PL229917B1 - 1-Tyminooctan 4-(di-2,2’-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA - Google Patents
1-Tyminooctan 4-(di-2,2’-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAAInfo
- Publication number
- PL229917B1 PL229917B1 PL409328A PL40932814A PL229917B1 PL 229917 B1 PL229917 B1 PL 229917B1 PL 409328 A PL409328 A PL 409328A PL 40932814 A PL40932814 A PL 40932814A PL 229917 B1 PL229917 B1 PL 229917B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- tataaa
- bitien
- oligonucleotide
- phenyl
- ylmethyl
- Prior art date
Links
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 title claims description 79
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 43
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 title claims description 36
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 11
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 8
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 title description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 title description 2
- 150000003577 thiophenes Chemical class 0.000 title description 2
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 title 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 34
- VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N methane Chemical compound C VNWKTOKETHGBQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 27
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N Dichloromethane Chemical compound ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N Toluene Chemical compound CC1=CC=CC=C1 YXFVVABEGXRONW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 claims description 19
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 17
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 16
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 125000001301 ethoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])O* 0.000 claims description 14
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N chloric acid Chemical compound OCl(=O)=O XTEGARKTQYYJKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 10
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 claims description 9
- 125000000175 2-thienyl group Chemical group S1C([*])=C([H])C([H])=C1[H] 0.000 claims description 8
- GOUHYARYYWKXHS-UHFFFAOYSA-N 4-formylbenzoic acid Chemical compound OC(=O)C1=CC=C(C=O)C=C1 GOUHYARYYWKXHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229940005991 chloric acid Drugs 0.000 claims description 8
- QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N methyl benzoate Chemical compound COC(=O)C1=CC=CC=C1 QPJVMBTYPHYUOC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 8
- 239000012491 analyte Substances 0.000 claims description 6
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 claims description 6
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 claims description 6
- 239000011261 inert gas Substances 0.000 claims description 6
- 208000026350 Inborn Genetic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 125000000848 adenin-9-yl group Chemical group [H]N([H])C1=C2N=C([H])N(*)C2=NC([H])=N1 0.000 claims description 5
- 230000005669 field effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000016361 genetic disease Diseases 0.000 claims description 5
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 claims description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 4
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 claims description 4
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940095102 methyl benzoate Drugs 0.000 claims description 4
- 206010010510 Congenital hypothyroidism Diseases 0.000 claims description 3
- 201000011252 Phenylketonuria Diseases 0.000 claims description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 claims description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 claims description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 3
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 claims description 3
- 238000012545 processing Methods 0.000 claims description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 claims description 3
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 claims description 3
- QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 2-methylphenol;3-methylphenol;4-methylphenol Chemical compound CC1=CC=C(O)C=C1.CC1=CC=CC(O)=C1.CC1=CC=CC=C1O QTWJRLJHJPIABL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 150000002334 glycols Chemical class 0.000 claims description 2
- 239000012046 mixed solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 2
- 239000000376 reactant Substances 0.000 claims description 2
- CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M tetrabutylazanium;chlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)=O.CCCC[N+](CCCC)(CCCC)CCCC CDDFFMJAOKTPRF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims 1
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 claims 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims 1
- 229910001914 chlorine tetroxide Inorganic materials 0.000 claims 1
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Chemical compound [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 38
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 20
- 230000008859 change Effects 0.000 description 15
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 13
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 12
- 230000008021 deposition Effects 0.000 description 11
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 10
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 10
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N Titanium Chemical compound [Ti] RTAQQCXQSZGOHL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 9
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 9
- BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N platinum Chemical compound [Pt] BASFCYQUMIYNBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 229910052719 titanium Inorganic materials 0.000 description 9
- 239000010936 titanium Substances 0.000 description 9
- RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N Thymine Natural products CC1=CNC(=O)NC1=O RWQNBRDOKXIBIV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 8
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 7
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 6
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 5
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 5
- 238000011088 calibration curve Methods 0.000 description 5
- 238000004401 flow injection analysis Methods 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 5
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 5
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 5
- RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 4-hydroxybenzaldehyde Chemical compound OC1=CC=C(C=O)C=C1 RGHHSNMVTDWUBI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000003775 Density Functional Theory Methods 0.000 description 4
- YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N Thiophene Chemical group C=1C=CSC=1 YTPLMLYBLZKORZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N benzaldehyde Chemical compound O=CC1=CC=CC=C1 HUMNYLRZRPPJDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 4
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 4
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 4
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 229910052697 platinum Inorganic materials 0.000 description 4
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Chemical compound [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000003077 quantum chemistry computational method Methods 0.000 description 4
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 4
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000012085 test solution Substances 0.000 description 4
- 229940113082 thymine Drugs 0.000 description 4
- XFHTVCMRNSBQCF-UHFFFAOYSA-N 4-(2-bromoethoxy)benzaldehyde Chemical compound BrCCOC1=CC=C(C=O)C=C1 XFHTVCMRNSBQCF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000000026 X-ray photoelectron spectrum Methods 0.000 description 3
- 238000007792 addition Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 3
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 3
- 108020000948 Antisense Oligonucleotides Proteins 0.000 description 2
- 238000004057 DFT-B3LYP calculation Methods 0.000 description 2
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910021607 Silver chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 108700026226 TATA Box Proteins 0.000 description 2
- 238000004833 X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 2
- 239000000074 antisense oligonucleotide Substances 0.000 description 2
- 238000012230 antisense oligonucleotides Methods 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000004630 atomic force microscopy Methods 0.000 description 2
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 239000002800 charge carrier Substances 0.000 description 2
- 229920001940 conductive polymer Polymers 0.000 description 2
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 2
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 2
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 2
- 229920000344 molecularly imprinted polymer Polymers 0.000 description 2
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 2
- QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N para-ethylbenzaldehyde Natural products CCC1=CC=C(C=O)C=C1 QNGNSVIICDLXHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 125000004437 phosphorous atom Chemical group 0.000 description 2
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 2
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 2
- 229910000027 potassium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 2
- HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M silver monochloride Chemical compound [Cl-].[Ag+] HKZLPVFGJNLROG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 229930192474 thiophene Natural products 0.000 description 2
- PAAZPARNPHGIKF-UHFFFAOYSA-N 1,2-dibromoethane Chemical compound BrCCBr PAAZPARNPHGIKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 description 1
- 102100021519 Hemoglobin subunit beta Human genes 0.000 description 1
- 108091005904 Hemoglobin subunit beta Proteins 0.000 description 1
- HVSHKFIJUYMMLO-UHFFFAOYSA-N NC1=C2N=CN(CCOC3=CC=C(C=O)C=C3)C2=NC=N1 Chemical compound NC1=C2N=CN(CCOC3=CC=C(C=O)C=C3)C2=NC=N1 HVSHKFIJUYMMLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000012902 Nervous system disease Diseases 0.000 description 1
- 208000025966 Neurological disease Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 102000009572 RNA Polymerase II Human genes 0.000 description 1
- 108010009460 RNA Polymerase II Proteins 0.000 description 1
- 238000001237 Raman spectrum Methods 0.000 description 1
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical class [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108700009124 Transcription Initiation Site Proteins 0.000 description 1
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000012670 alkaline solution Substances 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000003592 biomimetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 1
- 239000012267 brine Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 230000009918 complex formation Effects 0.000 description 1
- 229940125898 compound 5 Drugs 0.000 description 1
- 239000002322 conducting polymer Substances 0.000 description 1
- 238000007887 coronary angioplasty Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 238000002848 electrochemical method Methods 0.000 description 1
- 238000002330 electrospray ionisation mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000002189 fluorescence spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000002272 high-resolution X-ray photoelectron spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002086 nanomaterial Substances 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 238000003793 prenatal diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000003380 quartz crystal microbalance Methods 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 238000010992 reflux Methods 0.000 description 1
- 239000012488 sample solution Substances 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M sodium;chloride;hydrate Chemical compound O.[Na+].[Cl-] HPALAKNZSZLMCH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000012306 spectroscopic technique Methods 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229920001059 synthetic polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA (T - tymina, A - adenina).
Stan techniki
Genomika zawdzięcza oligonukleotydowi TATAAA 1 (Schemat 1) rozpoczęcie transkrypcji. Ten heksanukleotyd, zawierający cztery cząsteczki adeniny (A) i dwie cząsteczki tyminy (T), charakteryzuje się sekwencją promotorową tych zasad, bez której niemożliwe jest rozpoczęcie transkrypcji. Co więcej, transkrypcja nie może się rozpocząć w przypadkowym miejscu matrycy DNA {S. Grunberg et al., Trends Biochem. Sci. 2013, 38, 603; L. Stryer et al., Wydawnictwo Naukowe PWN, Warszawa 2009}. Miejscem rozpoczęcia transkrypcji musi być początek genu. Sygnały rozpoczęcia transkrypcji są zawarte w promotorowej sekwencji zasad nukleinowych, położonej bezpośrednio przed sekwencją genu, który ulega transkrypcji. Promotorowe sekwencje nukleotydówto miejsca specyficznego przyłączania polimerazy RNA II.
Miejsca promotorowe eukariotycznych genów kodujących białka zawierają nukleotydy o sekwencji zgodnej z sekwencją oligonukleotydu TATAAA w rejonie ~25 nukleotydów od miejsca rozpoczęcia transkrypcji. Kaseta TATA (ang. TATA box) {Y. Kim et al., Naturę 1993, 365, 512} w tych genach, zwana też kasetą Hognessa, jest podobna do kasety Pribnowa (o sekwencji zgodnej TATAAT) w genach prokariotycznych, z tym że jest ona zlokalizowana w większej odległości od miejsca transkrypcji pierwszego nukleotydu niż w genach prokariotycznych (tj. w odległości 10 nukleotydów przed pierwszym nukleotydem ulegającym transkrypcji).
DNA może pochłaniać energię promienistą (co umożliwia rejestrowanie widm absorpcyjnych UV-vis, IR, NMR i CD), emitować ją po wzbudzeniu (co umożliwia rejestrowanie widm fluorescencyjnych), jak i ją rozpraszać (co umożliwia rejestrowanie widm Ramana). Dlatego wszystkie te techniki spektroskopowe są powszechnie stosowane do oznaczania DNA.
5'-TATAAG-3
5'-TATAGA-3'
PL 229 917 B1
Schemat 1. Wzór strukturalny szablonu i analitu, tj. oligonukleotydu TATAAA 1, skrócony zapis substancji przeszkadzających w oznaczaniu TATAAA, tj. oligonukleotydu TATAGA 2 i TATA AG 3.
Do oznaczania DNA coraz częściej stosuje się również bioczujniki elektrochemiczne {E. G. Hvastkovs et al., Analyst 2010, 135, 1817}. Przyczyną tej rosnącej popularności są ich zalety, które wykazują w porównaniu do innych metod oznaczania DNA. Mianowicie, oznaczenia wykonywane z ich zastosowaniem są w miarę proste, szybkie i stosunkowo czute. Wynik tych oznaczeń jest dostępny natychmiast po pomiarze, przeciwnie do różnego rodzaju testów genetycznych czy biologicznych. Przeważnie bioczujniki są niewielkich rozmiarów, co pozwala ograniczyć wymaganą objętość roztworu próbki i odczynników {G. Bidan et al., Synth. Met. 1999, 102, 1363}. Za pomocą bioczujników można oznaczać DNA zarówno w roztworach wodnych jak i aprotycznych. Co więcej, koszty produkcji elektrochemicznych bioczujników do oznaczania DNA i pomiarów wykonanych z ich pomocą są o wiele niższe niż koszty oznaczeń wykonanych za pomocą innych metod analitycznych {E. G. Hvastkovs and D. A. Buttry, Analyst 2010, 135, 1817; A. Sassolas et al., Chem. Rev. 2008, 108, 109; E. Palecek et al., Chem. Rev. 2012,112, 3427}.
Opracowane i wykonane przez nas czujniki do selektywnego oznaczania wybranych oligonukleotydów to czujniki chemiczne a nie biochemiczne, ponieważ elementem rozpoznającym jest w nich syntetyczny polimer. Nasze czujniki będzie można zastosować, m.in. w inżynierii genetycznej, jako „chipy (układy scalone) DNA, tj. odpowiedniki tzw. sond molekularnych do testów genetycznych. W biologii molekularnej, sondy molekularne to związki chemiczne zdolne do specyficznego przyłączenia wykrywanych substancji. Związki te mają właściwości umożliwiające wykrycie tych substancji. Sondy DNA wykrywają zamiany pojedynczych nukleotydów w łańcuchu DNA prowadzące do punktowych mutacji. Do takich należy np. mutacja w łańcuchu DNA, który koduje łańcuch beta hemoglobiny. Mutacja ta jest przyczyną anemii sierpowatej. Dzięki testom genetycznym za pomocą niniejszego wynalazku możliwe będzie wczesne wykrycie wielu dziedzicznych chorób genetycznych. Choroby genetyczne stanowią problem kliniczny w każdej specjalności medycznej. Na przykład w zakresie diagnostyki prenatalnej zalecane jest wykonanie szeregu diagnostycznych badań genetycznych. Następnie, w pierwszych dniach życia noworodka, wykonywane są testy przesiewowe w kierunku fenyloketonurii i wrodzonej niedoczynności tarczycy.
Nasze badania stworzą nowe możliwości diagnostyczne i terapeutyczne, w szczególności w odniesieniu do chorób nowotworowych, za które odpowiedzialne są zmutowane geny. Do nich zwłaszcza należą badania obejmujące blokowanie ekspresji wybranego genu za pomocą oligonukleotydów antysensowych. Próby terapeutyczne wyłączające ekspresję genów odpowiedzialnych za przebieg różnych chorób genetycznych za pomocą oligonukleotydów antysensowych są również obiecujące w angioplastyce naczyń wieńcowych, w leczeniu chorób neurologicznych oraz niektórych chorób wirusowych i chorób wywołanych przez pasożyty.
Ponadto nasze badania mogą przyczynić się do rozwoju nowych technik wykorzystujących mutagenezę sterowaną oligonukleotydami, a ta może znacznie usprawnić i przyspieszyć, np. produkcję roślinną.
Naprzeciw powyższym wyzwaniom diagnostycznym, terapeutycznym czy rolniczym wychodzą chemoczujniki z warstwą zdolną do selektywnego przyłączania oligonukleotydu o sekwencji TATAAA w celu jego rozpoznawania. Obiecującą metodą przygotowania tych warstw jest synteza tak zwanych polimerów wdrukowanych molekularnie (ang. molecularly imprinted polymers, MIPów). W ostatnich latach ich zastosowanie do biomimetycznego rozpoznawania różnych analitów w celu ich selektywnego oznaczania wzrasta {K. Haupt et al., Chem. Rev. 2000, 100, 2495; C. Malitesta et al., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 1827; P. S. Sharma et al., Anal. Bioanal. Chem. 2012, 402, 3177}. Jednakże dotychczas nie zastosowano takiej warstwy do budowy selektywnego chemoczujnika rozpoznającego oligonukleotydową sekwencję TATAAA {H. Peng et al., Biomaterials 2009, 30, 2132; S. J. Li et al., Prog. Polym. Sci. 2013, 39, 145}. Polimery przewodzące były stosowane do oznaczania DNA, jednakże nie do oznaczania sekwencji TATAAA {N. K. Guimard et al., Prog. Polym. Sci. 2007, 32, 876; M. Ates, Mater. Sci. Eng., C 2013, 33, 1853; L. A. Thompson et al., J. Am. Chem. Soc. 2003, 125, 324; K. Sreenivasan, React. Funct. Polym. 2007, 67, 859}. Tak więc celowa jest budowa chemoczujnika do wykrywania i selektywnego oznaczania TATAAA, poprzez opracowanie i wykonanie dedykowanej warstwy MIPu i zastosowanie jej jako elementu rozpoznającego chemoczujnika.
Dlatego celem niniejszego wynalazku jest zastosowanie znanego 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metanu] 4 (Fig. 1a i Schemat 7) oraz opracowanie i zsyntety4
PL 229 917 Β1 zowanie 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5 (Fig. 1a i Schemat 3). Związki te jako monomery funkcyjne wykorzystuje się, po spolimeryzowaniu, do budowy chemicznego czujnika do oznaczania oligonukleotydu o sekwencji TATAAA. Kolejnym celem wynalazku jest opracowanie warstwy polimeru wdrukowanego za pomocą oligonukleotydu TATAAA (MIP-TATAAA) i metody jej przygotowania oraz jej zastosowanie jako warstwy selektywnie rozpoznającej TATAAA 1, a nie różniące się jednym nukleotydem oligonukleotydy takie jak TATAGA 2 lub TATAAG 3. Ponadto cel wynalazku polega na zintegrowaniu warstwy tego polimeru z przetwornikiem sygnału rozpoznawania chemicznego na sygnał analityczny.
Obecny wynalazek obejmuje związek, 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo) fenylu, o wzorze 5:
Schemat 3. Wzór strukturalny monomeru funkcyjnego, 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5.
Wynalazek również obejmuje sposób wytwarzania 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5, charakteryzujący się tym, że składa się z następujących etapów:
(1) wyjściowy roztwór 2,2'-bisbitiofenu w glikolu etylenowym poddaje się reakcji z 4-karboksybenzaldehydem i kwasem chlorowym(VII) z wytworzeniem p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metylobenzoesanu glikolu, a następnie (2) ten p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metylobenzoesan glikolu poddaje się reakcji z eterem dietylowym i otrzymuje się 4-[di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenol, po czym (3) mieszaninę 4-(di-2,2'-bitien-5-ylo)metylofenolu i kwasu 1-tyminooctowego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie dichlorometanie, poddaje się reakcji z N,N'-dicykloheksylokarbodiimidem (DCC), w wyniku czego otrzymuje się 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5.
Korzystnie, Etap 1 tego sposobu prowadzi się z zastosowaniem glikolu etylenowego, w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 50 do 70°C, korzystnie w 60°C, przez 22 do 26 godz., korzystnie 24 godz., przy stosunku molowym reagentów względem 4-karboksybenzaldehydu w zakresie od 2 do 4, korzystnie 3, dla 2,2'-bisbitiofenu i od 20 do 60, korzystnie 45, dla kwasu chlorowego(VII).
Korzystnie, Etap 2 tego sposobu prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 20 do 35°C, korzystnie w temperaturze 25°C, a następnie dodaje się eter dietylowy, korzystnie dwa razy większą objętość eteru dietylowego niż kwasu chlorowego(VII).
Korzystnie, Etap 3 tego sposobu prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 20 do 30°C, korzystnie w 25°C, przez 15 do 21 godz., korzystnie 18 godz., przy stosunku molowym reagentów względem kwasu 1-tyminooctowego w zakresie od 0,5 do 3, korzystnie 1,73, dla 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenolu i od 0,5 do 3, korzystnie 1,64 dla Λ/,Λ/'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC).
Ponadto wynalazek obejmuje polimer rozpoznający, korzystnie w postaci warstwy, wytworzony metodą wdrukowywania molekularnego, charakteryzujący się tym, że stanowi ją polimer zawierający jako monomery funkcyjne 4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 4
PL 229 917 Β1 (Fig. 1a) i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5 (Fig. 1a) oraz jako monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 6 (Schemat 4).
Wynalazek obejmuje również sposób wytworzenia warstwy rozpoznającego polimeru, metodą molekularnego wdrukowania, za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, charakteryzującej się tym, że do elektropolimeryzacji stosuje się jako monomery funkcyjne 4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 4 i 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5, oraz monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 6.
Korzystnie, jako szablon/analit stosuje się oligonukleotyd, korzystnie oligonukleotyd TATAAA.
Korzystnie, do polimeryzacji stosuje się roztwór mieszanych rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5 : 1 : 1 : 0,5, zawierający oligonukleotyd TATAAA 1, 4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 4, 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5, (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 6, korzystnie w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1 : 2,5 : 1,25 : 25, oraz 0,1 M elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, (TBA)CIC>4.
Korzystnie, w sposobie tym stosuje się potencjał liniowo zmieniany cyklicznie w zakresie od 0 do 1,50 V, korzystnie w zakresie od 0,50 do 1,25 V, ze stałą szybkością zawierającą się w przedziale od 5 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s.
Wynalazek również obejmuje zastosowanie warstwy rozpoznającego polimeru według wynalazku, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do wykrywania i/lub selektywnego oznaczania oligonukleotydu TATAAA 1, korzystnie w płynach ustrojowych pacjenta, z wykorzystaniem piezomikrograwimetrycznego przetwarzania sygnału chemicznego rozpoznawania TATAAA 1 na sygnał analityczny, lub do tego przetwarzania wykorzystujący tranzystory połowę z zewnętrzną bramką (ang. extended-gate field-effect transistors, EG-FETy).
Ponadto wynalazek ten ma zastosowanie w inżynierii genetycznej, zwłaszcza do testów genetycznych, przy wczesnym wykrywaniu dziedzicznych chorób genetycznych, jak również do testów przesiewowych u noworodków w kierunku fenyloketonurii i wrodzonej niedoczynności tarczycy, lub do testów diagnostycznych i terapeutycznych w odniesieniu do chorób nowotworowych związanych ze zmutowanymi genami, albo do przyspieszania produkcji roślinnej poprzez mutagenezę sterowaną oligonukleotyd am i.
Schemat 4. Wzór strukturalny monomeru sieciującego, (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)- 3,3'-bitiofenu 6.
Do wytworzenia MIPu wykorzystano związki przedstawione na Figurze 1 a. Jest to 4-[2- (6-amino9/7-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] 4 i nowo zaprojektowany i zsyntetyzowany na potrzeby niniejszego wynalazku 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5. Oba te związki posłużyły jako monomery funkcyjne przyłączające, za pomocą wiązań wodorowych typu parWatsonaCricka, zasady nukleinowe oligonukleotydu TATAAA 1 (Fig. 1). Pary Watsona-Cricka tworzą się pomiędzy fragmentem tyminowym związku 5 i fragmentem adeninowym oligonukleotydu TATAAA 1 oraz pomiędzy fragmentem adeninowym monomeru funkcyjnego 4 i fragmentem tyminowym TATAAA 1. Jako monomer sieciujący zastosowano 2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen 6 w celu nadania strukturze polimeru odpowiedniej sztywności. Wszystkie zastosowane związki, tj. 4, 5 i 6, zawierają w swojej strukturze fragmenty tiofenowe zdolne do elektrochemicznej polimeryzacji. Te fragmenty pozwoliły na wytworzenie, w kontrolowany sposób, cienkich warstw polimeru z przyłączonym oligonukleotydem, MIP-TATAAA.
Zastosowane monomery funkcyjne i sieciujące umożliwiają przygotowanie kompleksu TATAAA 1 z odpowiednimi monomerami funkcyjnymi w roztworze do polimeryzacji, a następnie wytworzenie warstwy polimeru MIP-TATAAA. Struktura i skład kompleksu prepolimeryzacyjnego były modelowane za
PL 229 917 B1 pomocą obliczeń kwantowo-chemicznych. W dalszej kolejności przygotowanie roztworu do polimeryzacji elektrochemicznej wymagało rozpuszczenia wszystkich jego składników o różnej polarności w tym samym roztworze i zapewnienia warunków elektropolimeryzacji takich, aby wytworzone w jej trakcie kationorodniki tiofenu nie ulegały rekombinacji. Do tego celu przygotowano roztwór rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, zmieszanych w stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5 : 1 : 1 : 0,5. Następnie przeprowadzono elektrochemiczną polimeryzację w warunkach potencjodynamicznych z zastosowaniem powyższego roztworu. Pozwoliło to na efektywne osadzenie warstw MIP-TATAAA lub polimeru niewdrukowanego (ang. non-imprinted polimer, NIPu) dobrze przylegających do przewodzącego podłoża. Warstwy te osadzono na powierzchni dwóch różnych przetworników sygnału chemicznego. Następnie z osadzonych warstw MIP-TATAAA usunięto szablon 1. W ten sposób przygotowano elementy rozpoznające tych chemoczujników. W jednym z nich przetwornikiem był kwarcowy rezonator krystaliczny (ang. quartz crystal resonator, Au-QCR) o częstotliwości rezonansowej 10 MHz, z dyskową elektrodą złotą o średnicy 5 mm na podłożu tytanowym, elektrochemicznej mikrowagi kwarcowej (ang. electrochemical quartz crystal microbalance, EQCM). W pomiarach mikrograwimetrii piezoelektrycznej (ang. piezoelectric micrograwimetry, PM) przeprowadzonych za pomocą tej mikrowagi, jako analityczny sygnał detekcji wykorzystuje się zmianę częstotliwości rezonansowej Au-QCR. Przetwornikiem drugiego chemoczujnika był tranzystor połowy z zewnętrzną bramką (EG-FET). Sygnał detekcji oligonukleotydu TATAAA 1 w roztworze badanym związany jest z wypełnieniem a następnie opróżnieniem luk molekularnych MIPu przez cząsteczki analitu TATAAA 1. W pierwszym chemoczujniku jako sygnał detekcji służyła zmiana częstotliwości rezonansowej Au-QCR, proporcjonalna do zmian masy polimeru. W drugim natomiast jako sygnał detekcji wykorzystano zmianę prądu źródło-dren przy stałym napięciu bramki EG-FETa. Zmiana ta była wywołana przez sorpcję analitu TATAAA 1 w warstwie MIP-TATAAA osadzonej na tej bramce.
Opracowane i wykonane chemosensory wykazują wysoką selektywność oznaczania TATAAA 1 względem związków przeszkadzających, takich jak oligonukleotydy z zamienionym przynajmniej jednym nukleotydem. Przykładowo, czułość oznaczania TATAAA 1 jest znacznie wyższa niż oligonukleotydu TATAGA.
Wynalazek jest bliżej przedstawiony poniżej, w korzystnych przykładach wykonania, z odniesieniem do załączonego rysunku, na którym
Fig. 1 przedstawia (a) proponowany wzór strukturalny kompleksu 1 z monomerami funkcyjnymi 4 i 5 oraz (b) model szkieletowy zoptymalizowanego za pomocą teorii funkcjonału gęstości (ang. density functional theory, DFT) na poziomie B3LYP/3-21G(*) fragmentu TA sekwencji TATAAA skompleksowanego dwoma monomerami funkcyjnymi, 4 i 5,
Fig. 2 przedstawia krzywe potencjałowej zależności (a) prądu jak również zmian (b) częstotliwości rezonansowej i (c) rezystancji dynamicznej równocześnie zarejestrowanych w trakcie osadzania warstwy MIP-TATAAA, za pomocą elektropolimeryzacji w warunkach potencjodynamicznych, na elektrodzie złotej na podłożu tytanowym rezonatora kwarcowego o podstawowej częstotliwości rezonansowej 10 MHz, przy czym polimeryzacja ta prowadzona była w 0,04 mM 1, 0,1 mM 4, 0,05 mM 5, 1 mM 6, w 0,1 M (TBA)CIO4, w roztworze rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, zmieszanych w stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5 : 1 : 1 : 0,5, w zakresie potencjałów od 0,50 do 1,25 V vs Ag|AgCI, przy szybkości zmian potencjału 50 mV/s,
Fig. 3 przedstawia wysokiej rozdzielczości widma rentgenowskiej spektroskopii fotoelektronowej (ang. X-ray photoelectron spectroscopy, XPS) w zakresie energii wiązania elektronu P 2p dla warstwy MIP-TATAAA osadzonej na płytce szklanej z napylonym złotem na podłożu tytanowym (a) przed (krzywa 1) i po (krzywa 2) ekstrakcji oligonukleotydu TATAAA 1 za pomocą 0,1 M NaOH przez 3 godz. w temperaturze 25°C; dla porównania, (b) przedstawia widmo XPS (krzywa 3) dla warstwy TATAAA 1 przygotowanej przez nakroplenie na taką płytkę a następnie odparowanie roztworu 40 μM TATAAA w mieszaninie rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, przy czym warunki osadzania podane są w opisie do Fig. 2,
Fig. 4 przedstawia dwuwymiarowe zdjęcie mikroskopii sił atomowych (ang. atomie force microscopy, AFMu) warstwy polimeru MIP-TATAAA osadzonej na płytce szklanej z napylonym złotem na podłożu tytanowym w warunkach osadzania podanych w opisie do Fig. 2, przy czym pole widzenia obejmowało (0,5 x 0,5) μm2,
Fig. 5 przedstawia zmiany prądu źródło-dren w czasie po kolejnych dodatkach próbek wodnych roztworów oligonukleotydu TATAAA o różnych objętościach, zarejestrowane za pomocą czujnika EG-FET z bramką pokrytą (1) warstwą MIP-TATAAA z następnie wyekstrahowanym oligonukleotydem TATAAA 1
PL 229 917 Β1 lub (2) warstwą NIPu, przy czym napięcie źródło-dren i bramki wynosiło, odpowiednio, 1,7 i 1,50 V a zmiany te rejestrowano w warunkach stacjonarnych,
Fig. 6 przedstawia krzywe kalibracyjne oznaczania oligonukleotydu TATAAA 1 skonstruowane z wykorzystaniem pomiarów wykonanych za pomocą czujnika EG-FET z bramką pokrytą (1) warstwą MIP-TATAAA z następnie wyekstrahowanym oligonukleotydem TATAAA 1 oraz (2) warstwą NIPu, przy czym parametry pomiaru były identyczne jak te podane w opisie do Fig. 5,
Fig. 7 przedstawia krzywe kalibracyjne oznaczania (1) oligonukleotydu TATAAA 1 i (2) oligonukleotydu TATAGA skonstruowane z wykorzystaniem pomiarów wykonanych za pomocą czujnika EG-FET z bramką pokrytą warstwą MIP-TATAAA z następnie wyekstrahowanym oligonukleotydem TATAAA 1 i (3) warstwą NIPu, przy czym parametry pomiaru były identyczne jak te przedstawione w opisie do Fig. 5,
Fig. 8 przedstawia zmianę częstotliwości rezonansowej w czasie dla zastrzykiwanych próbek roztworów o objętości 250 μΙ i o różnych stężeniach oligonukleotydu TATAAA, przy czym zmiana ta była mierzona w warunkach analizy przepływo-wstrzykowej (ang. flow-injection analysis, FIA) dla warstwy MIP-TATAAA z wyekstrahowanym oligonukleotydem TATAAA pokrywającej elektrodę złotą rezonatora kwarcowego o podstawowej częstotliwości rezonansowej 10 MHz a 0,1 M bufor fosforanowy (pH = 7,5), pompowany z szybkością 35 μί/ίτιίη, służył jako roztwór nośny,
Fig. 9 przedstawia krzywą kalibracyjną oznaczania oligonukleotydu TATAAA skonstruowaną za pomocą czujnika piezomikrograwimetrycznego z Au-QCR pokrytym warstwą MIP-TATAAA z następnie wyekstrahowanym oligonukleotydem TATAAA 1, przy czym parametry pomiaru były identyczne jak te przedstawione w opisie do Fig. 8.
Korzystne przykłady wykonania wynalazku
Wykonanie wynalazku jest zilustrowane za pomocą przedstawionych poniżej sześciu korzystnych przykładów.
Przykład 1
Wytwarzanie monomeru funkcyjnego 4, tj. 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metanu]
Metoda trójetapowej syntezy monomeru funkcyjnego (4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metanu]) 4 została opracowana w ramach niniejszych badań, na ich potrzeby, w następujący sposób, z tym, że związek z Etapu 1 jest znany i można go również nabyć w handlu.
Etap 1. Synteza 4-(2-bromoetoksy)benzaldehydu (Schemat 5)
4-Hydroksybenzaldehyd (1,30 g, 10,64 mmoli) i 1,2-dibromoetan (8,00 g, 42,58 mmoli) rozpuszczono w acetonie (100 mL). Następnie dodano K2CO3 (8,80 g, 63,67 mmoli) i mieszano przez 16 godz. w temperaturze 70°C. Po odparowaniu rozpuszczalnika, surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym. Jako eluent zastosowano roztwór heksanu i chloroformu w stosunku objętościowym jak 4 : 1. Otrzymano 1,20 g czystego produktu (wydajność 32%). 1H NMR (CDCIs) δ 9,70 (s, 1H), 7,65 (d, 2H), 6,83 (d, 2H), 4,20 (t, 2H), 3,50 (t, 2H).
Br
CHO
Schemat 5. Wzór strukturalny 4-(2-bromoetoksy)benzaldehydu.
Etap 2. Synteza 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]benzaldehydu (Schemat 6)
Adeninę (300 mg, 2,22 mmoli) i K2CO3 (3,00 g, 21,7 mmoli) dodano do DMF (100 mL) i mieszano przez 1 godz. w temperaturze 130°C. Następnie do mieszaniny reakcyjnej dodano 4-(2-bromoetoksy)benzaldehyd (500 mg, 2,2 mmole) i mieszano przez 40 godz. w temperaturze 130°C. Po odparowaniu rozpuszczalnika, surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym. Jako eluent zastosowano roztwór chloroformu i metanolu w stosunku objętościowym jak 4 :1. Otrzymano 350 mg czystego produktu (wydajność 44%).
PL 229 917 Β1 1H NMR (CDCIs) δ 8,18 (s, 1H), 8,10 (s, 1H), 9,75 (s, 1H), 7,70 (d, 2H), 6,95 (d, 2H), 4,30 (t, 2H),
3,88 (t, 2H).
CHO
Schemat 6. Wzór strukturalny 4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]benzaldehydu.
Etap 3. Synteza 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metanu] (Schemat 7)
Przygotowano zawiesinę 2,2'-bitiofenu (220 mg, 1,32 mmola) i 4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]benzaldehydu (100 mg, 371,33 pmola) w glikolu etylenowym (50 mL). Do zawiesiny tej dodano 70% kwas chlorowy(VII) (8,2 mL), po czym mieszano ją przez 16 godz. wtemperaturze 60°C. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej, do mieszaniny reakcyjnej dodano nadmiar dichlorometanu. Następnie mieszaninę przemyto nasyconym roztworem Na2CC>3, po czym wodą. Wreszcie wysuszono ją siarczanem sodu i odparowano do sucha. Surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym. Jako eluent zastosowano dichlorometan. Otrzymano 20 mg czystego produktu (wydajność 6%).
1H NMR (CDCIs) δ 8,17 (s, 1H), 8,02 (s, 1H), 7,22 (d, 2H), 7,15 (d, 2H), 7,06 (dd, 2H), 6,97 (dd, 2H), 6,94 (d, 2H), 6,78 (d, 2H), 6,70 (d, 2H), 5,76 (s, 1H), 4,78 (t, 2H), 4,42 (t, 2H). ESI-MS, M. cz. obliczona dla C30H23N50S4: 597,80, wyznaczona: 598,08.
O
Schemat 7. Wzór strukturalny 4-[2-(6-amino-9/7-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metanu] 4.
Przykład 2
Otrzymywanie monomeru funkcyjnego 5, 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu
Dwuetapowa synteza monomeru funkcyjnego, 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5 została opracowana w ramach niniejszych badań, na ich potrzeby, w sposób następujący.
Etap 1. Synteza 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenolu (Schemat 8)
Przygotowano zawiesinę 2,2'-bitiofenu (4,00 g, 24,06 mmoli) i 4-hydroksybenzaldehydu (1,47 g, 12,07 mmoli) w glikolu etylenowym (200 mL). Do zawiesiny tej dodano 60% kwas chlorowy(VII) (25 mL)
PL 229 917 Β1 i mieszano ją przez 24 godz. w temperaturze 60°C. Po ochłodzeniu do temperatury pokojowej dodano do niej eter dietylowy (50 mL) i otrzymany roztwór przemyto dwa razy wodą (po 100 mL), a następnie solanką (50 mL). Po wysuszeniu siarczanem magnezu, rozpuszczalnik odparowano pod obniżonym ciśnieniem. Surowy produkt oczyszczono za pomocą chromatografii cieczowej na kolumnie wypełnionej żelem krzemionkowym. Jako eluent zastosowano roztwór heksanu i octanu etylu o stosunku objętościowym zmienianym w kolejności jak 9:1 -^-8:1^-7:1^-6:1. Otrzymano 2,00 g jasnofioletowego produktu (wydajność 38%) o t.t. 71 °C z rozkładem.
1H NMR (400 MHz, CDCIs) δ 7,26-7,20 (m, 1H), 7,16 (dd, J = 5,1, 1,0 Hz, 1H), 7,08 (dd, J = 3,6, 1,0 Hz, 1H), 7,00 (d, J = 3,6 Hz, 1H), 6,96 (dd, J = 5,1,3,6 Hz, 1H), 6,83-6,77 (m, 1H), 6,74 (dd, J = 3,6, 0,8 Hz, 1H), 5,70 (s, 1H), 4,86 (s, 1H), 1,61 (s, 1H).
13C NMR (100 MHz, CDCIs) δ 154,9, 146,8, 137,6, 137,0, 135,5, 129,8, 127,9, 126,8, 124,3, 123,6, 123,3, 115,6, 47,2.
OH
Schemat 8. Wzór strukturalny 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenolu.
Etap 2. Synteza 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu 5 (Schemat 3)
4-(Di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenol (610,1 mg, 1,4 mmoli) i kwas 1-tyminooctowy (352,4 mg, 1,93 nmoli) rozpuszczono w dichlorometanie (14 mL). Do otrzymanego roztworu dodano roztwór N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC) w dichlorometanie (2,8 mL, 1,0 M), po czym mieszaninę reakcyjną mieszano przez 18 godz. Następnie dichlorometan odparowano. Ze stałej pozostałości przygotowano zawiesinę w metanolu (30 mL), po czym gotowano ją pod chłodnicą zwrotną przez 1 godz. Wytrącony osad odsączono na gorąco a następnie przemyto metanolem. Otrzymano 724,4 mg białego produktu o t.t. 191°C z rozkładem (wydajność 86%).
1H NMR (400 MHz, DMSO) δ 11,45 (s, 1H), 7,70-7,34 (m, 5H), 7,34-6,96 (m, 8H), 6,87 (s, 2H), 6,11 (s, 1H), 4,77 (s, 2H), 1,78 (s, 3H).
13C NMR (100 MHz, DMSO) δ 167,1, 164,2, 151,0, 149,0, 145,8, 141,4, 140,8, 136,3, 136,0, 129,3, 128,2, 127,2, 125,3, 123,9, 123,5, 121,7, 108,8, 48,6, 45,7, 11,9.
Przykład 3
Obliczenia kwantowo-chemiczne dla kompleksu TATAAA 1 z monomerami funkcyjnymi 4 i 5
Strukturę kompleksu oligonukleotydu TATAAA 1 z monomerami funkcyjnymi 4 i 5 o różnych stosunkach molowych zoptymalizowano (Fig. 1b) a wartości funkcji termodynamicznych jego tworzenia obliczono za pomocą teorii funkcjonału gęstości (ang. density functional theory, DFT) w przybliżeniu B3LYP/3-21g* przy zastosowaniu oprogramowania Gaussian 09 {M. J. Frisch, et al., Gaussian, Inc., Wallingford, CT, USA 2009}. Przeprowadzone obliczenia wskazały, że kompleks o stosunku molowym oligonukleotydu TATAAA: 4 : 5 jak, odpowiednio, 1 : 2,5 :1,25, jest trwały. Zmiana całkowitej swobodnej entalpii tworzenia kompleksu fragmentu TA sekwencji TATAAA z dwoma monomerami funkcyjnymi, tj. 4 i 5, wynosi, AG = -256,64 kJ mol·1.
Przykład 4
Osadzanie warstw MIP-TATAAA na różnych elektrodach badanych
Warstwy MIP-TATAAA wytworzono za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych w zakresie potencjałów od 0,50 do 1,25 V vs Ag|AgCI przy szybkości zmian potencjału 50 mV/s. Do polimeryzacji zastosowano roztwór mieszaniny rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5 : 1 : 1 : 0,5, zawierający oligonukleotyd TATAAA 1, 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenolu 5, 4-[2-(6-amino-9/7-puryn9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2-bitien-5-ylo)metan] 4 o stosunku molowym jak, odpowiednio, 1 : 2,5 : 1,25. Stosunek ten przyjęto na podstawie przeprowadzonych obliczeń kwantowo-chemicznych opisanych
PL 229 917 B1 w Przykładzie 3, powyżej. Stężenie oligonukleotydu TATAAA 1 w roztworze mieszaniny rozpuszczalników, acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu, o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5 : 1 : 1 : 0,5, wynosiło 0,04 mM. Aby wdrukowane w polimerze luki molekularne były trwałe, do roztworu do polimeryzacji dodano monomer sieciujący 6 o stosunku molowym oligonukleotydu TATAAA 1 do monomeru sieciującego jak 1 : 25. Przewodność roztworu do polimeryzacji zapewnił elektrolit podstawowy, 0,1 M chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, (TBA)CIO4. W tak przygotowanym roztworze umieszczono odpowiednią elektrodę badaną, na której osadzono warstwę polimeru MIP-TATAAA kontrolując jej grubość za pomocą liczby cykli zmian potencjału. Warstwę MIP-TATAAA osadzono na platynowej elektrodzie dyskowej o średnicy 1 mm, na elektrodzie złotej Au-QCR, o podstawowej częstotliwości rezonansowej 10 MHz, lub na płytce szklanej z naparowaną warstwą złota na podkładzie tytanowym. Przygotowane w celach porównawczych warstwy polimeru niewdrukowanego, NIPu, osadzono z roztworu do elektropolimeryzacji nie zawierającego szablonu oligonukleotydu TATAAA stosując taką samą procedurę jak procedura zastosowana do osadzania warstw MIP-TATAAA.
W celu osadzenia warstwy MIP-TATAAA na elektrodzie złotej Au-QCR zastosowano elektropolimeryzację w warunkach potencjodynamicznych za pomocą sześciu cykli zmian potencjału w zakresie od 0,50 do 1,25 V vs Ag|AgCI przy szybkości zmian potencjału 50 mV/s (Fig. 2). W trakcie osadzania, na krzywej zależności prądu od potencjału widoczny był prąd anodowy związany z utlenianiem monomerów przy potencjale powyżej 0,90 V i pik anodowy przy potencjale 1,0 V (Fig. 2a). W kolejnych cyklach zmian potencjału natężenie prądu w zakresie od 0,90 do 1,10 V spadło w związku z osadzeniem warstwy polimeru o coraz wyższej oporności. Na krzywych zależności prądu od potencjału nie zaobserwowano prądów katodowych, które odpowiadałyby redukcji powstającego polimeru. Oligonukleotyd TATAAA 1 jest elektrochemicznie nieaktywny w zastosowanym zakresie potencjałów.
Rejestrowane równocześnie ze zmianami prądu zmiany częstotliwości rezonansowej Au-QCR (Fig. 2b) wskazały, że utlenianiu monomerów towarzyszył spadek częstotliwości rezonansowej. Ten spadek wywołany był wzrostem masy Au-QCR w wyniku osadzania na nim polimeru. Częstotliwość malała w każdym cyklu po osiągnięciu potencjału prądu piku. Spadek częstotliwości w kolejnych cyklach towarzyszył spadkowi prądu utleniania. Wskazuje to na wzrost oporności warstwy polimeru wraz ze wzrostem jej grubości.
W celu przeprowadzenia pomiarów elektrochemicznych, warstwę MIP-TATAAA osadzono również na platynowej elektrodzie dyskowej o średnicy 1 mm. Natomiast w celu scharakteryzowania warstwy i przygotowania chemoczujnika EG-FET, warstwę tę osadzono na płytce szklanej z warstwą złota na podkładzie tytanowym. W tych badaniach zastosowano taką samą procedurę osadzania MIP-TATAAA jak opisana powyżej procedura osadzania warstwy na elektrodzie złotej Au-QCR.
Zarówno na Au-QCR, na elektrodzie platynowej jak i na złoconych płytkach szklanych, w wyniku polimeryzacji powstawała brązowa warstwa polimeru o dobrej przyczepności do podłoża. Tak naniesione warstwy przemyto acetonitrylem w celu usunięcia z nich śladów elektrolitu podstawowego i niespolimeryzowanych monomerów.
Ekstrakcja szablonu, oligonukleotydu TATAAA, z warstw MIP-TATAAA
W celu opróżnienia luk molekularnych wdrukowanych w polimerze, z osadzonych warstw MIPTATAAA wyekstrahowano szablon oligonukleotydu 1 za pomocą 0,1 M NaOH w ciągu 3 godz. w temperaturze 25°C. Do ekstrakcji zastosowano roztwór o tej właśnie kwasowości z uwagi na dysocjację podwójnych łańcuchów DNA na pojedyncze w roztworach silnie alkalicznych. Postęp ekstrakcji szablonu monitorowano za pomocą XPS w zakresie energii wiązania elektronów atomu fosforu. W tym zakresie, dla warstwy przed ekstrakcją w widmie XPS występowały dwa piki o energii wiązania 133,6 i 134,5 eV (odpowiednio, krzywa 1a i 1b, Fig. 3a) odpowiadające elektronom, odpowiednio, P 2p3/2 i P 2p1/2 atomu fosforu {A. Jaramillo et al., Analyst 1999, 124, 1215}. Potwierdzają one obecność TATAAA 1 w warstwie MIP-TATAAA, jako że w badanym układzie tylko TATAAA 1 zawiera fosfor. Pików fosforu nie było w widmie XPS po ekstrakcji 1 (krzywa 2, Fig. 3a), co potwierdza całkowite usunięcie oligonukleotydu 1 z warstwy polimeru. Uzyskane wyniki wskazują na skuteczność usuwania szablonu oligonukleotydu 1 z polimeru i umożliwiają oszacowanie czasu niezbędnego do całkowitego usunięcia 1 z MIPu.
Morfologia warstwy MIP-TATAAA
W celu określenia grubości i szorstkości, warstwę MIP-TATAAA osadzono na złoconych płytkach szklanych za pomocą procedury opisanej w Przykładzie 4, powyżej. Warstwę tę osadzono w warunkach potencjodynamicznych za pomocą sześciu cykli zmian potencjału a następnie szablon 1 wyekstrahoPL 229 917 B1 wano według procedury opisanej w Przykładzie 4, powyżej. Następnie zarejestrowano zdjęcia mikroskopii sił atomowych AFM powierzchni warstw polimerów i na ich podstawie określono ich grubość i szorstkość. Dwuwymiarowe zdjęcie obszaru warstwy MIP-TATAAA o powierzchni (0,5 x 0,5) pm2 (Fig. 4) pokazuje, że warstwa zbudowana jest z nieregularnych agregatów o wielkości sięgającej kilkudziesięciu nanometrów. Osadzona warstwa MIP-TATAAA ma grubość 230 nm a jej szorstkość, wyrażona za pomocą parametru Ra, wynosi 2,6 nm.
P r z y k ł a d 5
Oznaczanie oligonukleotydu TATAAA 1 za pomocą czujnika chemicznego w postaci tranzystora polowego z zewnętrzną bramką (EG-FET) pokrytą warstwą MIP-TATAAA rozpoznającą oligonukleotyd TATAAA 1
W celu przygotowania czujnika EG-FET do oznaczania oligonukleotydu TATAAA 1 w roztworze badanym, warstwę MIP-TATAAA osadzono na płytce szklanej pokrytej warstwą złota na podłożu tytanowym stosując procedurę opisaną w Przykładzie 4, powyżej. Powierzchnia i grubość osadzonej warstwy wynosiła, odpowiednio, ~0,7 cm2 i ~230 nm. Z tak osadzonej warstwy wyekstrahowano szablon oligonukleotydu TATAAA 1 według procedury opisanej w Przykładzie 4, powyżej. Następnie płytkę z tą warstwą podłączono do bramki komercyjnego tranzystora polowego tak, aby tworzyła tzw. zewnętrzną bramkę (extended gate) {C.-P. Chen et al., Anal. Chem. 2011, 83, 1938}. Płytkę tę umieszczono w naczynku elektrochemicznym, w którym umieszczano również elektrodę odniesienia w postaci drutu platynowego. Do naczynka wlano wodę dejonizowaną. Elektrodę odniesienia podłączono do dwukanałowego źródła wymuszająco-pomiarowego. Natomiast źródło i dren tranzystora polowego oraz zewnętrzną bramkę podłączono do drugiego kanału tego źródła. Następnie w tak przygotowanym układzie pomiarowym zarejestrowano charakterystyki tranzystora, tj. zależności prądu źródło-dren (Usd) od napięcia źródło-dren (Usć) w zakresie od 0 do 5,0 V przy zadanym napięciu bramki, Ug = 1,50 V.
Po każdym dodaniu roztworu oligonukleotydu TATAAA 1 zarejestrowano krzywą isd vs Usd i zmierzono wzrost granicznego prądu źródło-dren iSd,lim. Wzrost ten wywołany był zwiększaniem liczby nośników ładunku w obszarze bramkowym tranzystora wskutek zmiany ładunku warstwy polimeru MIP-TATAAA wywołanej selektywną sorpcją oligonukleotydu TATAAA 1 w tej warstwie. Na podstawie tych pomiarów skonstruowano krzywą zależności prądu granicznego, isd,lim, od czasu przy Usd = 1,70V i Ug = 1,50V (Fig. 6). Zgodnie z oczekiwaniem, po dodaniu każdej kolejnej porcji roztworu oligonukleotydu TATAAA 1, isd,lim wzrastał w miarę jak oligonukleotyd TATAAA wiązany był w warstwie MIP-TATAAA. Dla porównania, pomiary takie przeprowadzono z zastosowaniem płytki szklanej z napylonym złotem na podłożu tytanowym pokrytej warstwą NIPu (krzywa 2, Fig. 6). Dla tego polimeru, isd,lim malał proporcjonalnie do stężenia oligonukleotydu TATAAA w roztworze. Poza tym bezwzględne zmiany isd,lim były znacznie mniejsze niż w przypadku zastosowania zewnętrznej bramki pokrytej polimerem MIP-TATAAA. Liniowy zakres stężeniowy rozciągał się przynajmniej od 0,10 do 7,5 pM (Fig. 7). Wyznaczona czułość tego chemoczujnika wynosiła 3,57 x 10-4 nA pM-1 ze współczynnikiem korelacji 0,92 a jego wykrywalność, przy stosunku sygnału do szumu, S/N = 3, wynosiła 330 nM TATAAA 1. Ponadto z nachylenia krzywych kalibracyjnych wyznaczono wartość pozornego współczynnika wdrukowania oligonukleotydu TATAAA 1 mierzonego stosunkiem czułości chemoczujnika z warstwą MIP-TATAAA do czułości czujnika z warstwą NIPu. Współczynnik ten był bardzo wysoki, wynosił bowiem 33.
W celu wyznaczenia selektywności chemoczujnika EG-FET przeprowadzono serię pomiarów z zastosowaniem pokrytej złotem na podłożu tytanowym szklanej płytki z osadzoną warstwą MIP-TATAAA, po wyekstrahowaniu szablonu, oligonukleotydu TATAAA. W pomiarach tych do roztworu badanego dodawano porcjami wodny roztwór oligonukleotydu TATAGA 2 jako substancji przeszkadzającej. Krzywą kalibracyjną skonstruowaną na podstawie tych pomiarów przedstawia Fig. 7. Po dodaniu kolejnej porcji roztworu TATAGA, isd,lim nieznacznie spadała. Jest to efekt przeciwny do obserwowanego w przypadku oligonukleotydu TATAAA. Wskazuje on na niewielkie zmniejszanie liczby nośników ładunku w obszarze bramkowym tranzystora w wyniku tylko nieznacznej sorpcji oligonukleotydu TATAGA w warstwie polimeru MIP-TATAAA.
Wyznaczone parametry analityczne przemawiają za tym, że wytworzony czujnik chemiczny EG-FET nadaje się do oznaczania oligonukleotydu TATAAA w układach biologicznych.
P r z y k ł a d 6
Oznaczanie oligonukleotydu TATAAA 1 w warunkach FIA za pomocą chemoczujnika PM z warstwą rozpoznającą MIP-TATAAA
PL 229 917 Β1
Do oznaczania oligonukleotydu TATAAA 1 w warunkach FIA za pomocą chemosensora PM zastosowano przetwornik Au-QCR z elektrodą pokrytą warstwą MIP-TATAAA o grubości ~230 nm, zgodnie z procedurą opisaną w Przykładzie 4, powyżej. Objętość każdej próbki zastrzykiwanego roztworu wynosiła 250 μΙ. Zastrzykiwane substancje rozpuszczono w roztworze o takim samym składzie jak roztwór nośny, tj. w 0,1 M buforze fosforanowym (pH = 7,0). Szybkość przepływu roztworu nośnego wynosiła 35 μί min'1.
Wyniki pomiarów pokazane są na Fig. 8. Dla dostatecznie sztywnych warstw MIP-TATAAA zmiana częstotliwości rezonansowej, Δ/, jest przeciwna do zmian masy, Am, zgodnie z zależnością Sauerbrey'a, Równanie 1 {D. A. Buttry et al., Chem. Rev. 1992, 92,1355}.
Af f0 Am
A (μ p ) ac q ' q'
1/2 (1)
W równaniu tym f0 oznacza podstawową częstotliwość rezonansową rezonatora kwarcowego. Dla zastosowanych w naszych badaniach rezonatorów Au-QCR, f0 = 10 MHz. Akustycznie czynna powierzchnia stosowanych rezonatorów Au-QCR, Aac, wynosiła 0,1963 cm2. Pozostałe wielkości w Równaniu 1 to /zq - moduł ścinający monokryształu kwarcu o cięciu AT (2,95 χ 1011 g s 2 cm1) i /μ - gęstość kwarcu (2,65 g cm 3). Zmiany lepkości i gęstości warstw MIP-TATAAA w trakcie pomiaru można zaniedbać {A. Pietrzyk et al., Anal. Chem. 2009, 81, 10061}.
Zarejestrowane krzywe zmian RA/ w czasie dla Au-QCR pokrytego warstwą MIP-TATAAA (krzywa 1, Fig. 8) i NIPu (krzywa 2, Fig. 8) wykazywały spadek częstotliwości rezonansowej po zastrzyknięciu kolejnej porcji roztworu oligonukleotydu 1. Za ten spadek odpowiedzialny był wzrost masy polimeru wynikający z wnikania 1 do opróżnionych luk molekularnych MIP-TATAAA. Ponieważ pomiar prowadzony był w warunkach FIA, nadmiar roztworu nośnego następnie wypłukiwał oligonukleotyd 1 z warstwy prowadząc do wzrostu częstotliwości Au-QCR do poziomu sygnału tła (tj. do całkowitego spadku jego masy). Pomiary te wskazują na odwracalne wiązanie analitu w warstwie MIP-TATAAA. Wysokość piku zmian częstotliwości była zależna do stężenia TATAAA w roztworze badanym przynajmniej w zakresie od 2 do 25 μΜ (Fig. 9). Wykrywalność i czułość chemoczujnika PM z warstwą MIPTATAAA, wyznaczona dla S/N = 3, wynosiła, odpowiednio, 18 nM TATAAA 1 i 5,09 Hz cm 2 μΜ1 ze współczynnikiem korelacji 0,98.
Tak więc wykrywalność chemoczujnika PM jest wyższa niż chemoczujnika EG-FET, niemniej oba czujniki nadają się do oznaczania oligonukleotydu 1 w układach biologicznych.
Wnioski
Obliczenia kwantowo-chemiczne wykazały możliwość tworzenia kompleksu oligonukleotydu TATAAA zarówno z każdym z monomerów funkcyjnych z osobna, jak też z obydwoma monomerami równocześnie. Wyniki obliczeń dają wgląd w strukturę i stechiometrię tworzonego kompleksu pre-polimeryzacyjnego.
Zsyntetyzowano nową pochodną bis(2,2'-bitien-5-ylo)metanu zawierającą fragment tyminowy, zdolną do wdrukowania molekularnego nie tylko oligonukleotydu TATAAA ale i innych oligonukleotydów zawierających fragment adeninowy.
Elektropolimeryzacja potencjodynamiczna w zakresie dodatnich potencjałów jest przydatna do wytwarzania warstw polimerów tiofenowych molekularnie wdrukowanych za pomocą oligonukleotydu TATAAA. Opracowana procedura polimeryzacji pozwala na szybkie przygotowanie warstw MIPów o znacznej grubości (200 do 300 nm) trwale przylegających do przewodzącego podłoża zarówno o znacznej (Au-QCR) jak i nieznacznej szorstkości (szkło/Au, elektrody platynowe). Procedura ta także umożliwia dogodną kontrolę grubości i porowatości otrzymanych warstw za pomocą liczby cykli zmian potencjału oraz doboru odpowiednich składników porogenicznych roztworu do elektropolimeryzacji (np. rodzaju elektrolitu podstawowego).
Opracowana i wykorzystana metoda osadzania warstw polimeru molekularnie wdrukowanego oligonukleotydem TATAAA umożliwia łatwą ich integrację z przetwornikami sygnału chemicznego, takimi jak chemoczułe tranzystory połowę z zewnętrzną bramką (EG-FETy) i przetworniki piezomikrograwimetryczne.
Z pomiarów piezomikrograwimetrycznych w warunkach analizy przepływowo-wstrzykowej wynika, że wiązanie oligonukleotydu TATAAA w lukach molekularnych polimeru MIP-TATAAA jest odwracalne. Świadczy o tym pojawianie się pików na krzywej zmian częstotliwości rezonansowej Au-QCR
PL 229 917 B1 pokrytego warstwą MIP-TATAAA w funkcji czasu po zastrzyknięciu kolejnych porcji roztworu oligonukleotydu TATAAA. Oznacza to, że chemoczujnik ten może być urządzeniem wielokrotnego użycia. Ponadto pomiary za pomocą chemoczujnika EG-FET w obecności substancji przeszkadzających, takich jak oligonukleotyd TATAGA, wykazują, że oznaczanie TATAAA jest wysoce selektywne.
Spośród dwóch zbudowanych w ramach wynalazku chemoczujników, chemoczujnik PM wykazał wyższą wykrywalność oligonukleotydu TATAAA. Wynosiła ona 18 nM TATAAA 1. Wykrywalność chemosensora EG-FET również była wysoka i wynosiła 330 nM TATAAA 1. Wykrywalności obu chemoczujników są wystarczające do oznaczania oligonukleotydu TATAAA 1 w układach biologicznych. Dodatkowo czujniki te pracują w środowisku wodnym, co ułatwia ich zastosowanie do oznaczeń nukleotydów w płynach ustrojowych.
Podziękowania
Niniejsza praca była sfinansowana ze środków Fundacji na rzecz Nauki Polskiej (grant POMOST/2012-6/10 dla A.P.-L), w ramach projektu „Kwantowe nanostruktury półprzewodnikowe do zastosowań w biologii i medycynie - Rozwój i komercjalizacja nowej generacji urządzeń diagnostyki molekularnej opartych o nowe polskie przyrządy półprzewodnikowe (POIG.01.01.02-00-008/08 dla W.K.) oraz ze środków US National Science Foundation (Grant No. 1110942 dla F.D.).
Opłaty związane z ochroną wynalazku sfinansowano ze środków projektu Nanotechnology, Biomaterials and alternative Energy Source for ERA integration FP7- REGPOT-CT-2011-285949-NO-BLESSE.
Claims (12)
1. Związek 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu o Wzorze 5.
2. Sposób wytwarzania 1-tyminooctanu 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy.
a) wyjściowy roztwór 2,2'-bisbitiofenu w glikolu etylenowym poddaje się reakcji z 4-karboksybenzaldehydem i kwasem chlorowym(VII) z wytworzeniem p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metylobenzoesanu glikolu, a następnie
b) ten p-bis(2,2'-bitien-5-ylo)metylobenzoesan glikolu poddaje się reakcji z eterem dietylowym i otrzymuje się 4-[di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenol, po czym
c) mieszaninę 4-(di-2,2'-bitien-5-ylo)metylofenolu i kwasu 1-tyminooctowego w rozpuszczalniku organicznym, korzystnie dichlorometanie, poddaje się reakcji z N,N'-dicykloheksylokarbodiimidem (DCC), w wyniku czego otrzymuje się 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo) fenylu.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że Etap 1 tego sposobu prowadzi się z zastosowaniem glikolu etylenowego, w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 50 do 70°C, korzystnie w 60°C, przez 22 do 26 godzin, korzystnie 24 godz., przy stosunku reagentów względem 4-karboksybenzaldehydu w zakresie od 2 do 4, korzystnie 3, dla 2,2'-bisbitiofenu i od 20 do 60, korzystnie 45, dla kwasu chlorowego(VII).
4. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że Etap 2 tego sposobu prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 20 do 35°C, korzystnie w temperaturze 25°C, a następnie dodaje się eter dietylowy, korzystnie, o objętości dwa razy większej niż objętość kwasu chlorowego(VII).
5. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że Etap 3 tego sposobu prowadzi się w atmosferze gazu obojętnego, w temperaturze w zakresie od 20 do 30°C, korzystnie w 25°C, przez 15 do 21 godz., korzystnie 18 godz., przy stosunku reagentów względem kwasu 1-tyminooctowego w zakresie od 0,5 do 3, korzystnie 1,73, dla 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenolu i od 0,5 do 3, korzystnie 1,64 dla N,N'-dicykloheksylokarbodiimidu (DCC).
6. Warstwa rozpoznającego polimeru, wytworzona metodą wdrukowywania molekularnego, znamienna tym, że stanowi ją polimer zawierający jako monomery funkcyjne 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan] oraz 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu oraz jako monomer sieciujący (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen.
PL 229 917 B1
7. Sposób wytwarzania warstwy rozpoznającego polimeru, metodą molekularnego wdrukowania, za pomocą polimeryzacji elektrochemicznej w warunkach potencjodynamicznych, znamienny tym, że jako monomery do elektropolimeryzacji stosuje się m onomer funkcyjny, 4-[2-(6-amino-N,N'-puryn-9-ylo)-etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan], i monomer funkcyjny, 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu oraz monomer sieciujący, (2,4,5, 2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen.
8. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że jako szablon/analit stosuje się aminę biogeniczną lub oligonukleotyd, korzystnie oligonukleotyd TATAAA.
9. Sposób według zastrz. 7 albo 8, znamienny tym, że do polimeryzacji stosuje się roztwór zmieszanych rozpuszczalników, korzystnie acetonitrylu, wody, toluenu i izopropanolu o stosunku objętościowym jak, odpowiednio, 7,5 : 1 : 1 : 0,5, zawierający oligonukleotyd TATAAA, 4-[2-(6-amino-9H-puryn-9-ylo)etoksy]fenylo-4-[bis(2,2'-bitien-5-ylo)metan], 1-tyminooctan 4-(di-2,2'-bitien-5-ylometylo)fenylu, (2,4,5,2',4',5'-heksa(tiofen-2-ylo)-3,3'-bitiofen, korzystnie w stosunku molowym jak, odpowiednio, 1 : 2,5 : 1,25 : 25, oraz 0,1 M elektrolit podstawowy, korzystnie chloran(VII) tetrabutyloamoniowy, (TBA) CIO4.
10. Sposób według zastrz. 7, znamienny tym, że stosuje się potencjał liniowo zmieniany cyklicznie w zakresie od 0 do 1,50 V, korzystnie w zakresie od 0,50 do 1,25 V, ze stałą szybkością w przedziale od 5 do 1000 mV/s, korzystnie 50 mV/s.
11. Zastosowanie warstwy rozpoznającego polimeru określonego w zastrz. 6, jako elementu rozpoznającego czujnika chemicznego do wykrywania i/lub selektywnego oznaczania oligonukleotydu TATAAA, korzystnie w płynach ustrojowych pacjenta, z wykorzystaniem piezomikrograwimetrycznego przetwarzania sygnału chemicznego rozpoznawania TATAAA na sygnał analityczny, lub do tego przetwarzania wykorzystujący tranzystory połowę z zewnętrzną bramką (ang. extended-gate field-effect transistors, EG-FETy).
12. Zastosowanie według zastrz. 11, w inżynierii genetycznej, zwłaszcza do testów genetycznych, przy wczesnym wykrywaniu dziedzicznych chorób genetycznych, jak również do testów przesiewowych u noworodków w kierunku fenyloketonurii i wrodzonej niedoczynności tarczycy, lub do testów diagnostycznych i terapeutycznych w odniesieniu do chorób nowotworowych związanych ze zmutowanymi genami, albo do przyspieszania produkcji roślinnej poprzez mutagenezę sterowaną oligonukleotydami.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL409328A PL229917B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 1-Tyminooctan 4-(di-2,2’-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL409328A PL229917B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 1-Tyminooctan 4-(di-2,2’-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL409328A1 PL409328A1 (pl) | 2016-03-14 |
| PL229917B1 true PL229917B1 (pl) | 2018-09-28 |
Family
ID=55450754
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL409328A PL229917B1 (pl) | 2014-08-29 | 2014-08-29 | 1-Tyminooctan 4-(di-2,2’-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL229917B1 (pl) |
-
2014
- 2014-08-29 PL PL409328A patent/PL229917B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL409328A1 (pl) | 2016-03-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Huang et al. | Pd-Au@ carbon dots nanocomposite: Facile synthesis and application as an ultrasensitive electrochemical biosensor for determination of colitoxin DNA in human serum | |
| Sweetman et al. | A practical guide to prepare and synthetically modify graphene quantum dots | |
| Zhen et al. | An enzyme-free DNA circuit-assisted graphene oxide enhanced fluorescence anisotropy assay for microRNA detection with improved sensitivity and selectivity | |
| Rohde et al. | A non-oxidative approach toward chemically and electrochemically functionalizing Si (111) | |
| JP5712129B2 (ja) | ナノ構造化微小電極およびそれを組み込んだバイオセンシング装置 | |
| JP4418229B2 (ja) | 水溶性及び有機溶解性ククルビツリル誘導体、その調製方法、その分離方法ならびに用途 | |
| Lu et al. | Electrogenerated chemiluminescence biosensor with a tripod probe for the highly sensitive detection of microrna | |
| Ki et al. | Sensitive plasmonic detection of miR-10b in biological samples using enzyme-assisted target recycling and developed LSPR probe | |
| Zha et al. | A high performance dual-mode biosensor based on Nd-MOF nanosheets functionalized with ionic liquid and gold nanoparticles for sensing of ctDNA | |
| Diltemiz et al. | Designing of MIP based QCM sensor having thymine recognition sites based on biomimicking DNA approach | |
| JP2014012654A (ja) | テトラフェニルエテン誘導体から成る発蛍光性化合物 | |
| Ziółkowski et al. | Electrochemical detection of DNA hybridization using metallacarborane unit | |
| Li et al. | Development of a single-molecule nanobalance ratiometric electrochemical DNA biosensor using a triblock poly-adenine probe | |
| Parchekani et al. | Zepto molar miRNA-21 detection in gold Nano-islands platform toward early cancer screening | |
| Eksin et al. | Electrochemical detection of microRNAs by graphene oxide modified disposable graphite electrodes | |
| JP4959327B2 (ja) | ロタキサン化合物、ロタキサン化合物が結合した固体基板及びこれを利用したバイオチップ | |
| Nguyen et al. | Ultrasensitive electrochemical microRNA-21 detection based on MXene and ATRP photocatalytic strategy | |
| Salmi et al. | Grafting polymer–protein bioconjugate to boron-doped diamond using aryl diazonium coupling agents | |
| Chen et al. | “Click” Cucurbit [7] uril Hosts on Self-Assembled Monolayers: Quantitative Supramolecular Complexation with Ferrocene Guests | |
| Fu et al. | A photoelectrochemical sensor based on a reliable basic photoactive matrix possessing good analytical performance for miRNA-21 detection | |
| PL229917B1 (pl) | 1-Tyminooctan 4-(di-2,2’-bitien-5-ylometylo)fenylu i sposób jego wytwarzania, warstwa przewodzącego polimeru wdrukowywanego molekularnie z zastosowaniem pochodnych tiofenu i sposób jej wytworzenia oraz jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA | |
| JP2016197041A (ja) | 分子インプリンティング膜、その製造方法、鋳型化合物、およびステロイドホルモン化合物の検出方法 | |
| JP4588336B2 (ja) | 導電性化合物、これを含む電極及びセンサー、並びに前記センサーを利用した標的分子の検出方法 | |
| Yang et al. | Surface imprinted conducting polymer patterns electrochemically grown from gold pinhole arrays on 2D inverse silica opals and their effective use in aspartame detection | |
| PL229588B1 (pl) | Nowy sztuczny oligomer o sekwencji zasad nukleinowych ATATTT komplementarny do promotorowej sekwencji TATAAA, sztuczna nić promotora DNA zawierająca ten oligomer i jej zastosowanie do selektywnego wykrywania i oznaczania oligonukleotydu TATAAA |