PL230884B1 - Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny - Google Patents

Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny

Info

Publication number
PL230884B1
PL230884B1 PL400718A PL40071812A PL230884B1 PL 230884 B1 PL230884 B1 PL 230884B1 PL 400718 A PL400718 A PL 400718A PL 40071812 A PL40071812 A PL 40071812A PL 230884 B1 PL230884 B1 PL 230884B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
plasmid
plasmids
mobilized
pctx
seq
Prior art date
Application number
PL400718A
Other languages
English (en)
Other versions
PL400718A1 (pl
Inventor
Michał DMOWSKI
Michał Dmowski
Izabela KERN-ZDANOWICZ
Izabela Kern-Zdanowicz
Original Assignee
Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Instytut Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Lkb Biotech Violetta Kochmanska I Marek Welnicki Spólka Jawna
Lkb Biotech Violetta Kochmańska I Marek Wełnicki Spółka Jawna
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, Instytut Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk, Lkb Biotech Violetta Kochmanska I Marek Welnicki Spólka Jawna, Lkb Biotech Violetta Kochmańska I Marek Wełnicki Spółka Jawna filed Critical Inst Biochemii I Biofizyki Polskiej Akademii Nauk
Priority to PL400718A priority Critical patent/PL230884B1/pl
Priority to PCT/IB2013/058368 priority patent/WO2014037917A1/en
Publication of PL400718A1 publication Critical patent/PL400718A1/pl
Publication of PL230884B1 publication Critical patent/PL230884B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/64—General methods for preparing the vector, for introducing it into the cell or for selecting the vector-containing host
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

Wynalazek dotyczy plazmidu pomocniczego do mobilizacji, który obejmuje część mobilizującą systemu koniugacyjnego plazmidu pCTX-M3 (geny regionów tra i trb) oraz szczepu bakteryjnego do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy zawierającego wintegrowaną w chromosom bakteryjny część mobilizującą systemu koniugacyjnego (geny regionów tra i trb). Wynalazek dotyczy również systemów do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy obejmujących ten plazmid albo szczep bakteryjny oraz plazmid mobilizowany zawierający oriT o sekwencji nukleotydowej kompatybilnej z tym systemem.

Description

Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku są plazmidy pomocnicze do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy, szczepy bakteryjne do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy zawierające wintegrowaną w chromosom bakteryjny część mobilizującą systemu koniugacyjnego, system do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy obejmujący ten plazmid lub szczep bakteryjny oraz plazmid mobilizowany zawierający oriT o sekwencji nukleotydowej współdziałającej z tym systemem ich zastosowania oraz zestaw molekularny je zawierający.
Plazmid pCTX-M3 został wyizolowany z klinicznego szczepu Citrobacter freundii w Polsce w 1996 roku jako wektor przenoszący gen blacTx-M-3, kodujący nowoodkrytą β-laktamazę o rozszerzonym spektrum substratowym typu CTX-M (Gniadkowski i wsp., 1998, Antimicrob. Agents Chemother., 42:827-832). Wkrótce został on jeszcze znaleziony w 15 ośrodkach szpitalnych w Polsce w 7 różnych gatunkach bakterii Enterobacteriaceae: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Serratia marcescens i Salmonella enterica (Baraniak i wsp., 2002, Antimicrob. Agents Chemother., 46:151-159). Wykazano również, że plazmid pCTX-M3 ma bardzo szeroki zakres gospodarzy i ulega replikacji w przedstawicielach α-, β- i γ- Proteobacteria (Mierzejewska i wsp., 2007, Plasmid, 57:95-107). W optymalnych warunkach co dziesiąta komórka E. coli niosąca plazmid pCTX-M3 może stać się jego dawcą w czasie koniugacji (Gołębiewski i wsp., 2007, Antimicrob. Agents Chemother., 51: 3789-3795), co więcej, transfer koniugacyjny tego plazmidu jest możliwy, choć z niską częstością, także z komórek Agrobacterium tumefaciens (a-Proteobacteria) do E. coli (γ-Proteobacteria) (M. Gołębiewski, dane niepublikowane).
Sekwencja nukleotydowa plazmidu pCTX-M3 została ustalona, opisana i zdeponowana w banku genów GenBank pod numerem akcesyjnym AF550415. Plazmid ten niesie pojedynczy replikon typu IncL/M i koduje system koniugacyjny, którego geny są zlokalizowane w dwóch regionach tra i trb, a ich białkowe produkty wykazują podobieństwo od 30 do 60% do białek kodowanych w plazmidzie Collb-P9 z rodziny Incll (dotąd słabo zbadana grupa systemów koniugacyjnych T4BSS), charakteryzującej się wąskim zakresem gospodarzy. Transfer koniugacyjny to zjawisko powszechnie występujące wśród bakterii, odpowiedzialne za ich szybką zmienność, a także kluczowe w horyzontalnym rozprzestrzenianiu się genów w biosferze. Polega ono na przekazaniu odpowiednio przygotowanego DNA z komórki dawcy do komórki biorcy po tym, jak nastąpi między nimi bezpośredni fizyczny kontakt i utworzy się między nimi struktura zwana mostem koniugacyjnym. Posiadanie plazmidu koniugacyjnego lub transpozonu koniugacyjnego jest warunkiem koniecznym dla komórki bakterii do tego, żeby została dawcą w procesie koniugacji. Efektem transferu koniugacyjnego pomiędzy dawcą i biorcą jest powstanie transkoniugantów, komórek biorcy wzbogaconych o cechy kodowane przez DNA otrzymany od dawcy. Należy przy tym podkreślić, że DNA plazmidu przekazywanego drogą koniugacji „ucieka” działaniu systemu restrykcji biorcy, a co więcej, również duże plazmidy są tą drogą bardzo efektywnie przenoszone.
Kluczową funkcję w transferze koniugacyjnym pełnią białka uczestniczące w przygotowaniu DNA i utworzeniu pary koniugacyjnej dawcy z biorcą. W przypadku plazmidów koniugacyjnych, przygotowanie DNA do transferu zapewniają białka o funkcjach Dtr (ang. Dna transfer and replication): relaksaza/helikaza nacinająca jedną z nici DNA w rejonie oriT (ang. origin of conjugal transfer), białka pomocnicze, a także białko łącznikowe (ang. Coupling Protein), tworzące kompleks relaksosomu. Do utworzenia pary koniugacyjnej potrzebne są białka o funkcjach Mpf (ang. Mating pair formation), u bakterii Gram ujemnych odpowiedzialne za utworzenie pilusa, który łączy komórkę dawcy z biorcą.
Geny kodujące białka transferu koniugacyjnego zorganizowane są w wielogenowe operony, często z rozdzieleniem funkcji Dtr i Mpf np. w plazmidach z grupy IncP czy IncW. Białka mające funkcje Dtr są plazmidowo-specyficzne - przecinają nić tylko danego plazmidu, natomiast funkcje Mpf mogą być wykorzystywane przez współwystępujące w komórce bakterii plazmidy mobilizowalne, kodujące tylko funkcje Dtr i oriT. Minimalnym wymaganiem do tego, żeby plazmid mógł zostać zmobilizowany do transferu i przekazany komórce biorcy, czyli być plazmidem mobilizowanym, jest obecność samej sekwencji oriT. W takiej sytuacji plazmid pomocniczy, czyli mobilizujący, musi kodować białka odpowiedzialne za obie funkcje: Mpf i Dtr. Współdziałanie tych dwóch maszynerii - Mpf i Dtr zapewnia białko łącznikowe, które jest ATPazą, również kodowane w plazmidzie pomocniczym.
PL 230 884 Β1
Jak wykazano w dotychczas prowadzonych badaniach, geny systemu koniugacyjnego plazmidu pCTX-M3 są zlokalizowane w dwóch odległych od siebie rejonach (Gołębiewski i wsp., 2007, Antimicrob. Agents Chemother., 51: 3789-3795). Co więcej, poza wspomnianym plazmidem Collb-P9 i R64 z rodziny Incll, oraz plazmidów o identycznym „szkielecie” plazmidowym (pEL60 i pCTX360), geny te nie wykazują istotnej homologii do sekwencji mających przypisane funkcje, zgromadzonych w publicznych bazach danych (I. Kern-Zdanowicz i M. Gołębiewski, dane niepublikowane). O ile geny kodujące systemy koniugacyjne pCTX-M3 i Collb-P9 (Incll), wykazują podobieństwo i w obrębie rejonów większość genów ma w obu plazmidach podobną kolejność, to całe rejony tra i trb mają względem siebie różną lokalizację. Co więcej, plazmid pCTX-M3 potrafi, choć z niską częstością, mobilizować plazmidy zawierające heterologiczne oriTcoiib-P9 i vice versa, plazmid z oriTPcTx-M3jest mobilizowany przez plazmid pochodny Collb-P9 (I. Kern-Zdanowicz i M. Gołębiewski, dane niepublikowane). Mimo podobieństwa regionów tra i trb, geny kodowane w rejonie wiodącym (ang. leading region) czyli te, które jako pierwsze wchodzą do komórek biorcy, są w pCTX-M3 i Collb-P9 różne (z wyjątkiem dwóch genów, kodujących Ssb - single stranded DNA binding protein oraz białka antyrestrykcji). Pierwszym genem w rejonie wiodącym pCTX-M3 jest orf35 (Gołębiewski i wsp., 2007, Antimicrob. Agents Chemother., 51: 3789-3795). Gen ten ma podobną długość, lokalizację i kierunek transkrypcji do genów kilku plazmidów, szczególnie tych o szerokim spektrum gospodarza. Według naszych niepublikowanych danych, hipotetyczny produkt tego genu wykazuje niską homologię do białka MobC z plazmidów z grupy IncQ i jest odległym homologiem białka TraK z plazmidu RP4, kodującego białko pomocnicze kompleksu relaksazy (Ziegelin i wsp., 1992, J. Biol. Chem., 267:17279-17286). W plazmidach o szerokim zakresie gospodarzy, takich jak R46 z IncN, R388 z IncW, RK2 (RP4) z IncP-1, czy NAH7 z IncP-9, w ich rejonie wiodącym znajduje się trójgenowy operon, tzw. operon wiodący (ang. leading operon). Wyniki badań przeprowadzonych na plazmidzie NAH7 z Pseudomonas putida pokazują, że operon wiodący traDEF bierze udział w modulacji zakresu biorcy (Miyazaki i wsp., 2008, J Bacteriol., 190:6281-6289). W innych plazmidach o szerokim spektrum gospodarzy, takich jak np. RSF1010 z IncQ jest tylko jeden, gen mobC (Meyer, 2009, Plasmid, 62:57-70), podobnie jak w rejonie wiodącym plazmidu pCTX-M3.
Systemy transferu koniugacyjnego pozwalają na wydajne wprowadzenie z komórek dawcy do komórek biorcy każdego plazmidu niosącego specyficzną dla tego systemu sekwencję oriT.
W plazmidzie pCTX-M3 oriT (oriTpctx-m3) jest to fragment o długości o długości 106 bp (par zasad), który został przedstawiony na SEKW. ID. NR 1. Sekwencja οπΤΡοτχ-Μ3 obejmuje zarówno miejsce cięcia DNA przez nikazę czyli tzw. „nick site”, jak i region nic, w którym oddziałują białka kompleksu Dtr. Klonując oriTPcTx-M3do dowolnego plazmidu replikującego się w komórkach dawcy, można uzyskać plazmid mobilizowany przez system koniugacyjny plazmidu pCTX-M3 i za jego pomocą wprowadzić do komórek biorcy geny kodujące wybrane cechy.
Plazmidy zdolne do transferu koniugacyjnego, których biorcami mogą być bakterie należące do różnych grup taksonomicznych są interesującym obiektem do konstrukcji narzędzi biotechnologicznych, służących np. do wprowadzania plazmidów do „trudnych” szczepów bakterii. Plazmidem służącym do takiego celu jest plazmid z grupy IncP - plazmid RK2 (nazwany też RP4), którego system koniugacyjny jest przyporządkowany do dobrze scharakteryzowanej grupy T4ASS. Plazmid ten ma wielkość ok. 60 tys. pz. i determinuje oporność na tetracyklinę, ampicylinę i kanamycynę. Jest przy tym zdolny do replikacji w szerokim spektrum bakterii. Plazmid RK2 jest zdolny do mobilizowania plazmidów niosących oriTRK2, a biorcami plazmidów w takim transferze koniugacyjnym bądź mobilizacji mogą być nie tylko bakterie Gram ujemne, ale też Gram dodatnie (Poyart i Trieu-Cuot, 1997, FEMS MicrobioL, 156, 193-198). Opisano też transfer koniugacyjny przy pomocy RK2 do drożdży Saccharomyces cerevisiae (Bates i wsp., 1998, J. Bacteriol., 180:6538-6543) oraz komórek ssaczych (Waters, Naturę Genet., 2001,29:375-376).
Przy konstrukcji narzędzia do mobilizacji plazmidów, plazmid RK2 został w całości, łącznie z replikonem i genami warunkującymi oporność, wprowadzony do chromosomu bakterii E. coli przy pomocy faga Mu (Simon i wsp., 1983, Naturę Biotechnology, 1:784-791). System ten sprawnie mobilizuje plazmidy niosące oriTrk2 do transferu koniugacyjnego. Niestety wadą tego systemu jest wycinanie się z pewną częstością plazmidu z chromosomu, co więcej plazmid ten jest zdolny do dalszej koniugacji. Kolejną wadą tego systemu jest zdolność do mobilizacji z częstością rzędu 10 4 również
PL 230 884 Β1 chromosomu bakterii, w który został wintegrowany. W bakteriach, które są biorcami w takim transferze, może powodować to liczne, niepożądane zdarzenia rekombinacyjne. Modyfikacja, powodująca uszkodzenie rejonu nic, w obrębie ohTrk2, sprawia, że obecny w chromosomie bakterii RK2, nie może już mobilizować chromosomu do transferu (Babic i wsp. 2008, Res Microbiol, 159: 545-549). Jednak wada, polegająca na możliwości wycinania się plazmidu z chromosomu nie została usunięta. Ponadto, trzeba podkreślić, że plazmid obecny w chromosomie niesie komplet swoich genów, w tym geny determinujące oporność na wspomniane powyżej antybiotyki.
System oparty na wintegrowanym do chromosomu plazmidzie RK2 wykorzystano do zaproponowania terapii antybakteryjnej polegającej na zmobilizowaniu do transferu koniugacyjnego plazmidu niosącego gen kodujący kolicynę E3 czyli rybonukleazę tnącą 16SrRNA. W badaniach tych wyleczono z infekcji myszy mające oparzenia zakażone Acinetobacter baumanii (Shankar i wsp, 2007, Journal of Bum Care and Reasearch, 28:16-12).
Celem wynalazku jest więc dostarczenie nowych plazmidów, bakterii i systemów do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy pozbawionych wad występujących w istniejących systemach do mobilizacji plazmidów i zapewniających wydajną mobilizację do szerokiej grupy bakterii biorców.
Wynalazek oparty jest na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że możliwa jest skuteczna zmiana konstrukcji znanego plazmidu pCTX-M3 i uzyskanie nowych plazmidów, szczepów bakteryjnych i opartych na nich systemów do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy. Takie plazmidy pochodne pCTX-M3, pozbawione są czynników patogennych i są niezdolne do transferu koniugacyjnego. Ponadto wynalazek oparty jest na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że uzyskane plazmidy pochodne pCTX-M3 pozbawione orf35, którego obecność ze względu na jego położenie w regionie wiodącym i ewentualną funkcję w stabilizacji plazmidu w biorcy, wydawała się konieczna dla mobilizacji wykazują dodatkową, zwiększoną zdolność do mobilizacji plazmidów niosących oriTpcTx-M3. Taki plazmid, szczep bakteryjny i oparty na nich system do wydajnej mobilizacji plazmidów według wynalazku pozbawiony jest większości genów determinujących oporności na antybiotyki, jak również mobilnych elementów genetycznych, takich jak sekwencje IS i transpozony, dzięki temu są one stabilne strukturalnie i nie prowadzą do niekontrolowanych zjawisk rekombinacyjnych w gospodarzu bakteryjnym. Ponadto uzyskany plazmid, szczep bakteryjny i oparty na nich system według wynalazku zostały tak przygotowane, że zawierają niemniejszy zestaw genów niezbędnych do wytworzenia sprawnego systemu koniugacyjnego, a mniejsze rozmiary w porównaniu z kompletnym plazmidem pCTX-M3 ułatwiają ewentualne manipulacje w obrębie jego sekwencji, jak również ułatwiają wprowadzanie takiego plazmidu do komórek gospodarza (duże plazmidy trudno wprowadzić drogą transformacji). Taki plazmid, szczep bakteryjny i oparty na nich system niesie oriTpcTx-M3 mut, czyli uszkodzone miejsce oriT, zatem kodując system koniugacyjny sam nie może takiemu transferowi ulec, nie może zatem rozprzestrzeniać się w niekontrolowany sposób, a pozostaje wyłącznie w komórkach dawcy.
Wynalazek dotyczy więc plazmidu pomocniczego do mobilizacji, który obejmuje część mobilizującą systemu koniugacyjnego tra i trb w obrębie nukleotydów od 34 do 23136 SEKW. ID. NR 2 i od 24740 do 29654 SEKW. ID. NR 2, korzystniej obejmuje nukleotydy od 34 do 29654 SEKW. ID. NR 2, i przy czym plazmid pomocniczy do mobilizacji nie koduje funkcjonalnego białka Orf35 z pCTX-M3. Taki plazmid korzystnie jest plazmidem pMOBS, którego sekwencja przedstawiona jest na SEKW. ID. NR 2.
Wynalazek dotyczy również szczepu bakteryjnego do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy zawierającego wintegrowaną w chromosom bakteryjny część mobilizującą systemu koniugacyjnego tra i trb w obrębie nukleotydów od 34 do 23136 SEKW. ID. NR 2 i od 24740 do 29654 SEKW. ID. NR 2, korzystniej zawiera wintegrowane nukleotydy od 34 do 29654 SEKW. ID. NR 2, i przy czym w takim szczepie nie powstaje funkcjonalne białko Orf35 z pCTX-M3.
Szczep bakteryjny korzystnie jest bakterią Gram ujemną wybraną z grupy składającej się z: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Serratia marcescens, Salmonella enterica.
PL 230 884 Β1
Szczep bakteryjny korzystnie jest szczepem E. coli, do którego część mobilizująca systemu koniugacyjnego została wintegrowana w miejsce attB chromosomu, korzystniej jest to szczep E. coli S14.
Wynalazek dotyczy również systemu do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy obejmującego plazmid według wynalazku i/lub szczep bakteryjny według wynalazku oraz plazmid mobilizowany zawierający oriT o sekwencji nukleotydowej która to sekwencja nukleotydowa zapewnia, że to oriT współdziała z tym systemem.
W korzystnym systemie oriT o sekwencji nukleotydowej, która to sekwencja nukleotydowa zapewnia, że to oriT współdziała z tym systemem jest οπΤΡοτχ-Μ3 lub oriTcoiibP9, korzystniej jest nim οπΤΡοτχ-Μ3 przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.
W korzystnym systemie plazmid mobilizowany zawiera replikon umożliwiający replikacjęwdawcy, korzystnie zawiera ογϊρμβι z pUC19, ohra3 z pRA3, ohpisa z pACYC184 lub oriPcTx-M3 z pCTX-M3.
Wynalazek dotyczy również zastosowania plazmidu pomocniczego według wynalazku, szczepu bakteryjnego według wynalazku oraz systemu zawierającego plazmid mobilizowany według wynalazku do wydajnej mobilizacji plazmidów do komórek biorcy, przy czym komórkami biorcy są bakterie Gram ujemne: a-Proteobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria oraz bakterie Gram dodatnie, szczególnie z klasy Bacilli.
Korzystnie w takim zastosowaniu plazmid mobilizowany zawiera οπΤΡοτχ-Μ3 lub oriTcoiib p?, korzystniej oriT przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.
W równie korzystnym zastosowaniu plazmid mobilizowany zawiera replikon umożliwiający replikację w dawcy, korzystnie zawiera οπρμβι z pUC19, ohra3 z pras, ohpisa z pACYC184 lub OriPcTx-M3 z pCTX-M3.
Wynalazek ponadto dotyczy zastosowania systemu według wynalazku do wprowadzania genów kodujących czynnik korzystny dla bakterii biorcy w specyficznym środowisku lub warunkach, w którym w koniugacji mobilizowane są plazmidy zawierające οπΤροτχ-Μ3 lub oriTcoiib p?, korzystniej zwierające oriT przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, przy czym na mobilizowanym plazmidzie zostaje do komórki dawcy wprowadzony czynnik umożliwiający jego rozwój w specyficznym środowisku lub warunkach, który to czynnik jest bezpieczny dla szczepu dawcy.
Wynalazek dotyczy również zastosowania systemu według wynalazku, do wprowadzania do szczepu biorcy w celu integracji z chromosomem biorcy sekwencji nukleotydowej wprowadzanej na mobilizowanym plazmidzie, w którym plazmid mobilizowany nie ulega replikacji, przy czym w koniugacji mobilizowane są plazmidy zawierające οπΤροτχ-Μ3 lub oriTcoiib p?, korzystniej zwierające oriT przedstawiony na SEKW. ID. NR 1, oraz mobilizowany plazmid obejmuje sekwencję integrującą do chromosomu biorcy. Korzystnie w takim zastosowaniu integracja z chromosomem biorcy sekwencji nukleotydowej prowadzona jest w celu przeprowadzenia mutagenezy transpozonowej, przy czym mobilizowany plazmid obejmuje sekwencję integrującą do chromosomu biorcy, którą jest sekwencja transpozonu.
Zestaw molekularny zawierający plazmid według wynalazku i/lub szczep bakteryjny według wynalazku i/lub system do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy według wynalazku jest również objęty zakresem niniejszego wynalazku .
Termin „funkcjonalny odpowiednik sekwencji nukleotydowej” oznacza sekwencję nukleotydową, która koduje produkty zawierające identyczną lub wysoce podobną sekwencję aminokwasową lub nukleotydową do sekwencji kodowanych przez wyjściową sekwencję nukleotydową, której sekwencja nukleotydowa została zmieniona np. przez podstawienie, zastąpienie, delecję czy insercję tak, że nie zmienia to zasadniczo aktywności produktów kodowanych przez te sekwencje nukleotydowe.
Wykorzystując geny transferu koniugacyjnego z plazmidu pCTX-M3, wytworzony został wydajny system do mobilizacji według wynalazku, który umożliwia wprowadzanie z komórek bakterii Gram ujemnych z grupy α-, β-, lub γ-Proteobacteria np. Escherichia coli plazmidu zdolnego do replikacji w komórkach dawcy i/lub biorcy i zawierającego οπΤΡοτχ-Μ3 do komórek biorcy, którymi mogą być bakterie Gram ujemne: α-Proteobacteria jak np. Agrobacterium tumefaciens, β-Proteobacteria np. Ralstonia eutropha, γ-Proteobacteria jak np. Pseudomonas putida czy enterobakteriijak np. E. coli oraz bakterie Gram dodatnie z klasy Bacilli jak np. Lactococcus lactis.
PL 230 884 Β1
W jednym z wykonań wynalazku geny kodujące system koniugacyjny są zlokalizowane na plazmidzie pMOBS. Jest on pochodną pCTX-M3, pozbawioną niesionych przez ten plazmid genów warunkujących oporność na antybiotyki, genów ruchomych elementów genetycznych takich jak IS czy transpozony, a zawierającą geny tra i trb, lecz pozbawioną genów orf35 i orf46 (Przykład 3). Plazmid pMOBS zawiera zestaw genów niezbędnych do wytworzenia sprawnego systemu koniugacyjnego który obejmuje nukleotydy od 34 do 23136 SEKW. ID. NR 2 i od 24740 do 29654 SEKW. ID. NR 2 tworzących moduły tra i trb (Fig. 1). Ze względu na mutacje wprowadzone do sekwencji nic w plazmidzie pMOBS (oriTpcTx-M3-mut jest niefunkcjonalny), plazmid ten jest niezdolny do transferu koniugacyjnego, ale pełni rolę plazmidu pomocniczego w transferze koniugacyjnym. Jak wykazano w Przykładzie 4 częstość mobilizacji plazmidu niosącego οπΤροτχ-μ3 w obecności plazmidu pMOBS jako plazmidu pomocniczego jest 1000-krotnie wyższa niż w obecności plazmidu pCTX-M3.
W innym z wykonań wynalazku geny kodujące system koniugacyjny (moduły tra i trb, Fig. 1) są zlokalizowane w chromosomie bakterii. W Przykładzie 4 przedstawiono częstość mobilizacji plazmidu niosącego oriTPcTx-M3W szczepie E. coli S14 w którym moduły tra i trb znajdują się w miejscu integracji faga λ. W tym przypadku częstość mobilizacji jest ok. 10-krotnie wyższa niż w obecności plazmidu pCTX-M3.
W obu wykonaniach systemu według wynalazku na plazmidzie, który ma zostać przekazany do komórek biorcy jest zlokalizowany οπΤροτχ-μ3. Ponadto, geny potrzebne do mobilizacji tego plazmidu pozostają w komórce dawcy i nie są przekazywane do komórki biorcy w procesie koniugacji / mobilizacji.
Na plazmidzie mobilizowanym, niosącym oriTPcTx-M3mogą być sklonowane geny, których funkcje można badać w komórkach gospodarza, do którego został on wprowadzony (Przykład 5 i 6). Zaletą tego systemu jest możliwość wprowadzania plazmidów do bakterii drogą, która pozwala na uniknięcie systemu restrykcji, działającego w każdej komórce bakteryjnej. Należy podkreślić, że w obu z wykonań systemu według wynalazku, geny kodujące elementy systemu transferu koniugacyjnego nie mogą być przekazane do komórek biorcy, a wprowadzany plazmid, niosący οπΤΡοτχ-Μ3 nie może się samodzielnie dalej rozprzestrzeniać wśród bakterii.
Kolejną zaletą jednej z wersji systemu według wynalazku, w którym informacja genetyczna umożliwiająca koniugację jest zlokalizowana w chromosomie bakterii (chromosomalna lokalizacja genów transferu koniugacyjnego) jest brak możliwości wycinania się plazmidu w komórkach dawcy, jak to ma przykładowo miejsce w systemach opartych na wintegrowanym plazmidzie RK2. Wprowadzenie informacji genetycznej umożliwiającej koniugację do chromosomu bakterii również nie powoduje zawężenia wyboru plazmidu mobilizowanego ze względu na jego replikon (unika się niezgodności plazmidów). W systemie według wynalazku z chromosomalną lokalizacją genów transferu koniugacyjnego, podczas wytwarzania szczepów bakteryjnych będących jego częścią, do chromosomu bakterii, która potem będzie dawcą, wprowadzany jest wyłącznie fragment plazmidu pMOBS, kodujący geny tra-trb pCTX-M3, oraz gen cat niezbędny do selekcji integrantów. Co więcej, tak uzyskany szczep bakterii można poddać jeszcze dalszej modyfikacji, która polega na usunięciu z chromosomu genu cat. Zatem powstały szczep może być całkowicie pozbawiony wprowadzonego genu warunkującego oporność na chloramfenikol.
Przygotowane systemy do koniugacji i narzędzia biotechnologiczne powstałe na ich bazie można wykorzystać w wielu aspektach, przykładowo do: a) do wprowadzania plazmidów niosących odpowiedni oriT do różnych biorców, których transformacja z różnych powodów jest niemożliwa (np. do szczepów klinicznych lub szczepów środowiskowych); b) do przygotowywania i prowadzenia terapii typu BCBT, opartej na zjawisku koniugacji bakterii (ang. Bacterial conjugation based therapy) a polegającej na wprowadzaniu na plazmidzie mobilizowanym czynnika, który będąc bezpieczny dla dawcy prowadzi do śmierci komórki biorcy (Filutowicz i wsp., 2008, Plasmid 60:38-44); czynnikiem takim mógłby być gen kodujący truciznę (np. z plazmidu pSM19035) z systemu trucizna-odtrutka, który w biorcy, w nieobecności odtrutki prowadziłby do śmierci, natomiast dawcę przed działaniem trucizny zabezpieczałby wprowadzony gen odtrutki, c) do wprowadzania w aktywny, kontrolowany sposób genów kodujących czynniki, które mogą być korzystne dla bakterii, które są niepodatne na transformację, w specyficznym środowisku lub warunkach lub w sytuacji, gdy wprowadzenie tych czynników w inny sposób może być
PL 230 884 Β1 utrudnione (np. zastosowanie do wytwarzania szczepów wykorzystywanych w utylizacji np. przy oczyszczaniu ścieków, wprowadzanie genów oporności na metale ciężkie, genów rozkładu związków toksycznych takich jak fenol, toluen, dimetyloformamid itp.), d) do wprowadzania do biorcy, w którym plazmid mobilizowany nie ulega replikacji, genów, które miałyby zostać zintegrowane z jego chromosomem, w tym do mutagenezy transpozonowej (Simon i wsp., 1983, Naturę Biotechnology,1:784-791) z zastosowaniem różnych transpozonów, takich jak_Mu czy pochodne Tn3, Tn5 lub Tn7 (Choi i Kim, 2009. J. Microbiol. Biotechnol., 19:217-28).
Cytowane w opisie publikacje oraz podane w nich odniesienia są w całości niniejszym włączone jako referencje.
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Fig. 1 obrazuje graficzne przedstawienie modułów tra i, trb, wykorzystanych w przedstawionych przykładach. Koordynaty przy blokach ilustrujących rejony tra i trb odpowiadają tym z SEKW. ID. NR 2.
Fig. 2 przedstawia schemat klonowania skrajnych fragmentów modułów tra i trb plazmidu pCTX-M3 w pochodnej wektora pLDRIO zawierającej region attP (niezbędny do integracji do chromosomu) i utworzenie plazmidu pLDAB, prekursora plazmidu pLMAB212 (pokazanego na Fig. 3).
Fig. 3 przedstawia schemat bloków sekwencji, z których złożony jest plazmid pLMAB212 (zawiera oriTPcTx-M3), z którego został przygotowany plazmid pMOBS (zawiera oriTPcTx-M3-mut).
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
Przykłady
W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody opisane w Sambrook J. et al, „Molecular Cloning: A Laboratory manuał, 2nd edition. 1989. Cold Spring Harbor, N.Y. Cold Spring Harbor laboratory Press” lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod. W szczególności w podanych przykładach wykorzystano szczepy Escherichia coli DH5a [F~(<I>80dlacZAlVI15) recA1 endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17(rk'mk+) supE44 relA1 deoR J(/acZYA-argF)U196] (Hanahan, 1983), Escherichia coli JE2571 RifR (leu thr thi lacY thy pil fla) (Bradley 1980), Pseudomonas putida KT2442 (RifR) (otrzymany C.M. Thomasa, Birmingham, Wielka Brytania), Agrobacterium tumefaciens LBA1010 RifR (otrzymany od D. Bartosika, Instytut Mikrobiologii, Uniwersytet Warszawski), Ralstonia eutropha 7MP228r (otrzymany od K. Smalli, Braunschweig, Niemcy). Hodowle bakteryjne prowadzono w podłożu LB (Kahn i wsp. 1979) lub na podłożu LB zestalonym 1,5% agarem w temperaturze 30°C, 37°C lub 42°C (Diederich i wsp. 1992, Sambrook i wsp. 1989). W określonych przypadkach podłoża uzupełniano antybiotykami: chloramfenikol 10 μg ml·1, kanamycyna 50 μg ml·1, rifampicyna 100 μg ml·1 i tetracyklina 20 μg ml·1. Izolację plazmidowego DNA wykonywano przy użyciu odpowiednich zestawów (A&A Biotechnology, Promega); reakcję PCR, mutagenezę ukierunkowaną i transformacje bakterii prowadzono standardowymi metodami (Sambrook i wsp. 1989). Enzymy restrykcyjne i modyfikujące stosowane zgodnie z zaleceniami producentów i stosowano odpowiednio produkty firm Fermentas, Roche oraz Kucharczyk TE.
Spis wykorzystanych plazmidów i uzyskanych sposobami przedstawionymi w poniższych przykładach plazmidów przedstawiono w Tabeli 1.
PL 230 884 Β1
Tabela 1
Przedstawia spis plazmidów wyjściowych wykorzystanych w przykładach wykonania oraz uzyskane z nich plazmidy pochodne
Plazmid Najważniejsze cechy Źródło
Wektory i inne wykorzystane plazmidy
pCTX-M3 Gołębiewski i wsp., 2007, Antimicrob. Agents Chemother., 51:37893795
pCTX-M3 orf 35::cat pochodna pCTX-M3 zawiera gen cat zamiast orf35 M. Gołębiewski
pCTX-M3 orf46::cat pUC 18 pochodna pCΤΧ-Μ3 zawiera gen cat zamiast orf46 M. Gołębiewski wektor do klonowania οπρμβι, Apr Vieira i Messing, 1982, Gene, 19:259-268
pUC19 wektor do klonowania oripMBb Apr Vieira i Messing, 1982, Gene, 19:259-268
pLDRIO wektor do integracji w attP, Apr, Cmr Diederich i wsp. 1992, Plasmid 28:14-24
pLDR8 plazmid pomocniczy do integracji, gen integrazy Diederich i wsp. 1992, Plasmid 28:14-24
pACYC184 wektor do klonowania oriPi5A, Tcr, Cmr Chang i Cohen, 1978, J Bacteriol. 134: 11411156.
pET28A pOriT wektor do klonowania Kmr Novagen oriTcrx-M3 (31616-31721) w wektorze pMI3 - οπρμβι, Cmr. M. Gołębiewski
pBBRlMCS-2 pABB19 wektor do klonowania, oripBBRi, oriTRK2, Kmr Koyach i wsp. 1995 wektor, oripMBi, Apr Bartosik i wsp. 2012 J Microbiol Methods, 158:1183-1195
pABB20 wektor, oriRA3? Kmr Bartosik i wsp. 2012 J Microbiol Methods, 158:1183-1195
pBSUlOO pochodna pAT28, oripMBi, οπΡΛΜβΐ, Spcr Apr Aymanns i wsp., 2011 PLoS One, 6:el9822 Plazmidy do składania tra trb
PUCA0118 fr. pCTX-M3 (31285-32022) amplifikowany starterami FtraHind i RtraPst (Hindllł, Pstl), sklonowany w Hindlll-Pstl pUC18
pUCA0218 fr. pCTX-M3 (52154-54408) amplifikowany starterami FtraSal i RtraXba (Sali, Pstl). sklonowany w Sall-Xbal pUC18
pUCA0318 pochodna pUCAOl 18 z podstawieniami w sekwencji nic wprowadzonymi starterami FnicM i RnicM
pUCA3218 fr. KpnI-Sall pUCA0218 sklonowany w pUCA0318 KpnI-Sall
pUCB0219 fr. pCTX-M3 (87807-89020) amplifikowany starterami FtrbNco-RtrbEco (Sad, EcoRI), sklonowany w Sacl-EcoRT pUC19
PL 230 884 Β1
pUCB0318 fr. pCTX-M3 orf46: :cat (83021-85053) amplifikowany starterami LtrbXba i RtrbBam, sklonowany w Smal pUC18
pUCB3219 pUCB32!9B fr. Sall-KpnI pUCBO318 sklonowany w pUCB0219 Sall-Kpnl pochodna pUCB32!9? usunięty fr. Bspl407I (1543-1729)
pLDl pLDB pLDAB pB$3-l pLMAB2 pochodna pŁDRIO, usunięty fr. BsmI (1713-2120) fr. EcoRI-BamHI pUCB32l 9B sklonowany w EcoRI-BamHI pLDl fr HindTH-BamHI pUCA3218 sklonowany w HindlU-BarnHI pLDB Pochodna pCTX-M3 Bstl 1071-StuI (54309-57986), minireplikon, Apr fr. pBS3-l (3624-2152) zaw. replikcn pCTX-M3, amplifikowany starterami LRepCM i RepANB2 (Notl), sklonowany w Not! pLDAB
pSN17 pLMAB202 pochodna pCTX-M3 orf46::cat, fr. Ndel-SphI (53187-59797) i SphT-Ndel (80753-626) fr. Bspl407I pSN17 (11410-14854; 84420-87864 w pCTX-M3) sklonowany w Bspl407I pLMAB2
pSS29 pLMAB212 pochodna pCTX-M3, Swal-SalJ (30630-59552) i Sall-Swal (64145-64426) fr. AatH-Nhel pSS29 (729-21542; 31362-52175 w pCTX-M3) sklonowany w Aatll-Nhel pLMAB202
pAL-AS14 fr. pLMAB212 (92-359) amplifikowany starterami FAatH i RnicSpe, sklonowany w Smal pAL3
pAL-SP3 fr. pLMAB212 (356-1622) amplifikowany starterami FnicSpe i RPshAI, sklonowany w Smal pAL3
pALAP pALAPKl fr. Spel-Pstl pAL-SP3 sklonowany w Spel-Pstl pAL-AS14 fr. pET28a+ (3943-4832), zawiera gen oporności na kanamycynę, amplifikowany starterami FKanSpeż i RKanSpe (Spel), sklonowany w Spel pALAP
pMOBSK pMOBS fr. Aatll-PshAl pALAPKl sklonowany w pLMAB212 AatH-PshAl pochodna pMOBSK, usunięty fr. Spel-Spel z genem oporności na kanamycynę Plazmidy niosące oriT
pAL3 pALoriT pBBToriT fr. BstUI pUC18 zaw. gen lacZ i MCS sklonowany w ScaI-PvuII pACYC184 fr. EcoRl-Pstl pOriT zaw. oriTpcrx-M3 sklonowany w EcoRl-Psrl pAL3 (replikon pl5A) fr. Xbal-Pvul pALoriT zaw. gen oporności na tetracyklinę i oriTpcrx-M3 sklonowany w Pvul-Xbal pBBRlMCS-2 (replikon pBBRl) ”
pToriT pToiiTB pLMKoriT2 Pochodna pBBToriT, usunięty fr.Bsal-Bstl 1071 zawierający MOBro Pochodna pToriT, usunięty fr. BamHI BamHI z genem oporności na kanamycynę fr. pToriTB (2310^1127) amplifikowany starterami FKanAatH i oriTminDAatll zaw. gen oporności na kanamycynę i oriTpcrx-M3 (Aatll) sklonowany w AatU pBS3-l (replikon pCTX-M3)
pABB19oriT fr. BamHI-Pstl ρΟιίΤιηίη (181-293) zaw. oriTpcrx-M3 sklonowany w BamHI-Pstl pABB19 (replikon pMBl)
pABB20oriT fr. Hindlll (wypelnione)-BaniHI pABB19oriT (417-541) sklonowany w PvuII-BamHI pABB20 (replikon RA3)
pBSUoriT Fr. Pael-SacI pOriTmin zaw. oriTycrx-M3 sklonowany w Pael-SacI pBSUlOO (pochodna pAT28, replikon pMB 1 / ρΑΜβ 1)
PL 230 884 Β1
Statery stosowane w reakcjach PCR prowadzonych w poniższych przykładach przedstawione są w Tabeli 2.
Tabela 2
Przedstawia nazwę, sekwencję starterów stosowanych w reakcjach PCR i wykorzystaną w reakcji matrycę
Nazwa Sekwencja Matryca PCR
FtraHind Startery do składania tra trb CATACCCTTTCGAAGCTTTCAGC pCTX-M3
RtraPst CTCCTGCTGCAGTTTCTGTGC pCTX-M3
FnicM GTACGGGACAATATTGGTTTTTGGAGTACCGC pCJX-M3
RnicM CTCCAAAAACCAATATTGTCCCGTACTTAAATACC pCTXM3
FtraSal GCAGGGTCGACTTCTATCTTCGCTAGCGG pCTX-M3
RtraXba ACTCTCTCTAGAACTCCGGGTTAC pCTX-M3
FrrbXba AGATCTAGAAAACGTTGCTTAACGTGAG pCTX-M3 orf46; ;cat
RtrbBam TTCCAGGATCCCCTGGTACGCAGCGCAG pCTX-M3orf46::cat
FtrbNco (Sac) CGGTTGAGCTCGTCGAGAATGGATTTAGC pCTXM3
RtrbEco AATAGAATTCCTCTGACACCCTCTC pCTX-M3
FrepCNI GTGGCGGCCGCGTAAGAAACCATTATTATC pBS3-l
RrepANB2 TAGGCGGCCGCGGTCTCGCACCCCTGCCGTCTTACG pBS3-l
FAatll Startery do mutagenezy nic site TTCTGACGTCACATCAGGCAAGTCG pLMAB2!2
RnicSpe AACCGAACTAGTCCCGTACTTAAATACCTC PLMAB2I2
FKanSpe2 GAACTAGTCATGAACAATAAAACTGTCTGC pET28a+
RKanSpe AGACTAGTATCCGCTCATGAATTAATTC pET28a+
Fnic Spe GGACTAGTTCGGTTTTTGGAGTACCGCCGACAC pLMAB212
RPshAI GAAGACCGATGTCTGCAAATGTCTTATGC pLMAB212
FKanAatll Startery do kionowania Kan-oriT ATGGACGTCAGCTACTGGGCTATCTGG pToriTB
oriTminDAatll TTGGACGTCTGCAGAGATAGCTAACCTCGTTAGG pToriTB
orf35uEc Startery do sprawdzenia integracji TCG A ATTCGAC ATTATTGGG AGGGC
ybhB122 CTGGC AAGCGCCTCGATTAC
ybhC159 ACCAGGCGCGGTTTGATCAG
Przykład 1
Przygotowanie plazmidów do mobilizacji, niosących οπΤροτχ-Μ3
Przygotowano serię plazmidów do mobilizacji niosących ογϊΤροτχ-μ3. Plazmidy te różnią się przede wszystkim replikonem, a w konsekwencji również zakresem gospodarzy, w których te plazmidy mogą ulegać replikacji.
Fragment EcoRI-Pstl plazmidu pOriT sklonowano w wektorze pAL3, aby uzyskać plazmid pALoriT (replikon p15A). Z tego plazmidu przeniesiono też fragment Xbal-Pvul do plazmidu o szerokim zakresie gospodarzy pBBR1MCS-2, uzyskując plazmid pBBToriT, z którego następnie usunięto region mobilizacyjny plazmidu RK2 (BsaI-BstllO7I), uzyskując plazmid pToriT (replikon PBBrl). Plazmid pOriT posłużył też jako źródło οπΤροτχ-μ3 do klonowania w wektorze pABB 19 i uzyskania plazmidu pABB19oriT (replikon pMB1). Z tego plazmidu przeniesiono też fragment Hindlll (wypełnione lepkie końce)-BamHI do wektora pABB20 (w miejsce PvuII-BamHI) o szerokim zakresie gospodarzy uzyskując plazmid pABB20oriT (replikon RA3). W celu przygotowania matrycy do amplifikacji regionu oriTPcTx-M3zgenem oporności na tetracyklinę, z plazmidu pToriT usunięto fragment BamHI-BamHI usuwając w ten sposób gen kodujący oporność na kanamycynę. Z tak przygotowanej matrycy, przy użyciu starterów FKanAatll i oriTminDAatll amplifikowano fragment DNA, który sklonowano w miejscu Aatll plazmidu pBS3-1 (minireplikon pCTX-M3) uzyskując plazmid pLMKoriT2 (replikon pCTX-M3). Plazmid pBSUoriT otrzymano poprzez sklonowanie fragmentu Pael-SacI plazmidu pOriTmin w miejscu Pael-SacI plazmidu pBSU100.
PL 230 884 Β1
Przykład 2
Porównanie wydajności mobilizacji plazmidów niosących οπΤροτχ-Μ3
Porównano wydajność koniugacji E. coli DH5a niosących plazmidy pCTX-M3 albo pCTX-M3orf35::cat (plazmid pochodny pCTX-M3 z wprowadzonym genem cat w miejsce genu orf35) albo pCTX-M3orf46::cat (plazmid pochodny pCTX-M3 z wprowadzonym genem cat w miejsce genu orf46) do komórek biorcy E. coli JE2571 RifR. Ustalono, że wszystkie trzy plazmidy są przekazywane w transferze koniugacyjnym z taką samą wydajnością tzn. około 101, co oznacza, że co dziesiąta komórka została dawcą plazmidu.
Porównano zdolność do mobilizacji plazmidu pToriT (replikon PBBR1, οπΤΡοτχ-Μ3, TcR) przez komórki E. coli niosące plazmidy pCTX-M3 albo pCTX-M3orf35::cat albo pCTX-M3orf46::cat do komórek biorcy E. coli JE2571 RifR. Okazało się, że plazmid pToriT w obecności plazmidu pomocniczego pCTX-M3orF35:: cat jest mobilizowany z blisko 1000 razy wyższą częstością niż w obecności każdego z pozostałych dwóch plazmidów (odpowiednio ponad 101 vs poniżej 10 3). Zwiększoną częstość mobilizacji pToriT w obecności pCTX-M3orf35: mat w stosunku do pCTX-M3 obserwowano również wtedy, gdy biorcą były komórki A. tumefaciens.
W powyższym przykładzie wykazano, że pozbawienie genów kodujących system koniugacyjny plazmidu pCTX-M3 genu orf46 nie ma znaczenia dla mobilizacji, natomiast usunięcie orf35 podnosi jej wydajność 1000-krotnie.
Przykład 3
Wytworzenie plazmidu pMOBS, przygotowanie kasety genowej tra-trb do integracji do chromosomu oraz wytworzenie szczepu E. coli S14
Uzyskany końcowo plazmid pMOBS (SEKW. ID. NR 2), który posłużył do integracji do chromosomu bakterii regionów genowych tra i trb powstał w wyniku klonowania poszczególnych jego fragmentów uzyskanych poprzez amplifikację metodą PCR lub wycinanych z pochodnych pCTX-M3 (Fig. 2). Poniżej opisano poszczególne etapy prowadzące do uzyskania końcowego plazmidu pMOBS.
W pierwszym etapie, na matrycy pCTX-M3, przy użyciu par starterów FtraHind-RtraPst, FtraSal-RtraXba amplifikowano skrajne fragmenty regionu tra, które następnie sklonowane osobno w wektorze pUC18 w miejscach, odpowiednio Hindlll-Pstl i Sall-Xbal uzyskując plazmidy pUCA0118 i pUCA0218. Metodą mutagenezy ukierunkowanej, w sekwencji nic w plazmidzie pUCA0118, stosując startery FnicM i RnicM wprowadzono podstawienia nukleotydowe czyniące tę sekwencję niefunkcjonalną i uzyskano plazmid pUCA0318. Następnie, fragment KpnI-Sall pUCA0218 zawierający część regionu tra przeniesiono w miejsce KpnI-Sall plazmidu pUCA0318, uzyskując plazmid pUCA3218 zawierający dwie skrajne części regionu tra.
Równocześnie, na matrycy pCTX-M3, przy użyciu pary starterów FtrbNco-RtrbEco amplifikowano jeden ze skrajnych fragmentów regionu trb, który sklonowane w wektorze pUC19 w miejscu SacI-EcoRI. Drugi, skrajny fragment trb amplifikowano na matrycy pCTX-M3orf46: mat, przy użyciu starterów FtrbXba-RtrbBam i sklonowane w miejscu Smal plazmidu pUC18. Następnie, fragment Sall-KpnI plazmidu pUCB0318 przeniesiono w miejsce Sall-KpnI pUCB0219 uzyskując plazmid pUCB3219 zawierający dwie skrajne części regionu trb. W kolejnym kroku, aby umożliwić dalsze klonowania z pUCB3219 usunięto fragment (186 pz) pomiędzy miejscami Bspl407I.
Dalsze klonowania prowadzono w plazmidzie pLD1, pochodnej pLDR10 uzyskanej w wyniku usunięcia fragmentu pomiędzy miejscami BsmI, zawierającego gen warunkujący oporność na chloramfenikol. Najpierw w pLD1 sklonowane fragment EcoRI-BamHI plazmidu pUCB3219 (skrajne fragmenty trb), uzyskując plazmid pLDB, do którego wstawiono fragment Hindlll-BamHI pUCA3218 (skrajne fragmenty tra), uzyskując plazmid pLDAB (Fig. 2).
Przed sklonowaniem w pLDAB dużych fragmentów regionów tra i trb, usunięto z tego plazmidu fragment Notl-Notl zawierający wysokokopijny replikon Pmb1, a na jego miejsce wprowadzono niskokopijny replikon pCTX-M3 (οπΤροτχ-μ3) uzyskany poprzez amplifikację z użyciem starterów FrepCNI i RrepANB2 na matrycy minireplikonu pCTX-M3, czyli na plazmidzie pBS3-1.
PL 230 884 Β1
W ten sposób uzyskano plazmid pLMAB2, do którego wprowadzono środkowy, Bspl407IBspl407I fragment regionu trb, z plazmidu pSN17, uzyskując plazmid pLMAB202. Następnie, do tego plazmidu wprowadzono środkowy, Aatll-Nhel fragment regionu tra z plazmidu pSS29 uzyskując plazmid pLMAB212 wielkości 33614pz (Fig. 3).
Ponieważ plazmid pLMAB212 zawierał funkcjonalną sekwencję nic, przeprowadzono jego mutagenezę. W tym celu, przy użyciu par starterów FAatll-RnicSpe oraz FnicSpe-RPshAI, na matrycy pLMAB212 amplifikowano regiony ściśle sąsiadujące z sekwencją nic. Startery zostały zaprojektowane w taki sposób, aby wprowadzone podstawienia w sekwencji nic wprowadzały w tym miejscu sekwencję rozpoznawaną przez restryktazę Spel. Amplifikowane fragmenty klonowano osobno w plazmidzie pAL3, uzyskując odpowiednio plazmidy pAL-AS14 i pAL-SP3. Następnie, fragment Spel-Pstl plazmidu pAL-SP3 przeniesiono do pAL-AS14, uzyskując plazmid pALAP. Do tego plazmidu wprowadzono w miejsce Spel (czyli w zmodyfikowaną sekwencję nic) gen warunkujący oporność na kanamycynę uzyskany poprzez amplifikację przy użyciu starterów FKanSpe2 i RKanSpe na matrycy plazmidu pET28a+. Uzyskano w ten sposób plazmid pALAPKI, którego fragment Aatll-PshAI posłużył do wymiany odpowiedniego fragmentu wpLMAB212. Wprowadzenie genu oporności na kanamycynę do zmutowanej sekwencji nic umożliwiło selekcję odpowiednich transformantów i izolację plazmidu pMOBSK. W ostatnim etapie, z plazmidu pMOBSK usunięto fragment Spel-Spel (zawierający gen oporności na kanamycynę) uzyskując plazmid pMOBS (którego sekwencja przedstawiona jest na SEKW. ID. NR 2).
W celu wprowadzenia genów transferu koniugacyjnego do chromosomu E. coli DH5a w miejscu attB, z plazmidu pMOBS usunięto fragment Eco31I-Eco31I zawierający replikon οπΤΡοτχ-Μ3 oraz gen warunkujący oporność na ampicylinę. Następnie w cząsteczce wypełniono niekompatybilne lepkie końce, zligowano i takim DNA, zawierającym moduły genowe tra i trb niezbędne do mobilizacji, transformowano komórki E. coli zawierające plazmid pLDR8, niosący gen integrazy faga λ. Selekcję transformantów prowadzono zgodnie z zalecaną procedurą (Diederich i wsp. 1992, Plasmid, 28:14-24). Uzyskano w ten sposób szczep E. coli S14, a prawidłowość integracji potwierdzono przy użyciu PCR z parami starterów ybhC159-orf35UEc oraz FtrbNco-ybhB122.
W ten sposób wytworzono niskokopijny plazmid pMOBS, niosący geny tra i trb pCTX-M3 oraz replikon οπΡοτχ-Μ3, markerem do selekcji komórek niosących ten plazmid jest gen cat warunkujący oporność na chloramfenikol, który może być usunięty. Wychodząc od szczepu E. coli DH5a po wprowadzeniu genów tra i trb do jego chromosomu (z genem cat jako markerem selekcyjnym), uzyskano szczep E. coli S14 zdolny do mobilizowania plazmidów niosących οπΤροτχ-μ3.
Przykład 4
Porównanie wydajności mobilizacji plazmidu pToriT przez szczepy E. coli DH5a niosące plazmid pCTX-M3 albo plazmid pMOBS oraz szczep E. coli S14, zawierający geny tra-trb w chromosomie
Porównano wydajność mobilizacji plazmidu pToriT (plazmid niosący οπΤροτχ-μ3 o sekwencji przedstawionej na SEKW. ID. NR 1) przez szczepy E. coli DH5a niosące plazmid pCTX-M3 albo plazmid pMOBS oraz szczep E. coli S14, zawierający geny tra-trb w chromosomie do komórek biorcy E. coli JE2571 RifR. Ustalono, że w porównaniu ze szczepem niosącym pCTX-M3 (wydajność mobilizacji w przeliczeniu na 1 komórkę dawcy wynosi 10 3, tj. co tysięczna komórka niosąca plazmid jest dawcą plazmidu mobilizowanego), szczep niosący pMOBS mobilizuje z wydajnością blisko 1000 razy wyższą (blisko 10°), zaś szczep E. coli S14 z ponad 10 razy wyższą (10 2).
W przykładzie pokazano, że komórki niosące wytworzony plazmid pMOBS według wynalazku są zdolne do mobilizacji plazmidów z 1000-krotnie większą wydajnością niż pCTX-M3, natomiast wytworzony szczep E. coli S14, mobilizuje plazmidy 10-krotnie wydajniej niż pCTX-M3.
Przykład 5
Porównanie wydajności mobilizacji plazmidów niosących οπΤρστχ-Μ3Ζ różnymi replikonami
Porównano wydajności mobilizacji plazmidów opartych na różnych replikonach (ori). Uzyskane wyniki dla wydajności mobilizacji przedstawiono w poniższej Tabeli 3.
PL 230 884 Β1
Tabela 3
Zestawienie wydajności mobilizacji różnych replikonów przez różne szczepy dawców do różnych biorców
plazmid pABB19oriT pABB20oriT pALoriT pLMKoriT pToriT pBSUoriT
replikon pMB1 RA3 P15A incL/M pBBR1 pBBR1/pAMp1
Biorca Dawca
SM·
E coli E.coli DH5a(pMCBS) 100-10-1 ' 1Óo ..........
Wito Wisei β·»
A. tumefaciens E. coli S14 10-2 10-3-10-4
i·' .•'i r,L>-J, ®B! 'λΎ·4®>'£'Ί ; w 0¾ ϋβί WiS. W# w W |||| is es·
R. eutropha E. coli S14 10-3-10-4
I8i^ «Μ B·®»
L. lactis E. coli DH5a(pMQBS) 10-4-10-5
I tak plazmid pLMKoriT2 niesie replikon plazmidu pCTX-M3 - οπΡοτχ-Μ3, plazmid pABB19oriT niesie replikon wysokokopijnego wektora do klonowania pUC19 o wąskim zakresie gospodarza - οπρμβι, plazmid pToriT niesie replikon plazmidu pBBR1 o szerokim zakresie gospodarzy - oriPBBRi, plazmid pABB20oriT niesie replikon niskokopijnego plazmidu RA3 o szerokim zakresie gospodarzy - ohras, a plazmid pALoriT niesie ori p15A, replikon o średniej liczbie kopii i wąskim zakresie gospodarza. Wszystkie te plazmidy zawierały οπΤροτχ-μ3 warunkujące możliwość mobilizacji.
Badana była zdolność do mobilizacji tych plazmidów przez szczep E. coli S14 do komórek biorcy E. coli JE2571RifR. Wysokokopijny plazmid pABB19oriT był mobilizowany z częstością 10°, to znaczy każda komórka szczepu S14pabbi9oht została dawcą tego plazmidu. Plazmid pLMKoriT2 był mobilizowany z częstością ok. 5 χ 10 4, plazmid pToriT był mobilizowany z częstością 10 2—10 3, natomiast plazmid pABB20oriT był mobilizowany z częstością różniącą się w kolejnych eksperymentach od 5 χ 10 3 do 10°. Plazmid pALoriT w obecności plazmidu pomocniczego pMOBS był mobilizowany z częstością 10°—101. Jednocześnie, gdy plazmidy te nie niosły οπΤροτχ μ3, nie ulegały mobilizacji.
Plazmidy, do których została wprowadzona sekwencja oriTPcTx-M3 są mobilizowane przez szczep E. coli S14 z różną częstością, zależną od niesionego replikonu, dla wysokokopijnego plazmidu pABB19oriT sięgającą wydajności 10°.
Przykład 6
Badanie wydajności mobilizacji plazmidów niosących οπΤροτχ-Μ3 przez szczep E. coli S14 do przedstawicieli α-, β- i γ- Proteobacteria
Wykorzystano wytworzony w Przykładzie 3 szczep E. coli S14 do mobilizacji plazmidów niosących oriTPcTx-M3do przedstawicieli α-, β- i γ-Proteobacteria, odpowiednio Agrobacterium tumefaciens, Pseudomonas putida i Ralstonia eutropha. Plazmid pToriT (replikon pBBR1) był mobilizowany do A. tumefaciens z częstością 10 3—10 4, do R. eutropha 10 3—10 4, do P. putida 10 4. Plazmid pABB20oriT (replikon RA3) był mobilizowany do A. tumefaciens z częstością 10 2, a do P. putida nawet 101. Szczep E. coli S14 oraz DH5a z plazmidem pMOBS były wykorzystane do mobilizacji plazmidu pBSUoriT (replikon pMB1 w E. coli oraz ρΑΜβ1 w L. lactis) do L. lactis. W obu przypadkach plazmid pBSUoriT był mobilizowany z częstością 10 4—10 5 w przeliczeniu na jedną komórkę dawcy.
System koniugacyjny plazmidu pCTX-M3 jest zdolny do mobilizowania plazmidów do różnych bakterii Gram ujemnych należących do grupy α-, β- i γ-Proteobacteria, ale także do bakterii Gram dodatnich jak np. Lactococcus lactis.
Na poniższym wykazie sekwencji:
SEKW. ID. NR 1 przedstawia sekwencję nukleotydową oriTPcTx-M3
SEKW. ID. NR 2 przedstawia sekwencję nukleotydową uzyskanego plazmidu pMOBS
PL 230 884 Β1 <110> Instytut Biochemii i Biofizyki Polskiej Akademii Nauk <120> Plazmid pomocniczy, szczep i system o szerokim spektrum gospodarzy do mobilizacji plazmidów oraz ich zastosowania <130> PK/1670/AGR
<160> 2
<170> Patentln version 3.5
<210> 1
<211> 106
<212> DNA
<213> citrobacter freundii
<400> 1 agatagctaa cctcgttagg gggtgtcggg gcttgccctg accaagacgt ttttggacgg
ccgccgcgtg rcggcggtac tccaaaaaca catcrtgtcc cgtact
106 <210> 2 <211> 33614 <212> DNA <213> artificail <400> 2 aattctcatg tttgacagct tatcatcgat aagctttcag cttcttaatg tcagacttaa gttcatcgag tacgtgcttt ttctcaagcc tttctgacgt cacatcaggc aagtcgtcga gaatgctttt gaattttccg atgtcctcac tgctatagaa tgctttcttt tttgcaggca tatgccctcc caataatgtc aaaatcgacc atgcctaacc ggagaaaatc ggacaaggct attcaggtga ttttacatga tgcccggcat gattcaattg ctctgcctgc caggcccttc gctgctggca ttcaaacagc gccgatggta gaattcaatg aggtatttaa gtacgggact agttcggttt ttggagtacc gccgacacgc ggcggccgtc caaaaacgtc ttggtcaggg caagccccga caccccctaa cgaggttagc tatctgatga gccgtagcga gagcagaaaa acagacgatc gaatccaggt gagatgttcc acagaagtga aagctaaact caccgaaaag gcccatgaag cagggcttag tcttagtcaa tatcttatca aatctgggct tggaaagcgc attcaatcga aaggtaatta caatgcactt gccgctcttg taaagataac agcccttcaa aaacatctgt ttaacgaagg tgccggagtt catagcaagg agtattcaga gattctgatc gaggtcaaaa aggccgcaca gaaactgcaa caggagatgg atggtgatac ctaaaatcat tgagggccga agggacaaaa agtccagctt tggtcagctg attaagtaca tggcagacaa gccgtctcag gagttgactg atacagttca gcctactcct gagacggctt tagctgttaa atcggatatg ttcgaagggt taaacaatta cctgacccgt aagcagaaag tgatcagcac accggtggat gttgagccag gtgtacagcg tgttgtggtt ggtgatgtta cctgccagta caataccttc tcgctcgatg gtgcagcaca ggaaatgaat tcagtttctc agcaaagcac acgctgtaaa gatccagtta tgcactatgt tctttcatgg cctgactatg aaaagccgaa tgatgatcag gttttcgatt cggtgaagtt tacactggca tcgatgggca tgtccgatca
120
180
240
300
360
420
480
540
600
660
720
780
840
900
960
1020
1080
1140
1200
PL 230 884 Β1
ccagtatgtt gctgccatcc accgggatac agataacctg catgtgcatg ttgctgttaa 1260
ccgcatcaat ccccagacat ataaagcagc ctcatcgagc tttaccaaag acactcttca 1320
tcaggcgtgc cgcttactgg aattgaagaa tggttggtcc cattcaaacg gtgcatatgt 1380
ggttaatgac cgtcaacaga ttgtccggaa ccctcacagc aagaaagagc ggggcaactg 1440
gcgctcactc gatcgcatca acaagatgga gaataaagag ggggttgaaa cgctctatcg 1500
ciaratcgtt ggigatgaac aggtaggcgg tagtcgtcaa aacttgatcc atgtttcagc 1560
tgggcttcgt gaagccaaaa gctgggatga tgtgcataag acatttgcag acatcggtct 1620
tcgtgtcgaa aaagcacagg ggaaaaaggg ctacgtcatt acccacgaac atcaaaacca 1680
gaagacggct gttaaggcga gtctggtatt taacaaggcg caatataccc tgaagtcgat 1740
ggaagagcgc tttggtgaat accagccttc acatattgaa ccggccaaag tatcggtatt 1800
taaaaccgca tatacccctg gtgcttatcg tcgagatgcc aataaacgtc tgcagcgtaa 1860
aattgagcgc gcagaagaaa gaatgctgct caaggggcgc tatcgcgcct accggaacaa 1920
tttaccggta tattctccgg ataaggatcg catcgccgat gaataccgga aaattgccca 1980
acatacccgg ttggtgaaaa ataacgtccg gcattctgtt tcagatcctc ataccagaaa 2040
gctgatgtac aacctggctg agttcaaacg cctgcaggcg gttgccaatc tgcggcttag 2100
cttgcgtgaa gaacgcaacg gtttcagagc ggctaaccca cggctttctt accgggagtg 2160
ggtcgaacag gaagcactga agggtgataa ggcagcgctc agccaaatga ggggctttgc 2220
ctattcctcc aggaagaagg agaagtataa acagcagctg gttgagcaga tcgggttcaa 2280
ccgtaccttt aacgccatca ccagtcatga tcgtgatgat gtggccgtaa tggcctcagc 2340
acgtcatggt gtcaagccac ggcttttgaa agacggtact gttatctttg agcgcgacgg 2400
taaaccggta gcggctgatc gtggtcatat tgtgctgaca gaaagtaatg gaatcgacaa 2460
agagaaaacg gctgatcttg caattgcatt aacgattgct ggtaaagcca aatctgtacg 2520
tgrcgatggt gacggcgagt itaaggaact gigctgtaat cgratcgtcg atgcagcrgt 2580
gaaccacaat caccctgtcg cgcagggcat taccttcaca gatgccgctc agcaggcgta 2640
tgctcaaaac gagaaacatc gtttgattcg tgagcaaaal aatagraaaa atgaaatgca 2700
attcagaagt gaaagagacg acaaattcaa tccgaagtaa aatggagtaa gaaatgaaaa 2760
tcaaaatgca aacggtcctc gcggccgttt ctgtgttagc tcttgccggg tgtgcctctc 2820
aaagcgaaaa ggaaaaacaa atctctgcac agcagctggt agatcaggaa ttgcgtgagc 2880
aagccattaa gataaaactc gcacaggatg agctttacca ggctggagcc attaacagga 2940
cccgttacaa attccctacc attatcaatg caaacagtca gtatgttcgt gtgagctggc 3000
agggtgatgc ttacgaatta ctggagcaac tggctaaaca gcgtggcctt caattcacca 3060
gtcaggggat taagttaccg cttccactca atatcgatgt tggtggttcg aaggttacgt 3120
ttgaacagtt gctgaccctg atccgacaac aaacgcagta ccgtgccacc atcaaccaga 3180
aacccggtga actgcagctg ctttacctca caccatcgaa gaaaggttca ttcctcagag 3240
PL 230 884 Β1
ggacccgccc atgaaactta aactgatcgt gcttctgacg ttaccgctgc ttgctgcgaa 3300
cgttgcacgc gcggacgact ccgatgttaa aggcctggat tactacatgg acccgccaag 3360
ccaaagtgac gatgaggccg atgttactgg cagtatgcta aacgacgcag cgcacaccat 3420
tggatttcgc ggcggtaagg cagaacgcgc taaagaaatt cgcgccgcgc tggaaaatca 3480
gcgcagcaac cttgattaca tgtattcgtt ccagccgctg atctcttctg aaggctacct 3540
gcctccagtc attgctgaag ctaaagacgt tgcacacatt accaatgagc aaatccgaac 3600
ggccaaccgt gcctatgaca ttgtggtgcc ggcgcgcttt gtcagtaacc caccgacatg 3660
gaaaagctat cttctgaccg ggctgatggc gcagcggatc gaattgcctg aaccggcggc 3720
aatgccgaag gacgggaaac aacgtgatat ctggaaaaaa gctgtcgcgc tgggctggtc 3780
tgacggtcgc caaaaagctg atgagatatt cactgctaat ttcaatcgcc tcacacggga 3840
ttacaccggc atgttgcgct acagcacgct actgcagcag ggcatgatta aggctccagt 3900
catcacacag cagcagcaaa cagttacagg ggataaaaac cgcctcatgc tgggcgataa 3960
aacgaaacgt atgaagcagc aagctgagtt tgacatcaac aaacgcagct ggaaaccgac 4020
catacgttaa ggggcagtag atggaagcat tcaattttgg tccaacgctg acgccccaga 4080
cgctggaacg ttttctcgta cactgctcaa acaatgaagt gtccgatatt ctgttgcagg 4140
gcggagataa aatctgggta gaacgtcatg ggcgccagtt gcccatgaca tcttacccgc 4200
tcgacaacct ggagctggaa cgtaccgttg ataaggtgtt cggtcaggag atcaaaggga 4260
cgctgaaaag tgctgcggtc gttaataccg ctatccagct aagaggtgat gaagcgggca 4320
cgattggact cggccgcggc gaaacccgcc ggttccgcgc gaactttact caggccgata 4380
tttataaaac agaagcggca atgtctctga cactccgtgt tctgaatgag gttattcctc 4440
agcttaaaca aatgggtatt gagccggacc tgtttaattc tctgttgccg gctgccggcc 4500
tcggactgat atgcggcgag acgggatcgg gcaagtcaac cttgatggcc agcatattcc 4560
agtattgcgg tgaaacgtac caggaccgga aaatcatcac ggttgaagat cccatcgagt 4620
atcgcctggg aagrcgagac tggattgcgc cggcgccggc acagtcacag attgggcgcg 4680
atattgattc cttccacaat tttatcactc tctccgggct ccgtcgttct ccgaagatta 4740
tgggggttgg tgagctcctt aaccgcctgt catttgaagc tgctgtactg gcaggtaaat 4800
ccggccactt ttgtcttggc acactgcacg tcaaaacggt cggagaagcc atttcccgat 4860
cattgcagaa ctatccgccg gaaatgcgtg aagctgccgc ctttgacctg ctgagtatcc 4920
tttcttacat catcgtgcaa cgcttgctta aaacaaaaga cggccggcgc aaggctgtcc 4980
gtgaatatct cgtcattgat aacagcctgc gccgcaaact ctatgacgtt gattacagca 5040
agtggggccg ctacatcgac gacctgttga tcgctgaaaa ccgcagtctg attcagaatg 5100
cctgggcaat gcaccaggaa ggtttgatcg acgaagcgga agtcatcgag gtcgcaggat 5160
atatggacta tctggcgtta aaagagggca agtatggaca ttaacaaatg gcgttatgcc 5220
ggccggccac tgacggtttt tggtgtgcct gttatctcgt ttcttgtgta cttcatctgg 5280
tttccgttcc cgtcagtaaa aacctttgtt atctgcacct gtgtggttct cttttacttt 5340
PL 230 884 Β1
ctgctggcca tgatgggcta cacgttaccg gtgctgtacc aggtcattct ccgggttatc 5400
cgcgggaaaa aacttaccgg gcggccgtgg tggtaccggc gctctcagcg ataacacata 5460
actacagggg tagacagtat ggcgaaacct gaaattgcaa ctgaaagaac ccgtctgagt 5520
attccctttg acgatcgcca acgtgcaata cgtgcggccg gcaaactggc tgatggcagt 5580
aatgctctgg actacgtgaa ggaagaaaag gtgtggtatg cacagccggg ggccaacctg 5640
agccggctga aagagtggat ttttgacccc aataaggtga tcgaagaacc gcccctggat 5700
attcaagcca ttgaagatga atttacggcg tggcttgaag agcgcggtgc cattatcaaa 5760
gaccccatag agttcgatgg ccagaagcat tatgtcgata cagtggacgg taaagctggt 5820
tcaagaaagg gggtgtatgc cgcctttctg gatggccgac ctgcagggtg gtacagggac 5880
tataagaacg gtggtgaaat tcagaaatgg gtatctaccg gcgcagcccc taaccctgaa 5940
caaatggcca tgctccgtgc tgatgctgcg gcaaggcgtg aacaaagagc tgcagcgcaa 6000
gcggataagt ttgatcagac cgctaaccgg ttgatggaag aatataaccg gcttccggat 6060
gccacgggag atctggcata cctgaaaaac aaacaggtca ttgccgctaa cggccttaaa 6120
gctgatgagc ggggcaacgt tgtgatccct ctgtttaatg ctgatggcga gttcaggacc 6180
cttgagcgca tctggtccga cggtagtaaa caccttgaaa aagacggcca ggcatggggg 6240
agttttttcg ttgtgggtgg ccaactgaag gatggtgaca acctgcttta tgccgaggga 6300
tatgcgacag cagccagtat cagcgaagcc atcaatcagc ctgtgatcat gacggttaat 6360
gccggcaaca tggtggaagt tgctggccgc ctgaaagaca cctttccaaa cagcactcat 6420
tacttccttg ctgacaatga catttataaa gacgagaacg ttgggctaga aaaagcgaca 6480
gaagctgcag agctgactgc cggccatgtt ctggtccctg cctttagcaa cccgaaagaa 6540
gggcttactg actacaacga tttgcatgtc tctgaagggc tggagcaagt cagattgcag 6600
gtagaaggag ccattaatca aatgaacagg gtagacacta tgccgactga taacccgaac 6660
attactgacg ttaatcacag ctcgactgac agcgctgccg ttgcagctcc tgaaaaagcc 6720
gcgccggtgg ccagcacccc tgcagctgct gaaccggtgg aagccgcgcc ggtggccagc 6780
gcccctgcag ctgctgaagc ggtggaagcc gcgccggtgg ccagcgcccc tgcagctgct 6840
gaaccggtgg aaaccgcgcc ggtggcaagc acccctgaag ctgctgaacc ggtggaagcc 6900
gcgccggtgg ccagcgcccc tgcagctgcc gaaccggaat acgtcgcacc aacagatcga 6960
gacggcgatg atgaagagag taatagcgcc agtgatcttg aggcgtatgc cgctatgatg 7020
gcctttggcg gtgaaacaac tgacactgct cagcaaaagc ctgaagggat agcgcccagc 7080
gaacctgtag ctaataccgc cccggctgaa aatgaaaccg aggagaagaa aaaaacaaac 7140
gaagaactgg aaaacggcat acgctgggca accaacgata atgcagaaac gccaccaaaa 7200
gaacgtatag acctggaagg gttaattgcc cggtttgggt acagagcaga gaaagactat 7260
acggcgtata cgcttgatgg gcaggatgcg ttttacgatt acggttcaca tctgcgtatg 7320
gctacccctg aagccagcca gagtgacgag atgatcctgg cggccgttct taccgcggat 7380
PL 230 884 Β1
aagcaacatc atcgtggtat tgaaatcacc ggcagtgacg aatttaaaga gcgagtgttt 7440
aaccttatca gtgaatacaa cattgaggtg aaactgacta acccagaaca aagggttaaa 7500
ttgctcgaac tcaaaaaagc aaatgaaaca gcaaaagaaa cggcaaaaga aaatgttgct 7560
gattcaaatg cgaataagca ggaaggggca aacgaaaagg caaattcatc agttcagcag 7620
aatggaatgc gctgggaaga atcggcctct gtacagccga agaagcagaa tgcatctgat 7680
actcaaaagg aagataaagc tgcgggtgaa tcctgggaga aaggcgttat cgtcgcgcat 7740
ggacgtgcta agtargagtg gaaagatgat gaarccatga actactttgt caccctcaaa 7800
aatgaacatg gagagaagac actctggggg aaagaccttg agagagcggt taaagatgct 7860
ggtgtagaca ccgaacgtct tgttacagtc agaaagctgg gatttgtgga tgttgaggtg 7920
aatgcacctg tccgtgatga aagcaacaag atcgttcgtt atgaaactat ccagaccaaa 7980
cgtaatgagt gggaagtaaa acctgtatac ccacagccaa cagcagggaa tgaacaggcc 8040
tataagcctt ctgaactggt tccgtatgat gctgcaacct tccagaagct ccgcacaaca 8100
attcagcaga ttaccggrgi tgatcrcagc cgtgaggccg rgccrgaaaa agaactgtar 8160
tggrtcctgc cgaatggraa gccagctcct gaaagcatga caaaacccac aggctataaa 8220
ctccctcaag agtcaaaaac cgcgggtaca cctttgctgg tcgcaccgca taaaaaaggc 8280
gaacgcccgg attattacct tgttgagtct cgtaaaggat tcatgcaggg gatcgcaaag 8340
gataaggaat ctggcgagta ccatagcgta attggtaaag tgaacaagcg tattgataaa 8400
gatggaaact ggaaaacgta tatgacactt tcagcaatca ataaaaatgc agaaagtgga 8460
attgttttgc acggatacgg ccatgttgat cagggaggta aaaacctgct ttacaaaaac 8520
acaattgcaa atgaaaaaca gcctcagcat ttacaaccgg cctcagatga ggtaaaaaac 8580
aaaacagtaa tgaagcagct ttttcatcct tctaatgctg caaaaagaaa agatgatgaa 8640
aggagagaac agactcatgc accagtcgca aagtcagcgc ctcggccata aaacaaaaac 8700
cctactcgta gcagtagggt tttcctgcat ttctgtgagc tcatttgcag ccacacagac 8760
ctgtgcagca tacgaactgg caaaagctgg tgctgatgct gcctataaac aggaggttga 8820
acggattaac aacgccgcta aaagtgaatc cagtacatct gattctctcg gacagtgcct 8880
ggggtcgcta tcggtatcac taaaaatccc tcaatttccg tctatcagcg acatcattga 8940
taaggtgaag gatgaggtat gcaatacggt taaatcgaag ataaatgaga agtgggggag 9000
cctgactaat acaacgcrgg acccgtggtc aacgatttca tcccgactgc cagatacgtc 9060
aggtatcctg cccaacgcat cttctaagaa tgtgcaatta aacaatccgg cagctgcgag 9120
tggaagtggt gaggatgcaa acagtgatgc attcccgttc catttgtaac taccggaaga 9180
gtcctttcgg gattttatcg aatagcttgc cggttcgtat ttcaacgcgg cggtgttccg 9240
ccgcggttag taaacgcata aattctgtgg caggtagaac atcacgtttt gagtctacat 9300
acgtatcaag cgaatcttca ttcatgaaac gtctgacagt atgcagccag tcttcagctg 9360
atttcatatt ttttgagctc atcgtcgctc atctcggcaa acgctgcagg tcggcgacct 9420
tttcctgtcc aggttatgga ctttccatca acttcgatcc ggtacttcac ttttccaaaa 9480
PL 230 884 Β1
gtggatttac ttttcgtgga cggaccaaag agattttcga agatctggag agcttcatca 9540
gccgtaatat tgtgttcttc catgaaccgc tttgtggctg cggctttctc ttcagtggcc 9600
ttctgttctt ccttaaattt ctcgatcatt ccctgtgcaa tgtcggacca catattaatg 9660
agttgctcaa ggttttctgg cggaattttg cgcaaaacgg cggtggcttt tcgtcgttcg 9720
cacatgataa ctgcacagga ttcgtaatca ttatgttcgc tcatgtatac ctcattgttc 9780
attaacgatc tgcgtgattt tctaacacaa acttttgaaa agagaaactc tatgaaaaca 9840
caaaatggtg aaaatattat ggatcaaact gactcggatc aaaactcagt cgttgatgat 9900
gacagcaacg cccttgctcc agctctggct gaagagagta accgaacggt acaagaaatc 9960
gtatcgaaac atggtttaaa agtaattttg attcaaacgc taatcatatt agtcgcaatc 10020
attatcattg gtcttcaggg ttactggctt caccagaaaa aaatcaaata tattgcaacg 10080
aatgggggca tgatcacaga agttcatcca accgatgaac ccgcttacac ggcggaagag 10140
gtgatggact ttgccaaccg tacaatgatc aaatcgcttt cactgaactt Tgtgaattac 10200
gaaaaccaat taaccagcgt ccgcggcgat tttagcgctg aagggtacgt tagtttccgt 10260
aaagcgctgt ccgatagtgg gctgctgaaa gatatcagtg aaaaacgtct gaacgtaaaa 10320
ctttccacaa ctcctggaac cctgatcacg gaaggtctta tccgtggcac caaaacctat 10380
gcctggcaat accgcattcc ggtgactgtt cagcttgttg ggcaggctca ggactacaga 10440
ccgcaacctt acgatttgat ggttcaggta cgccgcgtca aagaagacga agatccacgg 10500
ggtattcaag tagcacaggc cattctcaaa ccccggaact actgaggtca atcatgaaga 10560
ttaaactgtt aactgtactt atggccgcac tgttttcggc aaattctgta tctgcagctg 10620
atgcgccgac tggtaatgga gcgccgcagc aaacggcgcc agctgtgcct ggtggtgata 10680
ttgctcaatg gcagcaggcc agttccgggt tgcccgtaaa tcagcagtca caggtgcaac 10740
agcctccaca gcaaacagca caggaacaag gtcagcagca ggcgcaaggc caacaaccac 10800
aggcacaggc ccaacagcgg ccaacgactg cactgcctcc tgcacccatg ccgcagattc 10860
ciccaccaca gcagcaggtt actcatgtta atccgcagac actggaagag ttacctgcac 10920
ctgttctgca gcagatccag cctattaccc ctggtcaggt gcggtcggcc cgcagcgcaa 10980
tggaagatat gagcgcggcg gccaaaacct caccattaac gccgatccca cgaatttcaa 11040
gccagacggt atcactgtca gctggcgcat ccattccgca ggtacgggta tttccaaacc 11100
aggcaacgac agtgacgttt tcagatgcaa ccggacaccc ctgggtatta ggtgcccctc 11160
catataattc gagtccctgt gcttcaggtg gtgaactgtg tgttggctat attccaggat 11220
cggcggtatt cacaatccag ccgaccaatg cctatgccag cgggaacatc acagtgcttc 11280
tgaaggggct ggccacgccg gtcattatta acgtgaaggg ggcagaaccc tccgttaaat 11340
caaaaaccgt tgatgttgat tatcgtctgg atctccgtat cccgaagcgc agtcctgaca 11400
caccggttta taccgctacg cctgagaaaa aaatctcact gtatgacaag cagctgcaga 11460
gcgtgctcga tggcatcccg cctgaagatg ctcagcggtt gaaacttaaa aacgcgccag 11520
PL 230 884 Β1
ggagtaccaa agtctggcag atcggtgatg agctctacgt cagaagtaac atgcagctgc 11580
aggatgagtt tgaaaaaacg ctttccgcta tcgatggcac acatgtttac gtgctgccgg 11640
caacaccagt gctgactttt tctgttaatg gtcaggcgcg tgacgttgaa gttgagctga 11700
attaagggga acgacgatgg ctacagataa aggtaaagaa accagaaaaa tgatgctcta 11760
cgtcggtggt gctgctgcag tggtggcgct tctgggaggg tactggttgt ttggctcatc 11820
agatgagccg gcaacgggcg ggtcgcaggt gaaagcccag gggctggaag ggaaaactgg 11880
cagggaaaaa gctaatgatc cccaatacaa caagctgctg aatgagtgga atgttgataa 11940
ttcagataaa gcggctctca caggggatag cttcatctcc acgttgtcag ccagtaatcc 12000
ggtggccgtt gattacggca ccaaagcacc gccaccaaaa tattcgtggg aatcgtcagc 12060
aaagccgtcg ggcgataaca gtaaggcgaa tgatgctgag cagaaagagc gtgagcgtca 12120
ggctaaagcg gtggctacgt tactgcagaa aatagaccag gccagaacac cagttgtcac 12180
gggtgttgct cttgcaaccc ctctgggagc agaaggaaat gacaagaacg gcggtacctt 12240
ctcagggtgg accgattcgg tctatccgca gaacaaaaag ccggatgctg aaaaacaaca 12300
gggggcgaag aataaggcca aagataaagg agcccggctt gtatcggctt acacgcttgt 12360
gccggcagta atggatacgg cgatggacag tgacgatcag aacagtattg ctattgccca 12420
tgttccaact ggagcgcagg ccggcgccaa attctattct ggccaaaacc gtcttgccgg 12480
cgatggtatt cgaattcact tcaccggcat ggagctgaac ggagtgcagt gtaaggtcga 12540
tgcgtatggc gtggcttccg actcgttgcg cgcggccgtt tcctcaaatg taaataaccg 12600
ctggttcagc cgtattattc tgccggctgt cgctaacgga ttaggccgaa ctggtcagct 12660
ctatgcggac agcaattcgc agatgattat cactgacggc gggaacgcat atcgttcaac 12720
tgatacacct gatggcaaag cggtagccgg taccattatt ggcgggatgg gtgagcaagc 12780
agggcgtgtc ctggccgacg atgcagcccg cctgccgatt aagcaggtta cggttgaccg 12840
taaccaactc ataggcatcc agtttgtcgc gccagtgtat gaaagcgact gtggcgagaa 12900
tttggaaaat gcttcrgcag agcaggcgca gcagcaagca actccgacac tatctagtgt 12960
gcaacctcag cagatgcctc agcctccggc tcctaattac cctcagcaaa actttccaag 13020
ctaccccggc tacgggtatg gcaccaataa cccgtattac cgttaaggag attgataatg 13080
aatctgtttg aagatgacaa taaaaaagaa gcagctcctg cccaggaacc ggtgtctgct 13140
aagactgctg aaaagccaaa accgacagtg acgccagcag caaaagcaaa caaaaagccg 13200
cttaagatta gtgactatgc atggattggt ggtatcgctg tcatagctat cctgctttta 13260
gtctggttgt ttgggggctc cgatagtggc actgcgcctg cggccgggaa tggcacgatc 13320
cagtcttcag ggcaacgtca gaacgtacag gctgcccctg ccgggcagga ttctggtgac 13380
ttccgcgagc agatttccgg gattttgctg cagcaaaagg aacggctgga cgcgatagaa 13440
tcaacttcta aaaatggaat gatgatcctt tccagtcagt tacaaagcgc taatgagcaa 13500
atcaaaaatc tgaacaatca ggttcaggaa ctgaaaatga aagccgctgg ttatgggcct 13560
tcatttagta atcagagtgg aacaatttcg ggggcaacgt cgcaggcatt acctttgttg 13620
PL 230 884 Β1
agaggttttt caattaatga tttatctggc gatcttgctt gggtaaaata caaaaaccag 13680
acgtatgctg tgaaggtcgg tagtcaactt ggcggagtca ccattacggg tatcgatact 13740
gaaaatagaa tcgttactac aagtaaaggc cttatccgct aaacaggacc taaaaaggcg 13800
aaactatgga tttagaatcg gtattaattc aggttgctaa cggtggtcag gaaccgctga 13860
caaggctaat cataggtgtc gctgcagtcg ttgggatcat tggtgttatt ggatatctga 13920
rgagcctgcg gaagcaggcc aggcattcaa caaaaggtgr ggaagttggc agaattttrg 13980
ccggtatcat cttctgtgta tgcctcatca cgttgaaggc acagatgaac tcaggcggrg 14040
ccactttagg atttggcgat gttagcttcg gacccgtcag ttatgcgagc gaatctacgt 14100
ttggcatggg agccgcagca gtcaacgcag tgctggggat tgttagaatt ctcggcgcat 14160
acttttttta caggggtata aaggggttga aagactctta ccttgagggc catacggagc 14220
tgtcagcttc gggtacgaga ggggcatcca ttgtgaaaat tgtatgtgga ctacttctga 14280
tgttcgatac acaaacgctc gatgcgttgc agagcacatt aaacattcac tggtaatcaa 14340
aaaggatact ttatgaaaat tgttaagctt atcaaagaca aggcattatc tgcatccatc 14400
gcagcgtatc agctgcgcgg aacggtggca aaatcgttag tggtattgcc gctggcatta 14460
ctgagcaaag aggctgcggc tgaaacgact gtctgggaga aaatcaatac cttcacggaa 14520
ggtcttgcca gtacccagcc tggtctgatt accggcggta aagtcattgg tgttgtgttc 14580
tttattgtcg ggcttgtttc tcttttcctt aaaaacaaac gcgggaaaga tatcagtggc 14640
agcttcatct tctggtcaat ggttgttggt gcttgcctgg tcggcctgac cgcatggatc 14700
tcttctgttg gttcaactgt tggcgttgac gcaaccctgt aatgtccctt cggccccgcc 14760
ttgcggggcc aatatcggag ttccctcatg aaagatttta agctcaccag gaatgaacaa 14820
cctgccagat gccatgtgtg cgggataaag agcaaagatg ttttctccct cgcagaagat 14880
ggacagaaag agagaatgct ttgctctgta tgcctgtcgc tcgaacatcc ggagaaaatg 14940
aaactagaga ctcaaaccgg acttctgctg aagagaaata caaaccgaaa actctacagc 15000
ctgcrgtTtc gttcaartgc aaaggcggaa aagtcaacgg acgartctra ccgtgaaaag 15060
gcgcagaaac ttaaacagat attgctcagc acaactgacg tagttctaaa cgaaaccggc 15120
agtgatgatg gatacgattt actgcacctg ataaaaaaac accatcagtt acttcccatg 15180
aattttgacg atgagtttgt cgcttctgtt gcagagtcag acgaattgcc ggatgtaagt 15240
gactggaatg aaatttacaa gggtaagaga ggttttaaat gatttctttc tttgaggatg 15300
tgatcgaagg tatctcacgc aatctgacat caaatgactc gttaaaatac tgtgatttga 15360
caacggttgt agggcttacg tcgcaggatc gcgttgagca tcctgaaatc agggctccgt 15420
acattctgac cactaagaac aacgattttc ttaccgttat tgaggttcag ggcgctaaat 15480
catcgtttga cgagaagtcg tttaatgact tcatcatgca cctatcaaac tccttgtcga 15540
attcctttat taacagcggc cataagttgt ctgtggtgtt cgaacgcgac tttaccaaga 15600
accaggaaga gctgaataat gtttataaac cgcaggtagc agcaatagag cgtctgcaga 15660
PL 230 884 Β1
tagacattaa agacctgatc gccgatgacg caaaaaaaat cgccgctcat tacagccgtg 15720
aacgcgctta catcgtgctg tatacctcga aggggatgat tgcgaaggat gaacttaaaa 15780
acgaacaggc aaaagctgcc ggcgtactga aggatatccc gcagacgcgc ttcagtcaga 15840
acccaatcga atttcagctt gaaggtttga agatcacgca tgacgcgatg ctgtggcgcc 15900
tgattggtat gcttcagggg gatgatgaat caggaatggg gcttctggtr gatgtcctcg 15960
atgtcaaaca cgctggcgca atgatgcgtc agatgctgtt ccggaattca acatcagaaa 16020
actggtaccc tcgcacgccg tttgaccaaa atctgcgaat ttatggcgcc ccacggaaag 16080
acaatatcga ctccgtgctg ccgccgcggc tgaatatcca gatcatggaa ggggaactgg 16140
aagaagatgg tggcctgatt tactgtgatg gtaagtatta cggctctgtt gcccttgagt 16200
taccaccact tcaccctgtc aaatttaagc agttattcaa cgcgattaac cggaaaatcc 16260
cgtaccggat aaaatatgac tttataggcg ggggcaaaaa agcactgttc tggccatcag 16320
taatcatatc tttccttcgt ttcattccct cactcggtaa tatcgcgcgt gatatggatt 16380
atgtccgggc ccagagcgaa accgatccaa cggctatcat ggccatcaac tttgccacct 16440
ggggcgacac taaggatgaa gccaaacgca acctggcggc tttaactaag gcgattgaag 16500
gctggggtgt atcaggtgtg tccaagacat atggcaatcc aggtagcgca ctgattgcat 16560
ccgtrccggg gctgacgacg gccacaccig gctcairgca ttatccgccg trgagtgaag 16620
gcttgcggat gttacctttt gaacgtccgg ccagiccctg gcatggtaaa ggcaatarca 16680
acttcatcac gctcgatggc aagctgttcc cctatcaaat cgccagtccc ctgcaggaga 16740
aatttaccga tgtcatcacc ggtgttcctg gttccggtaa aagcgtgctg gccaaccgcc 16800
ttaacctgag ttcgatttac cgggctgata aaaaactgcc ttatctgacc atcattgata 16860
agggctacag tgcaaaaggt atcgccgatc tgattagcgc tgagctgccg tcagagaaac 16920
gtcaccagat tgccagtatc accctgaaca atgacgaatc gcactgtatt aacatctgcg 16980
atacgcagtt aggttcaagg tatctgacgc agtttgagga agtattctta aagcagatgc 17040
ttaacgcatt ctgtattgat ccggcaattg gccagccgcc agatgcaatg agcgttggcc 17100
aaatcgtcag taaggttgta tcaaacgtat acaaagcaaa agcgcattca agtgctaact 17160
tgtttaagta taacgacccg gtgattaatg aagctctgaa agaatcaggt ctggataaag 17220
agcttggtga agactggttt gaaagagcta catggtggga agtcgttgat aagctgtttg 17280
ccaaaaaata tcttcatgct gcgacggttg ctcagcgtta tgctgtgcca accattcacg 17340
attttattgc tgaactacaa actgaatcat ttaaaaacca atacgctgac gtaaaagtra 17400
atgggagtga gcctgtagta ggcttcgttg cacgttgctt ccaggctgct gcagctgagt 17460
atgccatttt ctcagggata acggtttatg atttcagccc ggagactcgc attgcgatcc 17520
tggacatgca aaacgtcctc ggtgacagaa cgacacctgc aggtaagctc aagtccggca 17580
ttatgtatct ttttgcgcgc cagatggctg tgcgtaacta ctacctgcct cagtccgcag 17640
aaaccttcat tcctgcttta ccggagcagt acagggcata tcaccaggcg cgcatcaggg 17700
agctttcaga agaggttaaa catacctttt atgatgagtg tcataacttt gccggcatcg 17760
PL 230 884 Β1 actttattca aaatgcgctg aacaccgctg accttgaaga tcgtaaattc aacgtccgta 17820 ctgccttctc gtctcagtat ctgagccata tgccttcgag tgtgcttaaa accatgaaca 17880 gcctgtttat gatgcgcctg acggaagggg atgaagagta tctgaagcaa ttagagatca 17940 acatcccggc cgatatcctg cgtcgtttca gacagcttcc gcaaggggtt tatccggacg 18000 gaagtggtac tgcattcctc ggtattttta aaacaaaacg tggtcttatt tgccacattc 18060 tgaaaaacac attaggacca aaactgcttt gggctttgaa ctcatctgca aaagatagag 18120 cgctcagaga tgtgctttat gaagagctgg gaacgaaaaa agcaagggaa gaattagcaa 18180 atagattccc tatgggaagt gcatcaagta tcattgatga aatggtggtc aatcagggtg 18240 gtgagcgtga ttctgaagaa gaatcacaaa ctatggcgat gaagctcgct aaagaaatca 18300 tttctgatgt gagaagggga ttcagatgat aaaaatcgga aaagcaaaac ggtcagtgat 18360 ggccgtttca attctggcct tcagcgtaca gtcagcattt gcctatacgg tcaacgttaa 18420 cagcagcatt cccatctcaa cgcaggttat gccggcgttg agcacagcta atggcctgtt 18480 aggtaatatc caggccacgc tgattaacat tggtacggca atcagccagc agggcgatcg 18540 ccaggcagca ttaatgcagc aggtggctga aactaaccga cagttcgaag tcgagcaaaa 18600 acgtaatgac cggctgctgc aggcacagga taagtaccgt gttccggatg atatctgtgc 18660 gcagtctatt ggcggtggcg ccgcgggggt atcctctgcg gccgctggcg gtcagcgaac 18720 gctgggaagc gccagttctg cgaaagatgt taaggctatt tttgaagtgc cggcacgcgc 18780 aaccgacgtg gatgcatctt caacggccga agttcacagc cagtactgcg acagttcgga 18840 ttatgctgca tttggtggga cttcattctg cccaagtgta tctgacatgc cgcgggcaga 18900 tacgtcgctg agctcgttgc tttatggcgc cggcaaagaa ggcaaggcac ctgatctgac 18960 gtttacagat gagcagacag atgcggcgct gcgctatatg aaaaataccg cgttgcgcag 19020 tgctggrcgt cagctgagtc gtggggaagt taaaggcgcc agcgggcgaa Tttacctggg 19080 catgattcag caataccagg cgctcaccga cgcggccgca caacctcaga tggaaatgat 19140 cgccaactcc aaaccgaacc cggccactga tgccgcgctt gcagatgcgc gcaaagtgcc 19200 ggaagtcgaa tcctatttcc aggcgacggc cagtaacagg gcgaaacagc ttaaccgtat 19260 gtctgccaga gagtttgagg aattcgaagt aggtcgccgt tacagcaacc ctgcttacca 19320 ggcgacgctg accaacaaga acaccgaaga tttgatgcgt gagcaaatca atatcgccaa 19380 tctgaacaac tggttagtgc tgaaaaccaa acagcagctg gagaaacaaa atgtgctgct 19440 tggccagatc ctggcgaacg acgcatatca aacatacaaa ccgatgctgg cagcacagct 19500 ggagagtgtg aacgcgggag tatccagaaa atgaccgacg aaaataaaac aggggataaa 19560 gacacagcca aatcagggaa attaaaaaaa ggccttgatg ttgtaacagg tgtcaatgac 19620 ctcccggaag ggaaggctaa acgaacgata tattatatta ctggcatcag cgatatatat 19680 tttattatcg cgtcagtaaa gcaaacattc agcctgctct ttcagcgggc ttcattcgtt 19740 aagaagcaaa taaaaaacct tgatggtcca cctgttgatt ctgatgcaaa tcagccgttc 19800
PL 230 884 Β1
gccgaagtta tgaaacggag caatagacct gtatcagaat tgttggataa ggccagttta 19860
tacaagaaat actggctttg ttgttttttt gcattagtcc tcattctgct ttttttaacg 19920
tctggttatg ccagattgct tctaaatggc tcaccgaaca tgagcttgtt aagagcaact 19980
ctcacctgtg gcgtcctgtt tgctgctggg atctttactt tcattaaggc tctcacatgt 20040
gagttcatgg ggtggcagtt acgaaaccag gctcactctg atgcagagca aggtacgtta 20100
cgttatttcc ttaatgatgg gggagtgcgt aatacattta atttttcgca ggctggtcaa 20160
gagcgggggc cacatgagta aattaaaaag gttgcttcta tctcttttcg ttgtggcgtc 20220
gccttcatat tcagcggatt tggggattga tggcataact gaagcggcta aacgttcagg 20280
tgacctatcg cgtcaaatgt tacataccgt ttttggtgag gtagttaata atccgtttag 20340
cccttccggc gatggcttac ttaataacgt tttcttcact gtcaacgaag ttatcgcgat 20400
tcttgccctt gtctatatgg ggataatcag cattaagaaa cttcaccagg caggtcagtt 20460
gggaagtttc attgagggtg atggcaataa cgcattcaaa attgttaaaa cgacttttgg 20520
gtggttgttg cttgtaccta ccgttgtcgg ttggtctgtg gcgcagctgc tttttctatg 20580
gtgcggttca atcattggcg taggatctgc caatgttatt gcagataaaa cggcttcgga 20640
attagcgagt ggtaaagctg tctatatagc ccctgttatg ccagaaatgg cgtctgttgc 20700
aaaagggatg tttgaaacaa acctttgtgc tttgggtgta aatcagggga ttgctcaaat 20760
ggaggcttct ggccaacatt atgagaataa cgccagaatg caataccaaa caggtgacag 20820
cacatattct atatctgtaa acaacggctc agctgtatgt gggaccgttt cgctgccaca 20880
acgtccagca ggatggactt ctatcttcgc tagcggttat gcggattccg tctacagcgt 20940
tcagcaacaa gcaacggaca cgttgtgggg aaaaatgaag actgctgcag agcagtttaa 21000
tgcagcatat atggcaaaaa tgcgttccgg ggacggtgag ctgccagatg ttgaaagcgc 21060
gatccagact gctgcgcgtg attaccagct tcaggttcaa catgctgcta attcagcagc 21120
cggtgacgac gaaattgttc aaaaaatgga gtcggatatc aaagagaaag ggtggctata 21180
rcrrggtgrg ractarcaca cattagctac tgcgaatacc gagatgaaag argrrgctaa 21240
cctgaagccg gtagtfccag gaatgagtaa cgatggcgat atcggctcta tcgartactt 21300
taaaggcttg ttccaggctt accattctca actgaaaaat agtaattata cgccgcctct 21360
tggcaccgaa tctaacgcac ttgcaaggaa cattgatcaa aaaagccttg aaaatgccgc 21420
cacaactgga gacggaacgt cccttattac aaaaattttc gacttcaacg ttacaaactg 21480
gcttgcaacg agtaactacg gcactggtga tggttacagt gacgtgacca accctttact 21540
caaaatgaaa gctatcggcg attacacgtt aggtgtagct gaggttggac tcgccagttg 21600
gaccgctatc aatgttgcag tgaaggtttc agaagggaag agtctacccg gttttgctgc 21660
gggaatgatg aacaaactta cagggattcg agatgctatt gctggcgtat tagaatcggt 21720
ttcgttcttg gtttacccgc tgttttatag cctctttggt atcggtcttg cactatctat 21780
ctggctgccg tttataccga tgatttattg gtttgttgct atggcagatt ggctggttac 21840
gcttatgaca ggtgtattgg cgtcttccct gtgggcagct acccatatca acattggcca 21900
PL 230 884 Β1
gagtaatgat gagcggagta catatggtta tgtgttcctt atcgatgtaa tgattcggcc 21960
gatgctcatg gtaatggggt ttatttttgc ttctctggcc atcgtagctt tgggaacagc 22020
gttaaacatg atgtrtaaat tcgctatgga acaggtccag tctgactctt rcactggcct 22080
gctgtcatcg atcggatttt tgatgttata tgcaaggctt tgcacaggta tggtggctcg 22140
cgtatttgca cttcctgcga ggatgccgaa ctatgttata aactggattg gacagaagat 22200
gaacgattca gtgtrgggtg atatgcagaa ccatgttcat gacatctttg ctgcgttcgg 22260
tcgtggagcc aaaaatatga accgtaacaa ccctaagcaa tttaarcctg acgcaggtgt 22320
agataagagc aaggacggca tcaaaggagc ttaaatatga atgcgttatc aaacactgac 22380
tttaagaaaa ttagtaacaa tgcgcgtcct aaaaggcttg gatactacgc atcatggctc 22440
tggatgatgt ttgtattcct ctttctgttc gttagcgctt tcgtgtttct gagcggctta 22500
tactggacgg ttagagacgg ttcaattcag gagcactggt ttagtacagt cggtatcttt 22560
gtgatcgatg cagtgctgat ctggatgttg aaaaaggact tcaggagccg caagctctac 22620
caagtaactg cttcaatgaa gaactctggt ttcttcgagc ctcataagga ctgcgagcac 22680
tatgacctgg cccggagaac ttacatcggc tttgacttca gtactggaat cataggagta 22740
gcatccctgt atgccacatc cagtattaaa cgtgagcggc tattttttga agccgaaaca 22800
gtcgagtcat gggagtcagt cggcagggag ttaatcataa acctgcgaaa tacggggctt 22860
acgacgataa cgatcacagc tccaaatatc aataaagcgt acagggatat ggaaatcatc 22920
tgcagaacgc ataaaaatag ggatgaaaac tatcagcatc tgaagagtaa actgacagac 22980
gctggatggt tcataaacag caattattga gtttaacccg ccgaatatgg cgggtttttt 23040
gtgtatactc aagtggttat agtcgtatgt tgtgggagga agtagtgaac agagttactg 2 3100
agcgccagga acagaagagt aacccggagt tctagaggat ccccagatct agaaaacgtt 2 3160
gcttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tcagacccct tatttgagta aatgcgattt 23220
ctgccagaag ggcggcacaa aaaaacccga ctggtgagat cgggttttta tgttttgccc 23280
cggatggagg cgggaacacc taaacaattg acggttaaat attacgccat gagtgcagta 23340
aatgcaaacc acccggaata gggtatactg cgcgggtcaa tctgttgacg ttcttctcca 2 3400
gcccccgctt acgcggcgtg aacggattaa agccctggtt gaaaaacagg tggtgctgtt 23460
tcaatgccct ggctggagtg ggaacatcta aacaattgac gtgaggtagc cgctgtgaca 23520
ggcaatgtaa gggcgatcag cggtgttcct gctctgtatg gagcaaacgg atgattaact 23580
tgttaatcgt cgttctgcgg gctgttgttg cagtgtctaa cgctgtgata gcggtcctgg 2 3640
agctgarccg gcagtatrrt gactgaccgg aaacgtaacT aaaggcgggg ggaccacrcc 23700
ccgcctttta acacaaacct tcatatatga atatcctcct tagttcctat tccgaagttc 23760
ctattctcta gaaagtatag gaacttcggc gcgcctacct gtgacggaag atcacttcgc 23820
agaataaata aatcctggtg tccctgttga taccgggaag ccctgggcca acttttggcg 23880
aaaatgagac gttgatcggc acgtaagagg ttccaacttt caccataatg aaataagatc 23940
PL 230 884 Β1
actaccgggc gtattttttg agttgtcgag attttcagga gctaaggaag ctaaaatgga 24000
gaaaaaaatc actggatata ccaccgttga tatatcccaa tggcatcgta aagaacattt 24060
tgaggcattt cagtcagttg ctcaatgtac ctataaccag accgttcagc tggatattac 24120
ggccttttta aagaccgtaa agaaaaataa gcacaagttt tatccggcct ttattcacat 24180
tcttgcccgc ctgatgaatg ctcatccgga attacgtatg gcaatgaaag acggtgagct 24240
ggtgatatgg gatagtgttc acccttgtta caccgttttc catgagcaaa ctgaaacgtt 24300
rtcatcgctc tggagtgaat accacgacga tttccggcag trtctacaca tatattcgca 24360
agatgtggcg tgttacggtg aaaacctggc ctatttccct aaagggttta ttgagaatat 24420
gtttttcgtc tcagccaatc cctgggtgag tttcaccagt tttgatttaa acgtggccaa 24480
tatggacaac ttcttcgccc ccgttttcac catgggcaaa tattatacgc aaggcgacaa 24540
ggtgctgatg ccgctggcga ttcaggttca tcatgccgtt tgtgatggct tccatgtcgg 24600
cagaatgcrt aargaattac aacagtactg cgargagtgg cagggcgggg cgtaaggcgc 24660
gccatttaaa tgaagttcct attccgaagt tcctattctc tagaaagtat aggaacttcg 24720
aagcagctcc agcctacacc gtttggcctc ctgattaaca acgccggcaa acgccggcgt 24780
tcagggttac atctcgatca tcggaaacag atcgtcttcc tggtggtaaa gcacgtcgtc 24840
tgtgtccgtc ccatcaagcc agtcagcgaa cagttcaaac aggcacaccg acatttcctc 24900
cggtgaaatt gcgccacact gcagctcgta gaagacctca attttttcca gcaggctgtt 24960
ggccgctttg tcgtagccga acagcttgat cggcgggaag tgcattgcat ccgggttcgt 25020
ttccgccagt tcatcatcct tacgttccgg atagatgctg tacagcgtcg ccggcgatgg 2 5080
cggtaatacc tcgataaagc ggtttatccg catcggcagt tcgctggaaa acttctcatt 2 5140
gtccggaatg taaaacgctg cgctgcgtac cagggcatcc tggaaagaaa ttaccccctg 25200
accttcggtc tgctracgca gctcacgaar gttcacgcgg tccttttcac ggatttggta 25260
cagatcccct tcccggaccg ttttggaaaa cgtgccgtgt tcggcttcct gcccggagag 25320
ctctgaaraa taatcctggc cgacggtttc gcgcagtatt tcaaaggtrt tccggtcttc 25380
aatcgacrca aaatatttca cgcgggtgtt ggcgatcagc gaatccacct cgccgttcgc 2 5440
gccgcgggcg agcgacgggt gatcctggga ggaaaatacg cccattttrt ccagtgaacg 25500
catctgcgca ctcagcgtat ccataccgct ggtgaaatac tggcccagct cgtcataaat 25560
cagcccgtat ggcgcctgat tattcagcgc gtgagtgagc aggacttcct cttttttccc 25620
ttccagctgg tagcccaggt ccttactgat ggtcattcgc tgcagcgtca catataaacg 2 5680
gccaagcgtg gccgcttcac cgcgtgacag ctccagcgac gggatcatga cgatgagaat 25740
gcggtcattg tggaaaatat cgtccatccg gatatcgccg ctgtcttccg gaaaaacatg 2 5800
gccataagtt tcattgaaca gggagagcgt cttcaggaac tgacggctca tgtagttatg 25860
ctgttcgaag gcgcgggctt cccacgtttc cgggtattcc gcgttggcca gcaggaagcc 25920
tggtgtattt tccagataac tttccagcgc ggcgtaaccc tcgctgtgcc agccgttttt 25980
ctttgcctca acgtacagcg cggccattgc cggcagcgac atgtttttct gaatagtgcg 26040
PL 230 884 Β1
ctgtgacaaa agcagttcgc cgcgggcgcg cttataacac agggcattga tcagcgccga 26100
catcatggct tttgccgtat cctgccactg tgccgaatct ccgcccacct gggggagcat 26160
ggattccatc aactggatga tgaaggtcgg cggggcaacg ctgaagaggt tgactgagtt 26220
ggattgcgcg gggatgcttt cctgcttcac caggttcacg aacctgtcaa tactgccggt 26280
cagcaggttg aggacgtaat aatcatcctc acggccgaaa cggcgcgcca gcgaccaggt 26340
ggcgaaggcc agcttgttat ctgctttacc gtctgagagg cagtagccac ggcaccacag 26400
caggaagtta acgataaacc catagaaggt ttcggtttta cccgacccgg tggtaccaaa 26460
aaataccatg tggcgcagca ggtccgtcat gttcagccac agctcgcggc cgaacaggcg 26520
tccccgctca tacccgacat ataaaattcc cttcgctttc tttcgctccc ggaccttatg 26580
cgggatgcga atgggcccca gacggtattc cgcctgggtt tccgtggtca gggtgtcgtc 26640
gaacatttcg cagtctttcg gcattcgcag cggtggccgg aatttacgat ccgtgaatgc 26700
caccatcagc ggcggaagga tgaggatgct cagcagcatg gtaaagggga gaaacagacc 26760
cagcacggtc agtatggcca gcaggccaaa ctgtacgttc ggagtgagga accactccat 26820
gaacgaacca tctgggcgga tgactttttt actgtctaca gattcctgtt gcatagcggc 26880
tccgggttat tctcctattg cctgctgcag gcgggcatcg tctttgacga cggaaaccgg 26940
gatcacatca cccgaatcgg caacgatgga cggggtgccg ataaacccga atttcgcaaa 27000
tgccatattg ttcgcgtcaa ccaggcgggc gccggtggta tccggggctg ttttcggatc 27060
gtcaattttc gggttcatgg tggtgtatcc catgttaatc gtgtcttccc agcttttcag 27120
tcgggtatct ttcccggtat cgagtacagg agcggcgcgg accatcgagc gcaggtcgcc 27180
ataaacggac acggggaaaa tctcgacgtt atagcgtttg ctcagttcct gcagccgggg 27240
ttccagcgcg cggcagtgcg ggcacatcgg atcggaaaac acatacaggg tgtgtttatg 27300
cccggttgaa agcgagatcg taaagcgtcc gctggtgacg gcatctttca gtgacagcaa 27360
gtcgttatca gccagttttt taggggcttc aggtgctgcc tgaacctgca gctgctccgg 27420
cgcagtgaca ggctgctgca gacccggcgc gggagcatac gagtttgcct gcagtggctg 27480
tgccggctga tgcatattca tcaacgcgcc gttgatggag acgataaagc ccagcgcggc 27540
gactggccag aagataaagt tagacagccg gcgcacggca ttgagtccgc gctgctgttt 27600
cagcttttta cggatattgt tcagcgcctc gatggcctga tattcgtttt caaagcggaa 27660
cagctgcacc gcttcaccag aaaacgtatt gtgcgtcagg atgtggccgc tgccggcatc 27720
atggccaagt ccaaaatgac aggctgacag ggggaaggag tgcagggctt gttcctggta 27780
gcttccgtca gcggaaagat aaagtgtgtt gcgatcggtt tttacggtga gtttcatact 27840
tcctcgctta gagttccagg tgatcgggac gggttgccgg ctgaggttta gccggcgtcg 27900
gttcatcgtc tgtcagtcgc agactgttgt tcggggtgtc gtgcggagct gcaggcggcg 27960
tagccggctc gtcttccgct tcagcgtcag attcaaatgc aaatggcggt ataacgtctt 28020
cctgccagtg agcgaccgga atggcgggat cgcggcggtc aatatggcgg taatggagca 28080
PL 230 884 Β1
gatccagctc aaggcccagc acggccgccc gcacggttgg cgggaatttc gccgcctttt 28140
cttcatcgag cgtcagccgg taactttcgc actgactcca ggcaataacg ccacctcctt 28200
caatgaagaa cttcccgcgg ccggcgcttg aaagtgcata ccataacgtg cggtccacgc 28260
ctttcagcca ccggaaattt gcggatggca gctgcaggtc atcatcgaac agcgcgtaga 28320
gtagcgaacg ggagctgcgg cgcccctttg caaattctct gaacgcttcg cactggctgg 28380
cgacggtcca gagcccggcg gccagcgaar aaicagggaa gccgtctua gtccgcaggc 28440
aggaacggtt gagarcgicg agaatggati tagccgtrgg ccggtcgccc ataaaccgca 28500
gatgtacaaa cgaggctgcg agtgcttttt cccagggtgc cagggaaagg gccgcccctt 28560
gtttacctgt gacaggaata ccttatgtgc ggctttttta cggaggcggc 28620
gtttagcggt atcaatcagg ttatgttcct gggcaaactc aacgggtgac tgcgcgctgc 28680
gtgcttcttc cggatcttca ttcagcagca gctgatcgag gtggccaaac cgggcgagga 28740
tatgggctat ccccggatag ttttttacca tcacccaggg caggttccgg atggtcagtt 28800
tacgggtcag acggtagtaa ggattgcgcg agataaccca gacgaacaac ccgatgatta 28860
aaatgaacag gggaaagagc acgctggccg tgtcgttcat cacgctgata aagtcccaca 28920
gcgaaacctg gtgattatac cgcgccgccg acagcagcat gtcccggcgc tcggtcgcat 28980
tacccggtgt aatggcgtcc ggcagtacac cgtagatcca gtaaagcagg cgacaggctc 29040
cgtaaatcac ataatcacga aagccaaacc acatcactgt gatcatgatg agaagggccc 29100
cgataatcat caggccatca tcccctcccc ctttccgttg tggctggttt tgcatcagaa 29160
cctcagagaa ttttggtaaa ccttcccgat ataccaggcc ttacgcgccg gcgtattgga 29220
gtgatagcgg ccgacaccct gccagaaatc ccccccttcg agaatgatgt tgtatttgag 29280
gatgtaggca ctggccattg cagaggcgca aaagtcgtgc tgcagctgct ccgctctcac 29340
accaaaatca gccgccagct tattcgccca gatggtgttt atctggaatg cgccgtaatc 29400
gtaagtaccg tttttgtttt tatttttcat tcccggtttc ccgccttcag tcagccacaa 29460
ggcgaggaat ccacggagag gaatgtgata aatcigtgct gcttcaacca tgcaggttgg 29520
cagcgggatt gagggcgggg catcaaccat aacaatctcc taatgatttc tatttcgagt 29580
aaaaaatata ccatcaaaag gagatttttt taaatcattt tggtgcgcat aattgagagg 29640
gtgtcagagg aattcgaagc agctttgcac tggattgcga ggctttgtgc ttctctggag 29700
tgcgacaggt ttgatgacaa aaaattagcg caagaagaca aaaatcacct tgcgctaatg 29760
ctctgttaca ggtcactaat accatctaag tagttgattc atagtgactg catatgttgt 29820
gttttacagt attatgtagt ctgtttttta tgcaaaatct aatttaatat attgatattt 29880
atatcatttt acgtttctcg ttcagctttt ttatactaag ttggcattat aaaaaagcat 29940
tgcttatcaa tttgttgcaa cgaacaggtc actatcagtc aaaataaaat cattatttga 30000
tttcaatttt gtcccactcc ctgcctctgt catcacgata ctgtgatgcc atggtgtccg 30060
acttatgccc gagaagatgt tgagcaaact tatcgcttat ctgcttctca tagagtcttg 30120
cagacaaact gcgcaactcg tgaaaggtag gcggatctat tcrtactcct agatcttarg 30180
PL 230 884 Β1
cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg agaaaatacc gcatcaggcg ctcttccgct 30240
tcctcgctca ctgactcgct gcgctcggtc gttcggctgc ggcgagcggt atcagctcac 30300
tcaaaggcgg taatacggtt atccacagaa tcaggggata acgcaggaaa gaagcggccg 30360
cggtctcgca cccctgccgt cttacggggg tgttcatagt tacaacatcc atcatgcttt 30420
tttctgccga gccgttggct cggcggggaa aagcacggtg gggcaaagaa gaatccggac 30480
tggaggtitc igctggccac ccigcccggc atitgccggg igctaacctg ggagcatagc 30540
gaccattctg gccgtcgtgc cgcgtagcgg cgctgaaagg ccaggcatat tcccataatc 30600
cacagaaaat tgagcctgaa taacagtgat ctctttattg aataaagatc tttttaaaga 30660
agttaagagt gtattgcagc ttgttttgac cacgattgca ggtgacttta tttcctcctt 30720
tgcggataac tgtggatagt ggtgatttcg ctgccggtta tccaccggcg gcgccagaac 30780
gtcaaaaaat cacgttggcc acacgttaaa actggaggaa atttgagcag gtcgcgccgg 30840
ctggccagca cgaaaaccgc caggcggcgg taagagaatt acagggggag aaaatcagtg 30900
ataatcaggg ggaccggatt ccctctccag ccccagatcg agctgataca ggtggctgcg 30960
tactcgctgg gtaaactgct caggcgacag cgcgtgcagt tcgtctttcg gcagcgtccg 31020
tatcagatga acggacatgg cgtaagcccg gtcgtcatag ggctgttctg ccagcgcttt 31080
cagcttcttc tcgcgcttac ccttcagggc ggcttcacgc cggcgaacca gcgtggcgtg 31140
catcattttt tcataccagc gccggcgcgc ggctttaaca gagatttctt ccgcctggcc 31200
atgttcatca cgggttatcc agcctgcagc ttcagcggcc acctgttcgg cctgctccgc 31260
atacagctta tcgagatcaa caccgatcat cttccagagg cgttccgtca gcaccacatg 31320
cttggggaac cacttgcggt taaacgggtc ccatgtgacg ccttcaggca gcgccagtaa 31380
cccgaattcc atcatgtgct gcagcagccg gcaaacccgc ggtaccgtca ctttccggat 31440
cacgttccct tcgctgtcct tttcgctgag ctgccacgcc attttactga ggttgatagt 31500
gtcaatatgg gtagcccggt caacggtgct gaccaggagc ggcacaatcg catcgagtaa 31560
ttrctcccgc tccgggcgga agtcgcgctg ccggccagcc tgctcgcgca gctgcacgaa 31620
gtacgggtgg cggctgatcc gcatacgcag acttaacgcg cccgttttgc gatcgcggcg 31680
aacaaggcgg ttgtaggcat ggccaagctg gccagggagc tttttgaaat tgtccggtcg 31740
gtaccagctg ggctccgggc agagacacgc cgttgagtgc gtaccgcgac gacggcgggt 31800
tttgcgcacg ggcctggtgc cttcatcgag aagcagctgc aggggcgatt ctttagggga 31860
ctggctttca agccaggaga tgaactccgg cgaaagacct tctactgact caatgtcaga 31920
aagctgtagg tatggattct tttgattcac cagcccctgc acttattggc cgggctgtat 31980
tgcaataggg tacgcatttg ctataatcct ttctgccagc aaggcagttt gcgccccctg 32040
atttcatctc tgaccggcca aagtgagagg atgaatcagg gggttttact ttttgtggct 32100
cctgccacac cccaagcggt acatctccgg gccgctcttc ccgtgctaaa Ttctgtaata 32160
accccgtaag gttatgtaaa cgccgcttaa catatcatgc gtttctaagc ggggcaatac 32220
PL 230 884 Β1
ctgcgaaccc gcttttacat agtaagatca ctcttcagaa tcgtcaaatt tcaatccgtc 32280
gtaataactt ttgacaagaa attcaatgac ttcagcctga gtgagttttt taacttttgt 32340
gatctctatc aacattcttt ttgcatcttt ggggagataa aggtttaact ggtcgtgtgt 32400
ttcccggata cggttccggt actctctctg gaactccggg ttactcttct gttcctggcg 32460
ctcagtaact ctgttcacta cttcctccca caacatacga ctataaccac ttgagtacct 32520
cgtgatacgc ctatttttat aggttaatgt catgataata atggtttctt acgcggccgc 32580
caggrggcac ttttcgggga aatgtgcgcg gaaccccdta TttgrtraTt tttctaaata 32640
cattcaaata tgtatccgct catgagacaa taaccctgat aaatgcttca ataatattga 32700
aaaaggaaga gtatgagtat tcaacatttc cgtgtcgccc ttattccctt ttttgcggca 32760
ttttgccttc ctgtttttgc tcacccagaa acgctggtga aagtaaaaga tgctgaagat 32820
cagttgggtg cacgagtggg ttacatcgaa ctggatctca acagcggtaa gatccttgag 32880
agttttcgcc ccgaagaacg ttttccaatg atgagcactt ttaaagttct gctatgtggc 32940
gcggtattat cccgtgttga cgccgggcaa gagcaactcg gtcgccgcat acactattct 33000
cagaatgact tggttgagta ctcaccagtc acagaaaagc atcttacgga tggcatgaca 33060
gtaagagaat tatgcagtgc tgccataacc atgagtgata acactgcggc caacttactt 33120
ctgacaacga tcggaggacc gaaggagcta accgcttttt tgcacaacat gggggatcat 33180
gtaactcgcc ttgatcgttg ggaaccggag ctgaatgaag ccataccaaa cgacgagcgt 33240
gacaccacga tgcctgtagc aatggcaaca acgttgcgca aactattaac tggcgaacta 33300
cttactctag cttcccggca acaattaata gactggatgg aggcggataa agttgcagga 33360
ccacttctgc gctcggccct tccggctggc tggtttattg ctgataaatc tggagccggt 33420
gagcgtgggt ctcgcggtat cattgcagca ctggggccag atggtaagcc ctcccgtatc 33480
gtagttatct acacgacggg gagtcaggca actatggatg aacgaaatag acagatcgct 33540
gagataggtg cctcactgat taagcattgg taactgtcag accaagttta ctcatatata 33600
ctttagattg attt 33614
Zastrzeżenia patentowe

Claims (15)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Plazmid pomocniczy do mobilizacji, który obejmuje część mobilizującą systemu koniugacyjnego tra i trb w obrębie nukleotydów od 34 do 23136 SEKW. ID. NR 2 i od 24740 do 29654 SEKW. ID. NR 2, korzystniej obejmuje nukleotydy od 34 do 29654 SEKW. ID. NR 2, i przy czym plazmid pomocniczy do mobilizacji nie koduje funkcjonalnego białka Orf35 z pCTX-M3.
  2. 2. Plazmid pomocniczy według zastrz. 1, znamienny tym, że jest plazmidem pMOBS, którego sekwencja przedstawiona jest na SEKW. ID. NR 2.
  3. 3. Szczep bakteryjny do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy zawierający wintegrowaną w chromosom bakteryjny część mobilizującą systemu koniugacyjnego tra i trb w obrębie nukleotydów od 34 do 23136 SEKW. ID. NR 2 i od 24740 do 29654 SEKW. ID. NR 2, korzystniej zawierający wintegrowane nukleotydy od 34 do 29654 SEKW. ID. NR 2, i przy czym w takim szczepie nie powstaje funkcjonalne białko Orf35 z pCTX-M3.
    PL 230 884 Β1
  4. 4. Szczep bakteryjny według zastrz. 3, znamienny tym, że jest bakterią Gram ujemną wybraną z grupy składającej się z: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Enterobacter cloacae, Morganella morganii, Serratia marcescens, Salmonella enteńca.
  5. 5. Szczep bakteryjny według zastrz. 3 albo 4, znamienny tym, że jest szczepem E. coli do którego część mobilizującą systemu koniugacyjnego została wintegrowana w miejsce attB chromosomu, korzystnie jest to szczep E. coli S14.
  6. 6. System do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy obejmujący plazmid określony w zastrz. 1-2 i/lub szczep bakteryjny określony w zastrz. 3-5 oraz plazmid mobilizowany zawierający ohT o sekwencji nukleotydowej, która to sekwencja mikleotydowa zapewnia, że to ohTwspółdziała z tym systemem.
  7. 7. System według zastrz. 6, znamienny tym, że ohT o sekwencji nukleotydowej, która to sekwencja nukleotydowa zapewnia, że to ohT współdziała z tym systemem jest οπΤΡοτχ-Μ3 lub or/Tcoiib P9, korzystniej οπΤΡοτχ-Μ3 przedstawiony na SEKW. ID. NR 1.
  8. 8. System według zastrz. 6-7, znamienny tym, że plazmid mobilizowany zawiera replikon umożliwiający replikację w dawcy, korzystnie zawiera ολ/ρμβι z pUC19, o/7ra3 z pRA3, ohpisa z pACYC184 lub ohTPcn-M3Z pCTX-M3.
  9. 9. Zastosowanie plazmidu pomocniczego określonego w zastrz. 1-2, szczepu bakteryjnego określonego w zastrz. 3-5 albo systemu zawierającego plazmid mobilizowany określonego w zastrz. 6-8 do wydajnej mobilizacji plazmidów do komórek biorcy, przy czym komórkami biorcy są bakterie Gram ujemne: a-Protcobacteria, β-Proteobacteria, γ-Proteobacteria oraz bakterie Gram dodatnie, szczególnie z klasy Bacilli.
  10. 10. Zastosowanie według zastrz. 9, znamienne tym, że plazmid mobilizowany zawiera oriTPcTx-M3 lub onTcoiib-P9, korzystniej ohTprzedstawiony na SEKW. ID. NR 1.
  11. 11. Zastosowanie według zastrz. 9-10, znamienne tym, że plazmid mobilizowany zawiera replikon umożliwiający replikację w dawcy, korzystnie zawiera ολ/ρμβι z pUC19, ohras z pRA3, oripi5A z pACYC184 lub ohTPcn-M3Z pCTX-M3.
  12. 12. Zastosowanie systemu określonego w zastrz. 6-8 do wprowadzania genów kodujących czynnik korzystny dla bakterii biorcy w specyficznym środowisku lub warunkach, w którym w koniugacji mobilizowane są plazmidy zawierające ohTpctx-m3 lub onTcoiib-ps, korzystniej zawierające ohTprzedstawiony na SEKW. ID, NR 1, przy czym na mobilizowanym plazmidzie zostaje do komórki dawcy wprowadzony czynnik umożliwiający jego rozwój w specyficznym środowisku lub warunkach, który to czynnik jest bezpieczny dla szczepu dawcy.
  13. 13. Zastosowanie systemu określonego w zastrz. 6-8, do wprowadzania do szczepu biorcy w celu integracji z chromosomem biorcy sekwencji nukleotydowej wprowadzanej na mobilizowanym plazmidzie, w którym plazmid mobilizowany nie ulega replikacji, przy czym w koniugacji mobilizowane są plazmidy zawierające ohTPcn-M3 lub or/coiib-P9 korzystniej zwierające ohT przedstaw jony na SEKW, ID. NR I. oraz mobilizowany plazmid obejmuje sekwencje integrującą do chromosomu biorcy.
  14. 14. Zastosowanie według zastrz. 13, znamienne tym, że integracja z chromosomem biorcy sekwencji nukleotydowej prowadzona jest w celu przeprowadzenia mutagenezy transpozonowej, przy czym mobilizowany plazmid obejmuje sekwencjię integrującą do chromosomu biorcy, którą jest sekwencja transpozonu.
  15. 15. Zestaw molekularny, znamienny tym, że zawiera plazmid określony w zastrz. 1-2 i/lub szczep bakteryjny określony w zastrz. 3-5 i lub system do wydajnej mobilizacji plazmidów o szerokim spektrum gospodarzy określony w zastrz. 6-8,
PL400718A 2012-09-10 2012-09-10 Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny PL230884B1 (pl)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL400718A PL230884B1 (pl) 2012-09-10 2012-09-10 Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny
PCT/IB2013/058368 WO2014037917A1 (en) 2012-09-10 2013-09-07 The helper plasmid, bacterial strain and the broad host range system for plasmid mobilization and uses thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
PL400718A PL230884B1 (pl) 2012-09-10 2012-09-10 Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL400718A1 PL400718A1 (pl) 2014-03-17
PL230884B1 true PL230884B1 (pl) 2018-12-31

Family

ID=49724617

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL400718A PL230884B1 (pl) 2012-09-10 2012-09-10 Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny

Country Status (2)

Country Link
PL (1) PL230884B1 (pl)
WO (1) WO2014037917A1 (pl)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR3099769B1 (fr) 2019-08-05 2021-11-05 Bgene Genetics Mutagénèse bactérienne par conjugaison en milieu liquide
WO2023092189A1 (en) * 2021-11-25 2023-06-01 The Westmead Institute for Medical Research Broad host range conjugative plasmids
CN114874968A (zh) * 2022-06-21 2022-08-09 中国林业科学研究院森林生态环境与自然保护研究所 对植物内生微生物组的宏基因组进行原位改造的方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6991786B1 (en) * 2000-08-30 2006-01-31 Wisconsin Alumni Research Foundation Anti-microbial biotherapeutic agents: alternatives to conventional pharmaceutical antibiotics

Also Published As

Publication number Publication date
PL400718A1 (pl) 2014-03-17
WO2014037917A1 (en) 2014-03-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US6787316B2 (en) DNA cloning method
US20220411777A1 (en) C-to-G Transversion DNA Base Editors
AU780002B2 (en) Method for generating split, non-transferable genes that are able to express an active protein product
Kim et al. Transcription induction of the ferric citrate transport genes via the N‐terminus of the FecA outer membrane protein, the Ton system and the electrochemical potential of the cytoplasmic membrane
WO2020181202A1 (en) A:t to t:a base editing through adenine deamination and oxidation
CN101622356B (zh) 修整的重组酶用于治疗逆转录病毒感染的用途
KR102646320B1 (ko) 3-히드록시프로피온산을 생산하기 위한 재조합 박테리아, 그의 제조 방법, 및 그의 적용
PL230884B1 (pl) Plazmid pomocniczy do mobilizacji, szczep bakteryjny, system o szerokim spektrum gospodarzy do wydajnej mobilizacji plazmidów, ich zastosowania oraz zestaw molekularny
CN101611145A (zh) 用于在细菌细胞中表达基因的修饰型信使rna稳定化序列
WO2000058488A2 (en) Delivery of functional protein sequences by translocating polypeptides
CN110951767A (zh) 一种具有高拷贝能力的棒状杆菌和大肠杆菌双表达载体及其构建方法
US20250333714A1 (en) Artificial dna replisome and methods of use thereof
CN111778200B (zh) 生产L-天冬氨酸的平台菌、基于该平台菌构建的生产β-丙氨酸的重组菌及其构建方法
EP2675898A1 (en) Protein secretion
CN112094794B (zh) 一种产MTSase和MTHase的方法及应用
Joseph et al. Molecular Characterization of Heterologous HIV‐1gp120 Gene Expression Disruption in Mycobacterium bovis BCG Host Strain: A Critical Issue for Engineering Mycobacterial Based‐Vaccine Vectors
EP4294922A1 (en) Methods and systems for generating nucleic acid diversity
CN112410389B (zh) 支链α-酮酸脱氢酶复合体在制备丙二酸单酰辅酶A中的应用
US20220154221A1 (en) Site specific recombinase integrase variants and uses thereof in gene editing in eukaryotic cells
Yang et al. TraA is required for megaplasmid conjugation in Rhodococcus erythropolis AN12
CA3130645A1 (en) Use of an improved sleeping beauty transposase with increased solubility to facilitate and control transfection of a target cell with a transgene
US20240318166A1 (en) Method for producing plasmid dna using escherichia coli
CN116262930A (zh) 一种提高酿酒酵母sam辅因子供应的方法、工程菌及其应用
Takahashi et al. Suppressor mutants from MotB-D24E and MotS-D30E in the flagellar stator complex of Bacillus subtilis
KR100470907B1 (ko) 분자내 양방향 염색체 제거에 사용되는 트랜스포존, 이를이용한 미생물 변이주 제조 및 생장 비필수 유전자 선별방법