PL230419B1 - Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta - Google Patents

Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta

Info

Publication number
PL230419B1
PL230419B1 PL417583A PL41758316A PL230419B1 PL 230419 B1 PL230419 B1 PL 230419B1 PL 417583 A PL417583 A PL 417583A PL 41758316 A PL41758316 A PL 41758316A PL 230419 B1 PL230419 B1 PL 230419B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
gene
pair
rye
molecular detection
rye plants
Prior art date
Application number
PL417583A
Other languages
English (en)
Other versions
PL417583A1 (pl
Inventor
Katarzyna Molik
Edyta Pawłowska
Paweł Milczarski
Original Assignee
Zachodniopomorski Univ Technologiczny W Szczecinie
Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny W Szczecinie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Zachodniopomorski Univ Technologiczny W Szczecinie, Zachodniopomorski Uniwersytet Technologiczny W Szczecinie filed Critical Zachodniopomorski Univ Technologiczny W Szczecinie
Priority to PL417583A priority Critical patent/PL230419B1/pl
Publication of PL417583A1 publication Critical patent/PL417583A1/pl
Publication of PL230419B1 publication Critical patent/PL230419B1/pl

Links

Landscapes

  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta, o sekwencjach: F - 5'F25439F: CAACATCACCGGAGCGATTT R - 5'F25439R: GTGAAGAAGTACCACTCGCG. Zgłoszenie zawiera też sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji. Sposób charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach: F - 5'F25439F: CAACATCACCGGAGCGATTT R - 5'F25439R: GTGAAGAAGTACCACTCGCG,

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8w roślinach żyta.
Gen karłowatości dw8 występuje w linii wsobnej żyta RXL10, pochodzącej z kolekcji Katedry Genetyki, Hodowli i Biotechnologii Roślin, Zachodniopomorskiego Uniwersytetu Technologicznego w Szczecinie. Linia RXL10 została wyprowadzona z odmiany żyta ozimego Zeelandzkie, zdeponowanej w Krajowym Centrum Roślinnych Zasobów Genowych IHAR w Radzikowie (Accession nr. 30504).
Jedną z metod zapobiegających wylęganiu u zbóż jest hodowla odmian o skróconym źdźble. Rośliny takie uzyskuje się w wyniku krzyżowania form karłowych, odpornych na wylęganie z formami o normalnym wzroście, podatnymi na wylęganie. U żyta zidentyfikowano dotąd trzy dominujące geny warunkujące karłowatość: Dw1, Dw2, Dw3, które zmapowano odpowiednio na chromosomach 5R, 7R i 1R (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173; Bórner A., Korzun V. 1998. A consensus linkage map of rye (Secale cereale L.) including 374 RFLPs, 24 isozymes and 15 gene loci. Theor. Appl. Genet. 97: 1279-1288; Bórner A., Korzun V., Voylokov A.V., Weber W.E. 1999. Detection of quantitative trait loci on chromosome 5R of rye (Secale cereale L.). Theor. Appl. Genet. 98: 1087-1090 oraz Stojałowski S., Myśków B., Hanek M., 2015. Phenotypic effect and chromosomal localization of Ddw3, the dominant dwarfing gene in rye (Secale cereale L.). Euphytica, VoL 201, 1: 43-52) oraz 14 genów recesywnych. Szerokie zastosowanie w programach hodowlanych żyta i pszenżyta znalazł gen Dw1, jednak obecnie w Polsce w Krajowym Rejestrze odmian gatunków roślin uprawnych nie ma zarejestrowanej odmiany żyta karłowego, zawierającego którykolwiek ze wspomnianych genów.
Gen dw8 został wstępnie zmapowany w populacji DS2 x RXL10 na długim ramieniu chromosomu 5R (Devos K. M., Atkinson M. D., Chinoy C. N., Francis H. A., Harcourt R. L., Koebner R. M. D., Liu C. J., Masojc P, Xie D. X., Gale M. D. 1993. Chromosomal rearrangements in the rye genome relative to that of wheat. Theor Appl Genet 85:673-680), w rejonie dystalnym, w obrębie translokacji 4RL/5RL. Jest to obszar chromosomu, który wykazuje homeologię do pszenicznych chromosomów 5AL, 4BL i 4DL. Gen został opisany przez autorów jako częściowo dominujący. Na konsensusowej mapie chromosomu 5R znajduje się on nad genem Dw1, który lokalizuje się pomiędzy genem β-Amy (położonym dystalnie) a genem Hp1 (Gustafson J. R, Ma X-F, Korzun V., Snape J. W. 2009. A consensus map of rye integrating mapping data from five mapping populations. Theor Appl Genet 118: 793-800). Oprócz genu dw8 na chromosomie 5R zidentyfikowano dwa inne, recesywne geny karłowatości: dw6 (Melz G. 1989. Beitrage zur Genetik des Roggens (Secale cereale L.). Dsc. Thesis, Berlin: 173) i ct2, który zmapowano na długim ramieniu chromosomu 5R, powyżej genu a-Amy3 (Plaschke J., Bórner A., Xie D. X., Koebner R. M. D., Schlegel R., Gale M. D. 1993. RFLP-mapping of genes affecting plant height and growth habit in rye. Theor Appl Genet 85:1049-1054). Oba loci mogą być jednak różnymi allelami tego samego genu, co zasugerował Bórner A. 1991. Genetical studies of gibberellic acid insensitivity in rye (Secale cereale L.), Plant Breed 106:53-57).
Aby określić dokładną lokalizację chromosomową genu dw8, potwierdzić jego odrębność od innych genów karłowatości chromosomu 5R oraz aby identyfikować gen dw8 w roślinach o niskim pokroju niezbędne było znalezienie markera blisko sprzężonego z tym genem. Na początku przeprowadzono test różnych markerów na liniach rodzicielskich 541 i RXL10, następnie określono ich segregację w populacji F2 541 x RXL10. Weryfikację markerów dokonano testując je na 28 karłowych i wysokich, niespokrewnionych liniach wsobnych żyta (w tym linii RXL10).
Celem wynalazku było znalezienie takich markerów, które nie tylko odróżniałyby formy karłowe od wysokich, ale również pozwalały potwierdzić źródło karłowatości.
Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8w roślinach żyta, według wynalazku, o sekwencjach:
F - 5' F25439F: CAACATCACCGGAGCGATTT
R - 5'F25439R: GTGAAGAAGTACCACTCGCG
Sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw 8 w roślinach żyta, według wynalazku, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, charakteryzuje się tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach:
PL230 419 Β1
F - 5' F25439F: CAACATCACCGGAGCGATTT
R - 5' F25439R: GTGAAGAAGTACCACTCGCG przy czym stosuje się marker F25439 (Wzór 1 prążek markera F25439 związany z cechą karłowatości genu dw8).
Wynalazek jest bliżej w przykładzie wykonania i na rysunku, na którym Fig. 1 przedstawia elektroforegramy, na których pokazano segregację markera F25439 w genotypach wysokich i karłowych (Fk) populacji F2 mieszańca 541 x RXL10 oraz linii rodzicielskich (Wzór 1 zaznaczono strzałką). Fig. 2 przedstawia elektroforegram, na którym pokazano segregację markera F25439 wśród niespokrewnionych linii wsobnych (A1-A27). Pełnymi nazwami wyróżniono linię posiadającą gen dw8 (RXL10).
W pierwszym etapie wytworzono populację mieszańca linii 541 (linia wysoka) i RXL10 (linia karłowa). W trakcie badań opracowano kodominujący marker F25439, który w prosty i szybki sposób identyfikuje rośliny żyta posiadające gen dw8 zarówno w pulach skrajnych genotypów (Fig. 1) jak i w grupie genotypów niespokrewnionych (Fig. 2).
Przeprowadzone przez Zgłaszającego badania markera F25439 wykazały, że jest on znacznikiem genu dw8 w życie.
Metoda identyfikacji markera F25439
Przygotowanie materiału roślinnego: DNA izolowano z liofilizowanych liści z wykorzystaniem komercyjnych zestawów kolumienkowych, wykorzystujących złoża krzemionkowe do wiązania DNA. Dokonano oceny ilościowej i jakościowej izolatów, wyrównano stężenia poszczególnych roztworów DNA do 10 ng/μΙ.
Startery wykorzystane w PCR:
Startery zaprojektowano na podstawie sekwencji własnych, w programie Primer3 (Untergasser A., Cutcutache I., Koressaar T., Ye J., Faircloth B. C., Remm M., Rożen S. G. 2012. Primer3 - new capabilities and interfaces. Nucleic Acids Research 40 (15): e115; Koressaar T., Remm M. 2007. Enhancements and modifications ofprimer design program Primer3 Bioinformatics 23 (10): 1289-91).
Starter 1: F25439F: CAACATCACCGGAGCGATTT
Starter 2: F25439R: GTGAAGAAGTACCACTCGCG
Skład mieszaniny reakcyjnej i warunki przeprowadzenia PCR:
Składnik Objętość
Woda 7,65 μΙ
Bufor TrueStart Hot Start 10x 1,5 μΐ
dNTP 2 mM 1,0 μΐ
MgCl2 25 mM 1,2 μΐ
Starter F 5 pM 1,0 μΐ
Starter R 5 pM 1,0 μ!
DNA 10 ng/μΐ 1,5 μΐ
Pol i me raz a DNA Taq TrueStart Hot Start Thermo Scientific 5 U/μΙ 0,15 μΐ
Całkowita objętość 15 μΐ
PCR przeprowadzano w termocyklerze: T100™ Thermal Cycler (Bio-RAD). Profil temperaturowy reakcji przedstawiono w tabeli poniżej.
Temperatura Czas Liczba cykli
95°C 2 min 1
95°C 30 s
65°C -FC/ cykl 30 s 10
72°C 1 min
95°C 30 s
55°C 30 s 30
72°C 1 min
72°C 10 min 1
PL230 419 Β1
Rozdział produktów reakcji i wizualizacja wyników:
Produkty rozdzielono metodą elektroforezy poziomej w 2% żelu agarozowym, w buforze 1 x TBE, pH=8,3. Do określenia długości otrzymanych produktów na żel nałożono 10 μΙ wzorca GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder. Parametry rozdziału: 90V/ 2 h. Wizualizacji produktów dokonano przy użyciu systemu G-Box (Syngene), po uprzednim barwienie żelu w roztworze bromku etydyny (0,1%).
Wyniki:
Przeprowadzony na 94 osobnikach populacji F2 mieszańca 541 x RXL10 test wykazał 97% skuteczność w identyfikacji form karłowych i wysokich (Fig. 1). Dla roślin karłowych uzyskany produkt jest krótszy (<300 pz) niż dla roślin wysokich (ok. 300 pz). Test przeprowadzony na 28 niespokrewnionych liniach wsobnych żyta, w tym jednej linii RXL10 (posiadającej gen dw8) wykazał, że opisana metoda z wykorzystaniem markera F25439 jest w 100% skuteczna w identyfikacji genu karłowatości dw8 (Fig. 2).

Claims (2)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8w roślinach żyta o sekwencjach:
    F - 5' F25439F: CAACATCACCGGAGCGATTT
    R - 5' F25439R: GTGAAGAAGTACCACTCGCG
  2. 2. Sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta, w którym to sposobie polimorficzny fragment DNA sprzężony z badanym genem amplifikowany jest w reakcji PCR z zastosowaniem pary starterów, po czym dokonuje się detekcji produktu amplifikacji, znamienny tym, że parę starterów stanowi para oligonukleotydowych starterów o sekwencjach:
PL417583A 2016-06-15 2016-06-15 Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta PL230419B1 (pl)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL417583A PL230419B1 (pl) 2016-06-15 2016-06-15 Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL417583A PL230419B1 (pl) 2016-06-15 2016-06-15 Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL417583A1 PL417583A1 (pl) 2017-12-18
PL230419B1 true PL230419B1 (pl) 2018-10-31

Family

ID=60655789

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL417583A PL230419B1 (pl) 2016-06-15 2016-06-15 Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta

Country Status (1)

Country Link
PL (1) PL230419B1 (pl)

Also Published As

Publication number Publication date
PL417583A1 (pl) 2017-12-18

Similar Documents

Publication Publication Date Title
DK2298066T3 (en) Markers for use in the production of double-layer restorers-lines of Brassica napus, which have a good agronomic value
CN104073487A (zh) 水稻抗稻瘟病基因Pi2的分子标记及其应用
Barakat et al. Assessment of genetic diversity among wheat doubled haploid plants using TRAP markers and morpho-agronomic traits
Aliyeva-Schnorr et al. Collinearity of homoeologous group 3 chromosomes in the genus Hordeum and Secale cereale as revealed by 3H-derived FISH analysis
BR112016013111B1 (pt) Métodos de identificação e/ou seleção de planta de milho
CN118441090A (zh) 小麦条锈病高温成株抗性检测kasp引物组及应用
Copete et al. Chromosomal location of genes for resistance to powdery mildew in Agropyron cristatum and mapping of conserved orthologous set molecular markers
CN104419708A (zh) 核酸和检测转基因水稻eb7001s及其衍生系的方法以及试剂盒及其用途
BR112017002448B1 (pt) Método de identificação de planta de milho com resistência à helmintosporiose do milho e método de introgressão de alelos de qtl em plantas de milho
CN104232758A (zh) 鉴定或辅助鉴定小麦抗寒性的方法
US20150037793A1 (en) Detection methods for oil palm shell alleles
Gultyaeva et al. The effectiveness of molecular markers for the identification of Lr28, Lr35, and Lr47 genes in common wheat
PL230419B1 (pl) Para oligonukleotydowych starterów do wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta i sposób wykrywania molekularnego obecności genu karłowatości dw8 w roślinach żyta
CN107619882A (zh) 一种野生二粒小麦抗白粉病基因分子标记及其应用
CN105861734A (zh) 快速鉴定谷子抗烟嘧磺隆基因纯合、杂合、不抗型的方法
CN103409417B (zh) 稻瘟病抗性基因Pi-d2的功能型分子标记及其专用引物序列与应用
CN107630105A (zh) 一种与野生二粒小麦抗白粉病基因紧密连锁的分子标记及其应用
CN116144820B (zh) 黄瓜根重调控基因连锁的Indel标记及其应用
CN118256650B (zh) 小麦赤霉病抗性QTL Qfhb.sdau-6BL的KASP分子标记及其应用
Cota et al. Preliminary studies on microsatellite marker analysis of resistance to common bunt in several wheat genotypes (Triticum aestivum L.)
RU2486254C1 (ru) СПОСОБ ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ FAE1.1, КОНТРОЛИРУЮЩИХ СОДЕРЖАНИЕ ЭРУКОВОЙ КИСЛОТЫ В МАСЛЕ СЕМЯН РАПСА, С ПОМОЩЬЮ dCAPS-МАРКЕРОВ
Tena et al. Molecular Analysis of Genetic Diversity and Population Structure of Local Sugarcane Genotypes in Ethiopia
Jayanthi et al. Evaluation of SSRs (microsatellites) for detecting genetic variability in oil palm (Elaeis guineensis) clone
CN108660240B (zh) 与谷子脖长性状相关的snp标记及其检测引物和应用
CN107058590A (zh) 调控玉米单穗重主效qtl的分子标记及其应用方法