PL229329B1 - Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzania - Google Patents
Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzaniaInfo
- Publication number
- PL229329B1 PL229329B1 PL415936A PL41593616A PL229329B1 PL 229329 B1 PL229329 B1 PL 229329B1 PL 415936 A PL415936 A PL 415936A PL 41593616 A PL41593616 A PL 41593616A PL 229329 B1 PL229329 B1 PL 229329B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- curdlan
- component
- solution
- naoh
- bioceramics
- Prior art date
Links
- 229920002558 Curdlan Polymers 0.000 title claims abstract description 44
- 239000001879 Curdlan Substances 0.000 title claims abstract description 44
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 title claims abstract description 44
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 title claims abstract description 44
- 235000019316 curdlan Nutrition 0.000 title claims abstract description 44
- 229940078035 curdlan Drugs 0.000 title claims abstract description 44
- 239000003462 bioceramic Substances 0.000 title claims abstract description 30
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 229920001503 Glucan Polymers 0.000 title claims 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 87
- 239000008187 granular material Substances 0.000 claims abstract description 27
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 claims abstract description 19
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 claims abstract description 17
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 claims abstract description 17
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 claims abstract description 17
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 13
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003910 polypeptide antibiotic agent Substances 0.000 claims abstract description 10
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims abstract description 9
- 239000011858 nanopowder Substances 0.000 claims abstract description 8
- 229920002498 Beta-glucan Polymers 0.000 claims abstract description 7
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims abstract description 7
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 20
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 18
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 18
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 14
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 claims description 13
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 11
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 11
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 11
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 11
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 claims description 10
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 claims description 10
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 claims description 6
- 108010049931 Bone Morphogenetic Protein 2 Proteins 0.000 claims description 5
- 108010049955 Bone Morphogenetic Protein 4 Proteins 0.000 claims description 5
- 102100024506 Bone morphogenetic protein 2 Human genes 0.000 claims description 5
- 102100024505 Bone morphogenetic protein 4 Human genes 0.000 claims description 5
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims description 5
- 102000016359 Fibronectins Human genes 0.000 claims description 5
- 108010049870 Bone Morphogenetic Protein 7 Proteins 0.000 claims description 4
- 102100022544 Bone morphogenetic protein 7 Human genes 0.000 claims description 4
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 3
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims 1
- 239000000463 material Substances 0.000 abstract description 72
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 abstract description 11
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 abstract description 10
- 238000002513 implantation Methods 0.000 abstract description 8
- 230000008439 repair process Effects 0.000 abstract description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 abstract description 6
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 5
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 abstract description 5
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 abstract description 5
- 239000007943 implant Substances 0.000 abstract description 4
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 abstract description 4
- 206010067268 Post procedural infection Diseases 0.000 abstract description 2
- 210000004663 osteoprogenitor cell Anatomy 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 47
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 28
- IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N Ethylene oxide Chemical compound C1CO1 IAYPIBMASNFSPL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 17
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 16
- 210000000963 osteoblast Anatomy 0.000 description 16
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 12
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 11
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 8
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 8
- 230000008859 change Effects 0.000 description 7
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 7
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 7
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 7
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 6
- 231100000956 nontoxicity Toxicity 0.000 description 6
- 210000005009 osteogenic cell Anatomy 0.000 description 6
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 5
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 description 5
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- 239000000316 bone substitute Substances 0.000 description 4
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 3
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 3
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 3
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 2
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 210000004292 cytoskeleton Anatomy 0.000 description 2
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 2
- 238000010304 firing Methods 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 2
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 2
- VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M sodium;4-[2-(2-methoxy-4-nitrophenyl)-3-(4-nitrophenyl)tetrazol-2-ium-5-yl]benzene-1,3-disulfonate Chemical compound [Na+].COC1=CC([N+]([O-])=O)=CC=C1[N+]1=NC(C=2C(=CC(=CC=2)S([O-])(=O)=O)S([O-])(=O)=O)=NN1C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 VSIVTUIKYVGDCX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 2
- MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N vancomycin Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)[C@H](O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-LYRMYLQWSA-N 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 6-{[2-carboxy-4,5-dihydroxy-6-(phosphanyloxy)oxan-3-yl]oxy}-4,5-dihydroxy-3-phosphanyloxane-2-carboxylic acid Chemical compound O1C(C(O)=O)C(P)C(O)C(O)C1OC1C(C(O)=O)OC(OP)C(O)C1O FHVDTGUDJYJELY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 1
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 1
- 102000008946 Fibrinogen Human genes 0.000 description 1
- 108010049003 Fibrinogen Proteins 0.000 description 1
- 108010015899 Glycopeptides Proteins 0.000 description 1
- 102000007547 Laminin Human genes 0.000 description 1
- 108010085895 Laminin Proteins 0.000 description 1
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010059993 Vancomycin Proteins 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 1
- 229940072056 alginate Drugs 0.000 description 1
- 229920000615 alginic acid Polymers 0.000 description 1
- 235000010443 alginic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 239000000560 biocompatible material Substances 0.000 description 1
- 239000011173 biocomposite Substances 0.000 description 1
- 230000033558 biomineral tissue development Effects 0.000 description 1
- 239000004068 calcium phosphate ceramic Substances 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N chembl3301825 Chemical compound O([C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1OC1=C2C=C3C=C1OC1=CC=C(C=C1Cl)[C@@H](O)[C@H](C(N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H]3C(=O)N[C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C3=CC(O)=CC(O)=C3C=3C(O)=CC=C1C=3)C(O)=O)=O)[C@H](O)C1=CC=C(C(=C1)Cl)O2)=O)NC(=O)[C@@H](CC(C)C)NC)[C@H]1C[C@](C)(N)C(O)[C@H](C)O1 MYPYJXKWCTUITO-KIIOPKALSA-N 0.000 description 1
- 229940045110 chitosan Drugs 0.000 description 1
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 1
- 229960005188 collagen Drugs 0.000 description 1
- 238000007398 colorimetric assay Methods 0.000 description 1
- 238000004624 confocal microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 238000012377 drug delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 229940012952 fibrinogen Drugs 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000001879 gelation Methods 0.000 description 1
- 150000004676 glycans Chemical class 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 229920005615 natural polymer Polymers 0.000 description 1
- 231100001083 no cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010883 osseointegration Methods 0.000 description 1
- 230000011164 ossification Effects 0.000 description 1
- 230000001582 osteoblastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000278 osteoconductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- RFWLACFDYFIVMC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;[oxido(phosphonatooxy)phosphoryl] phosphate Chemical class [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O RFWLACFDYFIVMC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 229920000747 poly(lactic acid) Polymers 0.000 description 1
- 229920001610 polycaprolactone Polymers 0.000 description 1
- 239000004632 polycaprolactone Substances 0.000 description 1
- 239000004626 polylactic acid Substances 0.000 description 1
- 229920001282 polysaccharide Polymers 0.000 description 1
- 239000005017 polysaccharide Substances 0.000 description 1
- 230000002035 prolonged effect Effects 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000013268 sustained release Methods 0.000 description 1
- 239000012730 sustained-release form Substances 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 125000003831 tetrazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960003165 vancomycin Drugs 0.000 description 1
- MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N vancomycin Natural products O1C(C(=C2)Cl)=CC=C2C(O)C(C(NC(C2=CC(O)=CC(O)=C2C=2C(O)=CC=C3C=2)C(O)=O)=O)NC(=O)C3NC(=O)C2NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(CC(C)C)NC)C(O)C(C=C3Cl)=CC=C3OC3=CC2=CC1=C3OC1OC(CO)C(O)C(O)C1OC1CC(C)(N)C(O)C(C)O1 MYPYJXKWCTUITO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Materials For Medical Uses (AREA)
Abstract
Rusztowanie kostne na bazie bioceramiki fosforanowo - wapniowej i kurdlanu, charakteryzuje się tym, że zawiera 6 - 20% (w/v) roztwór ß-1,3-glukanu zwany dalej kurdlanem, przygotowany w 0,1 - 0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x) oraz 2 - 90% (w/v) bioceramiki fosforanowo - wapniowej rozprowadzonej w przygotowanym roztworze kurdlanu, w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze 0,1 - 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C - 1300°C, korzystnie 1100 - 1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 7 - 10% kurdlanu i 60 - 80% bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru: ymax(x)=0,079x2-6,1557x+123,57. Przedmiotem zgłoszenia jest także sposób wytwarzania rusztowania kostnego na bazie bioceramiki fosforanowo - wapniowej i kurdlanu. Materiał przygotowany ze względu na swoje właściwości biologiczne nadaje się do stosowania zarówno in vitro w inżynierii tkankowej jako rusztowanie kostne, wstępnie zasiedlane komórkami osteoprogeniterowymi, wyprowadzonymi z organizmu pacjenta w celu wygenerowania tzw. żywego wszczepu, jak i in vitro w medycynie regeneracyjnej, jako materiał przyspieszający procesy regeneracyjne w miejscu implantacji. Ponadto, przygotowany materiał nadaje się do stosowania jako baza do immobilizacji substancji bioaktywnych, również termowrażliwych (np. białek adhezyjnych, czynników wzrostu, antybiotyków peptydowych), metodą pułapkowania wewnątrz struktury polimerowej żelu kurdlanowego (na etapie wytwarzania rusztowania kostnego), co wpłynie na poprawę jego właściwości biologicznych oraz będzie chronić przed post - operacyjnymi infekcjami.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania wysoko biokompatybilnego materiału na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki do zastosowań w inżynierii tkankowej kości w celu przyspieszania procesów regeneracyjnych w miejscu implantacji. Otrzymany według wynalazku materiał może znaleźć zastosowanie jako rusztowanie kostne zasiedlane w warunkach in vitro komórkami osteoprogeniterowymi wyprowadzonymi od pacjentów w celu uzupełniania niewielkich ubytków kostnych u tych samych pacjentów po przebytych złamaniach lub resekcji nowotworu (pacjenci mogą w tym przypadku być dawcami i biorcami komórek).
Kluczowym elementem procesu rekonstrukcji tkanek jest przygotowanie odpowiedniego materiału implantacyjnego (Bose S. i wsp., Trends in Biotechnology 30, 546-554, 2012; Rezwan K. i wsp., Biomaterials 27, 3413-3431, 2006). W medycynie regeneracyjnej kości wyróżnia się dwa typy biomateriałów: substytuty kostne służące do wypełniania dużych ubytków kostnych, poddawane dużym obciążeniom mechanicznym, więc charakteryzujące się parametrami mechanicznymi zbliżonymi do kości ludzkiej oraz rusztowania kostne (tzw. skafoldy), które nie zawsze są poddawane dużym obciążeniom mechanicznym, a ich główną funkcją jest przyspieszanie procesów regeneracyjnych w miejscu niewielkich ubytków kostnych (Przekora A. i wsp., Mater. Sci. Eng. C. Mater. Biol. Appl. 58, 891-899, 2016). Ze względu na fakt, że system biomechaniczny kości jest złożony, rusztowanie kostne musi spełniać szereg zróżnicowanych kryteriów. Przede wszystkim powinno charakteryzować się wysoką biokompatybilnością, tj. zgodnością tkankową, sprzyjać zasiedlaniu komórek, pobudzać proliferację i różnicowanie komórek kościotwórczych (osteoblastów) oraz nie wykazywać cytotoksyczności. Rusztowanie powinno także posiadać zwartą strukturę, odpowiednią elastyczność oraz plastyczność, dzięki czemu charakteryzuje się poręcznością chirurgiczną i łatwością w dopasowywaniu się do miejsca ubytku kostnego. Innym ważnym czynnikiem jest stopniowa biodegradowalność skafoldu in vivo, dzięki czemu powstają miejsca do zasiedlenia i wzrostu nowych komórek. (Chen G. P. i wsp., Macromolecular Bioscence 2, 67-77, 2002; O’Brien F. J., Materials Today 14, 88-95, 2011; Dhandayuthapani B. i wsp., International Journal of Polymer Science 290602,1-19, 2011).
Głównym materiałem implantacyjnym stosowanym w inżynierii tkankowej kości jest hydroksyapatyt (HAp) oraz pokrewne mu trójfosforany wapnia (tj. α-TCP oraz β-TCP). HAp, który jest głównym składnikiem części mineralnej kości, jest materiałem biozgodnym, osteokonduktywnym oraz bioresorbowalnym (Karageorgiou V. i Kapłan D., Biomaterials 26, 5474-5491,2005; Knowles J. C., Journal of Materiał Chemistry 13, 2395-2401,2003; Oonishi H. i wsp., Eighth International symposium on ceramics in medicine, Eselvier Science Ltd. Tokyo, Japan 1995,137-144). Niemniej jednak, bioceramika fosforanowo-wapniowa (HAp i TCP) jest stosunkowo długo degradowana w organizmie, posiada niezadowalające właściwości mechaniczne, a także ze względu na swoją sypkość, jest nieporęczna chirurgicznie. W inżynierii tkankowej kości stosowane są również polimery, zarówno pochodzenia naturalnego, takie jak: alginian, fibrynogen, kolagen, chitosan, czy kwas hialuronowy, jak i pochodzenia syntetycznego np. polikaprolakton, czy kwas polimlekowy. Wspomniane polimery charakteryzują się wysoką bioaktywnością, jak również stopniową biodegradowalnością in vivo. Dlatego też tworzenie kompozytów złożonych z bioceramiki HAp lub/i TCP oraz naturalnych, bądź syntetycznych polimerów, pozwala połączyć zalety obu typów materiałów tak, aby wykazywały lepsze właściwości mechaniczne, spełniały wymagania fizjologiczne i były szybko degradowane (Gloria A. i wsp., Journal of Applied Biomaterials & Biomechanics, 8, 57-67, 2010; Lee S. -H. i Shin H., Advances in Drug Delivery Research, 22, 339359, 2007).
Ze względu na swoją zdolność do tworzenia zwartego, sprężystego żelu, kurdlan znalazł zastosowanie jako materiał wiążący (lepiszcze) dla ceramiki HAp. Dotychczasowe badania ograniczają się jednak do zastosowania żelu kurdlanowego otrzymanego metodą termiczną z zawiesiny wodnej tego polisacharydu. Jedna z koncepcji obejmuje zastosowanie proszku HAp o wielkości cząsteczek ok. 1 pm oraz wodnej zawiesiny kurdlanu, ogrzewanej w temperaturze 40°C, co pozwala na uzyskanie plastycznej kompozycji (US Patent nr 5 132 255). Kolejny sposób dotyczący zastosowania kurdlanu związany jest z zastosowaniem żelu kurdlanowego otrzymanego w temperaturze 80-100°C jako lepiszcza dla bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci mikroporowatych granul (HAp, HAp-TCP, TCP, HAp modyfikowany) o rozmiarze 0,1-1,0 mm i porowatości otwartej 50-70% (PL Patent nr 206 394, International Patent nr EU 2 421 570 B1). Materiały kompozytowe, otrzymane według wymienionego patentu, zawierają w swoim składzie mikroporowatą bioceramikę przez co wykazują wysoką reaktywność jonową, która negatywnie wpływa na żywotność fibroblastów i komórek kościotwórczych in vitro (Przekora
PL 229 329 Β1 i wsp., Inżynieria Biomateriałów 15 (114), 59-65, 2012). W związku z tym materiały te nie spełniają podstawowych wymagań stawianych rusztowaniom kostnym i nie mogą być wstępnie zasiedlane w warunkach in vitro komórkami osteoprogeniterowymi wyprowadzonymi od pacjenta. Niemniej jednak, materiały o wysokiej reaktywności jonowej, według aktualnej wiedzy, wykazują zwiększoną bioaktywność w terapii in vivo (w przypadku implantacji do kości), co bardzo korzystnie wpływa na szybką regenerację i mineralizację tkanki kostnej w miejscu implantacji. Kompozyty otrzymane według patentu PL nr 206 394 i EP nr 2 421 570 zostały z powodzeniem wykorzystane jako materiały kościozastępcze do wypełniania niewielkich ubytków kostnych (Belcarz A. i wsp., Central European Journal of Biology 8, 534-548, 2013; Borkowski i wsp., Materials Science and Engineering C: Materials for Biological Applications 53, 60-67, 2015).
Przedmiotem wynalazku jest opracowana metoda wytwarzania w temperaturze pokojowej implantacyjnego materiału na bazie kurdlanu i bioceramiki fosforanowo-wapniowej (HAp, TCP, HAp-TCP), cechującego się wysoką bioaktywnością, biokompatybilnością oraz poręcznością chirurgiczną, którego wariant zawiera dodatek termowrażliwych substancji bioaktywnych, np. białek adhezyjnych lub czynników wzrostu, w celu intensyfikowania procesów adhezji, proliferacji i różnicowania komórek kościotwórczych na powierzchni biokompozytu. Sposób według wynalazku umożliwia także zastosowanie antybiotyków peptydowych zwłaszcza gliko- i lipopeptydowych już na etapie wytwarzania kompozytu w celu zapobiegania postoperacyjnym zakażeniom bakteryjnym, co pozwala na stopniowe, przedłużone w czasie uwalnianie, zapewniając długoterminową postoperacyjną ochronę przeciw-bakteryjną.
Opracowana wg wynalazku metoda wytwarzania rusztowania kostnego w temperaturze pokojowej jest korzystniejsza w porównaniu do tej wykorzystującej do żelowania temperaturę powyżej 80°C (PL nr 206 394 i EP nr 2 421 570), gdyż ta ostatnia uniemożliwia modyfikację biomateriału specyficznymi substancjami aktywnymi, które często są wrażliwe na wysoką temperaturę, a nawet mogą całkowicie utracić aktywność biologiczną. Dotyczyć to może takich substancji jak białkowe czynniki wzrostu, białka adhezyjne, antybiotyki peptydowe i inne, które dodane do kompozytu mogą poprawić jego właściwości biologiczne (np. w kierunku korzystnej adhezji komórek).
Rusztowanie kostne według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera β-1,3-glukan zwany dalej kurdlanem (komponent x) oraz bioceramikę fosforanowo-wapniową w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze od 0,1 do 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500-1300°C, korzystnie 1100-1200°C (komponent y), przy czym maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH) jest zgodna z proporcją wyrażoną w sposób matematyczny, jak niżej wskazano:
Niech „x” oznacza masę kurdlanu w gramach na 100 ml NaOH, gdzie:
χε <6;20> (zakres został ustalony eksperymentalnie).
Niech „y” oznacza masę granul ceramicznych w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH. Najkorzystniej jest, gdy proporcje składników wynoszą odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki.
Z eksperymentów wynika, że minimalna ilość granul ceramicznych (ymin) w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH, wynosi 2 - niezależnie od wartości x, natomiast maksymalna ilość granul ceramicznych (ymax) w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH wynosi (w zależności od „x”):
ymax (x) = 0,079x2- 6,1557x + 123,57, zatem dla dowolnego χε <6;20>:
< y < ymax (x).
Najkorzystniejszy rezultat uzyskuje się, gdy dla dowolnego χε <6;20> spełniony jest warunek: 90% ymax (X) < y < ymax (X).
Dla uzyskania rusztowań o dobrych właściwościach mechanicznych i biologicznych, najkorzystniej jest, gdy masa granul „y” wynosi nie mniej niż 60 g ze względu na fakt, że zawartość całkowitej ilości fazy mineralnej kości wynosi co najmniej 60% (Hui P. i wsp., Journal of Minerals & Materials Characterization & Engineering 9, 683-692, 2010). Masa granul ceramiki fosforanowo-wapniowej uzależniona jest od:
a) temperatury wypalania, przy czym im wyższa temperatura wypalania, tym niższa porowatość granul (Aminatun i wsp., Research Journal of Pharmaceutical Biological and Chemical Sciences 4, 1431-1442, 2013), tym większa zawartość wagowa w kompozycie;
b) rozmiaru granul, przy czym im większy rozmiar granul, tym wyższa waga pojedynczej granuli, tym niższa całościowa masa granul w kompozycie;
PL 229 329 Β1
Rusztowanie kostne, według alternatywnego rozwiązania, o składnikach i proporcjach jak wskazano w rozwiązaniu pierwszym, zawiera dodatkowo substancje bioaktywne, jak białka adhezyjne w ilości 0,1-500 mg na 100 ml NaOH oraz białka morfogenetyczne kości, przy czym jako białka adhezyjne zawiera lamininę, fibronektynę, zaś jako białka morfogenetyczne kości - BMP-2, BMP-4, BMP-7.
Rusztowanie korzystnie zawiera antybiotyki glikopeptydowe, zwłaszcza wankomycynę.
Przedmiotem wynalazku jest także sposób wytwarzania rusztowania kostnego według wynalazku, który polega na tym, że w 6-20% (w/v) roztworu β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanym w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500-1300°C, korzystnie 1100-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 710% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru:
ymax (x)= 0,079x2- 6,1557x + 123,57, (przy czym wzór ten wyjaśniono szerzej w sposób matematyczny przy opisywaniu rozwiązania pierwszego), otrzymaną mieszaninę umieszcza się następnie w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 18-28°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
Alternatywny sposób otrzymywania materiału według wynalazku polega na tym, że do 6-20% (w/v) roztworu β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanego w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), dodaje się substancje bioaktywne takie jak czynniki wzrostu w ilości 0,1-200 pg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH lub/i białka adhezyjne w ilości 0,1500 mg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH, a następnie w przygotowanym roztworze kurdlanu i substancji bioaktywnych rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500-1300°C, korzystnie 1100-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej, gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru:
ymax (x) = 0,079x2 - 6,1557x + 123,57 (wzór wyjaśniono matematycznie opisując pierwsze rozwiązanie).
Otrzymaną mieszaninę umieszcza się w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 18-28°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej. Korzystnie, gdy jako substancje bioaktywne materiał zawiera BMP-2, BMP-4, BMP-7, lamininę, fibronektynę. Korzystnie jest, gdy do roztworu kurdlanu dodaje się antybiotyki glikopeptydowe.
Znamiennym jest, że materiał przygotowany według wynalazku wykazuje wszystkie cechy, którymi powinno charakteryzować się rusztowanie kostne mające za zadanie przyspieszanie procesów regeneracyjnych w miejscu implantacji oraz umożliwiające wstępne zasiedlenie komórkami in vitro. Cechy te to:
1) dobra poręczność, spoistość, a także bioaktywność;
2) dobra plastyczność, dzięki czemu można go łatwo dopasować do miejsca niewielkiego ubytku kostnego. Jest podatny na przycinanie do pożądanego kształtu za pomocą noża bądź skalpela;
3) po wysuszeniu łatwe wchłanianie płynów, np. wody, soli fizjologicznej, surowicy, krwi. Kompozyt wtedy odzyskuje swoje sprężyste właściwości;
4) brak cytotoksyczności. Ocenę cytotoksyczności materiału wytworzonego według wynalazku przeprowadzono z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych mysich preosteoblastów (MC3T3-E1) oraz prawidłowych płodowych ludzkich osteoblastów (hFOB 1.19), pozyskanych z Amerykańskiej Kolekcji Kultur Komórkowych (ATCC). Przed doświadczeniem, materiał pocięto na krążki o średnicy 8 mm i grubości 1-2 mm i poddano sterylizacji za pomocą tlenku etylenu. Następnie, komórki MC3T3-E1 i hFOB 1.19 były wysiewane bezpośrednio na krążki materiału. Po 24-godzinnej inkubacji w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 37°C wykonywano barwienie różnicowe żywe/martwe w celu oceny ilości, żywotności oraz morfologii komórek. Komórki żywe wykazywały zieloną fluorescencję, podczas gdy komórki martwe wykazywały czerwoną fluorescencję.
PL 229 329 Β1
Po 24-godzinnej inkubacji, obserwowano dużą ilość żywych komórek osteoblastycznych oraz pojedyncze komórki martwe. Żywe komórki wykazywały prawidłową morfologię i były dobrze rozpłaszczone na materiale. Obserwacja ta potwierdza, że materiał nie jest cytotoksyczny w stosunku do komórek kościotwórczych;
5) sprzyjanie adhezji komórek.
Wpływ materiału na adhezję komórek badano z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych mysich preosteoblastów (MC3T3-E1) oraz prawidłowych płodowych ludzkich osteoblastów (hFOB 1.19) pozyskanych z ATCC. Przed doświadczeniem, materiał pocięto na krążki o średnicy 8 mm i grubości 1-2 mm i poddano sterylizacji za pomocą tlenku etylenu. Następnie, osteoblasty były wysiewane bezpośrednio na krążki materiału. Po 2 godzinnej inkubacji w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 34°C wykonywano test kolorymetryczny WST-8, który ocenia aktywność metaboliczną mitochondriów żywych komórek. Zasada tego testu opiera się na aktywności dehydrogenazy bursztynianowej, która przekształca sól tetrazoliową do pomarańczowego, rozpuszczalnego w wodzie formazanu. Intensywność barwy jest więc wprost proporcjonalna do ilości żywych, metabolicznie czynnych komórek. Poniższa tabela przedstawia ilość komórek, która uległa adhezji do materiału wytworzonego według wynalazku:
| Ilość komórek hFOB 1.19 wy siewana na | Ilość komórek hFOB 1.19, która uległa |
| materiał: | adhezji do materiału po 2 godzinach: |
| 5 xl04 kom^dysk | 1,2 xl04 kom./dysk |
| Ilość komórek MC3T3-E1 wysiewana na | Ilość komórek MC3T3-E1, która uległa |
| materiał: | adhezji do materiału po 2 godzinach: |
| 1 χΙΟ5 kom./dysk | 2,73 xl04 kom./dysk |
Po 2-godzinnej inkubacji komórek na materiale wytworzonym według wynalazku wykazano, że ok. 24% komórek hFOB 1.19 oraz 27% komórek MC3T3-E1 uległo adhezji do jego powierzchni. Wytworzony materiał umożliwia adhezję osteoblastów porównywalną do opisanych w literaturze materiałów wzmagających proliferację oraz różnicowanie komórek kościotwórczych, a więc procesy regeneracyjne kości (Przekora A. i wsp., Journal of Biotechnology 182-183, 46-53, 2014);
6) sprzyjanie proliferacji komórek.
Wpływ materiału na proliferację komórek badano z zastosowaniem linii komórkowej prawidłowych płodowych ludzkich osteoblastów (hFOB 1.19) pozyskanych z ATCC. Przed doświadczeniem, materiał pocięto na krążki o średnicy 8 mm i grubości 1-2 mm i poddano sterylizacji za pomocą tlenku etylenu. Następnie, komórki hFOB 1.19 były wysiewane bezpośrednio na krążki materiału. Po 2, 5 oraz 8 dniach inkubacji w atmosferze 5% CO2 i temperaturze 34°C, ilość komórek była oceniania za pomocą testu WST-8 (opis w punkcie 5). Ponadto, morfologia komórek była monitorowana poprzez obserwację w mikroskopie konfokalnym po barwieniu cytoszkieletu i jąder komórkowych. Poniższa tabela przedstawia wzrost liczby komórek na materiale w czasie:
| Czas inkubacji | Ilość komórek hFOB 1.19 |
| 2 dni | 2,3 xlO4 kom./dysk |
| 5 dni | 5,0 x!04 kom./dysk |
| 8 dni | 11,5 xl04 kom./dysk .......... |
Wraz z wydłużaniem czasu inkubacji, zaobserwowano wzrost liczby komórek hFOB 1.19 na materiale przygotowanym w oparciu o metodę stanowiącą przedmiot wynalazku. Co więcej, obserwacja w mikroskopie konfokalnym wykazała, że komórki są dobrze rozpłaszczone, mają prawidłową morfologię oraz dobrze rozbudowaną strukturę cytoszkieletu. Komórki obrastały nie tylko granule bioceramiki, ale również pokrywały powierzchnię kurdlanowego żelu. Zatem, materiał sprzyja wzrostowi oraz proliferacji (zdolności do podziałów) komórek kościotwórczych;
7) możliwość immobilizacji bioaktywnych związków, również termowrażliwych, metodą pułapkowania wewnątrz struktury polimerowej żelu kurdlanowego (na etapie wytwarzania rusztowania kostnego podczas sieciowania komponentu kurdlanowego w roztworze CaCb). Inkorporacja związków bioaktywnych wewnątrz macierzy kurdlanowej rusztowania kostnego umożliwi ich stopniowe, przedłużone w czasie uwalnianie zapewniając długoterminową postoperacyjną ochronę przeciwbakteryjną (immobi
PL 229 329 Β1 lizacja antybiotyków) lub/i stymulację procesów regeneracyjnych w miejscu implantacji poprzez intensyfikowanie procesu kościotworzenia (immobilizacja czynników wzrostu) lub/i intensyfikowanie adhezji oraz proliferacji komórek kościotwórczych (immobilizacja białek adhezyjnych);
8) zachowanie wszystkich swoich właściwości, gdy poddawany jest sterylizacji za pomocą tlenku etylenu.
Materiał wytworzony w oparciu o nową metodę neutralizacji i dializy, będącą przedmiotem wynalazku, ze względu na swoje bardzo dobre właściwości biologiczne będzie sprzyjał procesom regeneracyjnym w miejscu implantacji i może być stosowany zarówno w inżynierii tkankowej jako rusztowanie kostne do wstępnego przedoperacyjnego zasiedlania komórkami osteoprogeniterowymi in vitro, a także in vivow medycynie regeneracyjnej jako wypełniacz niewielkich ubytków kostnych.
Przedmiot wynalazku ilustrują przedstawione poniżej przykłady.
Przykład I
Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,6 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,3-0,6 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany kompozyt nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).
Przykład II
Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,0 g wysokoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 800°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 5 godzin, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).
Przykład III
Do 0,56 g kurdlanu dodawano 7 ml 0,3 M zasady sodowej i mieszano przez 7 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 4,2 g mieszanki HAp i TCP (stosunek wagowy 3:1, wypalane w temperaturze 1200°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano przez 6 min. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 23 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).
Przykład IV
Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór białka - fibronektyny (stężenie końcowe 10 pg/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,0 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 5 godzin, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich
PL 229 329 Β1 właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).
Przykład V
Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór białka - lamininy (stężenie końcowe 10 pg/ml) oraz roztwór BMP-2 (stężenie końcowe 300 ng/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,6 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,3-0,6 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).
Przykład VI
Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór BMP-4 (stężenie końcowe 200 ng/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,6 g niskoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 1150°C, rozmiar granul 0,30,6 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych, brak toksyczności, sprzyjanie adhezji i proliferacji osteoblastów).
Przykład VII
Do 0,16 g kurdlanu dodawano 2 ml 0,3 M zasady sodowej, a także roztwór antybiotyku glikopeptydowego - wankomycyny (stężenie końcowe 16 pg/ml) i mieszano przez 5 min do uzyskania jednolitej masy. Następnie, do uzyskanej masy dodawano 1,0 g wysokoporowatego HAp (wypalanego w temperaturze 800°C, rozmiar granul 0,4-1,0 mm) i mieszano. Starannie wymieszaną porcję umieszczano w worku dializacyjnym o średnicy 10 mm i poddawano dializie w obecności chlorku wapnia (CaCb) w stężeniu 100 g/l w temperaturze pokojowej przez 4 godziny. Następnie, wyjętą kompozycję poddawano 3-krotnemu płukaniu w wodzie dejonizowanej przez 30 min. Materiał suszono w temperaturze 37°C przez 24 godziny, a następnie sterylizowano za pomocą tlenku etylenu (55°C, 3 godziny, z 15-godzinnym wentylowaniem próbki w celu odprowadzenia tlenku etylenu po procesie sterylizacji). Tak wysterylizowany materiał nie zmienił swoich właściwości (sprężystości, zdolności pochłaniania roztworów wodnych).
Poniżej porównano właściwości materiału HAp-kurdlan przygotowanego w oparciu o metodę neutralizacji i dializy będącą przedmiotem wynalazku oraz materiału HAp-kurdlan otrzymanego metodą termicznego żelowania kurdlanu w oparciu o patent nr PL 206 394 i International Patent nr EU 2 421 570 B1, w kontekście zastosowania ich jako rusztowania komórkowe:
| Materiał otrzymywany według patentu PL 206394 i International Patent EU | Materiał otrzymywany według wynalazku | |
| Żywotność osteoblastów po 48 godzinach inkubacji (test pośredni na ekstraktach) | 58% | 98,5% |
| Zdolność przyklejania komórek do powierzchni materiału | Brak | ok. 30% |
PL 229 329 Β1
Wzrost osteoblastów na powierzchni materiału po 5 dniach hodowli
Cała powierzchnia
Pojedyncze komórki o materiału pokryta nieprawidłowej morfologii komórkami o prawidłowej morfologii
Możliwość immobilizacji bioaktywnych związków term (wrażliwych (na etapie wytwarzania)
Materiał przygotowany według metody będącej przedmiotem wynalazku wykazuje korzystniejsze właściwości biologiczne in vitro w porównaniu do kompozytu przygotowanego w oparciu o patent nr PL 206 394 i nr EP 2 421 570. W przeciwieństwie do materiału otrzymanego metodą opisaną w patencie nr PL 206 394 i International Patent nr EU 2 421 570 B1, materiał wytworzony według wynalazku nie obniża żywotności komórek kościotwórczych (osteoblastów), sprzyja adhezji (przyklejaniu się) oraz proliferacji osteoblastów, dzięki czemu może być wstępnie zasiedlany w warunkach in vitro komórkami wyprowadzonymi od pacjenta. Zatem można wnioskować, że w warunkach in vivo materiał przygotowany według nowej metody będzie stymulować przerastanie tkanką kostną, przyspieszając jej regenerację oraz osteointegrację implantu z kością pacjenta.
Materiał przygotowany według wynalazku ze względu na swoje bardzo dobre właściwości biologiczne nadaje się do stosowania zarówno in vitro w inżynierii tkankowej jako rusztowanie kostne wstępnie zasiedlane komórkami osteoprogeniterowymi wyprowadzonymi z organizmu pacjenta w celu wygenerowania tzw. żywego wszczepu, jak i in vivo w medycynie regeneracyjnej jako materiał przyspieszający procesy regeneracyjne w miejscu implantacji. Natomiast materiał kompozytowy przygotowany w oparciu o PL nr 206 394 oraz International Patent nr EP 2 421 570 B1, ze względu na swoje stosunkowo słabe właściwości biologiczne in vitro może być wyłącznie stosowany in vivo jako materiał kościozastępczy, czyli substytut kostny do wypełniania niewielkich ubytków kostnych.
Ponadto, materiał przygotowany według wynalazku, w przeciwieństwie do materiału otrzymanego w oparciu o patent PL nr 206 394 oraz International Patent EU nr 2 421 570 B1, nadaje się do stosowania jako baza do immobilizacji substancji bioaktywnych, również termowrażliwych (np. białek adhezyjnych, czynników wzrostu, antybiotyków peptydowych), metodą pułapkowania wewnątrz struktury polimerowej żelu kurdłanowego (na etapie wytwarzania rusztowania kostnego), co wpłynie na poprawę jego właściwości biologicznych oraz będzie chronić przed postoperacyjnymi infekcjami.
Claims (8)
- Zastrzeżenia patentowe1. Rusztowanie kostne na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej i kurdlanu, znamienne tym, że zawiera 3-1,3-glukan zwany dalej kurdlanem (komponent x) oraz bioceramikę fosforanowo-wapniową w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze od 0,1 do 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponenty), przy czym proporcje wagowe (gramy na 100 ml NaOH) stałych składników wynikają z wzoru (maksymalna ilość komponentu y w zależności od komponentu x): ymax (x) = 0,079 x2 - 6,1557 x + 123,57, a najkorzystniej, gdy wynoszą one odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki.
- 2. Rusztowanie kostne na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej i kurdlanu, znamienne tym, że zawiera 3-1,3-glukan zwany dalej kurdlanem (komponent x) oraz bioceramikę fosforanowo-wapniową w postaci nanoproszku, proszku lub granul, o rozmiarze od 0,1 do 1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponent y), przy czym proporcje wagowe (gramy na 100 ml NaOH) stałych składników wynikają z wzoru (maksymalna ilość komponentu y w zależności od komponentu x): ymax (x) = 0,079 x2 - 6,1557 x + 123,57, a najkorzystniej, gdy wynoszą one odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v)PL 229 329 Β1 bioceramiki, ponadto rusztowanie zawiera substancje bioaktywne takie jak białka adhezyjne w ilości 0,1-500 mg na 100 ml NaOH oraz białka morfogenetyczne kości.
- 3. Rusztowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako białka adhezyjne zawiera lamininę, fibronektynę, zaś jako białka morfogenetyczne kości - BMP-2, BMP-4, BMP-7.
- 4. Rusztowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że zawiera antybiotyki glikopeptydowe.
- 5. Sposób wytwarzania rusztowania kostnego na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej, znamienny tym, że w 6-20% (w/v) roztworze β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanym w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej, gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 7-10% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w 0,3 M NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru: ymax (x) = 0,079 x2- 6,1557 x + 123,57, otrzymaną mieszaninę umieszcza się w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 1828°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
- 6. Sposób wytwarzania rusztowania kostnego na bazie bioceramiki fosforanowo-wapniowej, znamienny tym, że do 6-20% (w/v) roztworu β-1,3-glukanu zwanego dalej kurdlanem, przygotowanego w 0,1-0,5 M roztworze zasady sodowej (NaOH), korzystnie 0,3 M (komponent x), dodaje się substancje bioaktywne jak białka morfogenetyczne kości w ilości 0,1-200 pg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH lub/i białka adhezyjne w ilości 0,1-500 mg lub antybiotyki glikopeptydowe w ilości 0,02-5 mg na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH, a następnie w przygotowanym roztworze kurdlanu i substancji bioaktywnych rozprowadza się 2-90% (w/v) bioceramiki fosforanowo-wapniowej, w postaci nanoproszku, proszku lub granul o rozmiarze 0,1-1,0 mm wypalanych w temperaturach 500°C-1300°C, korzystnie 1100°C-1200°C (komponent y), przy czym najkorzystniej, gdy proporcje wagowe stałych składników wynoszą odpowiednio 710% (w/v) kurdlanu i 60-80% (w/v) bioceramiki, a maksymalna ilość komponentu y (w gramach na 100 ml roztworu kurdlanu w NaOH) w zależności od komponentu x (w gramach na 100 ml NaOH), wynika ze wzoru: ymax (x) = 0,079 x2 - 6,1557 x +123,57, otrzymaną mieszaninę umieszcza się w workach dializacyjnych w roztworze soli wapniowej, korzystnie chlorku wapnia (CaCb) o stężeniu od 70 g/l do 150 g/l, korzystnie 100 g/l, na okres czasu 2-24 godzin, korzystnie 4 godziny w temperaturze 18-28°C, a następnie komponent płucze się w wodzie dejonizowanej lub destylowanej.
- 7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że jako substancje bioaktywne zawiera białka morfogenetyczne kości, takie jak BMP-2, BMP-4, BMP-7 oraz białka adhezyjne, jak laminina, fibronektyna.
- 8. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że do roztworu kurdlanu dodaje się antybiotyki glikopeptydowe.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415936A PL229329B1 (pl) | 2016-01-27 | 2016-01-27 | Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzania |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415936A PL229329B1 (pl) | 2016-01-27 | 2016-01-27 | Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzania |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415936A1 PL415936A1 (pl) | 2017-02-27 |
| PL229329B1 true PL229329B1 (pl) | 2018-07-31 |
Family
ID=58092075
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415936A PL229329B1 (pl) | 2016-01-27 | 2016-01-27 | Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzania |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229329B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL442451A1 (pl) * | 2022-10-05 | 2024-04-08 | Uniwersytet Medyczny W Lublinie | Nanokompozytowy granulat hydroksyapatytowo-polimerowy na bazie matrycy kurdlanowo-chitozanowej oraz sposób jego wytwarzania |
-
2016
- 2016-01-27 PL PL415936A patent/PL229329B1/pl unknown
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL442451A1 (pl) * | 2022-10-05 | 2024-04-08 | Uniwersytet Medyczny W Lublinie | Nanokompozytowy granulat hydroksyapatytowo-polimerowy na bazie matrycy kurdlanowo-chitozanowej oraz sposób jego wytwarzania |
| PL247449B1 (pl) * | 2022-10-05 | 2025-07-07 | Univ Medyczny W Lublinie | Nanokompozytowy granulat hydroksyapatytowo-polimerowy na bazie matrycy kurdlanowo-chitozanowej oraz sposób jego wytwarzania |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL415936A1 (pl) | 2017-02-27 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Hu et al. | 3D printed multifunctional biomimetic bone scaffold combined with TP‐Mg nanoparticles for the infectious bone defects repair | |
| US6132463A (en) | Cell seeding of ceramic compositions | |
| Kumar et al. | Synthesis and characterization of diopside particles and their suitability along with chitosan matrix for bone tissue engineering in vitro and in vivo | |
| JP5882997B2 (ja) | 骨移植片系 | |
| Belcarz et al. | Application of β-1, 3-glucan in production of ceramics-based elastic composite for bone repair | |
| KR20150058202A (ko) | 하이드로겔 코팅된 스캐폴드 | |
| KR101461159B1 (ko) | 약물 전달층을 포함하는 임플란트의 제조방법 및 이를 포함하는 생체이식용 임플란트 조성물 | |
| Kolanthai et al. | Effect of solvent; enhancing the wettability and engineering the porous structure of a calcium phosphate/agarose composite for drug delivery | |
| Goh et al. | Fabrication and in vitro biocompatibility of sodium tripolyphosphate-crosslinked chitosan–hydroxyapatite scaffolds for bone regeneration | |
| US11160905B2 (en) | Connective tissues, such as bone, dentin or pulp, regenerative material comprising calcium silicate | |
| US20210121606A1 (en) | Ionic-doped composition methods and uses thereof | |
| CN108404206B (zh) | 一种骨修复材料的制备方法 | |
| Mohamed | Biocomposite materials | |
| US20240148939A1 (en) | Biphasic biomaterial based on curdlan and hydroxy apatite (hap) for regeneration of osteochondral defects and the method of its preparation | |
| PL240725B1 (pl) | Biomateriał na bazie naturalnego polisacharydu-β-1,3-glukanu (kurdlanu) i ceramiki do zastosowań w inżynierii tkankowej kości oraz sposób jego otrzymywania | |
| Mills | The role of polymer additives in enhancing the response of calcium phosphate cement | |
| PL229329B1 (pl) | Rusztowanie kostne na bazie β-1,3-glukanu (kurdlanu) i bioceramiki oraz sposób jego wytwarzania | |
| Sohrabi et al. | Chitosan-based bionanocomposites in bone tissue engineering | |
| PL236369B1 (pl) | Sposób otrzymywania rusztowania kostnego na bazie ceramiki fluoroapatytowej i polimeru oraz rusztowanie kostne | |
| Kocak | Smart pH and Thermosensitive Injectable Hydrogels: Chitosan–Hydroxyapatite–Heparin Based Functionalised Biomaterials for Bone Regeneration | |
| JP7826202B2 (ja) | 骨複合体及び同骨複合体を調製するための組成物 | |
| Bojar et al. | Novel chitosan-based bone substitute | |
| US20110153029A1 (en) | Bioresorbable and flexible membranes exhibiting asymmetric osteoconductive behavior in both faces | |
| Pan et al. | Assessment of the suitability of a new composite as a bone defect filler in a rabbit model | |
| Sezer et al. | In vivo performance of poly (ε-caprolactone) constructs loaded with gentamicin releasing composite microspheres for use in bone regeneration |