PL229194B1 - Neoglikokoniugat oligocukru Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile oraz jego zastosowanie w szczepionkach przeciwbakteryjnych - Google Patents
Neoglikokoniugat oligocukru Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile oraz jego zastosowanie w szczepionkach przeciwbakteryjnychInfo
- Publication number
- PL229194B1 PL229194B1 PL415211A PL41521115A PL229194B1 PL 229194 B1 PL229194 B1 PL 229194B1 PL 415211 A PL415211 A PL 415211A PL 41521115 A PL41521115 A PL 41521115A PL 229194 B1 PL229194 B1 PL 229194B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- escherichia coli
- neoglycoconjugate
- los
- clostridium difficile
- oligosaccharide
- Prior art date
Links
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 54
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 title claims abstract description 17
- 229960001212 bacterial vaccine Drugs 0.000 title 1
- 229920001542 oligosaccharide Polymers 0.000 claims abstract description 34
- 150000002482 oligosaccharides Chemical class 0.000 claims abstract description 33
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 19
- 241000588832 Bordetella pertussis Species 0.000 claims abstract description 19
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 16
- 241000588747 Klebsiella pneumoniae Species 0.000 claims abstract description 14
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 13
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims abstract description 10
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 claims abstract description 9
- 210000004900 c-terminal fragment Anatomy 0.000 claims abstract description 7
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims abstract description 6
- 230000002265 prevention Effects 0.000 claims abstract description 5
- 238000009007 Diagnostic Kit Methods 0.000 claims abstract description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 12
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 12
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 claims description 11
- NNLZBVFSCVTSLA-HXUQBWEZSA-N 3-deoxy-alpha-D-manno-oct-2-ulopyranosonic acid Chemical compound OC[C@@H](O)[C@H]1O[C@@](O)(C(O)=O)C[C@@H](O)[C@H]1O NNLZBVFSCVTSLA-HXUQBWEZSA-N 0.000 claims description 9
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 8
- 101710182223 Toxin B Proteins 0.000 claims description 7
- 241000607768 Shigella Species 0.000 claims description 6
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 claims description 5
- 241000192125 Firmicutes Species 0.000 claims description 5
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 claims description 3
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 3
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims 1
- 108700022831 Clostridium difficile toxB Proteins 0.000 abstract description 6
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 24
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 17
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 17
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 16
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 13
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 8
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 8
- 241000588729 Hafnia alvei Species 0.000 description 7
- MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N beta-D-galactosamine Natural products NC1C(O)OC(CO)C(O)C1O MSWZFWKMSRAUBD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 7
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 6
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 6
- GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N lipid A (E. coli) Chemical compound O1[C@H](CO)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@@H](CCCCCCCCCCC)OC(=O)CCCCCCCCCCC)[C@@H]1OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](OC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](NC(=O)C[C@H](O)CCCCCCCCCCC)[C@@H](OP(O)(O)=O)O1 GZQKNULLWNGMCW-PWQABINMSA-N 0.000 description 6
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 6
- 102000051619 SUMO-1 Human genes 0.000 description 5
- 241000607760 Shigella sonnei Species 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 5
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 4
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 4
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 4
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 4
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 4
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N squalene Natural products CC(=CCCC(=CCCC(=CCCC=C(/C)CCC=C(/C)CC=C(C)C)C)C)C TUHBEKDERLKLEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N (6E,10E,14E,18E)-2,6,10,15,19,23-hexamethyltetracosa-2,6,10,14,18,22-hexaene Chemical compound CC(C)=CCCC(C)=CCCC(C)=CCCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 3
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000879203 Caenorhabditis elegans Small ubiquitin-related modifier Proteins 0.000 description 3
- 241000588923 Citrobacter Species 0.000 description 3
- 206010011409 Cross infection Diseases 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000588650 Neisseria meningitidis Species 0.000 description 3
- 241000588770 Proteus mirabilis Species 0.000 description 3
- BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N Tetramethylsqualene Natural products CC(=C)C(C)CCC(=C)C(C)CCC(C)=CCCC=C(C)CCC(C)C(=C)CCC(C)C(C)=C BHEOSNUKNHRBNM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N dodecahydrosqualene Natural products CC(C)CCCC(C)CCCC(C)CCCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C PRAKJMSDJKAYCZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 3
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 3
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 3
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- 229940031439 squalene Drugs 0.000 description 3
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 3
- 238000005199 ultracentrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002255 vaccination Methods 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000588921 Enterobacteriaceae Species 0.000 description 2
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 description 2
- 241001621104 Escherichia coli O6 Species 0.000 description 2
- 241000606768 Haemophilus influenzae Species 0.000 description 2
- 241000588652 Neisseria gonorrhoeae Species 0.000 description 2
- 201000005702 Pertussis Diseases 0.000 description 2
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 2
- 241000606999 Plesiomonas shigelloides Species 0.000 description 2
- 241001472782 Proteus penneri Species 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- 108700038981 SUMO-1 Proteins 0.000 description 2
- 241000607142 Salmonella Species 0.000 description 2
- 241001138501 Salmonella enterica Species 0.000 description 2
- 241000607762 Shigella flexneri Species 0.000 description 2
- 241001353153 Shigella flexneri 3a Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 2
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 2
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M sodium periodate Chemical compound [Na+].[O-]I(=O)(=O)=O JQWHASGSAFIOCM-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 239000003053 toxin Substances 0.000 description 2
- 231100000765 toxin Toxicity 0.000 description 2
- 238000001644 13C nuclear magnetic resonance spectroscopy Methods 0.000 description 1
- OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 2-[5-[[5-(6-aminopurin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methoxy]-3,4-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-4-phosphonooxyhexanedioic acid Chemical group C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C(C(C1O)O)OC1COC1C(CO)OC(OC(C(O)C(OP(O)(O)=O)C(O)C(O)=O)C(O)=O)C(O)C1O OTLLEIBWKHEHGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 2-amino-2-deoxy-D-glucopyranose Chemical group N[C@H]1C(O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O MSWZFWKMSRAUBD-IVMDWMLBSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate Chemical compound C1=C(Br)C(Cl)=C2C(OP(O)(=O)O)=CNC2=C1 QRXMUCSWCMTJGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N Borate Chemical compound [O-]B([O-])[O-] BTBUEUYNUDRHOZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000588807 Bordetella Species 0.000 description 1
- 101000708016 Caenorhabditis elegans Sentrin-specific protease Proteins 0.000 description 1
- 241000606161 Chlamydia Species 0.000 description 1
- 208000037384 Clostridium Infections Diseases 0.000 description 1
- 241000672609 Escherichia coli BL21 Species 0.000 description 1
- FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N Glc-NH2 Natural products O=CC(N)C(O)C(O)C(O)CO FZHXIRIBWMQPQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000590002 Helicobacter pylori Species 0.000 description 1
- 206010022678 Intestinal infections Diseases 0.000 description 1
- 241000588748 Klebsiella Species 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241000588655 Moraxella catarrhalis Species 0.000 description 1
- 238000005481 NMR spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 206010029803 Nosocomial infection Diseases 0.000 description 1
- 244000110797 Polygonum persicaria Species 0.000 description 1
- 241000588767 Proteus vulgaris Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 206010040070 Septic Shock Diseases 0.000 description 1
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000606834 [Haemophilus] ducreyi Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000005903 acid hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000740 bleeding effect Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 230000023555 blood coagulation Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000002421 cell wall Anatomy 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 1
- 239000013068 control sample Substances 0.000 description 1
- 230000037029 cross reaction Effects 0.000 description 1
- 230000009260 cross reactivity Effects 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- 239000002095 exotoxin Substances 0.000 description 1
- 231100000776 exotoxin Toxicity 0.000 description 1
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Polymers 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 229940037467 helicobacter pylori Drugs 0.000 description 1
- 150000002386 heptoses Chemical class 0.000 description 1
- 239000008241 heterogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000002013 hydrophilic interaction chromatography Methods 0.000 description 1
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 210000004201 immune sera Anatomy 0.000 description 1
- 229940042743 immune sera Drugs 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000005040 ion trap Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000007003 mineral medium Substances 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000000655 nuclear magnetic resonance spectrum Methods 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 229940066827 pertussis vaccine Drugs 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 description 1
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 description 1
- 150000004804 polysaccharides Polymers 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 229940007042 proteus vulgaris Drugs 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000006268 reductive amination reaction Methods 0.000 description 1
- 230000036303 septic shock Effects 0.000 description 1
- 229940115939 shigella sonnei Drugs 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N sodium cyanoborohydride Chemical compound [Na+].[B-]C#N BEOOHQFXGBMRKU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N squalene Chemical compound CC(C)=CCC\C(C)=C\CC\C(C)=C\CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C YYGNTYWPHWGJRM-AAJYLUCBSA-N 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 229960000814 tetanus toxoid Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 239000000304 virulence factor Substances 0.000 description 1
- 230000007923 virulence factor Effects 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Neoglikokoniugat będący przedmiotem zgłoszenia stanowi połączenie oligosacharydu zwitterjonowego Escherichia coli R1 LOS z rekombinowanym C-końcowym fragmentem toksyny B Clostridium difficile. Immunogena kompozycja zawierająca neoglikokoniugat przeznaczona jest do stosowania jako szczepionka w prewencji i leczeniu infekcji wywołanych przez bakterie Gram ujemne - Enterobacterioceae jak Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli a także przez Bordetella pertussis czy Clostridium difficile bądź jako element diagnostyczny do wykrywania zakażeń wywołanych przez rzeczone bakterie. Zgłoszenie obejmuje również kompozycję farmaceutyczną, szczepionkę zawierającą tę kompozycję, przeciwciało generowane oraz zestaw diagnostyczny.
Description
Wynalazek dotyczy nowego glikokoniugatu składającego się z oligocukru rdzenia Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile. immunogennej kompozycji farmaceutycznej i szczepionki zawierającej nowy glikokoniugat oraz jego zastosowania w zapobieganiu i leczeniu zakażeń wywołanych przez szczepy bakterii Gram ujemnych i Gram dodatnich.
Szczepionki antybakteryjne stanowią skuteczny sposób przeciwdziałania wielu chorobom wywoływanym przez wielolekooporne szczepy bakterii Gram-ujemnych i Gram-dodatnich, wobec których zawodzą terapie antybiotykowe. Immunoprofilaktyka jest obiecującym sposobem na zmniejszenie a nawet eliminację liczby zachorowań i powikłań wywołanych zakażeniami bakteryjnymi.
Dokument EP0941738 ujawnia zastosowanie jako antygenu koniugatu białka nośnikowego z konserwatywnym regionem LOS Neisseria meningitidis. Neisseria gonorrhoeae. H. influenzae, Haemophilus ducreyi, Helicobacter pylori, Chlamydia, Proteus mirabilis, P.aeruginosa, Moraxella catarrhalis, Bordetella pertussis, Klebsiella spp. oraz V cholerae. Regionem tym jest fragment LOS o strukturze GlcNAc-Hep2-PEtn-Kdo2-Lipid A, obejmujący wewnętrzny region oligocukrów rdzeni lipooligosacharydów wymienionych bakterii. Uzyskane w wyniku immunizacji takim koniugatem surowice wykazywały krzyżową reaktywność z LOS N. meningitidis, H. influenzae, N. gonorrhoeae i H. pylori oraz aktywność bakteriobójczą w testach in vitro z użyciem kilku szczepów N. meningitidis.
Z publikacji WO2014195881 znany jest glikokoniugat zawierający oligocukier lub fragment oligocukru LOS Bordetella pertussis (OS) i toksynę krztuśca (PT) połączone ze sobą wiązaniem kowalencyjnym mające zastosowania do wytworzenia przeciwkrztuścowej szczepionki zawierającej immunogenne składniki Bordetella pertussis w formie w pełni zinaktywowanej.
Zgłoszenie WO2014195880 ujawnia wyizolowany antygen będący immunogenną formą wspólnego enetrobakteryjnego antygenu Gram-ujemnych bakterii z rodziny Enterobacteriaceae. tj. ECA połączonego z lipopolisacharydem (ECALPS), mający zastosowanie w profilaktyce i leczeniu chorób wywołanych przez bakterie Gram-ujemne, zwłaszcza z rodziny Enterobacteriaceae, uwzględniających w szczególności zakażenie szpitalne i wstrząs septyczny oraz zakażenia jelitowe. Ujawniony antygen określa struktura [podjednostka ECA]n-oligocukier rdzenia - lipid A, gdzie powtarzająca się biologiczna podjednostka ECA stanowi: [ >3)-a-D-Fuc4NAc-(1 >4)-p-D-ManNAcA-(1 >4)-a-D-GlcNAc-(1 >]-. a n > 1, i gdzie oligocukier rdzenia i lipid A pochodzą z LPS lub LOS szczepów bakterii Gram-ujemnych. a lipid A jest detoksyfikowany.
Pomimo znanych ze stanu techniki rozwiązań nadal istnieje potrzeba dostarczenia immunogennej kompozycji, która będzie miała zastosowanie jako skuteczna hybrydowa szczepionka indukująca szerokie spektrum ochrony przeciwbakteryjnej zarówno wobec Gram-dodatnich jak i Gram-ujemnych szczepów.
W związku z tym istnieje potrzeba identyfikacji i wytworzenia nowych antygenów, wspólnych dla większej grupy gatunków Gram-ujemnych i Gram-dodatnich bakterii, w szczególności gatunków wywołujących zakażenia szpitalne oraz infekcje, takie jak te wywoływane przez Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae. Escherichia coli, Shigella spp. oraz Clostridium difficile.
Nieoczekiwanie problem ten rozwiązuje niniejszy wynalazek.
Przedmiotem wynalazku jest neoglikokoniugat składający się z białkowego nośnika zawierającego fragment C-końcowy toksyny B Clostridium difficile zawierający 517 aa od reszty 1850-2366. oraz z co najmniej jednego oligocukru rdzenia Escherichia coli R1 LOS.
Korzystnie. oligocukier rdzenia Escherichia coli R1 LOS posiada wolną grupę aminową (a-GlcN) oraz wolną grupę karboksylową (a-Kdo).
Korzystnie. oligocukier Escherichia coli R1 LOS posiada strukturę o wzorze 1.
Korzystnie, białkowy nośnik posiada sekwencję aminokwasową SEKW NR ID 1.
Wynalazek dotyczy również kompozycji farmaceutycznej zawierającej powyżej zdefiniowany neoglikokoniugat oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą i/lub adiuwant.
Innym przedmiotem wynalazku jest szczepionka zawierająca kompozycję farmaceutyczną obejmującą wyżej cytowany neoglikokoniugat oraz dopuszczalną farmaceutycznie substancję pomocniczą i adiuwant.
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca cytowany powyżej neoglikokoniugat oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą i/lub adiuwant do leczenia, zapobiegania i diagnozowania zakażeń wywołanych przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie.
PL229 194B1
Przedmiotem wynalazku jest również kompozycja farmaceutyczna zawierająca cytowany powyżej neoglikokoniugat oraz farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą i/lub adiuwant do leczenia, zapobiegania i diagnozowania zakażeń wywołanych przez bakterie Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile.
Innym przedmiotem wynalazku jest przeciwciało generowane przez powyższą kompozycję.
Innym przedmiotem wynalazku jest zestaw diagnostyczny do wykrywania zakażeń Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile zawierający powyżej cytowane przeciwciało.
Wynalazek dotyczy neoglikokoniugatu oligocukru i toksoidu Clostridium difficile. Neoglikokoniugat według rozwiązania stanowi połączenie oligosacharydu Escherichia coli R1 LOS z rekombinowanym C-końcowym fragmentem toksyny B Clostridium difficile. Oligocukierten stanowi konserwatywną strukturę głównego czynnika wirulencji bakterii Gram-ujemnych, natomiast toksyna B jest egzotoksyną bakterii Gram-dodatniej wywołującej częste zakażenia szpitalne.
Oligocukier wyizolowano z Escherichia coli mającej lipopolisacharyd pozbawiony antygenu O - LPS typu szorstkiego (LPS typu R, lipooligosacharyd, LOS). Oligocukierten otrzymano w wyniku łagodnej hydrolizy kwaśnej LOS Escherichia coli R1. Następnie z uzyskanej heterogennej mieszaniny wyizolowano oligocukier rdzenia wykazujący cechy zwitterjonu poprzez obecność wolnej grupy aminowej (α-GlcN) oraz grupy karboksylowej (α-Kdo). Zastosowanie oczyszczonej frakcji oligocukrów w postaci „zwitterjonów” zwiększa odpowiedź immunologiczną na dany antygen. Uzyskane fragmenty oczyszczano i skoniugowano z nośnikiem białkowym -toksoidem Clostridium difficile.
Oligosacharyd Escherichia coli R1 LOS (dekasacharyd rdzenia Escherichia coli PCM 1985) będący konserwatywnym fragmentem głównego antygenu powierzchniowego, ma strukturę wspólną dla wielu pokrewnych szczepów bakterii Gram-ujemnych i w formie immunogennej zapewnia szeroką ochronę przeciwbakteryjną. Według stanu techniki nie są znane właściwości immunogenne tej cząsteczki, opublikowano jedynie dane dotyczące koniugatów oligocukrowych zawierających głównie struktury pozbawione podstawienia GIcN. Strukturę oligosacharydu rdzenia Escherichia coli R1ZW (ZWT) odpowiadającą masie 1865,6 Da przedstawia WZÓR 1. Litery odpowiadają monosacharydom na widmie NMR.
O .o
ChOH B \
WZÓR 1
PL 229 194 B1
Nośnikiem białkowym jest chimera białkowa fragmentu C-końcowego toksyny B Clostridium difficile (TBd, 517 aa, reszty 1850-2366 TcdB) oraz białka SUMO (98 aa) otrzymany w wyniku rekombinacji w heterologicznym systemie bakteryjnym Escherichia coli.
Oligosacharyd skoniugowany z wymienionym wyżej nośnikiem białkowym uzyskuje nowe właściwości antygenowe. W modelu zwierzęcym w wyniku szczepienia takim antygenem generowane są przeciwciała reagujące z toksyną Clostridium difficile oraz z szerokim spektrum LPS i LOS Gram-ujemnych potencjalnie patogennych bakterii. Unikatową właściwością tak wygenerowanej szczepionki jest indukcja przeciwciał rozpoznających struktury powierzchniowe Bordetella pertussis (część końcową cząsteczki endotoksyny) oraz Klebsiella pneumoniae (struktury wielocukrowych epitopów) przy zachowaniu jednocześnie oczekiwanej aktywności generowania przeciwciał rozpoznających toksynę Clostridium difficile, i struktury endotoksyn Escherichia coli oraz Shigella spp.
Obserwowane reakcje dotyczą części rdzeniowej w przypadku Bordetella pertussis oraz szczepów Escherichia coli, których LPS zawierają rdzeń typu R1. W przypadku Klebsiella pneumoniae obserwuje się reakcje w regionie rdzeniowym jak i w części polisacharydowej LPS.
Neoglikokoniugat według wynalazku powoduje generację przeciwciał rozpoznających struktury antygenów o strukturach innych niż te użyte w neoglikokoniugacie. Może mieć to związek ze specyficznym rozkładem ładunków w nowosyntetyzowanym koniugacie i kontekście użytego fragmentu białkowego.
Indukowane neoglikokoniugatem przeciwciała wykazują właściwości bakteriobójcze wobec bakterii Escherichia coli (Escherichia coli PGM 1985), Bordetella pertussis (Bordetella pertussis 186), Klebsiella pneumoniae O5 w testach płytkowych. Neoglikokoniugat według wynalazku pozwala na dostarczenie hybrydowej szczepionki indukującej szerokie spektrum ochrony przeciwbakteryjnej. Szczepionka ta może zapewnić skuteczną ochronę przed infekcją wywołaną przez bakterie Gram-dodatnie i Gramujemne.
Fig. 1 Przesunięcia chemiczne 1H.13C NMR oligocukru zwitterjonowego R1ZW (ZWT).
Fig. 2 Sekwencja białka nośnikowego Clostridium difficile (SEKW NR ID 2).
Fig. 3 Sekwencja rekombinowanego nośnika białkowego TBd (SEKW NR ID 1).
Sekwencja białkowa zawiera 616 aa. Reszta N jest 1850 aminokwasem w sekwencji TcdB. Masa monoizotopowa rekombinantu wynosi 70748,44 Da. (peptyd SUMO 11261.68 Da).
Fig. 4 Profil elucji supernatantu po wirowaniu zawiesiny komórek E. coli, w których ekspresjonowano TBd. Eluent monitorowano przy 280 nm.
Fig. 5 Profil elucji frakcji II na kolumnie HitrapQ. Połączone frakcje zaznaczono. Eluent monitorowano przy 280 nm.
Fig. 6 Profil elucji utlenionego oligosacharydu rdzenia Escherichia coli ZWT. Frakcje oligosacharydu użyte do koniugacji zaznaczono. Eluent monitorowano z pomocą refraktometru przepływowego (Shodex).
Fig. 7 Rozdział w żelu poliakryloamidowym i immunobloting LPS z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi R1ZW-TBd.
Fig. 8 Rozdział w żelu poliakryloamidowym i immunobloting LPS z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi R1 ZW-TTd .
Fig. 9 Immunobloting (test dot blot) reakcja aktywnej toksyny B Clostridium difficile (TCdB) oraz toksoidu TBd (EcdB) z surowicą skierowaną przeciwko koniugatowi R1ZW-TBd. TCdB x1: 70 ng, x2: 140 ng, x3: 210 ng; TBd (EcdB) x1: 100 ng, x2 200 ng, x3: 300 ng. Rozcieńczenie surowicy 1:50.
P r z y k ł a d 1
Izolacja rdzenia Escherichia coli R1
Szczep Escherichia coli R1 uzyskano z Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów. Źródłem struktury jest szczep Escherichia coli PCM 1985. Hodowle bakteryjne prowadzono na płytkach agarowych w 37°C przez noc, następnie zawieszano w sterylnym PBS. Przygotowanym inokulum zaszczepiano 9 l podłoża LB lub podłoża mineralnego Davis'a wzbogaconego w glukozę, hydrolizat kazeiny i wyciąg drożdżowy. Hodowlę prowadzono przez 18 godzin w fermentorze Bioflo 415 (Eppendorf) w 37°C z napowietrzaniem. Po hodowli bakterie zabijano 0,5% fenolem i wirowano na wirówce przepływowej Cepa. Otrzymaną masę bakteryjną zawieszano w 300 ml wody (miliQ 18 MQ/cm) i liofilizowano.
Ekstrakcja LOS
LOS ekstrahowano z masy bakteryjnej metodą wodno-fenolową opisaną przez Westphala (1). Masę bakteryjną zawieszano w wodzie (25 ml wody miliQ na 2 g suchej masy), dodawano równą objętość fenolu i po ogrzewaniu do 65°C ekstrahowano przez 15 min. intensywnie mieszając. Mieszaninę
PL229 194B1 po ochłodzeniu do 4-5°C wirowano 3000 rpm przez 30 min. Zebrano fazę wodną, a do pozostałości dodano wody miliQ w ilości odpowiadającej zebranej objętości i powtórzono cykl ekstrakcji. Fazy wodne połączono i dializowano w wodzie przez 72 godziny, a następnie liofilizowano. Ostatnim etapem oczyszczania LOS było trzykrotne ultrawirowanie przy 100000xg przez 6 godzin (2). Zlifilizowany LOS po dializie zawieszono w wodzie miliO za pomocą sondy ultradźwiękowej i ultrawirowano. Osad po ultrawirowaniu (zawierający LOS) zawieszono w wodzie (miliO) i wirowano jeszcze dwa razy. Po ostatnim cyklu ultrawirowania LOS zawieszono w wodzie i liofilizowano.
Otrzymanie i oczyszczanie oligosacharydu ZWT
Oczyszczony LOS hydrolizowano w 1,5% kwasie octowym (40 ml 1,5% kwasu na 200 mg LOS) w temperaturze 100°C przez 0,5 do 1 godziny i wirowano 18000xg przez 20 minut w celu oddzielenia rozpuszczalnych oligosacharydów od osadu lipidu A. Oligosacharyd zwitterjonowy R1 ZW (ZWT) izolowano za pomocą chromatografii cieczowej sprzężonej z spektrometrią masową, korzystając z kolumny ZIC-HILIC (Merck-Milipore, SeOuant 5um 200A, 150x21,2 ΗΧ4310044) i spektrometru masowego ze źródłem jonowym typu ESI i pułapką jonową jako analizatorem jonów. Rozdziały chromatograficzne prowadzono w gradiencie acetonitrylu i 0,1% roztworu kwasu mrówkowego w wodzie (62%-40% acetonitrylu 30 min). Frakcje rdzeniowe o charakterze zwiterjonowym (oznaczone jako ZWT) z kolejnych rozdziałów łączono i liofilizowano. Osobno łączono frakcje ZWT monofosforylowane (obserwowane jony w widmie 931,8 i 922,8), a osobno pozostałe frakcje ZWT- pozostałe jony wyszczególnione w Tabeli nr 1. Strukturę zliofilizowanych oligosacharydów potwierdzano za pomocą spektroskopii NMR.
Tabela 1
| ZWT [M] | Obliczona masa monoizotopowa | Obserwowany jon (m/z) na widmie ESI QTrap | Interpretacja jonu |
| Kdo+3Hep+5Hex+HexN+P | 1988,57 | 993,2 | [M-2H+PEtNJ2' |
| Kdo+3Hep+5Hex+HexN+P | 1970,56 | 984,2 | [M-2H+PEtN-Hz0]2' |
| Kdo+3Hep+5Hex+HexN+2P | 1945,52 | 971,8 | [M2H]2' |
| Kdo+3Hep+5Hex+HexN+2P | 1927,5 | 962,8 | [Μ-2Η-Η2Ο]* |
| Kdo+3Hep+5Hex+HexN+R | 1865,56 | 931,8 | [M-2H]2' |
| Kdo+3Hep+5Hex+HexN+P | 1847,56 | 922,8 | [M 2H-H2O]2 |
Ekspresja C-końcowego fragmentu toksyny B z Clostridium difficile w Escherichia coli (EcdB).
Do ekspresji w systemie bakteryjnym wybrano fragment C-końca białka TcdB zawierający 517 aminokwasów. Do sekwencji dodano serynę jako pierwszy aminokwas, obecność tej reszty na N-końcu rekombinowanego białka ułatwia hydrolizę białka SUMO za pomocą proteazy SUMO. Zoptymalizowano skład nukleotydowy wybranej sekwencji, tak aby zawartość poszczególnych nukleotydów odpowiadała wymaganiom Escherichia coli.
Zawiesinę chemikompetentnych komórek Escherichia coli BL21 rozmrożono na lodzie i dodano 10 ng plazmidu ChampionTM pET SUMO z wklonowanym fragmentem receptorowym toksyny B z Clostridium difficile. Postępowano zgodnie z instrukcją dołączoną do zestawu Champion pET SUMO (Protein Expression System, lnvitrogen by life technologies). Inkubowano na lodzie przez 30 minut a następnie przez 30 sekund inkubowano w 42°C i dodano 250 ml SOC ogrzanego do temperatury pokojowej i inkubowano w 37°C z wytrząsaniem przez 1 h 200 rpm/min. Otrzymaną zawiesiną bakteryjną zaszczepiono 50 ml płynnego podłoża LB zawierającego kanamycynę (Gibco by life technologies) w stężeniu 50 pg/ml i inkubowano przez noc w 37°C z wytrząsaniem. Otrzymanym inokulum zaszczepiono 1,5 I płynnego LB zawierającego kanamycynę 50 pg/ml, hodowlę prowadzono w 37°C z wytrząsaniem. W momencie gdy gęstość optyczna hodowli osiągnęła wartość OD=0,6 dodano IPTG (Roth) do stężenia 1 mM/ml. Ekspresję prowadzono przez 5 godzin w 37°C z wytrząsaniem. Otrzymaną masę bakteryjną zebrano przez wirowanie 5000xg przez 10 minut i zamrożono w - 20°C. Masę bakteryjną po rozmrożeniu zawieszono w 20 ml buforu 10 mMTris/HCI 50 mMCaCb pH=8 (bufor A), i sonikowano na
PL 229 194 B1 lodzie 3 lub 4 razy po 1 min, w celu dezintegracji ściany i błony komórkowej bakterii, obserwując zgęstnienie zawiesiny w momencie uwolnienia zawartości komórki. Zawiesinę wirowano dwukrotnie 18000xg 20 min. Rekombinowane białko oczyszczono z supernatantu za pomocą chromatografii jonowymiennej na złożu DEAE Sephadex A-25, w buforze A w gradiencie 0-0,5M NaCI (1M NaCI 10m MTris/HCI 50 mMCaCl2 pH=8 - bufor B). Obecność białka w eluencie monitorowano obserwując absorbancję przy długości fali 260 i 280 nm. Obecność toksoidu TBd monitorowano w teście dot-blot za pomocą przeciwciała anty TcdB (antibodies-online GmbH).
Frakcje zawierające toksoid połączono, następnie zagęszczono na filtrach Amicon 30 kDa, wymieniając bufor na bufor A. Otrzymany roztwór toksoidu oczyszczano na kolumnie HiTrap Q w buforze A i gradiencie 0-0,5M NaCl. Obecność białka w eluencie monitorowano obserwując absorbancję przy długości fali 260 i 280 nm. Obecność toksoidu monitorowano w teście dot-blot za pomocą przeciwciała anty-TcdB. Oczyszczony toksoid przechowywano w -20°C w 50% roztworze glicerolu.
Przygotowanie koniugatów oligosacharydów rdzeniowych z toksoidem toksyny B z Clostridium difficile.
Koniugat R1ZW-TBd przygotowano wykorzystując reakcję reduktywnej aminacji, 4,2 mg oczyszczonego R1ZW (ZWT) rozpuszczono w 0,1M octanie sodu pH=5,5 w stężeniu 10 mg/ml i utleniano w ciemności w 10 mM nadjodanie sodu przez 1 h (3), w takich warunkach utlenieniu do aldehydów ulegają wicynalne grupy hydroksylowe na heptozach i Kdo. Następnie oligosacharyd oczyszczano za pomocą chromatografii SEC w wodzie na kolumnie ze złożem G3000 PW. Eluent monitorowano za pomocą refraktometru przepływowego, a otrzymane frakcje analizowano za pomocą spektrometrii mas na obecność oligosacharydów. Frakcje oligosacharydowe połączono i zliofilizowano. Otrzymano 3,5 mg utlenionego oligosacharydu. Utleniony oligosacharyd R1ZW (3.5 mg) następnie rozpuszczono w 260 pl roztworu białka TBd, (1,5 mg) w 0.2 M buforze boranowym (pH=9.0), inkubowano przez 1 h w 37°C, dodano 40 pl 1M roztworu cyjanoborowodorku sodu (odczynnik ALD, Sterogene, USA) oraz kroplę chloroformu. Reakcję prowadzono w temperaturze 37°C przez 12 dni, bez mieszania. W 5 i 10 dniu reakcji dodano kolejne porcje 22 pl ALD. Po zakończeniu reakcji mieszaninę oczyszczono przy użyciu SECHPLC na kolumnie G3000 SW (2.5 x 30 cm) (Tosoh Bioscience, Japonia) zrównoważonej buforem PBS. Wielkość nastrzyku wynosiła 1 ml, prędkość przepływu 6 ml/min., a objętość zbieranych frakcji wynosiła 3 ml. Frakcje koniugatu monitorowano immunochemicznie pod względem reakcji ze specyficznymi przeciwciałami anty-R1ZW i anty-CdTB i tym samym na obecność antygenu białkowego toksyny B C. difficile cukrowego ZWR1 za pomocą testu dot-blot. Na dwie membrany nitrocelulozowe naniesiono 3x 0,7 pl roztworu z każdej analizowanej frakcji. Membrany blokowano w 0,2% roztworze kazeiny w TBS, następnie w celu wykrycia antygenu cukrowego, jedną membranę inkubowano z surowicą króliczą, otrzymaną w wyniku immunizacji koniugatem oligosacharydu rdzenia E. coli R1 z toksoidem tężcowym OSR1TTd, w rozcieńczeniu 1:150. Surowicę rozcieńczano 0,2% roztworem kazeiny w TBS. Jako drugorzędowego przeciwciała użyto koziego anty króliczego IgG skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:500. Drugą membranę inkubowano z mysim przeciwciałem poliklonalnym przeciwko toksynie B z C. difficile, roztwór o stężeniu 1 mg/ml rozcieńczono 1:500 0,2% roztworem kazeiny w TBS. Jako drugorzędowego przeciwciała użyto koziego anty mysiego IgG skoniugowanego z fosfatazą alkaliczną w rozcieńczeniu 1:500. Jako substratów używano roztworów BCIP/NBT. Zebraną frakcję zawierającą glikokoniugat zagęszczono na koncentratorach Vivaspin 30 kDa (Millipore) do stężenia mg/ml w oparciu o pomiar zawartości białka (spektrofotometryczny, przy dł. fali 280 nm). Do konserwacji roztworu koniugatu użyto roztworu mertiolatu o końcowym stężeniu 0.02%. Roztwór koniugatu jest przechowywany w lodówce w 4°C.
Immunizacja zwierząt i preparacja surowic odpornościowych
3-miesięczne samice królików rasy baran francuski szczepiono podskórnie w okolice karku, 5-6 punktów podania. Cykl szczepień obejmował trójkrotną immunizację w odstępach 3 tygodni. Przed rozpoczęciem cyklu szczepień pobierano surowicę kontrolną. 14 dni po ostatniej immunizacji króliki poddawano procedurze całkowitego skrwawiania. Krew zbierano do probówek o obj. 10 ml (probówki PMMA z granulatem i akceleratorem koagulacji, FL Medical, Włochy) i pozostawiano (bez mieszania/wytrząsania) do wykrzepienia przez noc, w temperaturze 20°C. Po wykrzepieniu krwi, surowice oddzielano od skrzepu poprzez wirowanie (1500 x g, 15 min. 4°C, Beckman J-2MC, rotor JS-7.5). Otrzymane surowice inkubowano bez mieszania przez 30 min. w temperaturze 56°C w celu inaktywacji białek układu dopełniacza. Surowice porcjowano i przechowywano w temperaturze - 20°C.
PL 229 194 B1
Przygotowanie formulacji szczepionki
Bezpośrednio przed immunizacją królików sporządzano szczepionkę, która zawierała dla: R1ZW-dTT:
• 40 pg of the antygenu, (glikokoniugatu) (objętość zależna od stężenia antygenu), • 80 pl of the MPLA adiuwant (1 mg/ml in skwalen/lecytyna/Tween-80/PBS • PBS, pH=7,3 do objętości 320 pL dla : R1ZW-RdTCdB:
• 60 pg antygenu, (glikokoniugatu) (objętość zależna od stężenia antygenu), • 80 pl adiuwantu MPLA (1 mg/ml in squalen/1 ecitine/Tween-80/PBS • PBS, pH=7,3 do objętości 320 pL.
Mieszaninę, bezpośrednio przed immunizacją, homogenizowano ultradźwiękami na lodzie (5-krotnie po 5 sek., 10 sek. przerwy między etapami sonikacji moc: 70 Weff) stosując sondę ultradźwiękową (homogenizator ultradźwiękowy Sonoplus, Bandelin, Niemcy).
Przygotowanie adiuwantu - monofosforylowanei pochodnej lipidu A Hafnia alvei (MPLA)
Adiuwant MPLA otrzymano z lipidu A H. alvei PCM 1200. W celu otrzymania MPLA, lipid A (200 mg) zawieszono w 20 ml 0,1 M HCl, a następnie przeprowadzono reakcję hydrolizy w 100°C przez 15 min. Po reakcji mieszaninę zliofilizowano. Formulację adiuwantu otrzymano wg metody Baldridge i Crane (Methods, 1999, 19:103-7). Przygotowano 12% roztwór lecytyny w skwalenie oraz 0,5% roztwór detergentu Tween 80 w buforze PBS. 10 mg MPLA zawieszano w 1 ml 12% mieszaniny skwalenu w lecytynie w 65°C na łaźni ultradźwiękowej Bandelin RK10H przez 2 godziny - do rozpuszczenia próbki, a następnie 0,5 ml otrzymanej zawiesiny zmieszano z 4,5 ml 0,5% roztworu detergentu Tween 80 w PBS. Otrzymaną mieszaninę sonikowano sondą ultradźwiękową, chłodząc mieszaninę na lodzie. Tak przygotowaną formulację adiuwantu zawierającą 1 mg/ml MPLA stosowano do przygotowania szczepionek.
P r z y k ł a d 2
Surowicę skierowaną przeciwko koniugatowi R1ZW-TBd (Cd) (Fig. 7) przebadano z 32 lipopolisacharydami: Escherichia coli R1, R2, R3, R4, K-12, Shigella flexneri 3A, Shigella sonnei fazy II, Salmonella Ra, S. sonnei fazy I, Escherichia coli O6, O18, O39, O10, O100, O111, O86, Klebsiella pneumoniae O1, O2a, O3, O4, O5, Plesiomonas shigelloides O17, O51, Proteus penneri 12, Proteus vulgaris 9/57, Proteus mirabilis O28, Citrobacter O16, Hafnia alvei 1209, H. alvei 1190, Salmonella enterica, Shigella flexneri VI, Bordetella pertussis 186. Immunobloting poprzedzono rozdziałam elektroforetycznym z żelu poliakryloamidowym, w warunkach denaturujących.
Dla surowicy anty-R1ZW-TBd (Cd) obserwowano silne reakcje krzyżowe dla szybko wędrujących frakcji rdzeniowych dla LPS Escherichia coli R1, S. sonnei fazy II i I, Escherichia coli O6, O18, O39, Bordetella, pertussis 186 oraz dla LPS Klebsiella pneumoniae O5 dla wolno wędrujących frakcji łańcuchów O-swoistych. Surowica słabiej reagowała z LPS Klebsiella pneumoniae O1, O2a, O23, O4, P. shigelloides 017, 051, P. mirabilis O28, Citrobacter O16, H. alvei 1209, 1190, S. flexneri VI. Wyniki zebrano w Tabeli 2.
PL229 194B1
Tabela 2. Tabela reaktywności surowicy R1ZW-TBd (Cd), anty-R1ZW-TTd i anty-R1-TTd z LPS
| Bakterie | Reaktywność surowicy RlZW-TBd | Reaktywność surowicy RlZW-TTd | Reaktywność surowicy Rl-TTd |
| E.coli R1 | +++ | -F++ | -++ |
| E.C0//R2 | + | ||
| E.coli R3 | +++ | ||
| E.coli R4 | |||
| E.coli K-12 | |||
| S. flexneri 3a | + | ||
| S. sonnei fazy II | +++ | -++ | +++ |
| Salmonella Ra | |||
| S. sonnei fazy 1 | +++ | ) | |
| E.coli 06 | ++ | + | |
| E.coli 018 | +++ | +++ | -I-++ |
| E.coli 039 | +++ | -++ | +++ |
| E.coli 010 | |||
| E.coli 0100 | |||
| E.coli 0111 | + | ||
| E.coli 086 | |||
| K. pneuminlae Ol | + | ||
| K. pneuminiae 02a | + | ||
| K. pneuminiae 03 | + | 1' (silna reakcja w antygenie 0) | |
| K. pneuminiae 04 | + | ||
| K. pneuminiae 05 | +++ | ||
| P. shigeiioides 017 | + | ||
| P. shigeiioides 051 | + | ||
| p. penneri 12 | |||
| P. vulgaris 9/57 | |||
| P. mirabiiis 028 | + | ||
| Citrobacter 016 | ++ | ||
| H. alvei 1209 | + | ||
| H. alvei 1190 | ++ | ||
| Salmonella enterica | + | ||
| S. ftexneri VI | + | + | ++ |
| 8, pertussis 186 | +++ |
Na uwagę zasługuje brak reakcji surowic anty-R1-TTd i anty-R1ZW-TTd z lipopolisacharydem Bordetella pertussis 186 (Fig. 8) podczas gdy surowica indukowana koniugatem R1ZW-TBd reagowała silnie z lipopolisacharydem Bordetella pertussis 186. Wszystkie surowice anty R1ZW-TBd reagowały z toksyną B Clostridium difficile.
Bakteriobójcze działanie surowicy anty-R1ZW-TBd sprawdzono dla następujących bakterii: Klebsiella pneumoniae 05, Escherichia coli 018, Escherichia coli 039, Escherichia coli R1 oraz Bordetella pertussis 186 (Tabela 3). Dla wszystkich surowic badano rozcieńczenia dla 1:2 do 1:2048 z wyjątkiem Bordetella pertussis - testy do rozcieńczenia surowicy 1:400. Wszystkie testy przeprowadzono dwukrotnie, dane liczbowe: średnia liczba kolonii na płytkach.
Surowica anty-R1ZW-TBd wykazała właściwości bakteriobójcze wobec bakterii Klebsiella pneumoniae 05 przy rozcieńczeniu 1:8.
W przypadku bakterii Escherichia coli R1 surowica anty-R1ZW-TBd wykazała właściwości bakteriobójcze do rozcieńczenia 1:2048.
PL229 194B1
Tabela 3
| Bakteria | K- | K+ | Miano bakteriobójczości |
| E. coli Rl* | 90.5 | 24 | 1:2048, w tym stężeniu zabitych 52 % bakterii |
| E. coli 039 | 133 | 0,5 | W przypadku bakterii E. coli 039 nie obserwowano wzrostu bakterii nawet w przypadku próby kontrolnej (same bakterie z komplementem) - bakteriobójcze działanie komplementu. |
| E. coli 018 | 156 | 77,5 | Do rozcieńczenia surowicy 1:2 w przypadku E. coli 018 nie obserwowano właściwości bakteriobójczych surowicy anty-RlZW-RdTCdB |
| K. pneumoniae 05 | 96.5 | 83,5 | 1:8, w tym stężeniu zabitych 51% bakterii |
| B. pertussis | 1904 | 964 | 1:200, w tym stężeniu zabitych 58% bakterii |
K+ - kontrola: surowica królika nieimmunizowanego z komplementem, średnia liczba kolonii na płytkach
K- - surowica królika nieimmunizowanego bez komplementu * - test wykonany z użyciem płodowego komplementu cielęcego (źródło Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, Katedra Immunologii Weterynaryjnej (prof. Tadeusz Stefaniak). Ze względu na ograniczoną ilość otrzymanego płodowego komplementu cielęcego wykonano testy bakteriobójczości wyłącznie na bakteriach Escherichia coli R1.
Claims (10)
1. Neoglikokoniugat składający się z białkowego nośnika zawierającego C-końcowy fragment toksyny B Clostriudium difficile zawierający 517 aa od reszty 1850-2366, oraz z co najmniej jednego oligocukru rdzenia Escherichia coli R1 LOS.
2. Neoglikokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że oligocukier posiada wolną grupę aminową (α-GlcN) oraz wolną grupę karboksylową (a-Kdo).
3. Neoglikokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że oligocukier Escherichia coli R1 LOS posiada strukturę o wzorze 1.
4. Neoglikokoniugat według zastrz. 1, znamienny tym, że białkowy nośnik posiada sekwencję aminokwasową SEKW NR ID 1.
5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca neoglikokoniugat jak zdefiniowano w zastrz. 1-4 oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik i/lub adiuwant.
6. Szczepionka zawierająca kompozycję farmaceutyczną jak zdefiniowano w zastrz. 5.
7. Kompozycja farmaceutyczna jak zdefiniowano w zastrz. 5 do leczenia, zapobiegania i diagnozowania zakażeń wywołanych przez bakterie Gram-ujemne i Gram-dodatnie.
8. Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania według zastrz. 7, znamienna tym, że bakterie stanowią Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile.
9. Przeciwciało generowane przez kompozycję jak określono w zastrz. 5.
10. Zestaw diagnostyczny do wykrywania zakażeń wywołanych przez Bordetella pertussis, Klebsiella pneumoniae, Escherichia coli, Shigella spp., Clostridium difficile zawierający przeciwciało jak określono w zastrz. 9.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415211A PL229194B1 (pl) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | Neoglikokoniugat oligocukru Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile oraz jego zastosowanie w szczepionkach przeciwbakteryjnych |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415211A PL229194B1 (pl) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | Neoglikokoniugat oligocukru Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile oraz jego zastosowanie w szczepionkach przeciwbakteryjnych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415211A1 PL415211A1 (pl) | 2017-06-19 |
| PL229194B1 true PL229194B1 (pl) | 2018-06-29 |
Family
ID=59061625
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415211A PL229194B1 (pl) | 2015-12-09 | 2015-12-09 | Neoglikokoniugat oligocukru Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile oraz jego zastosowanie w szczepionkach przeciwbakteryjnych |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229194B1 (pl) |
-
2015
- 2015-12-09 PL PL415211A patent/PL229194B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415211A1 (pl) | 2017-06-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6771499B2 (ja) | 新規の多糖及びその使用 | |
| TWI751513B (zh) | E. coli O-抗原多醣生物結合物、其製備方法及其使用方法 | |
| TWI771663B (zh) | E. coli O-抗原多醣生物結合物之製備方法、其組合物及其使用方法 | |
| JP6381147B2 (ja) | ピロリ菌リポ多糖類の外殻エピトープ | |
| JP7485771B2 (ja) | ＦｉｍＨ変異体、その組成物、及びその使用 | |
| WO2019175147A1 (en) | Vaccines against intra-abdominal infections | |
| US20160136285A1 (en) | An isolated immunogenic bacterial antigen and its use in the prevention and treatment of infections caused by gram-negative bacteria | |
| JP2000509707A (ja) | 免疫原性複合体、その使用、製造法およびそれを含有するワクチン | |
| PL229194B1 (pl) | Neoglikokoniugat oligocukru Escherichia coli R1 LOS i toksoidu Clostridium difficile oraz jego zastosowanie w szczepionkach przeciwbakteryjnych | |
| JP2007537307A (ja) | 多種ワクチン候補としての保存された内側コアリポ多糖体エピトープ：アクチノバシラス・プレウロニューモニー、マンヘイミア・ヘモリティカ及びパスツレラ・マルトシダを含む畜獣の病原菌によって起きる病気の予防のためのワクチン候補としての内核リポ多糖体エピトープ | |
| RU2818894C1 (ru) | Свободные от примеси с-полисахарида капсульные полисахариды streptococcus pneumoniae с остатком 2,5-ангидроманнозы на восстанавливающем конце | |
| US20230346902A1 (en) | Shigella-Tetravalent (Shigella4V) Bioconjugate | |
| JP2025535072A (ja) | モラクセラ科ｏ結合型オリゴ糖転移酵素、糖鎖付加断片、及びそれらの使用 | |
| TW202434282A (zh) | 多價疫苗組合物及其用途 | |
| EA046636B1 (ru) | Способы получения биоконъюгатов полисахаридных о-антигенов e. coli, их композиции и способы их применения | |
| KR20070031936A (ko) | 다종 백신 후보로서의 보존된 내부 코어 지질다당류에피토프 |