PL227833B1

PL227833B1 - Peptydowe pochodne S-enancjomerów diarylowych estrów kwasów 1-aminoalkilofosfonowych, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie

Info

Publication number: PL227833B1
Application number: PL416659A
Authority: PL
Inventors: Marcin SKOREŃSKI; Marcin Skoreński; Józef Oleksyszyn; Marcin SIEŃCZYK; Marcin Sieńczyk
Original assignee: Politechnika Wroclawska
Priority date: 2016-04-01
Filing date: 2016-04-01
Publication date: 2018-01-31
Also published as: PL416659A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są peptydowe pochodne S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, dimetylocyklopropylową pochodną proliny lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna oraz sposoby ich wytwarzania. Zgłoszenie dotyczy również zastosowania peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych o wzorze ogólnym I w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, dimetylocyklopropylową pochodną proliny lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna jako nieodwracalnych inhibitorów proteazy NS3/4A o genotypach 1a oraz 1b.

Description

Przedmiotem wynalazku peptydowe pochodne S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie jako inhibitorów proteazy NS3/4A ekspresjonowanej przez ludzki wirus zapalenia wątroby typu C (HCV).

Według najnowszych doniesień na świecie około 130-150 milionów ludzi zarażonych jest wirusem zapalenia wątroby typu C. Dodatkowo z powodu braku skutecznej szczepionki co roku rejestruje się około 4 milionów nowych zachorowań tym wirusem. Każdego roku notuje się ponad 350 tysięcy zgonów na skutek powikłań oraz chorób towarzyszących infekcjom wirusa zapalenia wątroby typu C. Do nie dawna jedyną terapią była terapia dwuskładnikowa (składająca się z interferonu i Ribavarinu), która często nie była dobrze tolerowana przez pacjentów oraz nie była skuteczna. Dodatkowo, pojawiające się nowe genotypy wirusa okazały się być całkowicie oporne na jej działanie. W maju 2011 roku, Amerykańska Agencja ds. Żywności i Leków (FDA) zaakceptowała dwa nowe terapeutyki (Telaprevir, Boceprevir), które stosowane są w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu C. Mechanizm ich działania oparty jest na odwracalnym hamowaniu aktywności proteolitycznej wirusowej proteazy NS3/4A. Inhibicja aktywności tego enzymu nie pozwala na powstanie nowych wirusów zdolnych do dalszej replikacji. Największym problemem związanym z wykorzystaniem inhibitorów proteazy NS3/4A są pojawiające się mutacje materiału genetycznego, dzięki którym wirus uzyskuje oporność na nowe terapeutyki. Innym problemem jest występowanie efektów niepożądanych podczas stosowania wyżej wymienionych leków (Chang MH, Gordon LA, Fung HB. Clin Ther 2012, 34, 2021-38; Neukam K et al. PLoS One 2015, 10, 4). Z tego też powodu niesłychanie ważnym jest nieustanne poszukiwanie nowych związków będących inhibitorami tej kluczowej dla cyklu życiowego wirusa proteazy (Alkhouri N, Zein NN., Cleve Clin J Med. 2012, 79, 213-22; Pawlotsky, JM., Gastroenterology 2014, 146, 1176-92).

Zastosowania aromatycznych estrów kwasów 1 -aminoalkilofosfonowych, jako specyficznych inhibitorów proteaz serynowych zostało już wykorzystane w wielu pracach naukowych. Obecny w strukturze inhibitora N-końcowy fragment peptydowy odpowiada za oddziaływanie z kieszeniami S2-Sn proteazy, dzięki czemu możliwe jest uzyskanie wysokiej specyficzności ich działania, tzn. wyeliminowanie możliwości reakcji z innymi proteazami serynowymi, szczególnie inaktywacji ważnych proteaz gospodarza. Natomiast C-końcowy region inhibitora zawiera fosfonowy analog aminokwasu, którego struktura zapewnia nie tylko optymalne oddziaływanie cząsteczki z kieszenią wiążącą S1 proteazy, ale umożliwia aparatowi katalitycznemu enzymu rozpoczęcie nukleofilowego ataku na atom fosforu, co w konsekwencji prowadzi do samobójczej inaktywacji proteazy (Sienczyk, M., Oleksyszyn, J. Curr Med Chem. 2009, 16, 1673). Prezentowane związki to pochodne peptydów, jednak ich konfiguracja przy atomie węgla α w reaktywnej części inhibitora odpowiada konfiguracji niebiałkowych aminokwasów. W literaturze naukowej i patentowej opisano jedynie zastosowanie peptydowych pochodnych estrów arylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych jako związków hamujących aktywność ludzkich enzymów proteolitycznych takich jak m.in.: chymotrypsyna, trypsyna, elastaza neutrofilowa czy katepsyna G (Sieńczyk M., Lesner A., Wysocka M., Legowska A., Pietrusewicz E., Rolka K., Oleksyszyn J., Bioorg Med Chem. 2008, 16, 8863; Winiarski Ł, Oleksyszyn J, Sieńczyk M., J Med Chem. 2012, 55, 6541-53; Pietrusewicz E, Sieńczyk M, Oleksyszyn J. J Enzyme Inhib Med Chem. 2009, 24, 1229-36) lub inhibitorów proteaz bakteryjnych. Ponadto w literaturze patentowej i naukowej nie istnieją doniesienia o zastosowaniu peptydowych pochodnych estrów kwasów 1-aminoalkilofosfonowych jako inhibitorów proteazy NS3/4A ekspresjonowanej przez ludzki wirus zapalenia wątroby typu C (HCV). W poniższym wynalazku prezentujemy związki o odwrotnej konfiguracji asymetrycznego atomu węgla w fosfonowym analogu am inokwasu, odpowiadającej niebiałkowym aminokwasom, co zmniejsza podatność otrzymanych pochodnych na degradację przez enzymy proteolityczne, zarówno ludzkie, jak i wirusowe czy bakteryjne.

Istotą wynalazku są peptydowe pochodne S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych o wzorze ogólnym I w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, dimetylocyklopropylową pochodną proliny lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna.

Sposób wytwarzania peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych przedstawionych wzorami II-IX oraz o wzorze ogólnym I w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, dimetylocyklopropylową pochodną proliny lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu

PL 227 833 B1 pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna polega na tym, że fosforyn triarlowy, otrzymany z fenolu para-merkaptometylowego oraz chlorku fosforu (III) w acetonitrylu, poddaje się amidoalkilowaniu przy użyciu karbaminianu benzylu, fosforynu tri-(4-merkaptometylo)fenylowego oraz aldehydu n-butylowego, w acetonitrylu jako rozpuszczalniku stosując jako katalizator kompleks eteratu kwasu tetrafluoroborowego, po czym prowadzi się syntezę bromowodorku, w której odblokowuje się ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz) przy użyciu 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym, w kolejnym etapie otrzymany bromowodorek estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego poddaje się reakcji z proliną z zablokowaną grupą α-aminową a reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforan benzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i acetonitrylem jako rozpuszczalnikiem. W następnym etapie z otrzymanego fosfonodipeptydu, usuwa się grupę blokującą tert-butyloksykarbonylową (t-Boc) przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2Ch), po czym odblokowany dipeptyd estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego poddaje się reakcji z tert-butyloglicyną z zablokowaną grupą α-aminową w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanem benzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i acetonitrylem jako rozpuszczalnikiem, ostatnim etapem jest usunięcie grupy tert-butyloksykarbonylowej (t-Boc) przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2Cl2), a otrzymany produkt poddaje się reakcji sprzęgania z trzema różnymi grupami: kwasem pirazynokarboksylowym, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna, w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanembenzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i N,N-dimetyloformamidem jako rozpuszczalnikiem.

Korzystnie w przypadku syntezy pochodnej hydrochinonu prowadzi się finalną deprotekcję estru tert-butylowego przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2Ch).

Sposób wytwarzania peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych przedstawionych wzorami X—XV oraz wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza analog proliny: dimetylocyklopropyloprolinę lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwasu pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna znamienny tym, że uprzednio przygotowany peptydowy fragment poddaje się reakcji sprzęgania z bromowodorkiem estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego przygotowanego zgodnie z opisem powyżej. Reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanem benzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i N,N-dimetyloformamidem jako rozpuszczalnikiem.

Korzystnie w przypadku syntezy pochodnej hydrochinonu prowadzi się deprotekcję estru tertbutylowego dla związku o wzorze X przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2Cl2) lub estru benzylowego dla związku o wzorze XIII przy użyciu 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym.

Istotą wynalazku jest również zastosowanie peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkilofosfonowych o wzorze ogólnym I w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, dimetylocyklopropylową pochodną proliny lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna jako nieodwracalnych inhibitorów proteazy NS3/4A o genotypach 1a oraz 1b.

Przedmiot wynalazku przedstawiony jest bliżej w przykładach realizacji oraz na schematach reakcji na rysunku, na którym:

fig. 1 przedstawia schemat syntezy związków przedstawionych wzorami II-IX, fig. 2 przedstawia schemat syntezy związków przedstawionych wzorami X—XII, fig. 3 przedstawia schemat syntezy związków przedstawionych wzorami XIII—XV.

P r z y k ł a d 1.

Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowego) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 2

Etap 1. Otrzymywanie fosforynu trój-(4-metylomerkapto)fenylowego. W tym celu do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne dodaje się 4,1 g (29 mmol) 4-metylomerkaptofenolu i 20 ml acetonitrylu. Po rozpuszczeniu całość ogrzewa się pod chłodnicą zwrotną w temperaturze 90°C

PL 227 833 B1 przez 2 minuty. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 0,87 ml (9,8 mmol) chlorku fosforu (III). Całość ogrzewa się przez trzy godziny w temperaturze wrzenia. Następnie pod zmniejszonym ciśnieniem usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce obrotowej. Powstały surowy produkt w postaci oleju wykorzystuje się bezpośrednio, bez oczyszczania, do reakcji syntezy przedstawionej w etapie 2.

Etap 2. Otrzymywanie estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu l-N-(benzyloksykarbonylo)aminobutylofosfonowego. W tym celu do kolby okrągłodennej - zawierającej fosforyn trój-(4-merkaptometylo)fenylowy powstały bezpośrednio w etapie 1 - wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się 1,51 g (10 mmol) karbaminianu benzylu i 1,1 ml (10,5 mmol) aldehydu n-butylowego. Po rozpuszczeniu wszystkich składników w 15 ml acetonitrylu całość chłodzi się na łaźni lodowej. Następnie dodaje się 0,16 g (1 mmol) kwas tetrafluoroborowy w eterze dietylowym. Po 12 godzinach trwania reakcji w temperaturze pokojowej usuwa się lotne składniki mieszaniny na wyparce rotacyjnej pod zmniejszonym ciśnieniem, a pozostałość rozpuszcza w 50 ml metanolu i umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu. Uzyskany produkt odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu. Otrzymuje się 3,16 g produktu (wydajność 59%). Wzór sumaryczny: C26H30NO5P. Masa cząsteczkowa: 531,1303 g/mol.

Etap 3. Otrzymywanie bromowodorku estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,53 g estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu 1-N-(benzyloksykarbonylo)-aminobutylofosfonowego (1 mmol) i dodaje się 4 ml roztworu kwasu bromowodorowego (33%) w kwasie octowym. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, a uzyskany olej rozpuszcza się w minimalnej ilości metanolu i dodaje eteru dietylowego do pierwszego zmętnienia. Kolbę umieszcza się w temperaturze -20°C na 24 godziny w celu krystalizacji produktu, który odsącza się pod zmniejszonym ciśnieniem i suszy na powietrzu do stałej wagi. Otrzymuje się 0,45 g (94%) produktu w postaci białego osadu. Wzór sumaryczny: C18H25O3NPS2Br. Masa cząsteczkowa: 478,40 g/mol.

Etap 4. Otrzymywanie estru di-(4-metylosulfidofenylowego) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,37 g (0,77 mmol) bromowodoru estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego i dodaje się 0,20 g Boc-Pip-OH (0,88 mmola). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml) a po upływie 2 minut dodaje się 0,32 g N,N-diizopropyloetyloaminy (2,5 mmola). Po 10 minutach dodaje się 0,43 g (0,82 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie odparowuje się lotne składniki mieszaniny reakcyjnej, a powstały olej rozpuszcza się w 40 ml octanu etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego, solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,25 g (wydajność 53%) w postaci bezbarwnego oleju. Wzór sumaryczny: C29H41O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 608,75 g/mol.

Etap 5. Synteza trifluorooctanu estru di-(4-metylosulfidofenylowego) kwasu (N-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,16 mmol) estru di-(4-metylosulfidofenylowego) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego i rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwas trójfluoroctowy (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy jako substrat wyjściowy do otrzymania pochodnej w etapie 6.

Etap 6. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-tertbutyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie V produktu TFA*Pip-n Val^P(OC6H4-4-SCH3)2 0,1 g (0,16 mmola) dodaje się 0,04 g (0,17 mmola) Boc-Tleu-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,24 g (0,4 mmola) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,09 g (0,17 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie odparowuje się lotne składniki mieszaniny reakcyjnej, a powstały olej rozpuszcza się w 25 ml octanu etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej

PL 227 833 B1 stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 24%). Wzór sumaryczny: C35H52O7N3PS2. Masa cząsteczkowa: 721,91 g/mol. Rf = 0,18 (eter naftowy: AcOEt, 2:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCb) 88.34 (d, J = 9.0 Hz, 1H), 7.23-7.00 (m, 8H), 5.59 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 5.22 (m, 1H), 4.77 (m, 1H), 4.64 (m, 1H), 4.09 (m, 1H), 3.37 (m, 1H), 2.48-2.38 (m, 6H), 2.12-1.83 (m, 3H), 1.57 (m, 7H), 1.44-1.34 (m, 9H), 0.96 (s, 9H), 0.92-0.85 (m, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) 8 18.27 (s, 77%), 18.16 (s, 23%), (konformer). HRMS: otrzymano z (C35H52N3O?PS2)Na+, 744.2882; znaleziono: 744.2874

P r z y k ł a d 2. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 3.

Etap 1-6 identyczne jak w przykładzie 1.

Etap 7. Trifluorooctanu estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu (L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,03 g (0,04 mmol) estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu (L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego i rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluoroctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy jako substrat wyjściowy w etapie 8.

Etap 8. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-2-(4-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie VII produktu TFA*Tleu-Pip-nVal^P(OC6H4-4-SCH3)2 0,03 g (0,04 mmola) dodaje się 0,014 g (0,05 mmola) kwasu 2-(4-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)octowy. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,013 g (0,1 mmola) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,026 g (0,05 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,019 g (wydajność 53%). Wzór sumaryczny: C44H60O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 886,07 g/mol.

Etap 9. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Powstały w etapie VIII produkt (0,019 g; 0,02 mmol rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,015 g (wydajność 90%). Wzór sumaryczny: C40H52O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 829,96 g/mol Rf = 0,1, (eter naftowy: AcOEt, 1:5, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCb) 87.81 (d, J = 9.9 Hz, 1H), 7.45 (d, J = 7.3 Hz, 1H), 7.38-6.70 (m, 12H), 4.95-4.81 (m, 1H), 4.77-4.60 (m, 1H), 4.57-4.48 (m, 4H), 4.00-3.88 (m, 2H), 2.55 (s, 6H), 2.49-2.40 (m, 4H), 2.13-1.85 (m, 3H), 1.80-1.71 (m, 4H), 1.55-1.24 (m, 4H), 1.09-0.90 (m, 9H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) 8 20.71 (s). HRMS: otrzymano z (C40H52N3O10PS2)Na+, 852.2729; znaleziono 852.2737.

P r z y k ł a d 3.

Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 4.

Etap 1-7 identyczne jak w przykładzie 1.

Etap 8. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tertbutyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie VII produktu TFA*TleuPip-nVal^P(OC6H4-4-SCH3)2 0,03 g (0,04 mmola) dodaje się 0,01 g (0,08 mmola) kwasu piperazynowego.

PL 227 833 B1

Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,013 g (0,1 mmola) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,026 g (0,05 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,020 g (wydajność 67%). Wzór sumaryczny: C35H46O6N5PS2. Masa cząsteczkowa: 727,86 g/mol. Rf = 0,21, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCb) 89.36 (s, 1H), 9.10 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 7.25-6.94 (m, 8H), 5.10 (d, J = 9.4 Hz, 1H), 4.89-4.87 (m, 1H), 4.65 (d, J = 11.1Hz, 1H), 2.39 (s, 6H), 2.30-2.05 (m, 8H), 1.84-1.36 (m, 6H), 1.10 (s, 9H), 1.03-0.85 (m, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCl3) 8 18.79 (s). HRMS: otrzymano z (C35H46NsO6PS₂)Na+, 750.2516; znaleziono 750.2518.

P r z y k ł a d 4.

Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 5.

Etap 1-7 identyczne jak w przykładzie 1.

Etap 8. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-homoprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie VII produktu TFA*Tleu-Pip-nVal^P(OC6H4-4-SCH3)2 0,03 g (0,04 mmol) dodaje się 0,013 g (0,05 mmol) z (S)-2-cykloheksyl-2-(pyrazina-2-karboksyamido)octowy kwas. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,013 g (0,1 mmola) N,N-diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,026 g (0,05 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,018 g (wydajność 82%). Wzór sumaryczny: C43H59O7N6PS₂. Masa cząsteczkowa: 867,07 g/mol. Rf = 0,07 (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCb) 89.42 (d, J = 12.1 Hz, 1H), 8.85 (s, 1H), 8.55 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 8.408.25 (m, 1H), 7.70-7.05 (m, 8H), 6.65-6.50 (m, 1H), 4.99-4.90 (m, 1H), 4.50-4.35 (m, 1H), 2.77-2.68 (m, 2H), 2.55-2.50 (m, 6H), 2.21 -1.90 (m, 3H), 1.84-1.65 (m, 6H), 1.63-1.34 (m, 6H), 1.20 (s, 9H), 0.99 (s, 9H), 0.88-0.79 (m, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) 8 19.27 (s, 79%), 18.46 (s, 21%), (konformer) HRMS: otrzymano z (C43H59N6O7PS2)Na⁺, 889.3522; znaleziono: 889.3526.

P r z y k ł a d 5.

Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 6.

Etapy 1 -3 identyczne jak w przykładzie 1.

Etap 4. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,37 g (0,77 mmol) bromowodorku i dodaje się 0,23 g Boc-Oic-OH (0,88 mmola). Całość zalewa się acetonitrylem (15 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,32 g diizopropyloetyloaminy (2,5 mmola). Po 10 minutach dodaje się 0,43 g (0,82 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie odparowuje się lotne składniki mieszaniny reakcyjnej, a powstały olej rozpuszcza się w 40 ml octanu etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego, solanką, dwukrotnie wodorowęglanem sodu (5%) i solanką. Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt o masie 0,19 g (wydajność 38%) w postaci bezbarwnego oleju. Wzór sumaryczny: C32H45O6N2PS2. Masa cząsteczkowa: 648,81 g/mol.

PL 227 833 B1

Etap 5. Trójfluorooctanu estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,1 g (0,15 mmol) produktu otrzymanego w etapie 4 i rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy, jako substrat wyjściowy użyty w etapie 6.

Etap 6. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-tert-butyloksykarbonylo-L-tertbutyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego.

Do powstałego w etapie V produktu TFA*Oic-nVal^P(O-C6H4-4-SCH3)2 0,1 g (0,15 mmol) dodaje się 0,04 g (0,17 mmola) Boc-Tleu-OH. Całość zalewa się acetonitrylem (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,24 g (0,4 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,09 g (0,17 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie odparowuje się lotne składniki mieszaniny reakcyjnej, a powstały olej rozpuszcza się w 25 ml octanu etylu. Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 26%). Wzór sumaryczny: C38H56O7N3PS2. Masa cząsteczkowa: 761,97 g/mol. Rf = 0,19 (eter naftowy: AcOEt, 2:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, MeOD) δ 7.32-7.10 (m, 8H), 4.83-4.71 (m, 1H), 4.48-4.39 (m, 1H), 4.31-4.21 (m, 1H), 2.48 (s, 6H), 2.35-2.21 (m, 1H), 2.04-1.92 (m, 2H), 1.91-1.82 (m, 4H), 1.77-1.66 (m, 6H), 1.57-1.49 (m, 3H), 1.47 (s, 9H), 1.37-1.25 (m, 2H), 1.02 (s, 9H), 1.01-0.91 (m, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, MeOD) δ 18.63. HRMS: otrzymano z (C38H56N3O₇PS₂)Na+, 784.3195; znaleziono: 784.3189.

P r z y k ł a d 6.

Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego indolo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 7.

Etapy 1-6 identyczne jak w przykładzie 5

Etap 7. Synteza trójfluorooctanu estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu (L-tert-butyloglicylo-Loktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego. Do kolby okrągłodennej odważa się 0,03 g (0,04 mmol) produktu otrzymanego w etapie 6 i rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały ilościowo produkt w postaci żółtego olej służy, jako substrat wyjściowy w etapie 8.

Etap 8. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-2-(4-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie VII produktu TFA*Tleu-Oic-nVal^P(OC6H4-4-SCH₃)₂ 0,03 g (0,04 mmola) dodaje się 0,014 g (0,05 mmola) kwasu 2-(4-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)octowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,013 g (0,1 mmola) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,026 g (0,05 mmola) PyBOB. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,021 g (wydajność 45%). Wzór sumaryczny: C47H64O1qN₃PS₂. Masa cząsteczkowa: 926,13 g/mol.

PL 227 833 B1

Etap 9. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego indolo)aminobutanofosfonowego. Powstały w etapie 7 produkt (0,021 g; 0,02 mmol) rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,017 g (wydajność 98%). Wzór sumaryczny: C43H56O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 829,96 g/mol. Rf = 0,1, (eter naftowy: AcOEt, 1:5, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCb) S7.63 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.28-6.71 (m, 12H), 4.83-4.54 (m, 4H), 4.47 (d, J = 16.0 Hz, 1H), 4.154.06 (m, 1H), 3.52 (s, 1H), 2.77 (s, 1H), 2.55-2.45 (m, 6H), 2.28-2.16 (m, 2H), 2.10-1.67 (m, 8H), 1.65-1.26 (m, 6H), 0.98 (s, 9H), 0.950.87 (m, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCI3) S 19.44 (s). HRMS: otrzymano z (C43H₅6N3O10PS2)Na+, 892.3043; znaleziono 892.3041.

P r z y k ł a d 7.

Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 8.

Etapy 1-7 identyczne jak w przykładzie 5.

Etap 8. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tertbutyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie VII produktu TFA*Tleu-Oic- nVal^P(OC6H4-4-SCH3)2 0,03 g (0,04 mmola) dodaje się 0,01 g (0,08 mmola) kwas piperazynowy. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,013 g (0,1 mmola) diizopropyloetyloaminy. Po 5minutach dodaje się 0,026 g (0,05 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuj e formę białego osadu o masie 0,015 g (wydajność 48%). Wzór sumaryczny: C38H50O6N5PS2. Masa cząsteczkowa: 767,94 g/mol. Rf = 0,04, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCI3) S 9.40 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.39 (d, J = 9.5 Hz, 1H), 7.45-7.34 (m, 2H), 7.26-7.11 (m, 6H), 4.79-4.76 (m, 1H), 4.50-4.33 (m, 2H), 2.72 (s, 2H), 2.48 (s, 6H), 2.31-2.26 (m, 1H), 2.08-1.98 (m, 2H), 1.82-1.72 (m, 6H), 1.49-1.28 (m, 6H), 1.15 (s, 9H), 1.00-0.95 (m, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) S 18.07 (s). HRMS: otrzymano z (C38H50N5O6PS2)Na⁺, 790.2838; znaleziono 790.2827.

P r z y k ł a d 8. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 9.

Etapy 1 -7 identyczne jak w przykładzie 5.

Etap 8. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-oktahydro-1H-indolo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie VII produktu TFA*Tleu-Oic-nVal^P(OC6H4-4-SCH3)2 0,03 g (0,04 mmola) dodaje się 0,013 g (0,05 mmol) z (S)-2-cykloheksyl-2-(pyrazylo-2-karboksyamido)octowy kwas. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,013 g (0,1 mmola) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,026 g (0,05 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,013 g (wydajność 29%). Wzór sumaryczny: C46H63O7N6PS2. Masa cząsteczkowa: 907,14 g/mol. ¹H NMR (601 MHz,

PL 227 833 B1

CDCla) δ 9.45 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.60 (s, 1H), 8.30 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.24-7.10 (m, 8H), 4.85-4.77 (m, 1H), 4.65 (d, J = 9.2 Hz, 1H), 4.60-4.40 (m, 2H), 4.29-4.23 (m, 1H), 2.5 (d, J = 6.7 Hz, 6H), 2.081.86 (m, 6H), 1.81-1.61 (m, 12H), 1.49-1.38 (m, 3H), 1.20-1.07 (m, 7H), 0.98 (s, 9H), 0.90 (t, J = 7.4 Hz, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCI3) δ 18.48 (s). HRMS: otrzymano z (C46H63N6O7PS2W, 929.3835; znaleziono 929.3832.

P r z y k ł a d 9. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 10.

Etap 1. Synteza estru metylowego kwasu (1R,2S,5S)-3-((S)-2-((tert-butoksykarbonyl)amino)-3,3-dimetylobutano)-6,6-dimetylo-3-azabicyklo[3.1.0]heksanowego. W mieszaninie DCM/DMF (25 mL, 1:1, v/v) rozpuszczono 0,55 g Boc-Tleu-OH (2,36 mmol) następnie dodano 0,44 g (1 R,5R)-3-(metoksykarbonyl)-6,6-dimetyl-2-azabicyklo[3.1.0]heksan-2-ium chlorku (2,16 mmol); 0,66 g NMM (6,5 mmol) oraz 1,12 g PyBOP (2,16 mmol). Reakcja prowadzona była przez 24 godziny na mieszadle magnetycznym w temperaturze pokojowej. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodano 5% roztwór kwasu cytrynowego (20 mL). Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto DCM (3x20 mL). Połączone frakcje organiczne przemyto kolejno: 5% roztworem kwasu cytrynowego (20 mL), wodą (20 mL), 5% roztworem wodorowęglanu sodu oraz solanką. Warstwę organiczną suszono bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono a następnie odparowano. Surowy produkt oczyszczono za pomocą techniki chromatografii kolumnowej. Otrzymano 0,49 g (wydajność 59%) produktu w postaci bezbarwnego oleju. Wzór sumaryczny: C20H34O5N2. Masa cząsteczkowa: 382,50 g/mol.

Etap 2. Synteza kwasu (1R,2S,5S)-3-((S)-2-((tert-butoksykarbonyl)amino)-3,3-dimetylobutano)-6,6-dimetylo-3-azabicyklo[3.1.0]heksanowego. W mieszaninie MeOH/THF/H2O (10 mL, 1:1:1, v/v/V) rozpuszczono 0,1 g (0,26 mmol) produktu otrzymanego w etapie 1. Następnie dodano 260 liL 1M roztworu LiOH w wodzie (0,26 mmol). Przebieg reakcji monitorowano przy użyciu techniki TLC. Po zakończeniu reakcji (2-3 godziny) do mieszaniny reakcyjnej dodano 5% roztwór kwasu cytrynowego i doprowadzono do pH=4. Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto DCM (3x20 mL). Połączone frakcje organiczne przemyto kolejno: 5% roztworem kwasu cytrynowego (20 mL), wodą (20 mL), 5% roztworem wodorowęglanu sodu oraz solanką. Warstwę organiczną suszono bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono a następnie odparowano. Surowy produkt w postaci bezbarwnego oleju (0,09 g, wydajność: 94%) użyty został do syntezy w następnym etapie. Rf = 0,06 (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). HRMS: otrzymano z (C1gH₃2N2O5)Na+, 391.2209; znaleziono: 391.2211.

Etap 3. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu (-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie II produktu 0,09 g (0,24 mmol) dodaje się 0,12 g (0,25 mmola) bromowodorku estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,081 g (0,63 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,15 g (0,28 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,11 g (wydajność 61%). Wzór sumaryczny: C₃7H54O₇N₃PS2. Masa cząsteczkowa: 747,95 g/mol. Rf = 0,12, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v).

Etap 4. Synteza trifluorooctanu estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu (-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego. Powstały w etapie III produkt (0,1 g; 0,13 mmol) rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy, jako substrat wyjściowy w następnym etapie.

Etap 5. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-(N-2-(4-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie IV produktu 0,08 g (0,1 mmol) dodaje się 0,028 g (0,1 mmola) kwasu 2-(4-(2-(tert10

PL 227 833 B1 butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)octowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,026 g (0,2 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,052 g (0,1 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,04 g (wydajność 44%). Wzór sumaryczny: C46H62O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 912,11 g/mol.

Etap 6. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego.

Powstały w etapie V produkt (0,04 g; 0,04 mmol) rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 88%). Wzór sumaryczny: C42H54O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 856,00 g/mol Rf = 0,03, (eter naftowy: AcOEt, 1:3, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCI3) 8 7.67-6.67 (m, 12H), 5.62 (s, 1H), 5.41-5.27 (m, 1H), 5.03 (s, 1H), 4.83 (s, 2H), 4.58 (s, 1H), 4.34-4.28 (m, 1H), 3.62-3.46 (m, 3H), 3.33-3.21 (m, 1H), 2.58 (s, 6H), 1.90-1.60 (m, 4H), 1.32-1.22 (m, 1H), 1.10-0.95 (m, 13H), 0.81 (s, 6H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCla) 8 20.31 (s). HRMS: otrzymano z (C42H₅4NaOgPS2)Na+ 862.2937; znaleziono 862.2940.

P r z y k ł a d 10. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tert-butyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 11.

Etap 1. Identyczny jak w przykładzie 9.

Etap 2. Powstały w etapie I produkt (0,1 g; 0,26 mmol) rozpuszcza się w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju o masie 0,09 g (wydajność 87%). Który używa się w następnym etapie. Wzór sumaryczny: C17H27O5N2F3. Masa cząsteczkowa: 396,41 g/mol.

Etap 3. Synteza estru metylowego (S)-2-(pirazyno-2-karboksyamido)-2-cykloheksyloglicyny. Do powstałego w etapie II produktu 0,04 g (0,1 mmol) dodaje się 0,02 g (0,16 mmola) kwasu piperazynowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,026 g (0,2 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,052 g (0,1 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 77%). Wzór sumaryczny: C20H28O4N4. Masa cząsteczkowa: 388,47 g/mol.

Etap 4. Synteza kwasu (S)-2-(pirazyno-2-karboksyamido)-2-cykloheksyloglicyny. W mieszaninie MeOH/THF/H2O (10 mL, 1:1:1, v/v/v) rozpuszczono 0,03 g (0,08 mmol) produktu otrzymanego w etapie III. Następnie dodano 80 μL 1M roztworu LiOH w wodzie (0,08 mmol). Przebieg reakcji monitorowano przy użyciu techniki TLC. Po zakończeniu reakcji (2-3 godziny) do mieszaniny reakcyjnej dodano 5% roztwór kwasu cytrynowego i doprowadzono do pH=4. Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto DCM (3x20 mL). Połączone frakcje organiczne przemyto kolejno: 5% roztworem kwasu cytrynowego (20 mL),

PL 227 833 B1 wodą (20 mL), 5% roztworem wodorowęglanu sodu oraz solanką. Warstwę organiczną suszono bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono a następnie odparowano. Surowy produkt w postaci bezbarwnego oleju (0,03 g, wydajność: 100%) użyty został do syntezy w następnym etapie.

Etap 5. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tertbutyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie IV produktu 0,03 g (0,08 mmol) dodaje się 0,06 g (0,12 mmola) bromowodorku estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,027 g (0,21 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,075 g (0,14 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 50%). Wzór sumaryczny: C37H48O6N5PS2. Masa cząsteczkowa: 753,91 g/mol. Rf = 0,06, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCl3) 8 9.38 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.39 (d, J = 9.8 Hz, 1H), 7.26-7.11 (m, 8H), 6.82 (d, J = 10.1 Hz, 1H), 4.88-4.80 (m, 1H), 4.79 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.27 (s, 1H), 4.05 (d, J = 10.3 Hz, 1H), 2.47 (d, J = 2.8 Hz, 6H), 2.07-1.92 (m, 1H), 1.83-1.71 (m, 2H), 1.69-1.54 (m, 6H), 1.52-1.42 (m, 1H), 1.11 (s, 6H), 1.04 (s, 3H), 0.96 (t, J = 7.3 Hz, 3H), 0.84 (s, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) 8 18.52. HRMS: otrzymano z (C37H48N5O6PS2)Na+,776.2681; znaleziono 776.2681.

P r z y k ł a d 11. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 12.

Etap 1-2. Identyczne jak w przykładzie 10.

Etap 3. Synteza estru metylowego kwasu (1R,2S,5S)-3-((S)-2-((S)-2-cykloheksylo-2-(pirazyno-2-karboksyamido)acetamido)-3,3-dimetylobutylo)-6,6-dimetylo-3-azabicyklo[3.1.0]heksanowego. Do powstałego w etapie II produktu 0,04 g (0,1 mmol) dodaje się 0,042 g (0,16 mmola) (S)-2-(pirazyno-2-karboksyamido)-2-cykloheksyloglicynę. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,026 g (0,2 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,052 g (0,1 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 57%). Wzór sumaryczny: C28H41O5N5. Masa cząsteczkowa: 527,67 g/mol.

Etap 4. Synteza kwasu (1R,2S,5S)-3-((S)-2-((S)-2-cykloheksylo-2-(pirazyno-2-karboksyamido)acetamido)-3,3-dimetylobutylo)-6,6-dimetylo-3-azabicyklo[3.1.0]heksanowy. W mieszaninie MeOH//THF/H2O (10 mL, 1:1:1, v/v/v) rozpuszczono 0,03 g produktu (0,06 mmol) otrzymanego w etapie III. Następnie dodano 60 μL 1M roztworu LiOH w wodzie (0,06mmol). Przebieg reakcji monitorowano przy użyciu techniki TLC. Po zakończeniu reakcji (2-3 godziny) do mieszaniny reakcyjnej dodano 5% roztwór kwasu cytrynowego i doprowadzono do pH=4. Następnie mieszaninę reakcyjną przemyto DCM (3x20 mL). Połączone frakcje organiczne przemyto kolejno: 5% roztworem kwasu cytrynowego (20 mL), wodą (20 mL), 5% roztworem wodorowęglanu sodu oraz solanką. Warstwę organiczną suszono bezwodnym siarczanem magnezu, przesączono a następnie odparowano. Surowy produkt w postaci bezbarwnego oleju (0,03 g, wydajność: 100%) użyty został do syntezy w następnym etapie. Wzór sumaryczny: C27H39O5N5. Masa cząsteczkowa: 513,67 g/mol.

Etap 5. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-dimetylocyklopropyloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie IV produktu 0,03 g (0,06 mmol) dodaje się 0,06 g (0,12 mmola) bromowodorku estru

PL 227 833 B1 di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,027 g (0,21 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,075 g (0,14 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 56%). Wzór sumaryczny: C45H61O7N6PS2. Masa cząsteczkowa: 893,11 g/mol. Rf = 0,10, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCI3) 8 9.42 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.32 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.26-7.06 (m, 8H), 6.88-6.78 (m, 1H), 4.90-4.77 (m, 1H), 4.65 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.48-4.42 (m, 1H), 3.97 (d, J = 10.6 Hz, 1H), 3.87-3.77 (m, 1H), 2.50-2.45 (m, 6H), 2.10-1.96 (m, 3H), 1.92-1.55 (m, 9H), 1.54-1.43 (m, 2H), 1.30-1.04 (m, 8H), 1.02-0.95 (m, 5H), 0.95-0.86 (m, 10H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) 8 18.44 (s). HRMS: otrzymano z (C45H61N6O₇PS₂)Na+, 915.3679; znaleziono 915.3676.

P r z y k ł a d 12. Sposób wytwarzania 2-(4-(2-(((S)-1-((2S,3aS,6aS)-2-(((S)-1-(bis(4-(metylotio)fenoksy izopropyl)butyl)karbamoyl)heksahydroksycyklopenta[b]pyrrol-1(2H)-yl)-3,3-dimetyl-1-oksobutan-2-yl)amino)-2-oksoetoksy)fenoksy) kwas octowy przedstawionego wzorem 13.

Etap 1. Synteza estru tert-butylowego kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-(((benzyloksy)karbonylo)amino)-3,3-dimetylobutano)oktahydrocyklopenta[c]pirolowego. Do kolby okrągłodennej wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważa się ester t-butylowy szczawianu dicykloproliny (0,4 g), który zawiesza się w 20 ml octanu etylu. Następnie do mieszaniny dodaje się 15 ml H₂O oraz 4 g K2CO3. Mieszaninę pozostawia się na mieszadle przez 0,5 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie, mieszaninę przenosi się do rozdzielacza i oddziela fazę organiczną którą przemywa się 5 ml 25% K₂CO3 oraz 5 ml solanki oraz suszy bezwodnym MgSO4.

Do osobnej kolby wyposażonej w mieszadło magnetyczne odważono Cbz-tBuGly-OH-DCHA (0,6 g), zawieszono w eterze tert-butylometyIowym i dodano 20 ml 0,86 M roztworu H₂SO4. Mieszaninę pozostawia się na mieszadle przez 0,5 h w temperaturze pokojowej. Po tym czasie, mieszaninę przeniesiono do rozdzielacza i oddzielono fazę organiczną, którą przemyto 5 ml H₂O oraz 5 ml solanki oraz wysuszono bezwodnym MgSO4. Następnie do fazy organicznej dodano 6 ml NMM oraz odparowano eter na wyparce rotacyjnej.

W osobnej kolbie umieszczono 20 ml NMM w której rozpuszczono EDC-HCl (260 mg) oraz HOBt (204 mg). Kolbę umieszczono na łaźni lodowej i dodano Cbz- tBuGly-OH w NMM. Następnie po godzinie dodano ester t-butylowy dicykloproliny rozpuszczony w octanie etylu. Reakcję prowadzi się przez 24 godziny w temperaturze pokojowej. Po tym czasie do mieszaniny reakcyjnej dodaje się 30 ml octanu etylu oraz 20 ml 1M HCl i pozostawia na mieszadle magnetycznym przez 0,5 godziny. Oddzieloną fazę organiczną przemywa się 10 ml 25% K₂CO3 oraz 10 ml solanki i suszy bezwodnym MgSO4.

Po przesączeniu odparowuje się dichlorometan a powstały żółty olej oczyszcza się przy pomocy chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy: octan etylu; 1:1, v/v. Frakcje zawierające produkt odparowano otrzymując 0,1 g (65%) bezbarwnego oleju. Wzór sumaryczny: C₂6H38O5N₂. Masa cząsteczkowa: 458,60 g/mol.

Etap 2. Synteza estru tert-butylowy kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-amino)-3,3-dimetylobutano)oktahydrocyklopenta[c]pirolowego. 0,1 g produktu z etapu 1 rozpuszczono w 20 mL metanolu. Dodano 0,1 g 10% palladu na węglu. Reakcję prowadzono przez dwie godziny przepuszczając gazowy wodór. Postęp reakcji monitorowano używając chromatografii cienkowarstwowej-TLC. Po zakończeniu reakcji, na lejku z silica żelem oraz celitem odsączono katalizator. Przesącz odparowano. Otrzymano produkt w postaci bezbarwnego oleju o masie 0,07 g (wydajność 100%).

Etap 3. Synteza estru tert-butylowy kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-(2-(4-(2-(benzyloksy)-2-oksyetoksy)fenoksy)acetamido)-3,3-dimetylobutylo)oktahydrocyklopenta[c]pirolowego. Do powstałego w etapie II produktu 0,03 g (0,1 mmol) dodaje się 0,05 g (0,16 mmola) kwas 2-(4-(2-(tert-butoksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)octowy. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,026 g (0,2 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,052 g (0,1 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml),

PL 227 833 B1 dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,03 g (wydajność 57%). Wzór sumaryczny: C35H46O8N2. Masa cząsteczkowa: 622,76 g/mol.

Etap 4. Synteza kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-(2-(4-(2-(benzyloksy)-2-oksyetoksy)fenoksy)acetamido)-3,3-dimetylobutylo)oktahydrocyklopenta[c]pirolowy. W kolbie umieszcza się 0,03 g (0,05 mmol) produktu otrzymanego w etapie 3 i rozpuszcza w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy, jako substrat wyjściowy w następnym etapie syntezy.

Etap 5. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(2-(benzyloksy)-2-oksoetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-dicykloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie IV produktu 0,03 g (0,05 mmol) dodaje się 0,03 g (0,06 mmola) bromowodorku estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,014 g (0,1 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,038 g (0,07 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,025 g (wydajność 53%). Wzór sumaryczny: C49H60O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 946,12 g/mol.

Etap 6. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-2-(4-(karboksymetoksy)fenoksy)acetylo-L-tert-butyloglicylo-L-dicykloprolilo)aminobutanofosfonowego. Otrzymany w etapie V produkt (0,025 g; 0,026 mmol) rozpuszcza się w 33% procentowym roztworze kwasu bromowodorowego w kwasie octowym. Po dwóch godzinach odparowuje się lotne składniki mieszaniny reakcyjnej a powstały olej zalewa się eterem dietylowym. Powstałą mieszaninę przenosi się na probówki typu falcon i woruje przez 5 min. Czynność powtarza się trzykrotnie. Otrzymany osad rozpuszcza się w mieszaninie acetonitryl/woda i liofilizuje. Otrzymuje się produkt w postaci białego osadu o masie 0,01 g (wydajność: 45%). Wzór sumaryczny: C42H54O10N3PS2. Masa cząsteczkowa: 856,00 g/mol. Rf = 0,09, (eter naftowy: AcOEt, 1:3, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCb) 87.42-7.33 (m, 5H), 7.26-7.08 (m, 8H), 6.88 (s, 4H), 5.26 (s, 2H), 4.84-4.74 (m, 1H), 4.70 (d, J = 9.1 Hz, 1H), 4.65 (s, 2H), 4.54-4.44 (m, 3H), 3.80-3.74 (m, 2H), 3.52 (s, 2H), 2.96-2.90 (m, 1H), 2.84-2.76 (m, 1H), 2.47 (s, 6H), 2.10-1.37 (m, 12H), 1.06-0.90 (m, 10H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCla) 818.67 (s). HRMS: otrzymano z (C49H60NaO10PS₂)Na+, 968.3356; znaleziono 968.3360.

P r z y k ł a d 13. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tert-butyloglicylo-L-dicykloprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 14.

Etap 1-2. Identyczne jak w przykładzie 12.

Etap 3. Synteza estru tert-butylowy kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-3,3-dimetylo-2-(pirazyno-2-karboksyamido)butano)oktahydrocyklopenta[c]pirolowego. Do powstałego w etapie II produktu 0,03 g (0,1 mmol) dodaje się 0,02 g (0,16 mmola) kwasu piperazynowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,026 g (0,2 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,052 g (0,1 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe

PL 227 833 B1 suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju o masie 0,02 g (wydajność 46%). Wzór sumaryczny: C23H34O4N4. Masa cząsteczkowa: 430,55 g/mol. Rf = 0,31 (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). HRMS: otrzymano z (C₂3H34N4O4)Na+, 453.2478; znaleziono: 453.2484.

Etap 4. Synteza kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-(((benzyloksy)karbonylo)amino)-3,3-dimetylobutano)oktahydrocyklopenta[c]pirolowy. W kolbie umieszcza się 0,02 g (0,05 mmol) produktu otrzymanego w etapie 3 i rozpuszcza w dichlorometanie (5 ml), a następnie dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy, jako substrat wyjściowy w następnym etapie syntezy.

Etap 5. Synteza estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-tertbutyloglicylo-L-dicykloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie 4 produktu 0,02 g (0,05 mmol) dodaje się 0,03 g (0,06 mmola) bromowodorku estru di-(4-sulfidometylofenylowego) kwasu aminobutylofosfonowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,014 g (0,1 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,038 g (0,07 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,019 g (wydajność 50%). Wzór sumaryczny: C37H48O6N5PS2. Masa cząsteczkowa: 753,91 g/mol. Rf = 0,02, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCI3) 8 9.40 (s, 1H), 8.79 (s, 1H), 8.61 (s, 1H), 8.46 (d, J = 9.3 Hz, 1H), 7.26-7.11 (m, 8H), 7.09-6.98 (m, 1H), 4.86 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.84-4.75 (m, 1H), 4.48 (s, 1H), 3.85 (d, J = 5.9 Hz, 2H), 2.97-2.90 (m, 1H), 2.86-2.79 (m, 1H), 2.49 (d, J = 7.3 Hz, 6H), 2.07-1.89 (m, 3H), 1.82-1.73 (m, 2H), 1.68-1.50 (m, 4H), 1.49-1.41 (m, 1H), 1.06 (s, 9H), 0.98 (t, J = 7.3 Hz, 3H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCb) 8 18.83 (s). HRMS: otrzymano z (C37H48N₅O6PS2)Na+, 776.2681; znaleziono 776.2678.

P r z y k ł a d 14. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1-N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-dicykloprolilo)aminobutanofosfonowego przedstawionego wzorem 15.

Etap 1-2. Identyczne jak w przykładzie 12.

Etap 3. Synteza estru tert-butylowego kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-((S)-2-cykloheksylo-2-(pirazyno-2-karboksyamido)acetamido)-3,3-dimetylobutano)oktahydrocyklopenta[c]pirolowego. Do powstałego w etapie II produktu 0,03 g (0,1 mmol) dodaje się 0,04 g (0,16 mmola) (S)-2-(pirazyno-2-karboksyamido)-2-cykloheksyloglicynę. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,026 g (0,2 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,052 g (0,1 mmol) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 2:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju o masie 0,02 g (wydajność 35%). Wzór sumaryczny: C31H47O5N5. Masa cząsteczkowa: 569,75 g/mol. Rf = 0,28 (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). HRMS: otrzymano z (C31H47NsO5)H+, 570.3655; znaleziono: 570.3663.

Etap 4. Synteza kwasu (1S,3aS,6aR)-2-((S)-2-((S)-2-cykloheksylo-2-(pirazyno-2-karboksyamido)acetamido)-3,3-dimetylobutano)oktahydrocyklopenta[c]pirolowego. W kolbie umieszcza się 0,02 g (0,03 mmol) produktu otrzymanego w etapie 3 i rozpuszcza w dichlorometanie (2,5 ml), następnie

PL 227 833 Β1 dodaje się powoli kwasu trójfluorooctowego (2,5 ml). Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 2 godziny, a jej przebieg monitoruje się metodą chromatografii cienkowarstwowej. Następnie lotne składniki mieszaniny poreakcyjnej usuwa się na wyparce obrotowej, uzyskany olej rozpuszcza się w toluenie i ponownie odparowuje. Czynność tą powtarza się trzykrotnie. Powstały olej służy jako substrat wyjściowy w następnym etapie syntezy.

Etap 5. Sposób wytwarzania estru di-(4-metylosulfidofenylowy) kwasu 1 -N-D-(N-pirazyloksykarbonylo-L-cykloheksyloglicylo-L-tert-butyloglicylo-L-dicykloprolilo)aminobutanofosfonowego. Do powstałego w etapie IV produktu 0,02 g (0,03 mmol) dodaje się 0,03 g (0,06 mmola) bromowodorku estru di(4-sulfidometylofenylowego) kwasu-aminobutylofosfonowego. Całość rozpuszcza się w DMF (~5 ml). Odczekuje się 2 minuty i dodaje się 0,014 g (0,1 mmol) diizopropyloetyloaminy. Po 5 minutach dodaje się 0,038 g (0,07 mmola) PyBOP. Reakcję prowadzi się w temperaturze pokojowej przez 12 godzin. Następnie mieszaninę reakcyjną rozcieńcza się octanem etylu (30 ml). Warstwę octanową przemywa się kolejno: dwukrotnie wodą (50 ml), dwukrotnie 5% roztworem kwasu cytrynowego (10 ml), solanką (10 ml), dwukrotnie 5% roztworem wodorowęglanem sodu (10 ml) i solanką (10 ml). Frakcje octanowe suszy się bezwodnym siarczanem magnezu. Odparowuje się lotne rozpuszczalniki, a następnie produkt oczyszcza się metodą chromatografii kolumnowej stosując, jako eluent eter naftowy/octan etylu w stosunku objętościowym 1:1. Po zebraniu frakcji zawierających oczekiwany produkt, lotne rozpuszczalniki odparowuje się na wyparce rotacyjnej. Otrzymuje się oczekiwany produkt w postaci bezbarwnego oleju, który po liofilizacji przyjmuje formę białego osadu o masie 0,015 g (wydajność 56%). Wzór sumaryczny: C45H61O7N6PS2. Masa cząsteczkowa: 893,11 g/mol. Rf = 0,06, (eter naftowy: AcOEt, 1:1, v/v). ¹H NMR (601 MHz, CDCIs) 59.41 (s, 1H), 8.78 (s, 1H), 8.58 (s, 1H), 8.34 (d, J = 8.6 Hz, 1H), 7.26-7.07 (m, 8H), 6.75 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 6.50 (d, J = 9.6 Hz, 1H), 4.83-4.75 (m, 1H), 4.72 (d, J = 9.7 Hz, 1H), 4.47 (t, J = 7.9 Hz, 1H), 3.79-3.75 (m, 1H), 3.69 (t, J = 9.2 Hz, 1H), 3.02-2.95 (m, 1H), 2.82-2.76 (m, 1H), 2.48 (d, J= 12.9 Hz, 6H), 2.08-1.88 (m, 4H), 1.82-1.63 (m, 8H), 1.54-1.41 (m, 3H), 1.33-1.22 (m, 4H), 1.171.06 (m, 3H), 0.98 (t, J = 7.4 Hz, 3H), 0.94 (s, 9H). ³¹P NMR (243 MHz, CDCIs) 518.52 (s). HRMS: otrzymano z (C4sH6iN6O7PS₂)Na⁺, 915.3679; znaleziono 915.3679.

Przykład 15

Aktywność biologiczną peptydowych pochodnych estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego o wzorach od II do XV (stosując ich czyste formy diastereoizomeryczne) przebadano pod kątem ich zdolności do hamowania proteolitycznej aktywności proteazy NS3/4A ekspresjonowanej przez ludzki wirus zapalenia wątroby typu C. Wszystkie badania przeprowadzono stosując fluorescencyjny substrat Ac-Asp-Glu-Asp(EDANS)-Glu-Glu-Abu-\y-[COO]-Ala-Ser-Lys(DABCYL)NH₂ (wzbudzenie 350 nm, emisja 460 nm). Pomiar przeprowadzono w temperaturze 37°C przy użyciu spektrofluorymetru płytkowego.

No.	R:	Diastereoizomer	Proteaza NS3/4A
Genotyp la	Genotyp Ib
% inhibicji przy C\|= 100 μΜ	% inhibicji przy Q= 100 μΜ

			O' O,_

PL 227 833 Β1

II		s	3	6
III	Γγ°Α· o	s	7	8
IV	cA	s	11	13
V		s	11	8

VI	>*Λ	s	4	3
VII	□	s	5	8
VIII	cA N	5	11	13
IX	H	S	14	12

X	0	s	4	8
XI	ćA u	s	19	22
XII	(/%·	s	28	31

^r-n A-JL -A -o

C? Sa

XIII	0	5	8	4
XIV	cA	5	18	19
XV	ęAA	S	30	25

Tabela 1. Aktywność biologiczna związków oznaczonych wzorem II—XV względem proteazy NS3/4A genotyp 1a oraz NS3/4A genotyp 1b

Claims

1. Peptydowe pochodne S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I, w którym w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, dimetylocyklopropylową pochodną proliny lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna.

2. Sposób wytwarzania peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych przedstawionych wzorami II—IX oraz wzorem ogólnym I, w którym w którym R1 oznacza analog proliny: pierścień piperydyny, pierścień oktadehydroindolu, R2 oznacza resztę tert-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna, znamienny tym, że fosforyn triarylowy, otrzymany z fenolu para-merkaptometylowego oraz chlorku fosforu (III) w acetonitrylu, poddaje się amidoalkilowaniu przy użyciu karbaminianu benzylu, fosforynu tri-(4-merkaptometylo)fenylowego oraz aldehydu n-butylowego, w acetonitrylu jako rozpuszczalniku stosując jako katalizator kompleks eteratu kwasu tetrafluoroborowego, po czym prowadzi się syntezę bromowodorku, w której odblokowuje się ochronną grupę benzyloksykarbonylową (Cbz) przy użyciu 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym, w kolejnym etapie otrzymany bromowodorek estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego poddaje się reakcji z proliną z zablokowaną grupą α-aminową a reakcję sprzęgania prowadzi się w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanembenzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i acetonitrylem jako rozpuszczalnikiem, w następnym etapie z otrzymanego fosfonodipeptydu, usuwa się grupę blokującą tert-butyloksykarbonylową (Y-Boc) przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2CL), po czym odblokowany dipeptyd estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego poddaje się reakcji z tert-butyloglicyną z zablokowaną grupą α-aminową w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanem benzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i acetonitrylem jako rozpuszczalnikiem, ostatnim etapem jest usunięcie grupy tert-butyloksykarbonylowej (Y-Boc) przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2CL), a otrzymany produkt poddaje się reakcji sprzęgania z trzema różnymi grupami: kwasem pirazynokarboksylowym, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowycykloheksyloglicyna, w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanem benzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i N,N-dimetyloformamidem jako rozpuszczalnikiem.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że w przypadku syntezy pochodnej hydrochinonu prowadzi się finalną deprotekcję estru fe/Y-butylowego przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2CL).

4. Sposób wytwarzania peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1-aminoalkanofosfonowych przedstawionych wzorami X-XV oraz wzorem ogólnym I, w którym R1 oznacza analog proliny: dimetylocyklopropyloprolinę lub bicykliczną pochodną proliny, R2 oznacza resztę fe/Y-butyloksykarbonylową, kwasu pirazynokarboksylowego, pochodną hydrochinonu lub dipeptydową pochodną: kwas pirazynokarboksylowy-cykloheksyloglicyna, znamienny tym, że uprzednio przygotowany peptydowy fragment poddaje się reakcji sprzęgania z bromowodorkiem estru di(4-merkaptometylo)fenylowego kwasu 1-aminobutanofosfonowego w obecności N,N-diizopropyloetyloaminy (DIPEA) oraz heksafluorofosforanem benzotriazol-1-yl-oksytripirolidinofosfonianu (PyBOP) jako odczynnikiem sprzęgającym i N,N-dimetyloformamidem jako rozpuszczalnikiem.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że w przypadku syntezy pochodnej hydrochinonu prowadzi się deprotekcję estru fe/Y-butylowego dla związku o wzorze X przy użyciu 50% roztworu kwasu trójfluorooctowego (TFA) w dichlorometanie (CH2CL) lub estru benzylowego dla związku o wzorze XIII przy użyciu 33% roztworu kwasu bromowodorowego w kwasie octowym.

PL 227 833 Β1

6. Zastosowanie peptydowych pochodnych S-enancjomerów estrów diarylowych kwasów 1 -aminoalkanofosfonowych o wzorze ogólnym I określonych w zastrzeżeniu 1 jako nieodwracalnych inhibitorów proteazy NS3/4A o genotypach 1a oraz 1b.