7H), 3,50-3,52 (m, 2H), 3,51 (s, 6H), 4,30-4,35 (m, 1H), 5,20-5,21 (m, 1H), 6,72-7,19 (m, 8H).
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego (1,0 g, 1,64 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w p ostaci oleju o masie 0,99 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
PL 227 742 B1
Etap 6. Otrzymywanie biotynylowanej dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Powstały w Etapie 5 produkt TFA* Pro-LeuP(OC6H4-4-S-CH3)2 (0,96 g, 1,33 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,32 g, 1,33 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,58 ml (3,33 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,55 g (1,46 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,21 g, (21% wagowo). Wzór sumaryczny: C34H47N4O6PS3. Masa cząsteczkowa: 734,24 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 21,13 min. Analiza HRMS m/z 757,2293-757,2303 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 9
Sposób wytwarzania estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynyloP
-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego (Bt-Val-Pro-LeuP(O-C6H4-4-COOCH3)2, przedstawionego wzorem 9.
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu tri-4-metylokarboksyfenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,56 g (30 mmol) 4-metylokarboksyfenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na w yparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego.
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-metylokarboksyfenylowego powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,30 ml (12 mmol) aldehydu izowalerianowego (3-metylo-butylowego). Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 2,45 g surowego produktu (43% wagowo). Wzór sumaryczn y: C29H32NO9P. Masa cząsteczkowa: 569,54 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 19.53 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 0,90 (d, J=5.7 Hz, 6H), 1,79-1,82 (m, 3H), 3,82 (s, 6H), 4,52-4,61 (m, 1H), 5,01-5,16 (m, 3H), 6,92-7,93 (m, 13H). Temperatura topnienia: 87°C.
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonylo-1-amino)-3-metylobutanofosfonowego (3,51 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny.
Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzym uje się 1,60 g (88% wagowo) bromowodorku estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C21H27BrNO7P. Masa cząsteczkowa: 516,32 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 16,42 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, ppm): δ 0,91-0,96 (m, 6H), 1,81-1,85 (m, 3H), 3,80 (s, 6H), 4,30-4,33 (m, 1H), 7,36-8,03 (m, 8H), 8,77 (s, 3H).
PL 227 742 B1
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu
1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 1,03 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N, N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trz ykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne ro zpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,78 g (62% wagowo). Wzór sumaryczny: C31H41O10N2P. Masa cząsteczkowa: 632,64 g/mol. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 19,62 (s). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 0,81-0,85 (m, 6H), 1,31 (s, 9H), 1,66-2,21 (m, 7H), 3,26-3,30 (m, 2H), 3,76 (s, 6H), 4,17-4,19 (m, 1H), 4,78-4,80 (m, 1H), 7,27-7,75 (m, 8H).
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminoetanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego (1,06 g, 1,68 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,86 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutano-fosfonowego.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 produktu TFA*Pro-LeuP(OC6H4-4-COOCH3)2 (1,05 g; 1,66 mmol) dodaje się 0,37g (1,66 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,55 ml (4,15 mmol) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,84 g (69% wagowo). Wzór sumaryczny: C36H50N3O11P. Masa cząsteczkowa: 731,77 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 19,83 (s, 43%), 19,55 (s, 57%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 0,92-0,95 (m, 12H), 1,36 (s, 9H), 1,60-2,10 (m, 8H), 3,62-3,68 (m, 2H), 3,79 (s, 6H), 4,22-4,25 (m, 1H), 4,44-4,48 (m, 1H), 4,59-5,00 (m, 1H), 5,28 (d, J=9.3 Hz), 6,70-7,19 (m, 8H).
Etap 7. Usunięcie grupy t-butoksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego (1,05 g, 1,44 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,93 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
PL 227 742 B1
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-metylokarboksyfenylowego kwasu 1-amino-3-metylobutanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt (TFA*Val-Pro-LeuP(OC6H4-4-COOCH3)2 (0,99 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,36 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 0,57 g (1,50 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,54 g, (46% wagowo). Wzór sumaryczny: C36H50N5O7PS3. Masa cząsteczkowa: 791,98 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna. Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 26,49 min. Analiza HRMS m/z 880,3359/880,3408 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 10
Sposób wytwarzania estru difenylowego kwasu N-(prolilowalilobursztynylopentylo-aminobiotynylo-1-amino)-2-fenyloetanofosfonowego, (Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phe (O-C6H5)2, przedstawionego wzorem 10. W celu otrzymania tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego wykonuje się Etapy 1-6 opisane w Przykładzie 3.
Etap 7. Otrzymywanie bursztynylowej tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
Powstały w Etapie 1 produkt (TFA*Val-Pro-PheP(OC6H5)2 (0,88 g, 1,36 mmol) rozpuszcza się w octanie etylu (50 ml) i dodaje bezwodnik bursztynowy (1,5 g, 1,50 mmol). Po 5 minutach do mieszaniny reakcyjnej dodaje się diizopropyloetyloaminę w ilości 0,48 ml (3,44 mmol). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej od 12 do 24 godzin a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 100 ml octanu etylu, a następnie przemywa dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcję organiczną suszy się nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego lotne składniki mieszaniny odparowuje się na wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się docelowy produkt w ilości 0,80 g, (91% wagowo). Wzór sumaryczny: C34H40N3O8P. Masa cząsteczkowa: 649,67 g/mol. Analiza HRMS m/z 672,2451/672,1422 (M+Na)+. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 25,71 min. Widmo 31P NMR (121MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 18,53 (s, 50%), 17,48 (s, 50%); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 0,86-0,94 (m, 6H), 1,11-1,39 (m, 2H), 1,40-1,45 (m, 1H), 1,51-2,0 (m, 3H), 2,51-2,61 (m, 4H), 2,98-3,06 (m, 1H), 3,38-3,51 (m, 2H), 3,71-3,84 (m, 1H) 4,46-4.50 (m, 1H), 5,13-5,14 (m, 1H), 7,03-7,36 (m, 15H), 7,50 (d, J=2,1 Hz, 1H), 7,88 (d, J=9,0 Hz, 1H).
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej bursztynylowej tripeptydowej pochodnej estru difenylowego kwasu 1-amino-2-fenyloetanofosfonowego.
P
Powstały w Etapie 2 produkt (Suc-Val-Pro-Phe (OC6H5)2 (88,5 mg, 0,136 mmol) rozpuszcza się w 2 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynylopentyloaminy (Bt-LC-NH2 (44,5 mg, 0,136 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 48 gl (0,344 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 57 mg (0,15 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 27,4 mg, (21% wagowo). Wzór sumaryczny: C49H66N7O9PS. Masa cząsteczkowa: 960,13 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 19,80 min. Analiza HRMS m/z 960,4459/960,4481 (M+H)+.
P r z y k ł a d 11
Sposób wytwarzania estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylopentyloaminobiotynylo)-1-amino-1-[(4-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego (Bt-LC-Suc-PheP
-Val-Thr-(4-Gu)Phg (O-C6H4-4-S,-CH3)2, przedstawionego wzorem 11.
Etap 1. Otrzymywanie monoestru t-butylowego kwasu bursztynowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się kolejno bezwodnik bursztynowy (3,00 g, 30 mmol),
N-hydroksybursztynimid (1,00 g, 9 mmol) oraz dimetylopirydynę (0,35 g, 2,86 mmol) i rozpuszcza
PL 227 742 B1 w toluenie (50 ml). Następnie dodaje się alkohol tert-butylowy (5 ml) oraz trietyloaminę (1,25 ml, 9 mmol). Całość ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez 24 godziny. Po schłodzeniu do mieszaniny poreakcyjnej dodaje się octan etylu (50 ml) i przemywa kolejno 5% kwasem cytrynowym w wodzie, solanką. Frakcję organiczną suszy się nad bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników na wyparce rotacyjnej otrzymuje się brązowy olej, który rozpuszcza się w mieszaninie eteru dietylowego/heksanu (1/3, v/v) i pozostawia do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Otrzymuje się produkt w ilości 3.65 g (70% wagowo). Wzór sumaryczny: C8H14O4. Masa cząsteczkowa: 174,19 g/mol. Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 1,44 (s, 9H), 2,51-2,68 (m, 4H).
Etap 2. Otrzymywanie peptydu tBu-Suc-Phe-Val-Thr(O-tBu)-OH
Syntezę peptydu tBu-Suc-Phe-Val-Thr(O-tBu)-OH przeprowadza się metodą syntezy na podłożu stałym. W tym celu do kartridża reakcyjnego odważa się żywicę chlorotrytylową (1,00 g, 0,92 mmol) zawierającą przyłączoną resztę treoniny, w której reszta hydroksylowa zablokowana jest grupą tertbutylową, a grupa aminowa jest wolna. Żywicę przemywa się kolejno dichlorometanem (3 razy), mieszaniną dimetyloformamid:dichlorometan (1/1, v/v; 3 razy) oraz dimetyloformamidem (3 razy). Do przygotowanej żywicy dodaje się Fmoc-Val-OH (0,94 g, 2,76 mmol) i dodaje się dimetyloformamid (2 ml). Po upływie 5 minut do mieszaniny dodaje się PyBOP (1,44 g, 2,76 mmol). Po upływie dwóch minut do mieszaniny reakcyjnej dodaje się diizopropyloetyloaminę (1,2 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny a jej przebieg monitoruje się przy użyciu testu ninh ydrynowego. Następnie całość przemywa się dziesięciokrotnie dimetyloformamidem. Następnie do ziaren żywicy dodaje się 20% roztwór piperydyny w dimetyloformamidzie w celu usunięcia grupy Fmoc i reakcję prowadzi się trzy minuty. Po usunięciu rozpuszczalników ponownie dodaje się świeży roztwór 20% piperydyny w DMF i reakcję prowadzi się trzy minuty. Po usunięciu rozpuszczalników ponownie dodaje się świeży roztwór 20% piperydyny w DMF i reakcję prowadzi się 20 minut. Następnie całość przemywa się dziesięciokrotnie dimetyloformamidem. Do tak przygotowanej żywicy dodaje się FmocPhe-OH (1,07 g, 2,76 mmol) i dodaje się dimetyloformamid (2 ml). Po upływie 5 minut do mieszaniny dodaje się PyBOP (1,44 g, 2,76 mmol). Po upływie dwóch minut do mieszaniny reakcyjnej dodaje się diizopropyloetyloaminę (1,2 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny a jej przebieg monitoruje się przy użyciu testu ninhydrynowego. Następnie całość przemywa się dziesięciokrotnie dimetyloformamidem. Następnie do ziaren żywicy dodaje się 20% roztwór piperydyny w dimetyloformamidzie w celu usunięcia grupy Fmoc i reakcję prowadzi się trzy minuty. Po usunięciu rozpuszczalników ponownie dodaje się świeży roztwór 20% piperydyny w DMF i reakcję prowadzi się trzy minuty. Po usunięciu rozpuszczalników ponownie dodaje się świeży roztwór 20% piperydyny w DMF i reakcję prowadzi się 20 minut. Następnie całość przemywa się dziesięciokrotnie dimetyloformamidem. Do przygotowanej żywicy dodaje się przygotowany w Etapie 1 monoester t-butylowy kwasu bursztynowego (0,48 g, 2,76 mmol) i dodaje się dimetyloformamid (2 ml). Po upływie 5 minut do mieszaniny dodaje się PyBOP (1,44 g, 2,76 mmol). Po upływie dwóch minut do mieszaniny reakcyjnej dodaje się diizopropyloetyloaminę (1,2 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez około 2 godziny a jej przebieg monitoruje się przy użyciu testu ninhydrynowego. Następnie całość przemywa się kolejno: dziesięciokrotnie dimetyloformamidem, 5 razy dichlorometanem, 5 razy metanolem i 5 razy heksanem. Całość suszy się w eksykatorze nad stałym P2O5 przez 48 godzin. W celu usunięcia peptydu z nośnika do żywicy dodaje się 30% trifluoroetanolu w dichlorometanie (20 ml) i reakcję prowadzi się 2 godziny w temperaturze pokojowej. Roztwór zawierający produkt przesącza się bezpośrednio z kartridża do kolby okrągłodennej i usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem. Otrzymuje się 0,47 g produktu (88% wagowo) w postaci żółto-pomarańczowego oleju. Wzór sumaryczny: C30H47N3O8. Masa cząsteczkowa: 577,71 g/mol. Analiza HRMS m/z 600,3261/600,2151 (M+Na)+.
Etap 3. Otrzymywanie fosforynu tri-4-tiometylofenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,2 g (30 mmol) 4-tiometylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-2-metylo-propanofosfonowego.
PL 227 742 B1
Etap 4. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)1-[(4-nitro)fenylo]-metanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-tiometylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,51 (10 mmol) p-nitrobenzaldehydu. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90° C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 3,90 g surowego produktu (64% wagowo). Wzór sum aryczny: C29H27N2O7PS2. Masa cząsteczkowa: 610,64 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 13,66 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 5,01-5,17 (m, 2H), 5,65 (dd, J=9,0/23,4 Hz, 1H), 6,13 (dd, J=5,7/8,8 Hz, 1H), 6,91-8,19 (m, 19H). Temperatura topnienia: 160-161°C.
Etap 5. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymany w Etapie 4 ester di-4-tiometylofenylowy kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-1-[(4-nitro)fenylo]-metanofosfonowy w ilości 1,83 g (3 mmol) i rozpuszcza się go w octanie etylu (60 ml). Następnie dodaje się SnCl2 (3,30 g, 17,4 mmol) oraz wodę (1,08 ml, 60 mmol). Całość ogrzewa się w temperaturze wrzenia przez 48 godzin a przebieg reakcji monitoruje się przy użyciu chromatografii cienkowarstwowej. Do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 250 ml octanu etylu i roztwór przenosi się do rozdzielacza. Następnie dodaje się wodny roztwór wodorotlenku sodu (1 N) aż pH roztworu osiągnie 7-8. Całość sączy się przez warstwę Celitu, oddziela frakcję organiczną i przemywa trzykrotnie solanką. Po wysuszeniu frakcji organicznej nad bezwodnym siarczanem magnezu usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej i otrzymuje produkt w ilości 1,74 g (99% wagowo). Wzór sumaryczny: C29H29N5O5PS2. Masa cząsteczkowa: 580,65 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCh, δ [ppm]): δ 17,38 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 4,98 (d, J=12,5 Hz, 1H), 5,06 (d, J=12,4 Hz, 1H), 5,13 (s, 2H), 5,28 (dd, J=10,1/20,1 Hz), 6,47-7,30 (m, 19H), 8,61 (d, J=10,1,1H). Temperatura topnienia: 176-178°C.
Etap 6. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się ester di-4-tiometylofenylowy kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowy w ilości 2,00 g (3,44 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 2,01 g (96% wagowo) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C21H25Br2N2O3PS2. Masa cząsteczkowa: 608,35 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w DMSO-d6, δ [ppm]): δ 12,68 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-d6, ppm): δ 2,43 (d, J=7,5 Hz, 6H), 5,45 (d, J=12,5 Hz), 6,81-7,43 (m, 12H), 9,21 (s, 4H).
Etap 7. Otrzymywanie N,N’-di-Boc-S-etyloizotiomocznika.
Do kolby okrągłodennej zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne odważa się tiomocznik (7,62 g, 0.1 mola) i zalewa absolutnym alkoholem etylowym. Następnie do roztworu dodaje się świeżo destylowany bromoetan (8,3 ml, 0,11 mola) i całość ogrzewa w temperaturze wrzenia. Reakcję prowadzi się przez 4 godziny po czym lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej odparowuje na wyparce rotacyjnej. Otrzymany olej zalewa się eterem dietylowym (100 ml) i pozostawia do krystalizacji w temperaturze pokojowej. Powstały biały krystaliczny osad odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa eterem dietylowym i suszy w eksykatorze nad P2O5. Wysuszony bromowodorek S-etyloizotiomocznika odważa się następnie do kolby okrągłodennej zaopatrzonej w mieszadło magnetyczne i wkraplacz (1,85 g, 0,01 mola) i rozpuszcza w absolutnym dichlorometanie (25 ml). Następnie dodaje się diwęglan di-tert-butylu (0,48 g, 0,022 mola) i po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej wkrapla powoli diizopropyloetyloaminę (3,6 ml, 0,022 mola). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4-5 dni a jej przebieg monitoruje metodą chromatografii cienkowarstwowej. Mieszaninę poreakcyjną
PL 227 742 B1 przenosi się do rozdzielacza i przemywa kolejno solanką, 5% NaHCO3, 5% kwasem cytrynowym i wodą. Warstwę organiczną suszy się nad bezwodnym siarczanem magnezu i po odsączeniu środka suszącego pozostawia na powietrzu w celu krystalizacji. Produkt krystalizuje w postaci długich, prostopadłościennych, bezbarwnych kryształów, które odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem, przemywa heksanem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się produkt w ilości 2,55 g (84% wa1 gowo). Wzór sumaryczny: C13H24N2O4S. Masa cząsteczkowa: 304,41 g/mol. Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 1,24 (t, J=4,2 Hz, 3H), 1,48 (d, J=4.1, 18H), 3,01 (q, J=7,5 Hz, 2H), 11,62 (s, 1H). Temperatura topnienia: 69°C.
Etap 8. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo-t-butylo)-1-amino-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowego (tBu-Suc-Phe-Val-Thr-(4-NH2)PhgP-(O-C6H4-4-S-CH3)2.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymany w Etapie 2 peptyd t-Bu-Suc-Phe-Val-Thr(O-tBu)-OH (240 mg, 0,41 mmol) i rozpuszcza w acetonitrylu (10 ml). Następnie dodaje się otrzymany w Etapie 6 bromowodorek estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowego (255 mg, 0,41 mmol). Mieszaninę schładza się w łaźni lodowej i po 2 minutach dodaje się 0,21 ml trietyloaminy (1,48 mmol). Po 10 minutach dodaje się 190 mg (0,49 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się przez 24 godziny do samoistnego ogrzania do temperatury pokojowej. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokoj owej przez 24 godziny. Z mieszaniny poreakcyjnej usuwa się lotne składniki na wyparce rotacyjnej, pozostałość rozpuszcza się w octanie etylu (50 ml), przenosi do rozdzielacza i przemywa się kole jno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a otrzymany surowy produkt w ilości 360 mg wykorzystuje się bezpośrednio do reakcji otrzymywania estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treo-nylowalilofenyloalanylobursztynylo-t-butylo)-1-amino-1-[(4-di-Boc-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C51H68O10N5PS2. Masa cząsteczkowa: 1006,22 g/mol. Analiza HRMS m/z 1028,4043/1028, 1646 (M+Na)+.
Etap 9. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo-t-butylo)-1-amino-1-[(4-di-Boc-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego (tBu-Suc-Phe-Val-Thr-(4-Boc2Gu)PhgP(O-C6H4-4-S-CH3)2·
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymany w Etapie 7 ester di-4-tiometylofenylowy kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo-t-butylo)-1-amino-1-[(4-amino)fenylo]-metanofosfonowego w ilości 340 mg (0,33 mmol) i rozpuszcza się w absolutnym chloroformie (30 ml). Następnie dodaje się otrz ymany w Etapie 6 N,N'-di-Boc-S-etyloizotiomocznik (155 mg, 0,49 mmol), trietyloaminę (0,14 ml, 1 mmol) oraz HgCl2 (850 mg, 3,9 mmol). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 48 godzin. Mieszaninę poreakcyjną sączy się przez warstwę Celitu, lotne składniki usuwa się na wyparce rotacyjnej, pozostałość rozpuszcza się w octanie etylu (50 ml), przenosi do rozdzielacza i przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a otrzymany surowy produkt w ilości 320 mg wykorzystuje się bezpośrednio do reakcji otrzymywania estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo)-1-amino-1-[(4-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C62H86O14N7PS2. Masa cząsteczkowa: 1248,49 g/mol. Analiza HRMS m/z 1270, 5310/1270,3177 (M+Na)+.
Etap 10. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo)-1-amino-1-[(4-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego (Suc-Phe-Val-Thr-(4-Gu)PhgP(O-CeH4-4-S-CH3)2Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymany w Etapie 8 ester di-4-tiometylofenylowy kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo-t-butylo)-1-amino-1-[(4-di-Boc-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego w ilości 320 mg i rozpuszcza się w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Następnie produkt izoluje się przy uż yciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-8. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 42 mg, (18% wagowo). Wzór sumaryczny: C44H54N7O10PS2. Masa czą24
PL 227 742 B1 steczkowa: 936,04 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna SunFire™ Prep, 10x250 mm, 5 μm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 23,41 min. Analiza HRMS m/z 936,3190/936,0670 (M+H)+.
Etap 11. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylopyntyloaminobiotynylo)-1-amino-1-[(4-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego (Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-Gu)Phgp (O-CH-J-S-CHak
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymany w Etapie 9 ester di-4-tiometylofenylowy kwasu N-(treonylowalilofenyloalanylobursztynylo)-1-amino-1-[(4-guanidyno)fenylo]-metanofosfonowego (Suc-Phe-Val-Thr-(4-Gu)PhgP(O-C6H4-4-S-CH3)2 w ilości 10 mg (0,01 mmol) i rozpuszcza w 0,5 ml NMP NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynylopentyloaminy (Bt-LC-NH2 (3,5 mg, 0,01 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 6 μl (0,03 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników do mieszaniny dodaje się 4,6 mg (0,012 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-Ν,Ν,Ν',Ν'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 6,8 mg, (54% wagowo). Wzór sumaryczny: C59H80N11O11PS3. Masa cząsteczkowa: 1246,50 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 23,97 min. Analiza HRMS m/z 1246,5017/1246,4969 (M+H)+.
P r z y k ł a d 12
Sposób wytwarzania estru di-4-metyltiofenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)P
-3-metylo-butanofosfonowego (Bt-Val-Pro-LeuP(O-C6H4-4-S-CH3)2, przedstawionego wzorem 12.
Etapy od 1 do 5 opisano w przykładzie 8.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 (Przykład 8) produktu TFA*Pro-LeuP(OC6H4-4-S-CH3)2 (m=0,99 g; 1,59 mmol) dodaje się 0,35 g (1,59 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,53 ml (3,98 mmola) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,64 g (1,7 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,02 g (91% wagowo). Wzór sumaryczny: C34H50N3O7PS2. Masa cząsteczkowa: 707,88 g/mol. Widmo P NMR (roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 18,32 (s, 60%), 19,40 (s, 60%). Widmo 1H NMR (roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 0,94-1,02 (m, 12H), 1,36 (s, 1H), 1,50 (s, 9H), 1,60-1,92 (m, 7H), 2,35-2,38 (m, 6H), 3,50-3,55 (m, 2H), 4,50-4,52 (m, 1H), 4,80-4,90 (m, 1H), 5,10 (s, 1H), 6,20-7,50 (m, 8H). HRMS m/s 730,2725/730,2731.
Etap 7. Usunięcie grupy t-butyloksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego (1,0 g, 1,41 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskan y olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,96 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-3-metylo-butanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt TFA*Val-Pro-LeuP(OC6H4-4-S-CH3)2 (0,96 g, 1,33 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (N-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,32 g, 1,33 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,58 ml (3,33 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników
PL 227 742 B1 do mieszaniny dodaje się 0,55 g (1,46 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,49 g, (44% wagowo). Wzór sumaryczny: C39H56N5O7PS3. Masa cząsteczkowa: 833,31 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 22.46 min. Analiza HRMS m/z 834,3158/834,2836 (M+H)+.
P r z y k ł a d 13
Sposób wytwarzania estru di-4-metyltiofenylowego kwasu N-(prolilowalilobiotynylo-1-amino)-propanofosfonowego (Bt-Val-Pro-Abu (O-C6H4-4-S-CH3)2, przedstawionego wzorem 13.
Etap 1. Otrzymywanie fosforynu tri-4-tiometylofenylowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,2 g (30 mmol) 4-tiometylofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (10 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez sześć godzin w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio bez oczyszczania do reakcji syntezy estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-propanofosfonowego.
Etap 2. Otrzymywanie estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-butanofosfonowego.
W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn tri-4-tiometylofenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 0,86 ml (12 mmol) aldehydu propionowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 10 ml lodowatego kwasu octowego całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C przez 3 godziny. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej a pozostałość rozpuszcza w 100-150 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 3,99 g surowego produktu (77% wago31 wo). Wzór sumaryczny: C25H28NO5PS2. Masa cząsteczkowa: 517,11 g/mol. Widmo P NMR (121 MHz, roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 18,79 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 1,06-1,11 (t, J=14,7 Hz, 3H), 1,72-1,80 (dd, J=15,2/7,5 Hz, 1H,), 2,06-2,11 (m, 2H), 2,44 (s, 6H), 4,35-4,43 (m, 1H), 5,08-5,18 (d, J=6,6 Hz, 2H). 7,00-7,33 (m, 13H). Współczynnik Rf = 0,60 (CHCl3:AcOEt, 4:1, v/v). Temperatura topnienia: 107°C.
Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 2,00 g estru di-4-tiometylofenylowego kwasu N-(benzyloksykarbonyl-1-amino)-butanofosfonowego (3,87 mmol) i dodaje się 5,00 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje się eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na wolnym powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 1,67 g (93% wagowo) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego. Wzór sumaryczny: C17H23BrNO3PS2. Masa cząsteczkowa: 463,00 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w DMSO-de, δ [ppm]): δ 13,03 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w DMSO-de, ppm): δ 1,17-1,22 (t, J=6,3 Hz, 3H), 2,08-2,20 (m, 2H), 2,37 (s, 6H), 3,95-4,02 (m, 1H), 7,00-7,23 (m, 8H), 8,92-9,09 (d, J=6,9 Hz, 3H). Temperatura topnienia: 148°C. Współczynnik Rf = 0,21 (CHCl3:AcOEt, 4:1, v/v).
Etap 4. Otrzymywanie dipeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się 0,93 g (2 mmol) bromowodorku estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego i dodaje się 0,43 g Boc-Pro-OH (2 mmol). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Po 2 minutach dodaje się 0,55 ml trietyloaminy (4 mmol). Po 10 minutach dodaje się 0,76 g (2 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego.
PL 227 742 B1
Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 24 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem m agnezu. Po usunięciu środka suszącego odparowuje się lotne składniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 4:1. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odparowuje się na w yparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 1,01 g (87% wagowo). Wzór sumaryczny: C27H37O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 580,18 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCI3, δ [ppm]): δ 18,95 (s); Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCh, ppm): δ 0,96-1,08 (m, 2H), 1,22-1,27 (m, 2H), 1,43 (s, 9H), 1,60-2,40 (m, 5H), 2,44 (s, 6H). Temperatura topnienia: 54°C. Współczynnik Rf = 0,28 (CHC^AcOEt, 4:1, v/v).
Etap 5. Usunięcie grupy t-Boc z pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się pochodną dipeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego (1,0 g, 1,72 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,96 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Etap 6. Otrzymywanie tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Do powstałego w Etapie 5 produktu TFA*Pro-AbuP(OC6H4-4-S-CH3)2 (m=0,96 g; 1,62 mmol) dodaje się 0,36 g (1,62 mmol) Boc-Val-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (10 ml). Po upływie 2 minut dodaje się 0,54 ml (4,05 mmola) trietyloaminy. Po 10 minutach dodaje się 0,68 g (1,8 mmol) heksafluorofosforanu O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie mieszaninę poreakcyjną zalewa się solanką, przenosi do rozdzielacza i ekstrahuje się trzykrotnie octanem etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodorosiarczanem potasu (5%), solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%), solanką. Warstwę octanową suszy się siarczanem magnezu. Po usunięciu lotnych składników produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent chloroform/octan etylu w stosunku objętościowym 1:4. Po zebraniu frakcji zawierających produkt lotne rozpuszczalniki odp arowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,97 g (88% wagowo). Wzór sumaryczny: C32H46N3O7PS2. Masa cząsteczkowa: 679,25 g/mol. Widmo 31P NMR (121 MHz, roztwór w CDCl3, δ [ppm]): δ 18,66 (s, 59%), 19,06 (s, 41%). Widmo 1H NMR (300 MHz, roztwór w CDCI3, ppm): δ 0,85-1,05 (m, 10H), 1,43 (s, 9H), 1,60-2,18 (m, 7H), 2,45 (s, 6H), 3,52-3,80 (m, 2H), 4,25-4,30 (m, 1H), 4,50-4,52 (d, J=6,0 Hz, 1H), 4,55-4,75 (m, 1H), 5,16-5,30 (dd, J=9,0/33,0 Hz, 1H), 7,03-7,22 (m, 8H). Temperatura topnienia: 53°C. Współczynnik Rf = 0,10 (CHC^AcOEt, 4:1, v/v).
Etap 7. Usunięcie grupy t-butyloksykarbonylowej z tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Do kolby okrągłodennej odważa się otrzymaną w Etapie 6 pochodną tripeptydową estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego (0,95 g, 1,40 mmol) i rozpuszcza się ją w 50% roztworze kwasu trifluoroctowego w dichlorometanie (10 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały produkt w postaci oleju o masie 0,93 g wykorzystuje się bez oczyszczania do otrzymania biotynylowanej pochodnej tripeptydowej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Etap 8. Otrzymywanie biotynylowanej tripeptydowej pochodnej estru di-4-tiometylofenylowego kwasu 1-amino-butanofosfonowego.
Powstały w Etapie 7 produkt TFA*Val-Pro-AbuP(OC6H4-4-S-CH3)2 (0,93 g, 1,34 mmol) rozpuszcza się w 10 ml NMP (W-metylopirolidon) i dodaje biotynę (0,33 g, 1,34 mmol), a następnie dodaje się diizopropyloaminę (DIEA) w ilości 0,58 ml (3,35 mmol). Po rozpuszczeniu wszystkich składników
PL 227 742 B1 do mieszaniny dodaje się 0,56 g (1,47 mmol) heksafluorofosforanu (O-benzotriazol-1-ylo-N, Ν,Ν',Ν'-tetrametylouroniowego. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 18 godzin. Następnie produkt izoluje się bezpośrednio z mieszaniny reakcyjnej przy użyciu chromatografii HPLC w układzie rozpuszczalników woda-acetonitryl zawierających 0,05% kwasu trifluorooctowego stosując kolumnę C-18. Frakcje zawierające produkt poddaje się liofilizacji i uzyskuje oczekiwany produkt w ilości 0,61 g, (57% wagowo). Wzór sumaryczny: C37H52N5O7PS3. Masa cząsteczkowa: 805,28 g/mol. Czas retencji (HPLC, kolumna Alltech Econosphere C-18 10U, 250x22 mm, gradient 5%-95% MeCN/45min): 20,55 min. Analiza HRMS m/z 828,2664/828,2648 (M+Na)+.
P r z y k ł a d 14
Aktywność inhibitorowa pochodnych otrzymanych w przykładach 1-13 wobec wybranych proteaz serynowych i cysteinowych.
Aktywność biologiczną otrzymanych peptydowych pochodnych estrów diarylowych fosfonowych analogów waliny, alaniny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny, leucyny i kwasu 1-aminomasłowego zawierających na N-końcu resztę biotyny przebadano pod kątem zdolności do hamowania proteolitycznej aktywności wybranych proteaz serynowych, a także kontrolnych proteaz cysteinowych. Wszystkie badania wykonano przy zastosowaniu czytnika mikropłytek Molecular Devices Spectramax Gemini XP. Jako substratów reakcji enzymatycznych użyto fluorescencyjnych substratów peptyd owych. Sposób wykonania pomiaru aktywności otrzymanych związków opisano poniżej dla każdego z testowanych enzymów: ludzkiej neutrofilowej elastazy (HNE), świńskiej elastazy trzustkowej (PPE), subtylizyny (Sub), katepsyny G (CatG), proteinazy 3 (PR3), chymotrypsyny (ChTry), trypsyny (Try), papainy (Pap) oraz katepsyny L (CatL). Pomiary aktywności inhibitorowej wykonano przy różnych stężeniach inhibitorów w zakresie od 12,5 nM do 2000 nM.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec ludzkiej neutrofilowej elastazy (HNE).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,01 M HEPES, 0,5 M NaCl, 0,03% Triton X-100, pH 7,5, w czasie 10 minut po uprzedniej preinkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 0,0025 U/ml. Substrat Me-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AFC o stężeniu 25 μM. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 400 nm i emisji 505 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec świńskiej trzustkowej elastazy (PPE).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,01 M Tris-HCl, 0,05% Triton X-100, pH 8,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 60 nM. Substrat Me-Suc-Ala-Ala-Pro-Val-AMC o stężeniu 100 μM. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 350 nm i emisji 460 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec subtylizyny (Sub).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,05 M Tris-HCl, 1M NaCl, 0,01% Triton X-100, pH 7,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 5nM. Substrat Me-Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC o stężeniu 5 μM. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 350 nm i emisji 460 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec trypsyny (Try).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,1 M HEPES, 0,5M NaCl, 0,03% Triton X-100, pH 7,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 25 nM. Substrat Cbz-Arg-AFC o stężeniu 100 μM. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 400 nm i emisji 505 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec chymotrypsyny (ChTry).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,1 M HEPES, 0,5M NaCl, pH 7,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 3 nM. Substrat Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-AMC o stężeniu 5 μM. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 350 nm i emisji 460 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec katepsyny G (CatG).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,1 M Tris-HCl, 0,5M NaCl, pH 7,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 100 nM. Substrat MCA-Phe-Val-Thr-Gnf-Ser-Trp-Anb-NH2 o stężeniu 2,5 μM. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 325 nm i emisji 400 nm.
PL 227 742 Β1
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec proteinazy 3 (PR3).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,1 M Tris-HCI, 0,5M NaCI, pH 7,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 17 nM. Substrat Abz-Tyr-Tyr-Abu-Anb-NH2 o stężeniu 30 μΜ. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 325 nm i emisji 400 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec katepsyny L (CatL).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,4 M octan sodu, 4 mM
EDTA, 8mM DTT, pH 5,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 2 ng/ml. Substrat Cbz-Phe-Arg-AMC o stężeniu 7 μΜ. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 350 nm i emisji 460 nm.
Pomiar aktywności inhibitorowej otrzymanych związków wobec papainy (Pap).
Pomiar aktywności wykonuje się w temperaturze 37°C w buforze 0,4 M octan sodu, 4 mM
EDTA, 8 mM DTT, pH 5,5, w czasie 10 minut po uprzedniej pre-inkubacji roztworu enzymu i inhibitora w 37°C w czasie 10 minut. Stężenie enzymu wynosi 25 nM. Substrat Cbz-Phe-Arg-AMC o stężeniu 4,5 μΜ. Pomiaru dokonuje się przy długości fali wzbudzenia 350 nm i emisji 460 nm.
Wyniki przedstawiono w Tabeli 1. Wartość IC50 - stężenie inhibitora potrzebne do zahamowania połowy aktywności enzymu po 10 min inkubacji.
Tabela 1
Wyniki badania aktywności inhibitorowej peptydowych pochodnych estrów diarylowych fosfonowych analogów waliny, alaniny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny, leucyny i kwasu 1-aminomasłowego zawierających na N-końcu resztę biotyny wobec ludzkiej neutrofilowej elastazy (HNE), świńskiej elastazy trzustkowej (PPE), subtylizyny (Sub), katepsyny G (CatG), proteinazy 3 (PR3), chymotrypsyny (ChTry), trypsyny (Try), papainy (Pap) oraz katepsyny L (CatL).
| HNE | PPE | PR3 | CatG | |||||
| FCso [nM] | Kobi/[I] [M-is-η | ICso fnMl | Kote/fl] rM-«s-ii | ICso fnMl | Kobl/[I] [Μ-’ϊ-η | ICso ΓηΜΙ | Ko«/[I] ΓΜ·ι5-ΐ] | |
| 1 | 2.110.1 | 5.5*105 | 23.514.5 | 4.9*10* | 72.516 | 3.2*10* | NI | NI |
| 2 | 6.5+0.3 | 1.8*10’ | 245.5130.5 | 4.7*10’ | 728144 | 3.2*10’ | NI | NI |
| 3 | NI | NI | NI | NI | NI | NI | 258133 | 4.5*105 |
| 4 | 5.55+0.25 | 2.1*105 | 135.517.5 | 8.5*10’ | NI | NI | NI | NI |
| 5 | N! | NI | 5000 | 2*102 | NI | NI | NI | NI |
| 6 | 1.5510.05 | 2.5*10’ | NI | NI | NI | NI | 218145 | 5.3*10’ |
| 7 | Ni | NI | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 3 | 37971250 | 3.0*10’ | NI | NI | NI | NI | 1095+139 | 1.0*10’ |
| 9 | 5.6110.02 | 2.1*105 | >5000 | <200 | 59.518 | 3.9*10* | 720160 | 1.6*10’ |
| 10 | NI | NI | NI | NI | NI | NI | 30010.5 | 3.8*10’ |
| 11 | NI | NI | NI | NI | 603149 | 3.8*10’ | 47411556 | 2.4*10’ |
| 12 | 66.516.5 | 1.7*10* | 288.8H0 | 4*10’ | NI | NI | 436122 | 2.6*10’ |
| 13 | 2.7510.05 | 4.2*105 | 23.5ll.95 | 4.9*10* | 2Z7±17 | 1.0*10* | NI | NI |
| ChyTr | Sub | Try | CatL | Pap | ||||||
| JCsc [nMl | K=h,/[l] [M’s-*1 | ICso ΓηΜ] | K»te/[I] [M+s+l | ICso ΓηΜ] | Kol,s/[t] ΓΜ-is·1! | ICso fnMl | Wfl] [Ms] | ICso fnM] | K»b,/[I] ΓΜ-·ϊ>1 | |
| 1 | 182.513.5 | 6.3*10’ | 77.514.5 | 1.5*10* | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 2 | NI | NI | 415117 | 2.8*10’ | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 3 | 20.65l0.25 | 5.6*10* | 11.6+0.2 | 1.0*10s | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 4 | NI | NI | 40.210,01 | 2.9*10* | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 5 | 1561Ϊ2 | 7.4*10’ | 47.910.57 | 2.4*10* | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 6 | 11.512.5 | 1.0*10’ | 5.610.8 | 2.1*10’ | 31501550 | 3.7*10’ | NI | NI | NI | NI |
| 7 | 123.314.4 | 9.4*10’ | 76.511.65 | 1.5*10* | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 8 | 400130 | 2.9*10’ | 11.710.61 | 9.9*10* | 11501140 | 1*10’ | NI | NI | NI | NI |
| 9 | 2214 | 5,2*10* | 21.211.2 | 5.4*10* | 26.25+0.45 | 4.4*10* | NI | NI | NI | NI |
| 10 | 16.411.2 | 7,0*10* | 39.9514.6 | 2.9*10* | NI | NI | NI | NI | NI | NI |
| 11 | NI | NI | 480.5115.5 | 2.4*10’ | 424.519.5 | 2.7*10’ | NI | NI | NI | NI |
| 12 | 25.715 | 4.5*10* | NI | NI | 612190 | 1.9*10’ | NI | NI | NI | NI |
| 13 | 970180 | 1.2*10’ | 147+4 | 7.8*10’ | 39001200 | 3*10’ | NI | NI | NI | NI |
NI - brak inhibicji
PL 227 742 Β1
Przykład 15
Detekcja aktywnej enzymatycznie subtylizyny w płynie hodowlanym bakterii Bacillus subtilis.
Z 48 godzinnej hodowli bakterii Bacillus subtilis pobrano 10 ml roztworu i przefiltrowano przy użyciu filtra strzykawkowego (0,22 μπι) w celu usunięcia komórek bakteryjnych. Do otrzymanego płynu hodowlanego (50 μΙ) dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Roztwory inkubowano następnie w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Do każdego z roztworów dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rys 1.
Rys. 1. Wyniki analizy western blotting płynu hodowlanego Bacillus subtilis po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 2.4 (A), 1.2 (B) i 0.6 (C) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-\/al-Pro-Valp(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 4], 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 16
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy subtylizyny
Przygotowano wodny roztwór subtylizyny (Sigma-Aldrich z Bacillus licheniformis, nr. 85968) o stężeniu 0,8187 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 62,5 μg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rys 2.
PL 227 742 Β1
Rys 2. Wyniki analizy western blotting sutylizyny pochodzącej z Bacillus licheniformis po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C, D - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B), 1,2 (C) i 0,6 (D) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1—13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Var(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3L 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 41, 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phe7OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-ProLeup(OC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 17
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy katepsyny G
Przygotowano roztwór katepsyny G (Biocentrum, nr. E-002) o stężeniu 1,176 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 62,5 μg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego roztworu dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 8 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0.05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rys 3.
Rys 3. Wyniki analizy western blotting ludzkiej katepsyny G po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C, D - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wolowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B), 1,2 (C) i 0,6 (D) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 41, 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leu-(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(pC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-SucA/al-Pro-Phe^OCeHsh; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
PL 227 742 Β1
Przykład 18
Określenie limitu detekcji aktywnej katepsyny G przez związek 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2]
Przygotowano roztwór katepsyny G (Biocentrum, E-002) o stężeniu 1,176 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło kolejno 100 pg/ml, 50 pg/ml, 25 pg/ml, 12,5 pg/ml, 6,25 pg/ml, 3,125 pg/ml, 1,5625 pg/ml, 0,78125 pg/ml, 0,390625 pg/ml. Z otrzymanych roztworów pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2 o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego roztworu dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rys 4.
A 1 2 3 456789
Rys 4. Wyniki analizy western blotting ludzkiej katepsyny G po inkubacji ze związkiem zawiązku Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2. Oznaczenia: A - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej 4,8 μιτιοίί biotyny/studzienkę. Numery 1-9 odpowiadają katepsynie G po inkubacji z badanym związkiem w ilości naniesionej na studzienkę żelu poliakrylamidowego: 1 - 1000 ng; 2 - 500 ng; 3 - 250 ng; 4 -125 ng; 5 - 62,5 ng; 6 - 31,25 ng; 7 - 15,625 ng; 8-7,8125 ng; 9-3,90625 ng.
Przykład 19
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy trypsyny.
Przygotowano roztwór trypsyny (AppliChem, nr. A-3964.0500) o stężeniu 1,0 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 10 μg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego roztworu dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0.05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 5.
PL 227 742 Β1
ABCl 2 3456789 1011 12 13 fu
24kDa
Rysunek 5. Wyniki analizy western blotting trypsyny po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B) i 1,2 (C) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-\/alp(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 4], 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leup-(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-ProLeup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 20
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy ludzkiej neutrofilowej elastazy. Przygotowano roztwór ludzkiej neutrofilowej elastazy (Biocentrum, cat#E-001) o stężeniu 0,625 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 40 gg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego roztworu dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 6.
ABCl 23456 789 10 11 12 13
K ' ·
67k0a—►
I
24kDa
Rysunek 6. Wyniki analizy western blotting ludzkiej neutrofilowej elastazy po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B) i 1,2 (C) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 41, 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leu(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(pC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phet’(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhgf (OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 21
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy świńskiej elastazy trzustkowej. Przygotowano roztwór świńskiej elastazy trzustkowej (Serva, nr. 20929) o stężeniu 1,0 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak,
PL 227 742 Β1 że końcowe stężenie enzymu wynosiło 12,5 μο^Ι. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego roztworu dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 7.
Rysunek 7. Wyniki analizy western blotting świńskiej elastazy trzustkowej po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C, D - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B), 1,2 (C) i 0,6 (D) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H4-4-S-ĆH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 4], 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leup-(OC6H5)2; Przykład 7L 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phev(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 22
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy ludzkiej proteinazy 3.
Przygotowano roztwór ludzkiej proteinazy 3 (Elastin, nr. ML734) o stężeniu 1,0 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 12,5 μg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego związku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 8.
PL 227 742 Β1
ABCl 2 34 56789 101112 13
7-ę , \·', .....'
67kDa—► »«·». '/i
29kDa —Hfe
Rysunek 8. Wyniki analizy western blotting ludzkiej proteinazy 3 po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C, D - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B), 1,2 (C) i 0,6 (D) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [BtA/al-Pro-Ala^OCehM-S-CHjfe Przykład 41, 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [BtA/al-Pro-Phe^OCeHL^-S-CHjfe Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leu(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leu^OCePL^-S.-CHsh; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(pC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-SucA/al-Pro-Phe^OCeHsh; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhgf (OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 23
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy chymotrypsyny.
Przygotowano roztwór ludzkiej proteinazy 3 (Sigma-Aldrich, nr. C4129) o stężeniu 1,0 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 62,5 gg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego dodano następnie bufor nieredukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 9.
345 67 89 10 11 12 13A 8 C
67kDa29kDa
Rysunek 9. Wyniki analizy western blotting chymotrypsyny po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wolowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B) i 1,2 (C) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 1], 2 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [BtA/al-Pro-Ala^OCePL-^S-CHjfe Przykład 4], 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leup-(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [BtA/al-Pro-Leu^OCePL^-COOCHjfe Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
PL 227 742 Β1
Przykład 24
Określenie wpływu czasu inkubacji związku Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OPh)2 przedstawionego wzorem 10 z chymotrypsyną na poziom detekcji powstałych kompleksów enzym-badany związek w technice western blotting. Przygotowano roztwór ludzkiej proteinazy 3 (Sigma-Aldrich, nr. C4129) o stężeniu 1,0 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 62,5 μg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano 200 μΙ i przeniesiono do osobnej probówki a następnie dodano 10 μΙ roztworu 29 kDa badanego zawiązku Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OPh)2 o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO) i inkubowano w temperaturze 37°C. W określonych odstępach czasu (0, 5, 10, 15, 25, 30, 45 i 60 minut) z mieszaniny reakcyjnej pobrano po 20 μΙ roztworu i dodano bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego. Ponadto przygotowano w identyczny sposób próbkę kontrolną (kontrola negatywna), w której zamiast badanego związku dodano wyłącznie DMSO. Wszystkie przygotowane w różnych czasach inkubacji próbki zagotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0.05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 10.
A KN O 1 234567
67kDa
29kOa14.8kDa
11.4kOa
Rysunek 10. Wyniki analizy western blotting chymotrypsyny po inkubacji ze związkiem Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OPh)2 w zależności od czasu inkubacji. Oznaczenia: A - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 2,4 pmoli biotyny/studzienkę. KN - kontrola negatywna. Numery 0-7 odpowiadają odpowiednim czasom inkubacji: 0-0 min, 1-5 min, 2 - 1Ó min, 3-15 min, 4-25 min, 5-30 min, 6-45 min, 7-60 min.
Przykład 25
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy papainy.
Przygotowano roztwór ludzkiej papainy (Sigma-Aldrich, nr. 76216) o stężeniu 25,8 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem octanowym (0,4 M octan sodu, 4 mM EDTA, 8 mM DTT, pH 5,5) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 62,5 μg/ml. Z otrzymanego roztworu pobrano po 20 μΙ i przeniesiono do osobnych probówek. Do każdej z probówek dodano po 1 μΙ roztworu badanego zawiązku (do każdej probówki inny związek) o stężeniu 1 mM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze. PBS zawierającego 0.05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 11.
PL 227 742 Β1
10 11 12 13
Z3kDa—►
Rysunek 11. Wyniki analizy western blotting papainy po inkubacji z otrzymanymi związkami. Oznaczenia: A, B, C, D - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 4,8 (A), 2,4 (B), 1,2 (C) i 0,6 (D) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-13 odpowiadają otrzymanym związkom: 1 [Bt-Val-Pro-Valp(OC6H4-4-S-ĆH3)2; Przykład 1], 2 [BtVal-Pro-Valp(OC6H5)2; Przykład 2], 3 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 3], 4 [Bt-Val-Pro-Alap(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 4], 5 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-O-CH3)2; Przykład 5], 6 [Bt-Val-Pro-Phep(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 6], 7 [Bt-Val-Pro-Leup-(OC6H5)2; Przykład 7], 8 [Bt-Pro-Leup(OC6H4-4-S,-CH3)2; Przykład 8], 9 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-COOCH3)2; Przykład 9], 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 10], 11 [Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 11], 12 [Bt-Val-Pro-Leup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 12], 13 [Bt-Val-Pro-Abup(OC6H4-4-S-CH3)2; Przykład 13],
Przykład 26
Detekcja aktywnej enzymatycznie formy katepsyny G w lizatach ludzkich komórek krwinek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
Komórki poddano lizie stosując bufor 10 mM Tris, 150 mM NaCl, 0.5% NP-40, pH 7,5 a następnie roztwory doprowadzono do jednakowych wartości całkowitego stężenia białka (oznaczonego testem Bradforda). Pobrano ilość roztworu odpowiadającą 20 gg białka i inkubowano w buforze PBS (pH 7,4) w obecności związku 10 (końcowe stężenie w mieszaninie reakcyjnej wynosiło 2 μΜ). Jako kontroli użyto związku Bt-DAP22c (MP Biomedicals) w końcowym stężeniu 2 μΜ. Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C do każdego roztworu dodano następnie bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego i gotowano w 100°C przez 10 minut. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono objętość roztworu odpowiadającą 20 μg, 10 μg oraz 5 μg białka. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0,05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Detekcji β-aktyny dokonano przy użyciu pierwszorzędowego przeciwciała anty-3-aktyna (mysie przeciwciało anty-aktyna, Sigma-Aldrich, Cat#A2228) i jako drugorzędowego przeciwciała koźlęcego anty-mysiego skoniugowanego zperoksydazą chrzanową (Dianova, Cat# 115-035-003). Odczytu wyników dokonano za kliszy rentgenowskiej (Amersham Hyperfilm TM ECL) przy czasie ekspozycji 60 sekund. Jako substratu użyto zestawu ECL Plus (GE Healthcare). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 12.
ABCD 1 234
37kDa—
25kDa —
20kDa—
CatG — i - = p-dktyna
37kDa —
Rysunek 12. Wyniki analizy western blotting lizatów ludzkich komórek krwinek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC) po inkubacji ze związkiem 10 [Bt-LC-Suc-Val-Pro-Phep(OC6H5)2; Przykład 10], Oznaczenia: A, B, C - kontrola pozytywna w postaci lizatów (A - 20 pg, B - 10 pg i C - 5 pg) lub czystej katepsyny G (D - 25 ng) inkubowanych ze związkiem Bt-DAP22c (MP Biomedicals); 1,2, 3 - lizaty (1 - 20 pg, 2 - 10 pg i 3 - 5 pg) lub czysta katepsyna G (4 - 25 ng) po inkubacji ze związkiem 10. Dolny panel przedstawia kontrolę nakładania - β-aktynę.
Przykład 27
Określenie stabilności kompleksu subtylizyny ze związkiem Bt-LC-Suc-Phe-Val-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2.
Przygotowano wodny roztwór subtylizyny (Sigma-Aldrich z Bacillus licheniformis, nr. 85968) o stężeniu 0,8187 mg/ml. Roztwór enzymu rozcieńczono następnie buforem fosforanowym (100 mM fosforan sodu, 150 mM chlorek sodu, pH 7,2) tak, że końcowe stężenie enzymu wynosiło 62,5 μg/ml.
PL 227 742 Β1
Z otrzymanego roztworu pobrano 200 μΙ i dodano 10 μΙ roztworu badanego zawiązku Bt-LC-Suc-PheVal-Thr-(4-GuPhg)p(OC6H4-4-S-CH3)2 (11) o stężeniu ImM sporządzonego w dimetylosulfotlenku (DMSO). Po inkubacji przez 60 minut w temperaturze 37°C mieszaninę umieszczono w temperaturze pokojowej, a następnie z mieszaniny reakcyjnej pobierano w różnych odstępach czasu (0 min - próbka pobrana po 60 minutowej inkubacji w temperaturze 37°C, 6h, 12h, 24h, 48h, 36h, 60h, 72h) po 20 μΙ roztworu i od razu dodawano do niego bufor redukujący do nakładania próbek do rozdziału elektroforetycznego, a następnie po zagotowaniu w 100°C przez 10 minut zamrażano w temperaturze -20°C. Na studzienki żelu poliakrylamidowego (4%/12%) naniesiono po 10 μΙ z otrzymanych roztworów. Po wykonaniu rozdziału elektroforetycznego przeprowadzono elektrotransfer białek na membranę nitrocelulozową w technice western blotting. Membranę następnie zablokowano 5% roztworem mleka odtłuszczonego w buforze PBS zawierającego 0.05% Tween-20. Jako czynnika detekcyjnego użyto koniugatu streptawidyna-peroksydaza chrzanowa. Odczytu wyników dokonano za pomocą systemu obrazowania molekularnego (GelLogic1500 Carestream) przy zastosowaniu substratu chemiluminescencyjnego WestPICO Super Signal (Pierce). Uzyskane w technice western blotting rezultaty przedstawione są na Rysunku 13.
A BI 23 45678
67kDa—►
29kDaRysunek 13. Wyniki analizy western blotting subtylizyny pochodzącej z Bacillus licheniformis po inkubacji ze związkiem 11 w zależności od czasu inkubacji. Oznaczenia: A, B - kontrola pozytywna w postaci biotynylowanej albuminy wołowej w ilości odpowiadającej kolejno 2,4 (A) i 1,2 (B) pmoli biotyny/studzienkę. Numery 1-8 odpowiadają różnym czasom inkubacji: 1-0 min, 2 - 6h, 3 - 12h, 4 - 24h, 5 - 36h, 6 - 48h, 7 - 60h, 8 - 72h.
Claims (5)
1. Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl.
2. Sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl, znamienny tym, że fosforyn triarlowy, otrzymany z fenolu zawierającego podstawnik w pozycji para oraz chlorku fosforu (III) w acetonitrylu, poddaje się amidoalkilowaniu przy użyciu karbaminianu benzylu, fosforynu triarlowego oraz aldehydu, takiego jak aldehyd octowy, propionowy, izomasłowy, fenylooctowy, p-nitrobenzoesowy i izowalerianowy, następnie prowadzi się syntezę bromowodorków estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, w których odblokowuje się ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz) a w kolejnym etapie poddaje się reakcji z aminokwasem z zablokowaną grupą α-aminową w obecności odczynnika sprzęgającego, po czym z otrzymanego fosfonodipeptydu po usunięciu grupy blokującej fe/Y-butoksykarbonylowej (f-Boc) uzyskuje się dipeptyd estru difenylowego kwasu 1-aminoalkanofosfonowego, który poddaje się reakcji w obecności odczynnika sprzęgającego w sposób analogiczny do przedstawionego powyżej z kolejnym aminokwasem z zablokowaną grupą α-aminową, biotyną lub jej pochodną.
PL 227 742 B1
3. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że jako odczynnik sprzęgający stosuje się heksafluorofosforan O-benzotriazol-1-ylo-N,N,N',N'-tetrametylouroniowy (HBTU) w obecności WW-diizopropyloetyloaminy (DIEA).
4. Zastosowanie pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl do wytwarzania leku będącego inhibitorem proteaz serynowych.
5. Zastosowanie in vitro pochodnych estrów di arylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym Bt oznacza biotynę, W oznacza łącznik węglowodorowy składający się od 5 do 10 atomów węgla, Y oznacza reszty aminokwasowe w ilości od 0 do 4, R oznacza podstawnik analogiczny do łańcucha bocznego waliny, alaniny, leucyny, fenyloalaniny, 4-guanidynofenyloglicyny lub kwasu 2-aminobutanowego (Abu); X oznacza wodór lub związek wybrany z grupy obejmującej: merkaptometyl (S-metyl), metoksyl (O-metyl) lub karboksymetyl, jako niskocząsteczkowych sond molekularnych do wykrywania aktywnych katalitycznie form enzymów.
Priority Applications (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399613A PL227742B1 (pl) | 2012-06-21 | 2012-06-21 | Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie |
| EP13172944.4A EP2676962A1 (en) | 2012-06-21 | 2013-06-20 | Derivatives of 1-aminoalkylphosphonate diaryl esters, method of 1-aminoalkylphosphonate diaryl ester derivatives preparation and their application |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399613A PL227742B1 (pl) | 2012-06-21 | 2012-06-21 | Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL399613A1 PL399613A1 (pl) | 2012-12-17 |
| PL227742B1 true PL227742B1 (pl) | 2018-01-31 |
Family
ID=47392398
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL399613A PL227742B1 (pl) | 2012-06-21 | 2012-06-21 | Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP2676962A1 (pl) |
| PL (1) | PL227742B1 (pl) |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US10017527B2 (en) | 2014-03-28 | 2018-07-10 | Universiteit Antwerpen | KLK4 inhibitors |
| JP6768270B2 (ja) * | 2015-08-03 | 2020-10-14 | 学校法人神戸学院 | ビオチン直接結合型タンパク質活性調節物質 |
| DE102016114392A1 (de) * | 2016-08-03 | 2018-02-08 | Eberhard Karls Universität Tübingen Medizinische Fakultät | Verbindung zur Behandlung einer mit einer Desregulierung des alternativen Komplementweges assoziierten Erkrankung |
-
2012
- 2012-06-21 PL PL399613A patent/PL227742B1/pl unknown
-
2013
- 2013-06-20 EP EP13172944.4A patent/EP2676962A1/en not_active Withdrawn
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP2676962A1 (en) | 2013-12-25 |
| PL399613A1 (pl) | 2012-12-17 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP5501538B1 (ja) | 高感度膵液検出用蛍光プローブ、及び膵液検出方法 | |
| EP2316839A1 (en) | Antiviral compounds | |
| PT1206485E (pt) | Novos efectores da dipeptidil peptidase iv para a utilização tópica | |
| EP2288615B1 (en) | Selective caspase inhibitors and uses thereof | |
| JP5688826B2 (ja) | カルパイン活性検出蛍光プローブ | |
| Serim et al. | Tuning activity-based probe selectivity for serine proteases by on-resin ‘click’construction of peptide diphenyl phosphonates | |
| PL227742B1 (pl) | Pochodne estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych, sposób wytwarzania pochodnych estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych oraz ich zastosowanie | |
| Senten et al. | Rapid parallel synthesis of dipeptide diphenyl phosphonate esters as inhibitors of dipeptidyl peptidases | |
| EP2707034A1 (en) | Activity-based probes for the urokinase plasminogen activator | |
| JP6731669B2 (ja) | ジペプチジルペプチダーゼｉｖ検出用蛍光プローブ | |
| Yates et al. | A stable pyrophosphoserine analog for incorporation into peptides and proteins | |
| EP3625243A1 (en) | Tailored cyclodepsipeptides as potent non-covalent serine protease inhibitors | |
| Modrzycka et al. | Parallel imaging of coagulation pathway proteases activated protein C, thrombin, and factor Xa in human plasma | |
| WO2022260135A1 (ja) | 固相抽出を利用した蛍光プローブライブラリの調製方法、及びこれを用いた酵素活性計測方法 | |
| JP2001525315A (ja) | 新規メタロプロテアーゼ阻害剤、その治療的利用およびその合成における開始化合物の製造方法 | |
| EP3727386A1 (en) | Inhibitors of protease activated receptor-2 | |
| TWI404723B (zh) | 蛋白質酪胺酸磷酸酯水解酵素之標示化合物及其前驅物 | |
| Burchacka et al. | Substrate profiling of Finegoldia magna SufA protease, inhibitor screening and application to prevent human fibrinogen degradation and bacteria growth in vitro | |
| CA2791535C (en) | Methods and systems for preparing irreversible inhibitors of protein tyrosine phosphatases | |
| Huang et al. | Development of activity-based probes with tunable specificity for protein tyrosine phosphatase subfamilies | |
| Ji et al. | Furin-targeting activity-based probes with phosphonate and phosphinate esters as warheads | |
| Sevrain et al. | Glyco-Phospho-Glycero Ether Lipids (GPGEL): synthesis and evaluation as small conductance Ca 2+-activated K+ channel (SK3) inhibitors | |
| WO2015123783A1 (en) | Cathepsin b-targeting probes | |
| PL212735B1 (pl) | Sposób wytwarzania fosfonowych analogów pseudopeptydów i ich zastosowanie jako preparatów o aktywności przeciwbakteryjnej | |
| CA3120756A1 (en) | Sulfoxonium ylide derivatives as probes for cysteine protease |