PL230177B1 - Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta i sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta, o sekwencjach: F - 5'TTCAGGGCCATTGAGCCATT R - 5' AAGGGACATGTCGACGTCAC. Zgłoszenie obejmuje też sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta, według wynalazku, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach F - 5'TTCAGGGCCATTGAGCCATT R - 5'AAGGGACATGTCGACGTCAC, przy czym stosuje się marker E326147 związany z cechą karłowatości genu Dw3.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta i sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta.

Gen karłowatości występuje w liniach wsobnych 723, 711,4112Dw i 4127Dw znajdujące się w kolekcji Katedry Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie. Linie te stanowią źródło genu dla prac hodowlanych.

Zwiększenie odporności żyta na wylęganie, która to cecha jest wyraźnie skorelowana z wysokością roślin, jest jednym z ważniejszych celów hodowlanych. Zjawisko wylęgania jest czynnikiem w dużym stopniu decydującym o plonowaniu, gdyż wpływa na gorsze wykształcenie ziarna, zmniejszenie liczby kłosów produkcyjnych, liczby ziaren z rośliny i masy 1000 ziaren. Szacuje się, że problem ten, w latach o przeciętnym układzie warunków pogodowych, dotyczy około 5-10% plantacji, co przyczynia się do rocznych strat finansowych na poziomie 75-150 mln zł. Najlepszym rozwiązaniem byłoby znalezienie i wprowadzenie do odmian żyta źródła karłowatości, które pozwoli wyhodować formy odporne na wyleganie i wysoko plonujące.

U żyta zidentyfikowano jak dotąd 17 genów warunkujących niski pokrój roślin, z których większość przypisano do chromosomów (Borner A., Korzun V. 1998. A consensus linkage map of rye (Secale cereale L.) including 374 RFLPs, 24 isozymes and 15 gene loci. Theor. Appl. Genet. 97: 1279-1288 oraz Borner A., Gale M.D., Appleford N.E.J., Lenton J.R. 1993. Gibberelin status and responsiveness in shoots of tall and dwarf genotypes of diploid rye (Secale cereale). Physiol. Plant. 89: 309-314 oraz Borner A., Plaschke J., Korzun V., Worland A.J. 1996. The relationships between the dwarfing genes of wheat and rye. Euphytica 89: 69-75 oraz Kubicka H., Kubicki B. 1990. Two types of dwarfness in winter rye (Secale cereale L.). Gen. Pol.81: 9-19 oraz Melz G., Schlegel R., Sybenga J. 1988. Indentification of the chromosomes in the “Esto” set of trisomics. Plant Breed. 100: 169-172). Trzy geny warunkują karłowatość dominującą, pozostałe są recesywne. Dotychczas w praktycznej hodowli żyta znalazły zastosowanie jedynie dwa: Dw1 (syn. Ddw1, H1) i ct2 (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173 oraz Kubicka H., Kubicki B. 1990. Two types of dwarfness in winter rye (Secale cereale L.). Gen. Pol. 81: 9-19 oraz Plaschke J., Korzun V., Koebner R.M.D., Borner A. 1995. Mapping of the GA3-insensitive dwarfing gene ct1 on chromosome 7R in rye. Plant Breed. 114: 113-116). Gen Dw1 , wywodzi się z najlepiej poznanego źródła żytniej karłowatości -mutanta EM1 (Kobyljanski V.D. 1972. K genetike dominantnogo faktora korotkosteblnosti rżi. Genetika 8(2): 12-17). Gen ten zmapowano na końcowym odcinku długiego ramienia chromosomu 5R (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173 oraz Borner A., Korzun V., Voylokov A.V., Weber W.E. 1999. Detection of quantitative trait loci on chromosome 5R of rye (Secale cereale L.). Theor. Appl. Genet. 98: 1087-1090). Drugi dominujący gen karłowatości Dw2 (Ddw2) zlokalizowano wstępnie na chromosomie 7R (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173). Źródłem tego genu jest karłowa forma żyta pochodząca z Bułgarii (K10028). Trzeci gen warunkujący karłowatość dominującą został sklasyfikowany jako odrębny od Dw1 i Dw2, i opisany w publikacji Stojałowski S., Myśków B., Hanek M., 2012. Phenotypic effect and chromosomal localization of Ddw3, the dominant dwarfing gene in rye (Secale cereale L.). Euphytica, Vol. 201, 1: 43-52 jako Dw3. Autorzy ci skonstruowali mapę genetyczną mieszańca F2 linii bliskoizogenicznych 4112Dw x 4112N lokalizując gen na długim ramieniu chromosomu 1R w pozycji ok. 135cM. Sprzężone z genem markery DArT mapowano w oddaleniu około 3 cM. Żaden z markerów sprzężonych z segregacją wysokości roślin nie można było uznać za wystarczająco skuteczny w odróżnianiu genotypów karłowych od wysokich. Autorzy dokonali także wstępnej charakterystyki wpływu genu na cechy morfologiczne roślin w tym wysokość roślin, stwierdzając około 30% redukcję długości źdźbła form posiadających gen Dw3. Sklasyfikowali oni również gen karłowatości jako wrażliwy na egzogennie zastosowany kwas giberelinowy (GA3).

Poza przedstawionymi 3 genami dominującymi w populacjach żyta obecnych jest kilkanaście genów recesywnych. Dodatkowo, poza znanymi i scharakteryzowanymi dotąd genami karłowatości żyta mogą się pojawić spontanicznie inne geny powodujące skrócenie roślin a nie znane dotychczas. Poważny problem stanowi szybkie i skuteczne rozpoznanie czy badane źródło jest tożsame czy odrębne od poznanych wcześniej źródeł, co ułatwia wykorzystania tego źródła w praktyce.

Celem wynalazku było znalezienie takich markerów, które nie tylko odróżniałyby formy karłowe od wysokich, ale również pozwalały potwierdzić źródło karłowatości.

PL 230 177 B1

Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta, według wynalazku, o sekwencjach:

F - 5' TTCAGGGCCATTGAGCCATT

R - 5' AAGGGACATGTCGACGTCAC

Sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta, według wynalazku, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach

F - 5' TTC AGGGCC ATTGAGCC ATT

R - 5' AAGGGACATGTCGACGTCAC, przy czym stosuje się marker E326147 (Wzór 1 - prążek markera E326147 związany z cechą karłowatości genu Dw3).

Wynalazek jest bliżej w przykładzie wykonania i na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia elektroforegramy, na których pokazano segregację markera E326147 w grupach genotypów wysokich (W) i karłowych (K) populacji RIL mieszańca 541 x 723 oraz linii rodzicielskich (Wzór 1 zaznaczono strzałką), Fig. 2 przedstawia elektroforegram, na których pokazano segregację markera E326147 wśród niespokrewnionych linii wsobnych (A1-A18). Pełnymi nazwami wyróżniono linie posiadające gen Dw3: 723, 711,4112Dw oraz 4127Dw.

W pierwszym etapie wytworzono populację mieszańca linii 541 (linia wysoka) i 723 (linia karłowa) składającą się z dwóch grup skrajnych rekombinacyjnych linii wsobnych (F5) (wysokich i karłowych) liczących po 43 genotypy każda. W trakcie badań opracowano kodominujący marker E326147, który w prosty i szybki sposób identyfikuje rośliny żyta posiadające gen Dw3 zarówno w pulach skrajnych genotypów (Fig. 1) jak i w grupie genotypów niespokrewnionych (Fig. 2).

Przeprowadzone przez Zgłaszającego badania markera E326147 wykazały, że jest on znacznikiem genu Dw3 w życie.

Metoda identyfikacji markera E326147

Materiał -- DNA izolowane z liści żyta jest znanymi metodami przy wykorzystaniu komercyjnie dostępnych zestawów.

Startery do amplifikacji markera E326147 zaprojektowano na podstawie sekwencji własnych.

Sekwencje starterów:

F - 5' TTCAGGGCCATTGAGCCATT

R - 5' AAGGGACATGTCGACGTCAC

Startery projektowano przy użyciu programu Geneious (Biomatters Ltd).

Skład mieszaniny reakcji PCR (Reakcja łańcuchowa polimerazy):

DNA	10-100 ng
10 x Taq bufor (200 mM Tris-HCl, 200 mM KCl, 50 mM (NH4)2SO4	1 x
dNTP	0,2 mM
MgCl2	1-3 mM
Polimeraza Taq	0,5-1,5 U
Starter F	0,1-1 pM
Starter R	0,1-1 pM
H2O	W zależności od objętości końcowej mieszaniny PCR

Warunki amplifikacji DNA

Reakcję PCR przeprowadzano w termocyklerach: PTC200 (MJ Research) lub Tl00™ Thermal Cycler (Bio-RAD).

Parametry PCR: 95°C - 1-3 min, 35 cykli (95°C-30 s, 65°C-30 s, 72°C-1 min), 72°C-7 min.

PL 230 177 B1

Identyfikacja markera E326147

Rozdział elektroforetyczny produktów amplifikacji przeprowadzano w 1,5% żelu agarozowym, bufor 1xTBE pH=8.5 przy napięciu 100 V przez 1,5 h. Jako wzorzec długości fragmentów DNA użyto GeneRuler Ladder 100 bp Plus (Fermentas). Po rozdziale żel zanurzano w roztworze bromku etydyny (0,01%) na 10 minut. Wizualizacji wyników dokonano przy użyciu systemu G-Box (Syngene).

Wyniki

Testowanie markera E326147 na osobnikach RIL populacji 541 x 723 wykazało 100% zgodność segregacji markera z karłowatością (Fig. 1). Uzyskany dla kolekcji 23 linii wsobnych żyta, w tym 4 genotypów posiadających gen Dw3, wynik identyfikacji z zastosowaniem markera E326147 i metody stanowiącej przedmiot wynalazku zaprezentowano na Fig. 2. Elektroforegram przedstawia zmienność amplifikowanych fragmentów DNA po włączeniu do analizy pary starterów F i R.

Zastosowanie testu molekularnego

Zastosowanie markera E326147 może być przydatne do identyfikacji genu Dw3 obecnego w materiałach hodowlanych żyta.

Claims (2)

1. Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta o sekwencjach:

F - 5' TTCAGGGCCATTGAGCCATT R - 5' AAGGGACATGTCGACGTCAC

2. Sposób wykrywania obecności genu karłowatości Dw3 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach F - 5' TTCAGGGCCATTGAGCCATT

R - 5' AAGGGACATGTCGACGTCAC, przy czym stosuje się marker E326147 (Wzór 1).