PL229015B1 - Sposób otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytowych - Google Patents

Description

RZECZPOSPOLITA

POLSKA

(12)OPIS PATENTOWY ₍i₉₎PL ₍n)229015 (13) B1 (51) Int.CI.

(21) Numer zgłoszenia: 404820 _{CQ1B 25/32 (200601)}

A61L 27/32 (2006.01)

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 23.07.2013 (54)

Sposób otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytowych (73) Uprawniony z patentu:

POLITECHNIKA WARSZAWSKA, Warszawa, PL (43) Zgłoszenie ogłoszono:

02.02.2015 BUP 03/15 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.05.2018 WUP 05/18 (72) Twórca(y) wynalazku:

TOMASZ CIACH, Warszawa, PL

EWA DUSZYŃSKA, Ostrów Mazowiecka, PL

MICHAŁ WOJASIŃSKI, Wołomin, PL (74) Pełnomocnik:

rzecz, pat. Grażyna Padee m

σ>

CM

CM

Q_

PL 229 015 B1

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytu, w postaci nanopłytek, nanopręcików, nanosfer, w procesie precypitacji chemicznej na mokro, z użyciem środka dyspergującego.

Kość ludzka może być uważana za przykład kompozytu nieorganiczno-organicznego, zawierającego około 70% wagowych nieorganicznych kryształów, głównie hydroksyapatytu o wzorze chemicznym Ca5(PO4)3OH, oraz 30% wagowych macierzy organicznej, głównie kolagenu typu I [Osteoblast mineralization with composite nanofibrous substrate for bone tissue regeneration, Venugopal JR, Giri Dev VR, Senthilram T, Sathiskumar D, Gupta D, Ramakrishna S., Cell Biology International, 35, 2011]. Obecnie hydroksyapatyt do zastosowań biomedycznych, takich jak nośniki leków, wypełnianie ubytków kostnych, przygotowanie implantów, wytwarzany jest najczęściej z wykorzystaniem następującej reakcji chemicznej:

5Ca²+ + 3PO4^3- + OH^- = Ca5(PO4)3OH. (Wzór 1)

Jako źródło jonów wapnia stosuje się najczęściej sole wapnia rozpuszczalne w wodzie, takie jak azotan lub chlorek, a jako źródło jonów fosforanowych stosuje się rozpuszczalne w wodzie fosforany amonu, sodu lub wapnia. Reakcję prowadzi się zwykle w środowisku zbliżonym do obojętnego, w temperaturze pokojowej lub podwyższonej.

W reakcji według powyższego równania uzyskiwany jest hydroksyapatyt charakteryzujący się właściwym stosunkiem molowym atomów Ca/P równym 1,67, co jest wartością charakteryzującą hydroksyapatyt pochodzenia naturalnego [Calcium phosphates as substitution of bone tissues, VelletRegi M, Gonzalez-Calbet JM, Progress in Solid State Chemistry, 32, 2004]. Gęsty hydroksyapatyt znajduje szereg zastosowań w zastępowaniu kości i jest wykorzystywany do naprawy uszkodzeń kostnych w ubytkach dentystycznych i ortopedycznych, natychmiastowego zastąpienia zębów, powiększania krawędzi pęcherzykowych, jako materiał do pokrycia miazgi oraz w rekonstrukcji szczękowo-twarzowej [Synthesis of stoichiometric nano crystalline hydroxyapatite by ethanol-based solgel technique at low temperature, Kuriakose TA, Kalkura SN, Palanichamy M, Arviuoli D, Dierks K, Bocelli G et al., Journal of Crystal Growth, 263, 2004].

Niestety, kryształy strącanego w czysto wodnych roztworach soli hydroksyapatytu są stosunkowo duże, o rozmiarach rzędu kilkudziesięciu, a nawet do kilkuset mikrometrów. Tak otrzymywane kryształy są ponadto całkowicie nierozpuszczalne i nie ulegają przebudowie w organizmie ludzkim. Naturalna kość jest natomiast strukturą dynamiczną; jest ciągle rozpuszczana i budowana przez komórki kostne, zatem zastosowanie hydroksyapatytu nieulegającego rozpuszczaniu przez komórki kostne zaburza ten proces. W celu rozwiązania tego problemu opracowano szereg technik otrzymywania hydroksyapatytu w formie nanokryształów lub stosowano hydroksyapatyt zawierający różne dodatki, tak by stał się podatny na przebudowę komórkową. Opisywano techniki wytwarzania nanocząstek hydroksyapatytu poprzez modyfikację przebiegu reakcji przedstawionej wzorem 1, z wykorzystaniem promieniowania UV, mikrofal, często w połączeniu z wysoką temperaturą i znacznym ciśnieniem (proces hydrotermalny) lub stosując na gotowych kryształach ablację laserową. Klasycznie stosowane techniki wytwarzania nanohydroksyapatytu bazują na procesach takich jak: synteza zol-żel, reakcje w stanie stałym, koprecypitacja, reakcje hydrotermalne, synteza w mikroemulsjach, synteza mechanochemiczna oraz różne techniki mokrej chemii, wśród nich - chemiczna precypitacja na mokro. Wszystkie przedstawione wcześniej sposoby wytwarzania nanohydroksyapatytu wymagają odpowiednich nastaw temperatury przebiegu procesu, w zakresie od 25°C do nawet 500°C, odpowiednich nastaw pH mieszaniny reakcyjnej, w zakresie od 4,5 do 11. W niektórych przypadkach wymagane jest podwyższone ciśnienie procesu, nawet do 40 atmosfer, lub stosowane są toksyczne środki powierzchniowo czynne.

W metodzie precypitacji chemicznej na mokro konieczne jest zastosowanie środka dyspergującego reagenty w środowisku reakcji, zapobiegającego tworzeniu się dużych kryształów. W znanych w sztuce protokołach wytwarzania nanohydroksyapatytu sposobem precypitacji chemicznej na mokro stosowane są środki dyspergujące obejmujące: surfaktanty, takie jak bromek cetylotrimetyloamoniowy (CTAB) [Hydrothermal synthesis of hydroxyapatite nanopowders using cationic surfactant as a template, Wang Y, Zhang S, Wei K, Zhao N, Chen J, Wang X. Materials Letters 60, 2006], emulgatory, takie jak etanoloamina [Effects of synthesis conditions on the morphology of hydroxyapatite nanoparticles produced by wet chemical process, Wang P, Li C, Gong H, Jiang X, Wang H, Li K. Powder Technology

PL 229 015 B1

203, 2010], macierze polimerowe z polimerów, takich jak alkohol poliwinylowy (PVA), glikol polietylenowy (PEG) [In situ synthesis and characterization of nano-size hydroxyapatite in poly(vinyl alcohol) matrix, Mollazadeh S, Javadpour J, Khavandi A. Ceramics International 33, 2007] oraz inne substancje chemiczne, takie jak np. kwas cytrynowy, aminokwasy, kwas (etylenodinitrylo)tetraoctowy (EDTA), i podobne [Nanoscale hydroxyapatite particles for bone tissue engineering, Zhou H, Lee J. Acta Biomaterialia 7, 2011].

Dotychczas znane techniki otrzymywania nanohydroksyapatytu wymagają stosowania wysokich temperatur w połączeniu z wysokim ciśnieniem, toksycznych emulgatorów czy dyspergatorów, niebiodegradowalnych polimerów. Pociąga to potrzebę długotrwałego oczyszczania produktu i sporej ilości odpadów, przy czym zawsze pozostaje ryzyko wywołania efektu toksycznego przez pozostałość dodatków chemicznych.

Celem wynalazku było opracowanie nowego sposobu otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytu, metodą precypitacji chemicznej na mokro, w łagodnych warunkach, przy zastosowaniu w pełni biozgodnego emulgatora. Celem wynalazku było także uzyskanie możliwości sterowania morfologią wytwarzanego hydroksyapatytu. Cel ten został zrealizowany dzięki przeprowadzeniu reakcji przedstawionej wzorem I w układzie reakcyjnym, w którym jako środek dyspergujący jest zastosowana lecytyna.

Sposób otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytu metodą precypitacji chemicznej na mokro, polega na tym, że rozpuszczalną w wodzie sól wapnia i rozpuszczalny w wodzie fosforan poddaje się reakcji w roztworze wodnym, przy stosunku molowym atomów wapnia do atomów fosforu wynoszącym około Ca/P 1,67 i w obecności środka dyspergującego, i według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako środek dyspergujący stosuje się lecytynę w ilości od 0,05% wag. do 20,00% wag., reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie od 20°C do 95°C, korzystnie 60°C, przy pH od 7 do 14, korzystnie 10.

Korzystnie jako źródło jonów wapnia Ca²⁺ w układzie reakcyjnym stosuje się sole wapnia łatwo rozpuszczalne w wodzie, takie jak azotan, octan, chlorek, mleczan (np. Ca(NO3)2 4H2O).

Korzystnie jako źródło jonów fosforanowych PO4^3- w układzie reakcyjnym stosuje się łatwo rozpuszczalne w wodzie fosforany amonu, sodu, potasu (np. (NH4)2HPO4).

Korzystnie stosuje się lecytynę pochodzenia naturalnego, jak lecytynę sojową lub z jaj kurzych.

Korzystnie lecytynę dodaje się w stężeniu od 0,05% do około 1,5% celem uzyskania nanopłytek; w stężeniu od 1,5% do około 3% celem uzyskania nanopręcików; w stężeniu od 3% do 20% celem uzyskania nanosfer.

Szczegółowo sposób według wynalazku realizuje się tak, że do wodnego roztworu związku będącego źródłem jonów wapnia w wodzie demineralizowanej dodaje się roztwór wodny lecytyny w wodzie demineralizowanej. Mieszaninę reakcyjną podgrzewa się do temperatury w zakresie od 20°C do 95°C, korzystnie 60°C, oraz dostosowuje się wartość pH w zakresie od 6 do 14, korzystnie około 10. Po uzyskaniu stabilnych warunków, do mieszaniny reakcyjnej dodaje się roztwór wodny fosforanu, tak by stechiometryczną ilość dodać w czasie do 24 godzin, korzystnie 1-2 godziny. Następnie roztwór chłodzi się do temperatury otoczenia i wiruje w celu wydzielenia produktu. Po dekantacji, otrzymany produkt przemywa się rozpuszczalnikiem organicznym (heksan, benzyna, etanol, aceton, izopropanol) lub wodą w celu usunięcia pozostałości lecytyny z produktu. Niewielka pozostałość lecytyny (0.01%-2%) nie wpływa negatywnie na własności produktu, a nawet je poprawia. Otrzymany produkt suszy się w temperaturze otoczenia lub podwyższonej.

Uzyskany produkt reakcji syntezy charakteryzowano za pomocą dyfrakcji promieni Roentgena (XRD) oraz stosując spektrofotometrię w podczerwieni z transformatą Fouriera (FTIR).

Na rysunku przedstawiono:

Fig. 1 - widmo FTIR uzyskanego produktu w odniesieniu do lecytyny i komercyjnie dostępnego hydroksyapatytu. Pierwsze widmo dotyczy lecytyny, drugie komercyjnego krystalicznego hydroksyapatytu, trzecie nano-hydroksyapatytu otrzymanego zgodnie z wynalazkiem.

Fig. 2 - charakterystyka krystalograficzna otrzymanego produktu, zgodna z danymi w pliku JCPDF nr 09-0432, w postaci dyfraktogramu XRD

Fig. 3 - zdjęcie SEM produktu o morfologii nanopłytek, uzyskanego zgodnie z przykładem 1.

Fig. 4 - zdjęcie SEM produktu o morfologii nanopręcików oraz nanosfer, uzyskanego zgodnie z przykładem 2.

Fig. 5 - zdjęcie SEM produktu o morfologii nanosfer o średnicach od około 30 nm do około 70 nm, uzyskanego zgodnie z przykładem 3.

Fig. 6 - zdjęcie SEM produktu o morfologii nanosfer o średnicy od około 30 nm do 100 nm, uzyskanego zgodnie z przykładem 4.

PL 229 015 B1

W sposobie według wynalazku naturalny surfaktant - lecytyna, składająca się głównie z fosfatydylocholin, związków fosfolipidowych posiadających cholinę związaną z grupą fosforanową, będący składnikiem błony komórkowej, mitochondriów, reticulum endoplazmatycznego oraz ściany jądra komórkowego - otacza powstające zarodki kryształów hydroksyapatytu i blokuje możliwość dalszego wzrostu kryształów. Taki układ reakcyjny pozwala prowadzić krystalizację hydroksyapatytu do formy nanocząstek o morfologii zależnej od stężenia środka dyspergującego - lecytyny - w układzie reakcyjnym. W procesie powstawania nanocząstek hydroksyapatytu dochodzi do częściowego związania lecytyny z produktem lub jej fizycznego związania w porach powstających cząstek. W obecnym wynalazku, taka sytuacja traktowana jest jako korzystna, zwiększająca biokompatybilność i bioaktywność materiału.

Stężenie lecytyny wpływa na morfologię uzyskanego produktu, co pozwala na kontrolowanie kształtu otrzymywanych nanocząstek.

Zastosowanie lecytyny jako emulgatora pozwala prowadzić proces w roztworze wodnym i w stosunkowo łagodnych warunkach. Lecytyna jest całkowicie nietoksyczna, a jej niewielka pozostałość w otrzymywanym produkcie nie wywołuje efektów negatywnych, lecz poprawia zwilżalność otrzymanego produktu, co podnosi jego walory użytkowe i ułatwia formowanie implantów kostnych z takiego proszku. Lecytyna jest składnikiem błony komórkowej, co podnosi biozgodność tak otrzymanego nanohydroksyapatytu.

Sposób według wynalazku został przedstawiony bliżej w przykładach stosowania.

P r z y k ł a d 1

Porcję 0,0075 moli (1,775 g) Ca(NO3)2 4H2O rozpuszczono w 25 ml wody demineralizowanej. Przygotowano 0,3% roztwór lecytyny w 37,5 ml wody demineralizowanej. Roztwór lecytyny wkroplono do roztworu tetrahydratu azotanu wapnia. Wartość pH uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ustalono na 10 oraz mieszaninę ustawiono w kąpieli wodnej na 60°C oraz mieszano. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono z szybkością 2 ml/h 15 ml roztwór 0,0046 moli (0,594g) (NH4)2HPO4 w wodzie demineralizowanej o pH ustalonym na wartość 10. Po wkropleniu mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1,5 godziny w temperaturze reakcji 60°C. Następnie mieszaninę naturalnie schłodzono do temperatury otoczenia, poddano wirowaniu, dekantacji. Uzyskany biały produkt przemyto pięciokrotnie heksanem w celu usunięcia pozostałości lecytyny. Morfologię uzyskanego produktu scharakteryzowano za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej (SEM) i przedstawiono na Fig. 3. Uzyskano produkt o morfologii nanopłytek o grubości kilku nanometrów oraz szerokości i długości rzędu kilku do kilkudziesięciu mikrometrów.

P r z y k ł a d 2

Porcję 0,0075 moli (1,775 g) Ca(NO3)2 4H2O rozpuszczono w 25 ml wody demineralizowanej. Przygotowano 1,5% roztwór lecytyny w 37,5 ml wody demineralizowanej. Roztwór lecytyny wkroplono do roztworu tetrahydratu azotanu wapnia. Wartość pH uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ustalono na 10 oraz mieszaninę ustawiono w kąpieli wodnej na 60°C oraz mieszano. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono 15 ml roztwór 0,0046 moli (0,594 g) (NH4)2HPO4 w wodzie demineralizowanej o pH ustalonym na wartość 10 z szybkością 2 ml/h. Po wkropleniu mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1,5 godziny w temperaturze reakcji - 60°C. Następnie mieszaninę naturalnie schłodzono do temperatury otoczenia, poddano wirowaniu, dekantacji. Uzyskany biały produkt przemyto pięciokrotnie heksanem w celu usunięcia pozostałości lecytyny. Morfologię uzyskanego produktu scharakteryzowano za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej (SEM) i przedstawiono na Fig. 4. Uzyskano produkt o morfologii nanopręcików oraz nanosfer. Uzyskano nanopręciki o długości od około 30 nm do około 180 nm oraz nanosfery o średnicach od około 30 nm do 70 nm.

P r z y k ł a d 3

Ilość 0,0075 moli (1,775 g) Ca(NO3)2 4H2O rozpuszczono w 25 ml wody demineralizowanej. Przygotowano 3% roztwór lecytyny w 37,5 ml wody demineralizowanej. Roztwór lecytyny wkroplono do roztworu tetrahydratu azotanu wapnia. Wartość pH uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ustalono na 10 oraz mieszaninę ustawiono w kąpieli wodnej na 60°C oraz mieszano. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono 15 ml roztwór 0,0046 moli (0,594 g) (NH4)2HPO4 w wodzie demineralizowanej o pH ustalonym na wartość 10 z szybkością 2 ml/h. Po wkropleniu mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1,5 godziny w temperaturze reakcji - 60°C. Następnie mieszaninę naturalnie schłodzono do temperatury otoczenia, poddano wirowaniu, dekantacji. Uzyskany biały produkt przemyto pięciokrotnie heksanem w celu usunięcia pozostałości lecytyny. Morfologię uzyskanego produktu scharakteryzowano za pomocą elektronowej

PL 229 015 B1 mikroskopii skaningowej (SEM) i przedstawiono na Fig. 5. Uzyskano produkt o morfologii nanosfer o średnicach od około 30 nm do około 70 nm.

P r z y k ł a d 4

Ilość 0,0075 moli (1,775 g) Ca(NO3)2 4H2O rozpuszczono w 25 ml wody demineralizowanej. Przygotowano 9% roztwór lecytyny w 37,5ml wody demineralizowanej. Roztwór lecytyny wkroplono do roztworu tetrahydratu azotanu wapnia. Wartość pH uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ustalono na 10 oraz mieszaninę ustawiono w kąpieli wodnej na 60°C oraz mieszano. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono 15 ml roztwór 0,0046 moli (0,594 g) (NH4)2HPO4 w wodzie demineralizowanej o pH ustalonym na wartość 10 z szybkością 2 ml/h. Po wkropleniu mieszaninę reakcyjną mieszano przez 1,5 godziny w temperaturze reakcji - 60°C. Następnie mieszaninę naturalnie schłodzono do temperatury otoczenia, poddano wirowaniu, dekantacji. Uzyskany biały produkt przemyto pięciokrotnie heksanem w celu usunięcia pozostałości lecytyny. Morfologię uzyskanego produktu scharakteryzowano za pomocą elektronowej mikroskopii skaningowej (SEM) i przedstawiono na Fig. 6. Uzyskano produkt o morfologii nanosfer o średnicy od około 30 nm do 100 nm.

P r z y k ł a d 5

Porcję 0,0075 moli uwodnionego chlorku wapniowego rozpuszczono w 30 ml wody demineralizowanej. Przygotowano 10% roztwór lecytyny w 40 ml wody demineralizowanej.

Roztwór lecytyny wkroplono do roztworu chlorku wapnia. Wartość pH uzyskanej mieszaniny reakcyjnej ustalono na 9 oraz mieszaninę ustawiono w kąpieli wodnej na 50°C oraz mieszano. Do mieszaniny reakcyjnej wkroplono 15 ml roztworu 0,0046 moli fosforanu sodu w wodzie demineralizowanej o pH ustalonym na wartość 9. Po wkropleniu mieszaninę reakcyjną mieszano przez godzinę w temperaturze reakcji 50°C. Następnie mieszaninę naturalnie schłodzono do temperatury otoczenia i poddano wirowaniu. Uzyskany biały proszek przemyto dwukrotnie etanolem 95% w celu usunięcia nadmiaru lecytyny. Uzyskano produkt o morfologii nanosfer o średnicach od około 30 nm do 110 nm.

Claims (7)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania nanocząstek hydroksyapatytu metodą precypitacji chemicznej na mokro, polegający na tym, że rozpuszczalną w wodzie sól wapnia i rozpuszczalny w wodzie fosforan poddaje się reakcji w roztworze wodnym, przy stosunku molowym atomów wapnia do atomów fosforu wynoszącym około Ca/P 1,67 i w obecności środka dyspergującego, znamienny tym, że jako środek dyspergujący stosuje się lecytynę w ilości od 0,05% wag. do 20,00% wag., reakcję prowadzi się w temperaturze w zakresie od 20°C do 95°C, przy pH od 7 do 14.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło jonów wapnia Ca²+ w układzie reakcyjnym stosuje się azotan wapnia, octan wapnia, chlorek wapnia, mleczan wapnia.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako źródło jonów fosforanowych PO4^3- w układzie reakcyjnym stosuje się fosforany: amonu, sodu, potasu.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się lecytynę pochodzenia naturalnego, korzystnie lecytynę sojową lub z jaj kurzych.
5. 5. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że lecytynę dodaje się w stężeniu od 0,05% wag. do 1,5% wag. w celu uzyskania nanopłytek.
6. 6. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że lecytynę dodaje się w stężeniu od 1,5% wag. do około 3% wag. w celu uzyskania nanopręcików.
7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że lecytynę dodaje się w stężeniu od 3% wag. do 20% wag. w celu uzyskania nanosfer.