PL227931B1 - Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią - Google Patents
Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią Download PDFInfo
- Publication number
- PL227931B1 PL227931B1 PL402291A PL40229112A PL227931B1 PL 227931 B1 PL227931 B1 PL 227931B1 PL 402291 A PL402291 A PL 402291A PL 40229112 A PL40229112 A PL 40229112A PL 227931 B1 PL227931 B1 PL 227931B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mirna
- expression
- mir
- seq
- hsa
- Prior art date
Links
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 title claims description 39
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 title claims description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 14
- KIWQWJKWBHZMDT-UHFFFAOYSA-N homocysteine thiolactone Chemical compound NC1CCSC1=O KIWQWJKWBHZMDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 17
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 claims description 12
- 210000003038 endothelium Anatomy 0.000 claims description 11
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 claims description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 claims description 8
- 108091066896 Homo sapiens miR-331 stem-loop Proteins 0.000 claims description 6
- 208000033892 Hyperhomocysteinemia Diseases 0.000 claims description 6
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000013068 control sample Substances 0.000 claims description 4
- 230000003225 hyperhomocysteinemia Effects 0.000 claims description 4
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 4
- FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N L-homocysteine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCS FFFHZYDWPBMWHY-VKHMYHEASA-N 0.000 description 20
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 14
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 13
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 208000024172 Cardiovascular disease Diseases 0.000 description 12
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 9
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 9
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 9
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 8
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000013614 RNA sample Substances 0.000 description 5
- 238000011161 development Methods 0.000 description 5
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 5
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 5
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 4
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 4
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 4
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 4
- 238000002493 microarray Methods 0.000 description 4
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- OROGUZVNAFJPHA-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-2,4-dimethyl-2H-thiophen-5-one Chemical compound CC1SC(=O)C(C)=C1O OROGUZVNAFJPHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N S-adenosyl-L-methioninate Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](C[S+](CC[C@H](N)C([O-])=O)C)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 MEFKEPWMEQBLKI-AIRLBKTGSA-N 0.000 description 3
- 229960001570 ademetionine Drugs 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000011848 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine S-Methyltransferase Human genes 0.000 description 2
- 108010075604 5-Methyltetrahydrofolate-Homocysteine S-Methyltransferase Proteins 0.000 description 2
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 2
- 102100034343 Integrase Human genes 0.000 description 2
- 108010003060 Methionine-tRNA ligase Proteins 0.000 description 2
- 102000000362 Methionyl-tRNA synthetases Human genes 0.000 description 2
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 2
- 108010092799 RNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 2
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 2
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 2
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 2
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 1
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 1
- 102100034976 Cystathionine beta-synthase Human genes 0.000 description 1
- 108010073644 Cystathionine beta-synthase Proteins 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000206602 Eukaryota Species 0.000 description 1
- 102100032839 Exportin-5 Human genes 0.000 description 1
- 206010016880 Folate deficiency Diseases 0.000 description 1
- 208000010188 Folic Acid Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 101000847058 Homo sapiens Exportin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000869796 Homo sapiens Microprocessor complex subunit DGCR8 Proteins 0.000 description 1
- 101000619708 Homo sapiens Peroxiredoxin-6 Proteins 0.000 description 1
- 108091067995 Homo sapiens miR-192 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 1
- 208000032382 Ischaemic stroke Diseases 0.000 description 1
- 241000721701 Lynx Species 0.000 description 1
- 102100032459 Microprocessor complex subunit DGCR8 Human genes 0.000 description 1
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 102100022239 Peroxiredoxin-6 Human genes 0.000 description 1
- 108091034057 RNA (poly(A)) Proteins 0.000 description 1
- 102000014450 RNA Polymerase III Human genes 0.000 description 1
- 108010078067 RNA Polymerase III Proteins 0.000 description 1
- 102000004389 Ribonucleoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108010081734 Ribonucleoproteins Proteins 0.000 description 1
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000011481 absorbance measurement Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 1
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 1
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 1
- 230000006229 amino acid addition Effects 0.000 description 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 1
- 230000033115 angiogenesis Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 1
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 1
- 230000006472 autoimmune response Effects 0.000 description 1
- 108091007497 betacoronavirus-specific marker domains Proteins 0.000 description 1
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 230000036765 blood level Effects 0.000 description 1
- 210000000748 cardiovascular system Anatomy 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000005779 cell damage Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- 125000004122 cyclic group Chemical group 0.000 description 1
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 1
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000805 cytoplasm Anatomy 0.000 description 1
- 230000006735 deficit Effects 0.000 description 1
- 238000012631 diagnostic technique Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 230000009395 genetic defect Effects 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000035474 group of disease Diseases 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000005802 health problem Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 238000002844 melting Methods 0.000 description 1
- 230000008018 melting Effects 0.000 description 1
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 208000031225 myocardial ischemia Diseases 0.000 description 1
- 230000004770 neurodegeneration Effects 0.000 description 1
- 208000015122 neurodegenerative disease Diseases 0.000 description 1
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 230000001991 pathophysiological effect Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 1
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 description 1
- 108091007428 primary miRNA Proteins 0.000 description 1
- 230000037452 priming Effects 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000012124 rapid diagnostic test Methods 0.000 description 1
- 230000011363 regulation of cellular process Effects 0.000 description 1
- 230000007363 regulatory process Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 150000007970 thio esters Chemical class 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003606 umbilical vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000004906 unfolded protein response Effects 0.000 description 1
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 1
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 1
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi. Rozwiązanie według wynalazku charakteryzuje się innowacyjnym podejściem do problemu szybkiej i nieinwazyjnej diagnostyki ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, które pozwoliłoby na ograniczenie negatywnych skutków pełnoobjawowego stanu chorobowego.
Mimo ogromnego postępu medycyny choroby układu krążenia są wciąż podstawowym zagrożeniem dla zdrowia i życia człowieka, szczególnie w krajach wysoko rozwiniętych. W Polsce jest to najczęstsza przyczyna hospitalizacji. Hiperhomocysteinemią (stan, w którym stężenie całkowitej homocysteiny we krwi przekracza 15 μΜ) jest niezależnym, rozpoznanym czynnikiem ryzyka rozwoju chorób układu krążenia takich jak miażdżyca, choroba niedokrwienna serca, czy udar mózgu. Diagnostyka na wczesnym etapie choroby umożliwiłaby wprowadzenie odpowiedniego leczenia i profilaktyki, zanim dojdzie do poważnych powikłań i długotrwałego leczenia szpitalnego.
Homocysteina (Hcy) jest niebiałkowym aminokwasem - pod względem budowy strukturalnej przypominającym białkowy aminokwas metioninę, od której różni się brakiem grupy metylowej. W organizmie człowieka może ona powstawać jedynie z metioniny dostarczanej wraz z pokarmem. Metionina uwolniona z białek podczas procesu trawienia, wykorzystywana jest przez maszynerię komórkową do syntezy nowych białek oraz S-adenozylometioniny (SAM), która pełni role uniwersalnego donora grupy metylowej. W wyniku reakcji metylacji SAM przekształcana jest do S-adenozylohomocysteiny, która następnie hydrolizowana jest do homocysteiny i adenozyny.
Hcy jest reutylizowana poprzez remetylację do metioniny bądź jest przekształcana w reakcji transsulfurylacji do cysteiny. Hcy może również ulegać konwersji do cyklicznego tioestru - tiolaktonu homocysteiny (HTL). Szlak ten staje się dominującym, gdy remetylacja i transsulfurylacja zostają zaburzone poprzez wystąpienie defektów genetycznych enzymów zaangażowanych w metabolizm Hcy, takich jak syntaza metioniny (MS), syntaza β cystationiny (CBS) czy reduktaza metyIotetrahydrofolianu (MTHFR) lub też na skutek niedoboru kwasu foliowego, witaminy B6 i B12 w diecie.
Homocysteina ze względu na swoje strukturalne podobieństwo do metioniny, może być błędnie rozpoznana przez syntetazę metionylo-tRNA w reakcji aminoacylacji. Jednak dzięki aktywności korekcyjnej tego enzymu, nigdy nie dochodzi do wbudowania Hcy do cząsteczki białka w procesie translacji. W wyniku reakcji korekcyjnej syntetazy metionylo-tRNA z Hcy powstaje tiolakton homocysteiny [1,2].
Podwyższony poziom Hcy we krwi (powyżej 15 μM) jest czynnikiem ryzyka wielu chorób, w tym chorób układu krążenia i neurodegeneracyjnych. W 1997 roku zaproponowano hipotezę, według której konwersja Hcy do HTL inicjuje szlak metaboliczny prowadzący do zmian patologicznych w organizmie [3].
Tiolakton homocysteiny jest cząsteczką wysoce reaktywną i może spontanicznie reagować z białkami, tworząc wiązanie amidowe z ε-aminową grupą reszt lizyny w białku. N-homocysteinylacja białek powoduje upośledzenie ich funkcji poprzez zmiany w drugorzędowej strukturze białek. Funkcja N-Hcy-białka jest tym bardziej zaburzona, im większy procent reszt lizynowych jest zmodyfikowanych przez tiolakton Hcy. Ponadto N-Hcy-białka stają się bardziej podatne na agregację, oraz na uszkodzenia spowodowane utlenianiem [4,5]. Patofizjologiczne konsekwencje N-homocysteinylacji białek obejmują: odpowiedź autoimmunologiczną, toksyczność komórkowa, stres siateczki śródplazmatycznej, aktywację odpowiedzi na niesfałdowane białka [3,5,6] na podstawie danych pochodzących z eksperymentów z użyciem kultur komórkowych dowiedziono, że modyfikacje potranslacyjne białek komórkowych poprzez N-homocysteinylację, inicjują uszkodzenia komórkowe, co może prowadzić do powstawania stanów patologicznych. N-homocysteinylacja białek jest procesem specyficznym wyłącznie dla homocysteiny, ponieważ HTL może powstać w organizmie ludzkim wyłącznie z Hcy [3,5].
Warstwa komórek śródbłonka naczyń krwionośnych odpowiadają za prawidłowe funkcjonowanie układu krwionośnego. Jedną z cech charakterystycznych dla wczesnych stadiów rozwoju miażdżycy jest uszkodzenie warstwy komórek śródbłonka. Wykrycie zmian w funkcjonowaniu śródbłonka jest możliwe dużo wcześniej, niż zaobserwowanie zmian strukturalnych tej tkanki. Wyniki badań przeprowadzonych in vitro oraz in vivo, wskazują, że HTL jest bardziej toksyczny dla komórek śródbłonka niż Hcy. Powoduje on wiele zmian morfologicznych, wywołuje stan zapalny, a także indukuje apoptozę [8,9].
PL 227 931 B1
MikroRNA (miRNA) to krótkie, niekodujące cząsteczki RNA, których występowanie potwierdzono u wielu organizmów. Są one zaangażowane w regulację ekspresji informacji genetycznej. Cząsteczki miRNA w komórkach ssaków mają długość około 22 nukleotydów. Prekursory miRNA, zwane pri-miRNA, transkrybowane są przez polimerazę III RNA w jądrze i są znacznie dłuższe niż dojrzałe cząsteczki. Na końcu 5' mają czapeczkę (ang. cap) oraz sekwencję poli(A) na końcu 3'. Podlegają one obróbce enzymatycznej przy udziale enzymów Drosha i Pasha, co prowadzi do powstania premiRNA. Następnie cząsteczki te przenoszone są przez białko eksportynę 5 do cytoplazmy, gdzie enzym Dicer przycina je do pełnej długości, dojrzałych miRNA. Dojrzałe miRNA włączane jest do rybonukleoproteinowego kompleksu RISC, dzięki czemu może oddziaływać z sekwencją komplementarną w mRNA, powodując jej przecięcie lub zahamowanie translacji. Jedna cząsteczka miRNA może posiadać wiele sekwencji docelowych w mRNA, a także pojedyncza sekwencja mRNA może zawierać wiele miejsc wiązania dla różnych miRNA [10,13].
Z danych literaturowych wiadomo, że miRNA ulegają wysokiej ekspresji w układzie sercowo-naczyniowym. Biorą one udział w regulacji procesów komórkowych takich jak różnicowanie, wzrost czy apoptoza. Przy pomocy eksperymentów z użyciem enzymów kluczowych dla powstawania miRNA (Dicer i Drosha) wykazano, iż cząsteczki te pełnią główne funkcje w regulacji takich procesów jak angiogeneza, proliferacja czy procesy zapalne w obrębie naczyń krwionośnych. Zaburzenia w funkcjonowaniu tych cząsteczek mogą prowadzić do powstania stanów chorobowych [11, 12, 13, 14, 15, 16].
Zgłoszenie patentowe US 2008/0305507 (publ. 2008-11-12) dotyczy enzymatycznej metody oznaczania poziomu całkowitej homocysteiny w próbkach biologicznych, takich jak osocze czy surowica krwi, która charakteryzuje się wysoką specyficznością.
Zgłoszenie patentowe CA2783536 (publ. 2011-06-16) opisuje metodę oceny ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, w oparciu o oznaczenie poziomu przynajmniej dwóch biomarkerów miRNA i/lub przynajmniej trzech biomarkerów białkowych (wybranych z listy podanej przez autorów zgłoszenia patentowego), w badanych próbkach. Poziom oznaczonych markerów molekularnych koreluje z poziomem ryzyka rozwoju chorób układu krążenia człowieka.
Zgłoszenie patentowe WO2010103015 opisuje wykorzystanie miRNA jak i antysensowych oligonukleotydów skierowanych przeciwko konkretnym miRNA, jako narzędzie do diagnostyki i leczenia chorób układu krążenia. Narzędzie to można również stosować również do poszukiwania/selekcji biologicznie aktywnych cząsteczek w celu leczenia i zapobiegania rozwojowi chorób układu krążenia lub w celu określenia predyspozycji rozwoju tej grupy chorób.
Choroby układu krążenia to bardzo poważny problem zdrowotny, zwłaszcza w krajach wysoko rozwiniętych. Obecnie stosowana diagnostyka jest w stanie wykryć jedynie zaawansowane stadia choroby, a także wymaga hospitalizacji pacjenta. Niezwykle ważne jest wcześniejsze wykrycie ognisk choroby poprzez zastosowanie łatwiejszych i szybszych technik diagnostycznych. Z punktu widzenia wprowadzania wczesnej profilaktyki zastosowanie biomarkerów pozwoliłoby uniknąć konieczności stosowania długotrwałych i kosztownych terapii leczniczych.
Pomimo zwiększających się co roku nakładów na ochronę zdrowia i wdrażanych programów profilaktycznych, nie ma narzędzi diagnostycznych, które umożliwiałyby szybką diagnozę. Opracowany na podstawie wytypowanych biomarkerów test diagnostyczny nie tylko umożliwiłby postawienie szybkiej diagnozy, ale również pozwoliłby znacznie obniżyć koszty badania oraz zapobiegać wysokim kosztom leczenia szpitalnego, a także skrócić czas oczekiwania na wydanie wyniku i zwiększyć ilość jednorazowo analizowanych prób.
Celem wynalazku jest opracowanie metody umożliwiającej opracowanie i wytypowanie narzędzia diagnostycznego do wykrywania wczesnych stadiów chorób układu krążenia, dającego podstawy do opracowania testów diagnostycznych stosowanych dla zapobiegania chorób układu krążenia.
Nieoczekiwanie okazało się, że opracowana według wynalazku metoda daje możliwość szybszej i bardziej precyzyjnej diagnostyki, a przede wszystkim daje możliwość wykrycia zmian na poziomie molekularnym, przed pojawieniem się zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych (stan chorobowy).
Przedmiotem wynalazku jest sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi, obejmujący pomiar ekspresji cząsteczek miRNA wybranych z grupy składającej się z hsa-miR 30e o długości 22nt i SEKW NR ID 2, hsa-miR 331 5p o długości 22nt i SEKW NR ID 5 lub hsa-miR 331 3p o długości 21nt i SEKW NR ID 6, przy czym co najmniej czterokrotny wzrost ekspresji
PL 227 931 Β1 rzeczonych cząsteczek miRNA w porównaniu z próbką kontrolną stanowi wskaźnik wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi.
Na figurze 1 przedstawiono przykładowe widmo dla pomiaru absorbancji w zakresie UV-VIS próbek miRNA wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5.
W celu lepszego zrozumienia wynalazku poniżej przedstawiono przykładowe rozwiązania.
Przykłady
Badania prowadzono na komórkach ludzkiego śródbłonka żyły pępowinowej (HUVEC) ze źródeł komercyjnych (Lonza). Hodowlę komórek HUVEC prowadzono na pożywce EGM 2 (Lonza), z dodatkiem antybiotyku i czynników wzrostu. Badania prowadzono przez 24 h z dodatkiem do medium hodowlanego tiolaktonu homocysteiny w stężeniach 1, 10, 100, 1000 μΜ. Po zakończeniu inkubacji za pomocą komercyjnie dostępnego zestawu przeprowadzono izolację kompletu próbek całkowitego RNA z komórek HUVEC (MirVana, Ambion). Całkowite RNA zostało również wyizolowane ze świeżej krwi obwodowej, pobranej na EDTA lub z frakcji leukocytarnej. W tym celu próbkę krwi żwirowano przez 10 min w temperaturze 4°C, 16000 g. Po odwirowaniu zgodnie z protokołem dostarczonym przez producenta. Wszystkie próbki całkowitego RNA scharakteryzowano pod względem czystości i jakości na bioanalizatorze Agilent2100 (Eukaryote Total RNA Nano 6000 kit).
Do dalszych etapów wyselekcjonowano tylko próbki, dla których współczynnik RIN (ang. RNA Integrity Number) wynosił powyżej 8,0. W ten sposób zgromadzono bibliotekę próbek całkowitego RNA z dwóch powtórzeń biologicznych eksperymentu obrazującego wpływ tiolaktonu homocysteiny na zmiany w poziomie ekspresji miRNA. Pulę cząsteczek miRNA obecnych w próbkach całkowitego RNA wyznakowano barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5 przy pomocy zestawu komercyjnego (ULS microRNA lab eling Kit, Kreatech Diagnostics), zgodnie z protokołem:
Tabela 1
Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji
| Składniki reakcji | |
| całkowite RNA | 2gg |
| Cy3/Cy5 | 2μ! |
| 10x iabeling soiution | 2μ! |
| nuclease free water | do 20μΙ |
85°C, IStnii], SOOrpm
Po inkubacji, próbki RNA oczyszczono na kolumnach KREApure columns (Kreatech Diagnostics) zgodnie z protokołem dołączonym przez producenta. Jakość wyznakowanych fluorescencyjnie próbek (stężenie cDNA oraz ilość przyłączonego barwnika fluorescencyjnego), oraz ich czystość sprawdzono przy pomocy spektrofotometru Nanodrop 2000c (Thermo Scientific). Do hybrydyzacji używano tylko próbki, w których do puli miRNA przyłączone zostało przynajmniej 100 pmoli barwnika fluorescencyjnego.
PL 227 931 Β1
Tabela 2
Wyniki pomiarów absorbancji w zakresie UV-VIS próbek miRNA wyznakowanych barwnikami fluorescencyjnymi Cy3 i Cy5 ktHTtCyS iei,S kJBicyś Ήο ϊύ'ΜίΐέΫ» W · •jgiyj.'
ŚriKttCyS 46,8 wHTLófś Jay iaiMHh.ęj3 jiW łSaSttflfĆiry 75,3 ŚOuHHTŁĆyS i?M «miMBirL CjfśW/s jaHOCyŚ''~“tMŁS K2HTLCyS __ Κ3ΜΠ^Γ ' “M* K4 M!t’ ćy/ 79,2 K5KRC/5 i4?,4 ttfM tffiLQ£ 'Ϊ83Λ ϊθ4Μ11·(^''^.ΐ a^terija ... ' 4 T Wy»» T ~>3n..........ł Wyntka I ageania I nę/'μΙ ssOMA ngAJTOlA '^g/fjTssDNA Tig/(aisOiA·' j^/ssONA •‘nąftilSBWŁ ttg/pt ssONA ’ηφμΙΜ&ΙΑ njtijt 5θίΑ ,ηφίμΐ-raDNA 'rgfpIssOhA 'ng,;(jtsOłA ΛΈΜΒΟΝ* .
n$ypl ssWW
Cy3 Cy3 CyJ Cy3 Js Cy 3 Cy3 Cy3 cy?
C/3
Cyj 'Cy3
Cy3
Cy3
Cy3
S.S A6 72 Mf AS 5,7 7,4. '1,5“ ’ -6,6 'A? U 1,0 0,8' re,s iCOuMKlLCyS SG0uMHTt.Cy5
SSL
77,0
| ng/pl ssONA | lĄtł | jM' ' |
| ng/jH ssOMft. | Cy3 | 0,1 |
| η®μΙ ssSM | 0(3 | <1,2 |
| n$fU ssDRA | 0(3 | 0,9 |
| ngAtfraWA | :-0(3 | ŚLO |
,ρΜ/μΙ ρηβί,-’μΐ pmof/μϋ .fmWA proł/pl pnua/pS pnx4.·^ pmol.M ;w«ołM pwi/μ!
pmoWi
J«S*M fmsl/ut
3wVti jpwi&Ł
| jCyS........ :'ćys | -0,1 :O,0 |
| 'Cy5 | 0,1 |
| cys | AiS |
| CyS | 0,0 |
| C/S | 0,0 |
| ryS | 0.0 |
| CyS | 0,0 |
| Cv5 | 0,0 |
| :Ćy5 | AO |
| ;Cy5 | S.6 |
| CyS | |
| Cy5 | 6.3 |
| Cy5 | A9 . |
| CyS | 7,0 |
| .0/5 | A# |
CyS 'ĆyA CyS ~ęjS'
6.2 :;p......
M
7.0 ΐρτηοΡμ»
J?W :ρτηοΙ/μί pmol/jjS pmoi/pf :j«ł:
;»rt<4W jpm©V'pl łsmd/tM pmal/pS ’βΐ&Γ jptWł/^ jpreriM ;pSH7j^ 'pmat/jj_____ p*TOi;pi
Następnie zastosowano proces hybrydyzacji do mikromacierzy zawierających sondy specyficzne dla prekursorów ludzkich miRNA (pre-miRNA). Podczas hybrydyzacji stosowano podejście typu „dye swap”, tzn. że w pierwszym powtórzeniu próbkę kontrolną (miRNA pochodzące z komórek nie traktowanych tiolaktonem Hcy) wyznakowano Cy3 a próbkę badaną Cy5, a przy drugim powtórzeniu zamieniono barwniki, tak aby próba kontrolna wyznakowana została Cy5 a badana Cy3. Próby kontrolne połączono z odpowiadającymi im próbami badanymi i zatężono do 20 μΙ. Proces hybrydyzacji przeprowadzono według poniższej tabeli. Po wysuszeniu płytki hybrydyzacyjne skanowano za pomocą skanera do mikromacierzy GenePix 4000AL. (Molecular Devices) z rozdzielczością 5 μΜ.
Tabela 3
Protokół hybrydyzacji, wraz z czasem trwania i składem buforów w poszczególnych etapach hybrydyzacji sond wyznakowanych fluorescencyjnie z płytkami mikromacierzowymi
| ETAP I | płukanie; 5x SSC, 0.1% SDS, !,5min, 42°C | |
| ETAP n | prchybrydyzacja i\ SSC, 0,1% SDS, ! h, 42';C | |
| lETAPin | płukanie | 5 min., 42°C, woda milfiO |
| 1,5 mim, 5x SSC, 0.1% SDS | ||
| ETAP IV | nałożenie próbki, miRNA OneArray hybridization bufłer U | |
| ETAP V | hybrydyzacja i 8h. 42°C | |
| ETAPV! | płukanie | 4 min., 42°C, 5x SSC, Ó, 1 % SDS |
| ó min., 2 Γ-C. 2x SSC, 0, S % SDS | ||
| 2 min., 23aC, 0,2x SSC | ||
| ETAPVn | suszenie 2min, 30°C |
Przeprowadzono analizę mikromacierzy z wykorzystaniem oprogramowania GenePix Pro6.0. Dla każdej sondy umieszczonej na mikromacierzy (w tym dla sond kontrolnych) zliczono sygnały pochodzące od próby kontrolnej i badanej, a także wykluczono z dalszej analizy sygnały słabe oraz artefakty. Następnie przeprowadzono analizę statystyczną posługując się dostępnym komercyjnie oprogramowaniem R (http://www.r-project.org).
Na podstawie przeprowadzonych analiz wytypowano markery molekularne, które stanowią miRNA wykazujące przynajmniej czterokrotną różnicę w ekspresji pod wpływem tiolaktonu homocysteiny, w porównaniu do próbek kontrolnych (nie traktowanych tioloaktonem homocysteiny).
PL 227 931 Β1
Tabela 4
Wykaz miRNA wykazujących odmienną ekspresję pod wpływem tiolaktonu homocysteina. Wartości krotności zmiany przedstawione w tabeli odnoszą się do najwyższego stężenia HTL (1000 μΜ)
| miRNA | numer w hazie danych ntiRBase | Krotność imiaoy (FC) |
| hsa-miR-200c | Acc:M10000342 | 6,59 |
| hsa-miR-192 | Acc:M10000234 | 5,47 |
| hsa-miR-jtłe | Acc; Mli)000749 | 15,9 |
| hsa-miR-let 7b | Acc:Mi0000650 | 20,11 |
| hsa-miR-200b | Acc:M!0000650 | 6,38 |
| hs3-miR.-377 | Acc:MK>000785 | 6,41 |
| hsa-miR-34a | Acc:Ml0000268 | 18.83 |
| hsa-miR-33t | Acc:M10000812 | 6,24 |
| hsa-miR-125 bl | Acc;MI0000446 | -7,36 |
Spośród tej grupy miRNA wybrano te cząsteczki, których poziom ekspresji był najbardziej zmieniony w porównaniu do kontroli. Były to:
hsa-miR 34a o długości 22nt i SEQ. ID nr 1; hsa-miR 30e o długości 22nt i SEQ. ID nr 2; hsa-miR 331 5p o długości 22nt i SEQ. ID nr 3 oraz hsa-miR 331 3p o długości 21 nt i SEQ. ID nr 4.
Następnie dla wybranych cząsteczek miRNA zaprojektowano primery typu spinki do włosów (ang. stem loop), przy pomocy miRNA Primer Desing Tool (https://mirnadesigntool.astridresearch.com), pozwalające na przepisanie miRNA na cDNA przy pomocy odwrotnej traskryptazy. Reakcję odwrotnej transkrypcji prowadzono według protokołu [17]:
Tabela 5
Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji odwrotnej transkrypcji z zastosowaniem primerówtypu stem loop
| składniki reakcji | iloii użyła do reakcji |
| całkowite RNA | IWłpg |
| ulem loop priitier | 250pM |
| 70'C, 5 min | |
| O C, 2 min | |
| 5x Reaction Bulkr | ix |
| dNTP mix | 2.5 μΜ |
| M-Mul,V Reverse Transcriptase | 0.5U |
| CZOOU/μΙ) | |
| RiboLock RNase Inhibitor (20U/pl) | 0.04U |
| nuclease free waier | do 15μ1 |
| 16aC 30 min | |
| 42”C 60 min | |
| 85“C 5min |
PL 227 931 Β1
Sekwencje primerów użyte do reakcji odwrotnej transkrypcji:
SEQ. ID nr 5 stem loop 331 5p
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACGGATCC 3’
SEQ. ID nr 6 stem loop 331 3p
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACTTCTAG 3'
SEQ. ID nr 7 stem loop 30e
5’ GTTGGCTCTOGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACCTTCCA 3'
SEQ. ID nr 8 stem loop 34a
5’ GTTGGCTCTGGTGCAGGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGCCAACACAACC 3'
W celu określenia różnic w poziomie ekspresji miRNA przeprowadzono reakcję PCR z analizą przyrostu ilości produktu w czasie rzeczywistym (ang. Real-Time PCR).
Sekwencje starterów użyte do reakcji Real-time PCR:
SEQ. ID nr 9 uniwersalny revers primera 5' GTGCAGGGTCCGAGGT 3'
SEQ. ID nr 10
331 5p forward
5’ GTTCTAGGTATGGTCCCAG 3'
SEQ. ID nr 11 331 3p forward
5’ TTGTGCCCCTGGGCCTAT 3'
SEQ. ID nr 12 30e forward
5' GTTTGGTGTAAACATCCTTGAC 3'
SEQ. ID nr 13 34a forward
5’ GTGTGGCAGTGTCTTAGCT 3'
Tabela 6
Skład mieszaniny reakcyjnej do reakcji real time PCR
| składniki reakcji | ilość użyta do reakcji |
| 2x qfłck Mater Mis | ΙΟμΙ |
| 2ίμΜ ROX | 0,2 μΐ |
| forward primer t,5 μΜ | 4μί |
| universal reverse primer 0,7 μΜ | 1.87μ1 |
| cDNA | 0,67 μΐ |
| nuciease free water | do 20μΙ |
Tabela 7
Warunki amplifikacji cDNA w reakcji real time PCR' Tm - temperatura topnienia primerów
| temperatura | czas | ilość cykli |
| 95“C | 10 min | 1 |
| 95 “C | 0:15 min | |
| Tm | 1 min | 45 |
| 72°C | 0:30 min | |
| 95“C | 1 min | 1 |
| 55οσ | 0:30 min | 1 |
| 95°C | 0:30 min | 1 |
PL 227 931 B1
Wszystkie reakcje przeprowadzono w dwóch powtórzeniach technicznych i trzech biologicznych.
Różnice w relatywnej ekspresji badanych cząsteczek miRNA pod wpływem homocysteiny określono na podstawie wartości Ct przy użyciu metody - ΔΔΟί [18].
Zastosowanie tego rodzaju techniki umożliwi wprowadzenie szybkiego badania w laboratoriach diagnostycznych i szpitalnych. Jest to szczególnie istotne dla osób będących w grupie ryzyka rozwoju chorób układu krążenia, u których ewentualne zmiany w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych są jeszcze na bardzo wczesnym etapie.
Rozwiązanie może służyć też do opracowania szybkich testów diagnostycznych wczesnych stanów chorobowych w zakresie chorób układu krążenia.
Zastosowanie opracowanej technologii umożliwia wykrywanie wczesnych zmian w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych na poziomie molekularnym w stosunkowo krótkim czasie.
Wykorzystanie biomarkerów i wczesna identyfikacja niekorzystnych zmian w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych, ma znaczenie dla:
• wprowadzenia szybkiego i łatwego do przeprowadzenia badania w laboratoriach diagnostycznych;
• charakterystyki molekularnej dla badań podstawowych.
Jednocześnie przy zastosowaniu proponowanego wynalazku lekarz/pracownik laboratorium diagnostycznego może realizować następujące cele:
• zastosować biomarkery do wykrywania wczesnych zaburzeń w funkcjonowaniu śródbłonka naczyń krwionośnych;
• skrócić czas potrzebny na wykonanie badania oraz zwiększyć ilość tego typu badań wykonywanych w ciągu doby;
• obniżyć koszty wykonania badania a także leczenia poprzez uniknięcie kosztownego pobytu pacjenta w szpitalu.
Claims (1)
1. Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi, obejmujący pomiar ekspresji cząsteczek miRNA wybranych z grupy składającej się z:
hsa-miR 30e o długości 22nt i SEKW NR ID 2 hsa-miR 331 5p o długości 22nt i SEKW NR ID 5 lub hsa-miR 331 3p o długości 21 nt i SEKW NR ID 6, przy czym co najmniej czterokrotny wzrost ekspresji rzeczonych cząsteczek miRNA w porównaniu z próbką kontrolną stanowi wskaźnik wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL402291A PL227931B1 (pl) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL402291A PL227931B1 (pl) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL402291A1 PL402291A1 (pl) | 2014-07-07 |
| PL227931B1 true PL227931B1 (pl) | 2018-01-31 |
Family
ID=51063101
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL402291A PL227931B1 (pl) | 2012-12-28 | 2012-12-28 | Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL227931B1 (pl) |
-
2012
- 2012-12-28 PL PL402291A patent/PL227931B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL402291A1 (pl) | 2014-07-07 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Abu-Halima et al. | Panel of five microRNAs as potential biomarkers for the diagnosis and assessment of male infertility | |
| CN105917005B (zh) | 使用来自体液的miRNA检测和监控帕金森病(PD)的方法 | |
| Vatandoost et al. | Dysregulated miR-103 and miR-143 expression in peripheral blood mononuclear cells from induced prediabetes and type 2 diabetes rats | |
| US20190169690A1 (en) | Methods and compositions for diagnosis of alzheimer's disease | |
| US11998331B2 (en) | Use of micro-ribonucleic acid (miRNA) to diagnose transplant rejection and tolerance of immunosuppression therapy | |
| US20200270690A1 (en) | Serum/plasma LncRNA marker composition associated with auxiliary diagnosis of intrahepatic cholestasis of pregnancy and application thereof | |
| WO2017165458A1 (en) | Methods of using mirnas from bodily fluids for detection and differentiation of neurodegenerative diseases | |
| CN103642914B (zh) | 与恶性黑素瘤相关的血浆/血清循环microRNA标志物及其应用 | |
| CN102876676A (zh) | 一种与胰腺癌相关的血清/血浆miRNA标志物及其应用 | |
| CN105177132A (zh) | 一种定量检测miRNA的RT-PCR方法 | |
| Jodati et al. | Different expression of Micro RNA-126, 133a and 145 in aorta and saphenous vein samples of patients undergoing coronary artery bypass graft surgery | |
| dos Santos Nunes et al. | Analysis of the DNA methylation profiles of miR-9-3, miR-34a, and miR-137 promoters in patients with diabetic retinopathy and nephropathy | |
| CN102443638B (zh) | 一种用于血清/血浆miRNA检测的内参及其应用 | |
| CN110042161B (zh) | 一种用于筛查急性高原反应易感者的microRNA分子标志物及其应用 | |
| CN109628583B (zh) | 血浆/血清外泌体miRNA作为青光眼诊断标志物中的应用 | |
| CN111733227A (zh) | 特发性视神经炎诊断分子标记物circRNA、试剂盒及应用 | |
| Li et al. | MiR-507 inhibits the growth and invasion of trophoblasts by targeting CAMK4 | |
| PL227931B1 (pl) | Sposób określania zmian ekspresji cząsteczek miRNA in vitro w celu oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią | |
| CN108728532A (zh) | 一种微小rna标志物及其应用 | |
| CN110951870A (zh) | miRNA表达量在预测氯吡格雷治疗疗效中的应用 | |
| EP2540829B1 (en) | Marker for detection of myogenic diseases, and method for detection of the diseases using same | |
| PL227930B1 (pl) | Zastosowanie molekularnych biomarkerów do oznaczania wczesnych chorobowych zmian strukturalnych śródbłonka naczyń krwionośnych spowodowanych hiperhomocysteinemią wywołaną podwyższonym poziomem tiolaktonu homocysteiny we krwi | |
| Zehtabian et al. | Development of a New Framework for Health Assessment in Patients with by using miRNA-197 in Adults Coronary Artery Disease. | |
| Zehtabian et al. | Development of a New Framework for Health Assessment in Patients with Coronary Artery Disease by using miRNA-197 in Adults | |
| Dadbinpour et al. | MiR-194-5p might be a Potential Biomarker for Type 2 Diabetes Mellitus |