PL227760B1 - Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki - Google Patents
Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki Download PDFInfo
- Publication number
- PL227760B1 PL227760B1 PL399630A PL39963012A PL227760B1 PL 227760 B1 PL227760 B1 PL 227760B1 PL 399630 A PL399630 A PL 399630A PL 39963012 A PL39963012 A PL 39963012A PL 227760 B1 PL227760 B1 PL 227760B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- formula
- group
- defined above
- atom
- blocking
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 30
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Chemical class Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 title claims description 16
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 title claims description 15
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 title claims description 7
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 title claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 title claims description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 title claims description 3
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 claims description 32
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 23
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 22
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 20
- GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 2,3,4,6,7,8,9,10-octahydropyrimido[1,2-a]azepine Chemical compound C1CCCCN2CCCN=C21 GQHTUMJGOHRCHB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 19
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 19
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 18
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 15
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 15
- UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N guanine Chemical compound O=C1NC(N)=NC2=C1N=CN2 UYTPUPDQBNUYGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 13
- 229940124276 oligodeoxyribonucleotide Drugs 0.000 claims description 13
- 238000009833 condensation Methods 0.000 claims description 11
- 230000005494 condensation Effects 0.000 claims description 11
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 10
- CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N tert‐butyl hydroperoxide Chemical compound CC(C)(C)OO CIHOLLKRGTVIJN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 claims description 9
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K thiophosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=S RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 9
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical group [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical group OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical group [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 8
- OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N cytosine Chemical compound NC=1C=CNC(=O)N=1 OPTASPLRGRRNAP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 8
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N thymine Chemical group CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N adenyl group Chemical group N1=CN=C2N=CNC2=C1N GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 7
- 150000002432 hydroperoxides Chemical class 0.000 claims description 7
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 claims description 7
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 7
- -1 tert-butyl oxide (tert-butylperoxytrimethylsilane) Chemical compound 0.000 claims description 7
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 claims description 6
- 239000003377 acid catalyst Substances 0.000 claims description 6
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 claims description 6
- 150000001451 organic peroxides Chemical class 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 5
- 125000000753 cycloalkyl group Chemical group 0.000 claims description 5
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000007800 oxidant agent Substances 0.000 claims description 4
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 claims description 4
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229940104302 cytosine Drugs 0.000 claims description 2
- 238000000151 deposition Methods 0.000 claims description 2
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 39
- XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N Argon Chemical compound [Ar] XKRFYHLGVUSROY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 36
- RAFKCLFWELPONH-UHFFFAOYSA-N acetonitrile;dichloromethane Chemical compound CC#N.ClCCl RAFKCLFWELPONH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 229910052786 argon Inorganic materials 0.000 description 18
- JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N dichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)Cl JXTHNDFMNIQAHM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N Acetic anhydride Chemical compound CC(=O)OC(C)=O WFDIJRYMOXRFFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 15
- VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 4-Dimethylaminopyridine Chemical compound CN(C)C1=CC=NC=C1 VHYFNPMBLIVWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 11
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229960005215 dichloroacetic acid Drugs 0.000 description 9
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 7
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 7
- 229940046166 oligodeoxynucleotide Drugs 0.000 description 7
- 125000002103 4,4'-dimethoxytriphenylmethyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)(C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H])C1=C([H])C([H])=C(OC([H])([H])[H])C([H])=C1[H] 0.000 description 6
- 229960000549 4-dimethylaminophenol Drugs 0.000 description 6
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CCVKPWUMYBYHCD-UHFFFAOYSA-N oxolane;pyridine Chemical compound C1CCOC1.C1=CC=NC=C1 CCVKPWUMYBYHCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 150000003536 tetrazoles Chemical class 0.000 description 6
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 5
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 230000001293 nucleolytic effect Effects 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 4
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 4
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonium chloride Substances [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 238000001906 matrix-assisted laser desorption--ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 230000000707 stereoselective effect Effects 0.000 description 3
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 238000006664 bond formation reaction Methods 0.000 description 2
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 2
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 2
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 2
- 125000004663 dialkyl amino group Chemical group 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 2
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 1-[5-[[bis(4-methoxyphenyl)-phenylmethoxy]methyl]-4-hydroxyoxolan-2-yl]-5-methylpyrimidine-2,4-dione Chemical compound C1=CC(OC)=CC=C1C(C=1C=CC(OC)=CC=1)(C=1C=CC=CC=1)OCC1C(O)CC(N2C(NC(=O)C(C)=C2)=O)O1 UBTJZUKVKGZHAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 1-methyl-1H-imidazole Chemical compound CN1C=CN=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KPAFWZJRLXXXKU-NXBSNPICSA-N 6-amino-6-benzoyl-3-[(2r,4s,5r)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-1h-pyrimidin-2-one Chemical compound C1=CC(N)(C(=O)C=2C=CC=CC=2)NC(=O)N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 KPAFWZJRLXXXKU-NXBSNPICSA-N 0.000 description 1
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 241000160765 Erebia ligea Species 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000020897 Formins Human genes 0.000 description 1
- 108091022623 Formins Proteins 0.000 description 1
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DIDVHIQFADPFOI-NTADQGDRSA-N [6-amino-9-[(2R,4S,5R)-4-hydroxy-5-(hydroxymethyl)oxolan-2-yl]-8H-purin-6-yl]-phenylmethanone Chemical compound C1N=C2C(N)(C(=O)C=3C=CC=CC=3)N=CN=C2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 DIDVHIQFADPFOI-NTADQGDRSA-N 0.000 description 1
- QVMHUALAQYRRBM-UHFFFAOYSA-N [P].[P] Chemical group [P].[P] QVMHUALAQYRRBM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000004703 alkoxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 description 1
- 150000008064 anhydrides Chemical class 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 229940041181 antineoplastic drug Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 125000003236 benzoyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C(*)=O 0.000 description 1
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 230000006957 competitive inhibition Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000007876 drug discovery Methods 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 125000000219 ethylidene group Chemical group [H]C(=[*])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000005755 formation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000003834 intracellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 125000000325 methylidene group Chemical group [H]C([H])=* 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920002842 oligophosphate Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- UQZZQHGRZPTZME-UHFFFAOYSA-N oxazaphospholidine Chemical class C1CPNO1 UQZZQHGRZPTZME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N potassium tert-butoxide Chemical compound [K+].CC(C)(C)[O-] LPNYRYFBWFDTMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000006239 protecting group Chemical group 0.000 description 1
- 230000009870 specific binding Effects 0.000 description 1
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 1
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 125000004665 trialkylsilyl group Chemical group 0.000 description 1
- 150000003852 triazoles Chemical class 0.000 description 1
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Polymers OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000002221 trityl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1C([*])(C1=C(C(=C(C(=C1[H])[H])[H])[H])[H])C1=C([H])C([H])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową lub stały nośnik, U oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową lub stały nośnik, R1 oznacza atom wodoru lub niepodstawioną resztę alkilową lub arylową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, X oznacza atom siarki a Y oznacza atom tlenu, lub X oznacza atom tlenu a Y oznacza atom siarki, k, I i m oznaczają liczby 0-100, przy czym co najmniej 2 z nich są różne od zera, a poszczególne symbole B w łańcuchu oligodeoksyrybonukleotydowym są takie same lub różne i oznaczają resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3 4 w których R3 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, przy czym przy poszczególnych tiofosforanowych atomach fosforu są konfiguracje takie same lub różne albo ich mieszanina, z wykorzystaniem mieszanej strategii oksatiafosfolanowo-amidofosforynowej.
Syntetyczne oligonukleotydy stanowią ważną grupę potencjalnych terapeutyków stosowanych w leczeniu chorób o podłożu genetycznym jak również wykazują działanie przeciwwirusowe (tzw. strategia antysensowa) [(a) S. Agrawal, Tibitech., 1996, 14, 376; (b) D. E. Szymkowski, Drug Discovery Today, 1996, 1,415]. Jednakże podatność niemodyfikowanych oligonukleotydów (PO-ODNs) na nukleolityczną degradację katalizowaną przez wewnątrzkomórkowe nukleazy, sprawia, że związki te nie mogą być wykorzystywane do tych celów. Rozwiązaniem problemu jest stabilizacja cząsteczki oligonukleotydu poprzez wprowadzenie trzech typów chemicznych modyfikacji: modyfikacje nukleozasady, modyfikacje reszty cukrowej (szczególnie pozycji 2'rybozy) oraz modyfikacje wiązania internukleotydowego [P. D. Cook, Anti-Cancer Drug Des., 1991, 6, 585]. Jako że niniejszy przedmiot wynalazku dotyczy modyfikacji wiązania internukleotydowego toteż poniższe wprowadzenie koncentruje się wyłącznie na tym typie modyfikacji.
Spośród różnorodnych modyfikacji wiązania internukleotydowego najistotniejszą rolę odgrywa zastąpienie jednego z niemostkowych atomów tlenu w wiązaniu fosfodiestrowym atomem siarki [F. Eckstein, Annu. Rev. Biochem., 1985, 54, 367]. Otrzymane w ten sposób tiofosforanowe oligonukleotydy (PS-ODNs), stanowią główną grupę tzw antysensowych oligonukleotydów pierwszej generacji.
Chociaż tiofosforanowe oligonukleotydy wykazują wiele pozytywnych cech (odporność na degradację nukleolityczną, aktywowanie RNAzy H, korzystne własności farmakokinetyczne) [(a) J. M. Campbell, T. A. Bacon, and E. Wickstrom, J. Biochem. Biophys. Methods, 1990, 20, 259; (b) M. I. Phillips and Y. C. Zhang, Methods Enzymol., 2000, 313, 46-56 (c) S. T. Crooke, Methods Enzymol., 2000, 313, 3]. to niestety, nie są pozbawione działań niepożądanych takich jak niesekwencyjnie specyficzne wiązanie z białkami komórkowymi, zależna od stężenia kompetycyjna inhibicja różnych nukleaz i polimeraz [(a) S. T. Crooke Therapeutic Application of Oligonucleotides 1995, pp. 63 R. G. Landes Co., Austin, TX; (b) M. A. Guvakova, L. A. Yakubov, I. Vlodavsky, J. L. Tonkinson and C. A. Stein, J. Biol. Chem., 1995, 270, 2620; (c) D. A. Brown, S.-H. Kang, S. M. Gryaznov, L. DeDionisio, O. Heidenreich, S. Sullivan, X. Xu and M. I. Neerenberg, J. Biol. Chem., 1994, 43, 26801]. Jakkolwiek powody tego niespecyficznego oddziaływania z białkami są do tej pory niewyjaśnione to mogą one być toksyczne dla komórki. Jednakże, jak wykazały liczne badania, modyfikacja każdego wiązania internukleotydowego w cząsteczce oligonukleotydu nie jest konieczna do podwyższenia jego nukleolitycznej stabilności [(a) J. P. Shaw, K. Kent, J. Bird, J. Fishback and B. Froehler, NucleicAcids Res., 1991, 19, 747; (b) G. D. Hoke, K. Draper, S. M. Freier, C. Gonzalez, V. B. Driver, M. C. Zounes and D. J. Ecker, Nucleic Acids Res., 1991, 19, 5743].
Tak zwane chimeryczne oligonukleotydy, które w jednej cząsteczce posiadają zarówno niemodyfikowane fosforanowe jak i tiofosforanowe wiązania internukleotydowe (PO/PS-ODNs) wykazują zwiększone powinowactwo do docelowej sekwencji wybranego mRNA i obniżone powinowactwo do białek. Ponadto PO/PS oligonukleotydy są znacząco bardziej odporne na działanie exo- i endonukleaz w porównaniu z niemodyfikowanymi PO oligonukleotydami [(a) W.-Y. Gao, F.-S. Han, Ch. Storm, W. Egan and Y.-Ch. Cheng, Mol. Pharmacol. 1992, 41, 223; (b) M. K. Ghosh, K. Ghosh and J. S. Cohen, Anti-Cancer Drug Des., 1993, 8, 15; (c) H. Soreq, D. Patinkin, E. Lev-Lehman, M. Grifman,
D. Ginzberg, F. Eckstein, Zakut, H. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 1994, 91,7907].
Biorąc pod uwagę budowę chemiczną chimeryczne oligonukleotydy można podzielić na dwa typy. Pierwszy z nich posiada wiązania tiofosforanowe w naprzemiennych pozycjach, podczas gdy drugi
PL 227 760 B1 zawiera połączone klastery oligofosforanów i tiofosforanów. W tym przypadku zakłada się, że tiofosforanowe fragmenty znajdujące się na końcach będą zapewniały większą nukleolityczną stabilność, podczas gdy centralny niemodyfikowany fragment fosforanowy zwiększa własności hybrydyzacyjne „chimerycznej” cząsteczki w porównaniu z PS-ODNs i ułatwia działanie RNAzy H na dupleks wytworzony z docelowym RNA [B. T. Monia, J. F. Johnston, H. Sasmor and L. L. Cummins, J. Biol. Chem. 1996, 271, 14533].
Rozważając biologiczną aktywność tiofosforanowych oligonukleotydów (PS ODNs) należy brać pod uwagę chiralność atomu fosforu, co sprawia, że tiofosforanowe analogi występują w postaci mieszaniny 2n (liczba chiralnych atomów fosforu) diastereoizomerów, gdyż standardowo PS-ODNs syntetyzowane są przy użyciu niestereoselektywnej metody amidofosforynowej [W.J. Stec, A. Wilk, Angew. Chem. 1994, 106, 747; Angew. Chem., Int. Ed. Engl. 1994, 33, 709]. Badania dotyczące stereoselektywnej metody syntezy PS-ODNs były prowadzone w licznych laboratoriach i obecnie mogą one być otrzymane w oparciu o jedną z trzech możliwych metod syntezy: metodologię oksatiafosfolanową [(a) W.J. Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznanski Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5883; (b) P. Guga, A. Okruszek, W.J. Stec Top. Curr. Chem. 2002, 220, 169], metodę wykorzystującą jako monomery 3'-O-(3-N-acylo)oksazafosfolidynowe pochodne nukleozydów [A. Wilk, A. Grajkowski, L.R. Phillips, S.L. Beaucage J. Am. Chem. Soc. 2000, 122, 2149] lub stereoselektywne monomery nukleozydowe pochodne 3'-O-oksazafosfolidynowe [N.Oka, T. Wada, K. Saigo J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 8307; N. oka, M. Yamamoto, T. Sato, T. Wada J. Am. Chem. Soc. 2008, 130, 16031].
W literaturze nie opisano dotychczas prób syntezy fosforanowo/tiofosforanowych chimerycznych oligonukleotydów z wykorzystaniem mieszanej strategii oksatiafosfolanowo-amidofosforynowej. Stereozdefiniowane internukleotydowe wiązania tiofosforanowe w cząsteczce oligodeoksyrybonukleotydu w sposobie według wynalazku są tworzone w oparciu o metodologię oksatiafosfolanową [(a) W.J. Stec, A. Grajkowski, M. Koziołkiewicz, B. Uznanski Nucleic Acid Res. 1991, 19, 5883; (b) P. Guga, A. Okruszek, W.J. Stec Top. Curr. Chem. 2002, 220, 169], która jako monomeryczne nukleotydy wykorzystuje poszczególne diastereomery odpowiednio blokowanych 3'-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolano)nukleozydów. Natomiast fosforanowe segmenty oligonukleotydów są otrzymywane z wykorzystywaniem powszechnie stosowanej metodologii amidofosforynowej.
Połączenie tych dwóch metodologii nie było dotychczas możliwe, gdyż odczynnik (mieszanina jod/woda) standardowo stosowany do utlenienia przejściowo tworzącego się fosforynowego wiązania internukleotydowego utlenia również tiofosforanowe wiązanie internukleotydowe utworzone w czasie elongacji łańcucha oligonukleotydowego za pomocą metodologii oksatiafosfolanowej.
Rozwiązanie tego problemu znaleziono stosując sposób według wynalazku, polegający na zastosowaniu specjalnie dobranego odczynnika utleniającego, który generuje wiązanie PO i w obecności, którego wiązanie PS pozostaje stabilne.
Sposób wytwarzania fosforanowo/tiofosforanowych oligonukleotydów o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową lub stały nośnik, U oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową lub stały nośnik, R1 oznacza atom wodoru lub niepodstawioną resztę alkilową lub arylową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, X oznacza atom siarki a Y oznacza atom tlenu lub X oznacza atom tlenu a Y oznacza atom siarki, k, I i m oznaczają liczby 0-100, przy czym co najmniej dwie z nich są różne od zera a poszczególne symbole B w łańcuchu oligodeoksyrybonukleotydowym są takie same lub różne i oznaczają resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3 lub 4, w których R3 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową, albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, przy czym przy poszczególnych tiofosforanowych atomach fosforu są konfiguracje takie same lub różne albo ich mieszanina, według wynalazku polega na tym, że kondensację prowadzi się osadzając na nośniku nukleozyd o wzorze 8a w którym Z1 oznacza grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a U oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6a w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7a, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6a, w którym B i Z1 mają wyżej podane znaczenie a R4, R5, R6, R7 oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7a, w którym B i Z1 mają wyżej podane znaczenie, a R1 i R2 oznaczają niepodstawione reszty alkilowe lub arylowe zawierające od 1 do 7 atomów węgla, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej
PL 227 760 B1 nukleotydu o wzorze 7a, w którym B, Z1, R1, R2 mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik albo kondensację prowadzi się stosując w pierwszym jej cyklu nukleozyd o wzorze 8b w którym Z2 oznacza grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a Q oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5,4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6b w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7b, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6b, w którym B i Z2 mają wyżej podane znaczenie a R4, R5, R6, R7 oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, a pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7b w którym B i Z2 mają wyżej podane znaczenie, a R1 i R2 oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7b, w którym Z2, B, R1, R2 mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik.
Równocześnie z odszczepieniem oligodeoksyrybonukleotydu od stałego nośnika usuwa się grupy blokujące funkcję egzoaminowe, z wytworzeniem związku o wzorze 1, w którym Q=H, U=H, B ma wyżej podane znaczenie, k, I, m, mają wyżej podane znaczenie a R=H.
Do zabezpieczenia grup 5'-hydroksylowych stosuje się znane grupy blokujące, korzystnie acylową, benzylową, trifenylometylową, trialkilosililową, 4-metoksytrifenylometylową, a zwłaszcza 4,4-dimetoksytrifenylometylową.
Do ochrony grup egzoaminowych stosuje się korzystnie, grupę fenoksyacetylową, izopropoksyacetylową, izobutyrylową, benzoilową, (dialkiloamino)metylenową, (dialkiloamino)etylidenową.
Po każdym cyklu kondensacji usuwa się grupy blokujące funkcję 5'-hydroksylową, aby przyłączyć następny nukleotyd.
Reakcję prowadzi się w bezwodnym rozpuszczalniku organicznym, korzystnie acetonitrylu, chlorku metylenu, N,N-dimetyloformamidzie.
Jako katalizator zasadowy reakcji tworzenia wiązania internukleotydowego stosuje się nienukleofilowe alkoholany, korzystnie tert-butanolan potasowy oraz 1-metyloimidazol, 4-dimetyloaminopirydyna, 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en.
Jako katalizator kwasowy reakcji tworzenia wiązania internukleotydowego korzystnie stosuje się takie związki jak triazol, tetrazol.
Jako odczynnik utleniający, który generuje internukleotydowe wiązanie fosforanowe (P=O) stosuje się nadtlenki i wodoronadtlenki organiczne, korzystnie sililowany wodoronadtlenek t-butylowy (t-butyloperoksytrimetylosilan).
Jak już wspomniano, zastosowanie sposobu według wynalazku zapewnia stereospecyficzność syntezy tiofosforanowych (P=S) segmentów chimerycznego oligodeoksyrybonukleotydu na stałym nośniku.
Poniżej przedstawiono szczególnie korzystny przebieg procedury według wynalazku.
W związku o wzorze 8a, w którym B oznacza resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3, 4, w których R3 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową, albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, Z1 oznacza grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, U oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem, odblokowuje się grupę 5'-hydroksylową na drodze kwaśnej hydrolizy i poddaje się kondensacji w obecności katalizatora zasadowego takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, ze związkiem o wzorze ogólnym 6a, w którym B, Z1 mają wyżej podane znaczenie, a R4, R5, R6, R7 oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, otrzymując związek o wzorze 1, w którym B, U mają wyżej podane znaczenie, Q=Z1, które ma wyżej podane znaczenie, R1 oznacza atom wodoru, X oznacza atom siarki, a k=0, l=0, m=1. Następnie odblokowuje się funkcję 5'-hydroksylową przez kwaśną hydrolizę i przyłącza się, w obecności katalizatora zasadowego takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en kolejny związek o wzorze 6a, w którym
PL 227 760 B1
B, Z1, R4, R5, R6, R7 mają wyżej podane znaczenie, powtarzając pierwszy cykl reakcji m-razy, aż do wytworzenia o żądanej sekwencji i o żądanej konfiguracji przy internukleotydowym atomie fosforu oligodeoksyrybonukleotydu o wzorze 1, w którym B, Q i U mają wyżej podane znaczenie, R1 oznacza atom wodoru, X oznacza atom siarki a k=0 i l=0. Następnie przyłącza się w obecności katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol związek o wzorze 7a, w którym B ma wyżej podane znaczenie, Z1 jest grupą blokującą, a R1, R2 oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, po czym do kolumienki reakcyjnej wprowadza się odczynnik utleniający otrzymując związek o wzorze 1, w którym B, Q i U mają wyżej podane znaczenie, X ma wyżej podane znaczenie, R1 ma wyżej podane znaczenie, Y oznacza atom tlenu, m ma wyżej podane znaczenie a k=0, 1=1. Następnie odblokowuje się funkcję 5'-hydroksylową przez kwaśną hydrolizę i powtarza się ostatni cykl reakcji l-razy aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o wzorze 1, w którym B, Q, U, R1 X i Y mają wyżej podane znaczenie, a k=0. Następnie po odblokowaniu 5'-hydroksylowej funkcji na drodze kwaśnej hydrolizy w obecności katalizatora zasadowego przyłącza się związek o wzorze 6a, w którym B, Z1, R4, R5, R6, R7 mają wyżej podane znaczenie, otrzymując związek o wzorze 1, w którym B, Q, U, R1, X i Y mają wyżej podane znaczenie,
I i m mają wyżej podane znaczenie a k=1. Następnie odblokowuje się funkcję 5'-hydroksylową na drodze kwaśnej hydrolizy i powtarza się ostatni cykl reakcji k-razy aż do wytworzenia o żądanej sekwencji i o żądanej konfiguracji przy internukleotydowym atomie fosforu oligodeoksyrybonukleotydu o wzorze 1, w którym B, Q, U, R1 X i Y mają wyżej podane znaczenie, k, I, m mają wyżej podane znaczenie. Odcięcie oligonukleotydu i usunięcie internukleotydowych grup ochronnych zachodzi w środowisku zasadowym i prowadzi do wytworzenia związku o wzorze 1, w którym X i Y mają wyżej podane znaczenie, B oznacza reszty niechronionych na grupach egzoaminowych nukleozasad takich jak adenina, guanina, cytozyna, tymina, Q, U, R1 oznaczają atom wodoru.
Wynalazek ilustrują niżej podane przykłady:
P r z y k ł a d I
Synteza fragmentu o sekwencji TpsTpsTpsTpoTpoTpoTpsTpsTpsToh
A. Przez kolumienkę o pojemności 150 pl, zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 1 μΜ 5’-0-{4,4’-dimetoksytrifenylometylo) tymidyny związanej ze stałym nośnikiem, przepuszczono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 1 ml chlorku metylenu a następnie 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
B. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μΜ 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-tymidylo-3’-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) (diastereomer mniej mobilny) i 50 μM 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-enu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią, po czym przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Następnie wprowadzono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
C. Procedurę opisaną w punkcie B powtórzono dwukrotnie.
D. Następnie do kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-O-(4,4,-dimetoksytrifenylometylo)-tymidylo-3’-O-(O-3-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu i 20 μΜ tetrazolu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod wysoką próżnią. Następnie przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 50 μM sililowanego wodoronadtlenku tert-butylowego. Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), a następnie wprowadzono x 5 μl 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji
PL 227 760 B1
5’-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
E. Procedurę opisaną w punkcie D powtórzono dwukrotnie
F. Następnie procedurę opisaną w punkcie B powtórzono trzykrotnie
G. Do kolumienki wprowadzono 150 pl 10% roztworu piperydyny w CH3CN, następnie po upływie 1 godz. usunięto roztwór i kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), po czym w celu odcięcia oligonukleotydu od stałego nośnika zawartość kolumienki przesypano do fiolki zawierającej 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku. Po upływie 1 godz. odfiltrowano roztwór i złoże przemyto amoniakiem, po czym połączone roztwory zatężono pod wysoką próżnią i analizowano za pomocą MALDI-MS [(M-1)m/z 3075; nieobecny pik M-16 co świadczy o braku utlenienia wiązania P=S].
P r z y k ł a d II
T poT poT poT poT pod(ApsApsApsAoH)
A. Przez kolumienkę o pojemności 150 pl, zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 1 μΜ 5’-O-(4,4,-dimetoksytrifenylometylo)-N6-benzoilo-deoksyadenozyny związanej ze stałym nośnikiem, przepuszczono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 1 ml chlorku metylenu a następnie 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
B. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-0-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-N6-benzoilodeoksyadenozyno-3’-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) (diastereomer mniej mobilny) i 50 μM 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-enu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią, po czym przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Następnie wprowadzono x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
C. Procedurę opisaną w punkcie B powtórzono dwukrotnie.
D. Następnie do kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-tymidylo-3’-O-(O-3-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu 20 μM tetrazolu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod wysoką próżnią. Następnie przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 50 μM sililowanego wodoronadtlenku tert-butylowego Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), a następnie wprowadzono x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
E. Procedurę opisaną w punkcie D powtórzono czterokrotnie
F. Następnie procedurę opisaną w punkcie B powtórzono trzykrotnie
G. Do kolumienki wprowadzono 150 μl 10% roztworu piperydyny w CH3CN, następnie po upływie 1 godz. usunięto roztwór i kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), po czym w celu odcięcia oligonukleotydu od stałego nośnika i odblokowania funkcji egzoaminowych zawartość kolumienki przesypano do fiolki zawierającej 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku. Po upływie 24 godz. odfiltrowano roztwór i złoże przemyto amoniakiem, po czym połączone roztwory zatężono pod wysoką próżnią i analizowano za pomocą MALDI-MS [(M-1)m/z 2758.2; nieobecny pik M-16 co świadczy o braku utlenienia wiązania P=S].
PL 227 760 B1
P r z y k ł a d III d(ApoCps ApoCpsApoCpsApoCpsCoh)
A. Przez kolumienkę o pojemności 150 μ|, zabezpieczonej z dwóch stron filterkami, zawierającej 1 μΜ 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-N4-benzoilodeoksycytydyny związanej ze stałym nośnikiem, przepuszczono 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu w ciągu 1 min., przemyto 1 ml chlorku metylenu a następnie 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
B. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu acetonitrylu zawierającego 20 μM 5’-O-(4,4’-dimetoksytrifenylometylo)-N4-benzoilodeoksycytydyno-3’-O-(2-tio-1,3,2-oksatiafosfolanu) (diastereomer bardziej mobilny) i 50 μM 1,8-diazabicyklo[5.4.0]-undec-7-enu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią, po czym przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7 g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Następnie wprowadzono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
C. Następnie do kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 20 μΜ 5'-O-(4,4'-dimetoksytrifenylometylo)-N6-benzoilodeoksyadenozyno-3’-O-(O-3-cyjanoetylo-N,N-diizopropylo)amidofosforynu i 20 μΜ tetrazolu. Reakcję prowadzono przez 15 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod wysoką próżnią. Następnie przez kolumienkę przepuszczono 150 μl roztworu A+B (1:1) w ciągu 1 min. [A-12% roztwór bezwodnika octowego w mieszaninie pirydyna-THF (10:8), B-7g DMAP w 100 ml THF]. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią. Do tak przygotowanej kolumienki wprowadzono 150 μl roztworu zawierającego 50 μM sililowanego wodoronadtlenku tert-butylowego. Reakcję prowadzono przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), a następnie wprowadzono 2 x 5 ml 2% kwasu dichlorooctowego w chlorku metylenu, w celu odblokowania funkcji 5'-hydroksylowej. Kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1) i suszono pod argonem a następnie pod wysoką próżnią.
D. Powtórzono procedurę opisaną w punkcie B.
E. Powtórzono procedurę opisaną w punkcie C.
F. Procedury opisane w punktach B i C powtarzano dwukrotnie.
G. Do kolumienki wprowadzono 150 μl 1.0% roztworu piperydyny w CH3CN, następnie po upływie 1 godz. usunięto roztwór i kolumienkę przemyto 8 ml mieszaniny acetonitryl-chlorek metylenu (1:1), po czym w celu odcięcia oligonukleotydu od stałego nośnika i odblokowania funkcji egzoaminowych zawartość kolumienki przesypano do fiolki zawierającej 1 ml 25% wodnego roztworu amoniaku. Po upływie 24 godz. odfiltrowano roztwór i złoże przemyto amoniakiem, po czym połączone roztwory zatężono pod wysoką próżnią i analizowano za pomocą MALDIMS [(M-1)m/z 2699.1; nieobecny pik M-16 co świadczy o braku utlenienia wiązania P=S].
Sposobem analogicznym do opisanego w przykładach l-III otrzymano następujące fragmenty:
d (GpoGpoApoApoApsAoh) d(GpoGpoApoApSApSAoH) d(ApsApsAps)T poT poT poT poT pod(ApsApsApsAoH)
T poT poT poT poT Pod(CpsCpsCpsCoH) d(ApsApsAps)T poT poT poT poT pod (ApsApsApsAoh)
Claims (2)
1. Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki, o ogólnym wzorze 1, w którym Q oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję
PL 227 760 B1
5'-hydroksylową lub stały nośnik, U oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 3’-hydroksylową lub stały nośnik, R1 oznacza atom wodoru lub niepodstawioną resztę alkilową lub arylową zawierającą od 1 do 7 atomów węgla, X oznacza atom siarki a Y oznacza atom tlenu lub X oznacza atom tlenu a Y oznacza atom siarki, k, I i m oznacza liczbę 0-100, przy czym co najmniej dwie z nich są różne od zera a poszczególne symbole B w łańcuchu oligodeoksyrybonukleotydowym są takie same lub różne i oznaczają resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3 lub 4, w których R3 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową, albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, przy czym przy poszczególnych tiofosforanowych atomach fosforu są konfiguracje takie same lub różne albo ich mieszanina, znamienny tym, że kondensację prowadzi się osadzając na nośniku nukleozyd o wzorze 8a w którym Z1 oznacza grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a U oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6a w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7a, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6a, w którym B i Z1 mają wyżej podane znaczenie a R4, R5, R6, R7 oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7a, w którym B i Z1 mają wyżej podane znaczenie, a R1 i R2 oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7a, w którym B, Z1, R1, R2 mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy (tert-butyloperoksytrimetylosilan) i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik albo kondensację prowadzi się stosując w pierwszym jej cyklu nukleozyd o wzorze 8b w którym Z2 oznacza grupę blokującą funkcję 3'-hydroksylową, B ma wyżej podane znaczenie, a Q oznacza stały nośnik z przedłużonym łańcuchem i dodaje się kolejno, naprzemiennie w obecności zasadowego katalizatora takiego jak 1,8-diazabicyklo[5.4.0]undec-7-en, pochodne nukleotydów o wzorze 6b w postaci takich samych lub różnych diastereomerów lub ich mieszanin, i wobec katalizatora kwasowego takiego jak tetrazol pochodne nukleotydów o wzorze 7b, przy czym gdy X lub Y oznacza atom siarki pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 6b, w którym B i Z2 mają wyżej podane znaczenie a R4, R5, R6, R7 oznaczają atom wodoru, prosty alkil, cykloalkil lub aryl o 1 do 6 atomów węgla, a gdy X lub Y oznacza atom tlenu, a pochodne nukleotydów mają wzór ogólny 7b w którym B i Z2 mają wyżej podane znaczenie, a R1 i R2 oznaczają niepodstawione reszty alkilowe lub arylowe zawierające od 1 do 7 atomów węgla, przy czym po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7b, w którym Z2, B, R1, R2 mają wyżej podane znaczenie stosuje się odczynnik utleniający wybrany z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, zwłaszcza sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy i powtarza się każdy cykl reakcji, aż do wytworzenia oligodeoksyrybonukleotydu o żądanej sekwencji i o żądanych konfiguracjach przy internukleotydowym tiofosforanowym atomie fosforu a po zakończeniu syntezy z otrzymanego produktu, ewentualnie usuwa się grupy blokujące oraz nośnik.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7a, w którym, Z1 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, a R1, R4 oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, B oznacza resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3, 4, w których R3 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5, lub po każdym etapie kondensacji z użyciem pochodnej nukleotydu o wzorze 7b, w którym Z2 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję 5'-hydroksylową, a R1, R2 oznaczają reszty alkilowe lub arylowe, B oznacza resztę adeniny, guaniny, cytozyny o wzorach 2, 3, 4, w których R3 oznacza atom wodoru lub grupę blokującą funkcję egzoaminową albo B oznacza resztę tyminy o wzorze 5 stosuje się odczynnik utleniający z grupy nadtlenków i wodoronadtlenków organicznych, korzystnie sililowany wodoronadtlenek tert-butylowy (tert-butyloperoksytrimetylosilan).
PL 227 760 Β1
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399630A PL227760B1 (pl) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL399630A PL227760B1 (pl) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL399630A1 PL399630A1 (pl) | 2013-12-23 |
| PL227760B1 true PL227760B1 (pl) | 2018-01-31 |
Family
ID=49767883
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL399630A PL227760B1 (pl) | 2012-06-22 | 2012-06-22 | Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL227760B1 (pl) |
-
2012
- 2012-06-22 PL PL399630A patent/PL227760B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL399630A1 (pl) | 2013-12-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4731324B2 (ja) | Ｎ−ｏ結合性架橋構造型新規人工核酸 | |
| JP3050595B2 (ja) | オリゴヌクレオチド類似体 | |
| US5532130A (en) | Methods and compositions for sequence-specific hybridization of RNA by 2'-5' oligonucleotides | |
| JP3653102B2 (ja) | 末端３′−３′および／または５′−５′連鎖を有するオリゴリボヌクレオチドおよびリボザイム類縁体 | |
| EP0549686A4 (en) | Modified internucleoside linkages | |
| WO2002018388A1 (fr) | Analogues de nucleosides et derives d'oligonucleotides renfermant ces analogues | |
| CA2878945A1 (en) | Chiral control | |
| WO2003039523A2 (en) | OLIGONUCLEOTIDES MODIFIED WITH NOVEL α-L-RNA ANALOGUES | |
| JPH07501527A (ja) | 修飾されたピリミジンを含有するオリゴマーを使用する増強された三重らせんおよび二重らせんの成形 | |
| JPH06502758A (ja) | 遺伝子発現を検出及び変調する糖修飾されたオリゴヌクレオチド | |
| CN113412268B (zh) | 5’位修饰核苷和使用其的核苷酸 | |
| CN111448316A (zh) | 新的硫代亚磷酰胺 | |
| KR100318796B1 (ko) | 변성올리고데옥시리보뉴클레오티드,그의제조방법및그의치료적용도 | |
| CN110590886A (zh) | 修饰核苷、核苷酸和核酸聚合物及其制备方法与应用 | |
| WO2002018406A1 (en) | Alkylated hexitol nucleoside analogues and oligomers thereof | |
| CN101238213B (zh) | 使用扭转嵌入核酸(TINA)稳定并选择性地形成Hoogsteen型三链体和双链体以及制备TINA的工艺 | |
| WO1996039414A1 (en) | Novel base protecting groups for oligonucleotide synthesis | |
| PL227760B1 (pl) | Sposób wytwarzania modyfikowanych oligonukleotydów zawierających co najmniej jedno wiązanie fosfodiestrowe, w którym niemostkowy atom tlenu jest zastąpiony atomem siarki | |
| BR112021016460A2 (pt) | Oligonucleotídeo gapmer antissenso de fita simples, sal farmaceuticamente aceitável de um oligonucleotídeo, conjugado, composição farmacêutica e invenção | |
| Meldgaard et al. | Automated synthesis of branched oligodeoxynucleotide analogues using arabino-uridine as branching nucleotide | |
| Banait et al. | DNA and RNA analogues–oligonucleotide phosphoramidates with bridging nitrogen | |
| JP2006248975A (ja) | ヌクレオシドホスホロアミダイト化合物 | |
| WO2005083084A1 (en) | Intercalating triplex forming oligonucleotide derivatives and process for the preparation thereof | |
| HK40119680A (zh) | 包含三硫代磷酸酯核苷间键的寡核苷酸 | |
| CN116568696A (zh) | 二硫代磷酸酯寡核苷酸的新颖合成 |