PL231643B1 - Sposób kriokonserwacji nasienia ryb łososiowatych - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób kriokonserwacji nasienia ryb, który charakteryzuje się tym, że pozyskuje się nasienia z przygotowanych samców lub neosamców, kontroluje jego jakość, rozrzedza się nasienie przy pomocy rozrzedzalnika glukozametanol i następnie poddaje się je ekwilibracji przez 15 min po czym napełnia się słomki i zamyka przy pomocy specjalistycznego aparatu oraz nanosi się na słomkę oznaczenie nasienia i poddaje zamrożeniu w parach ciekłego azotu.

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób kriokonserwacji nasienia ryb a w szczególności ryb łososiowatych i koregonidów.

Specyfiką nowoczesnej wylęgarni jest dywersyfikacja podaży opartej na produkcji gatunków, hybrydów i linii ryb łososiowatych przez okrągły rok. Podstawowy cel hybrydyzacji wynika z preferencji hodowlanych, które ukierunkowane są na uzyskanie osobników wykazujących pozytywne cechy wynikające z heterozji, w tym tempo wzrostu oraz, co szczególnie ważne w warunkach intensywnej hodowli ryb - odporności na choroby. U ryb łososiowatych korzystna jest także poliploidyzacja hybrydów, szczególnie triploidyzacja. Konieczność całorocznej podaży ryb stoi w bezpośredniej sprzeczności z biologią ryb łososiowatych, która charakteryzuje się wyraźnie zaznaczoną sezonowością rozrodu. Przełamanie sezonowości osiąga się poprzez wytworzenie sztucznych warunków fotoperiodu, ukierunkowanych na „oszukanie” natury, np. poprzez stworzenie skróconego (ok. 6 m-cy) lub wydłużonego (ok. 18 m-cy) roku. Skutkuje to przeniesieniem okresu gotowości rozrodczej (tarła) na terminy przed lub po tarle naturalnym. Podstawowym problemem w wylęgarnictwie jest konieczność zapewnienia dojrzałości samic i samców w tym samym czasie. Jest to zadanie trudne lub wręcz prawie niemożliwe, np. gdy tarła osobników rodzicielskich są znacznie od siebie oddalone w czasie.

Dla ryb łososiowatych opracowano i zastosowano z powodzeniem metodę wykorzystującą konfekcjonowanie nasienia w kulkach (Głogowski i wsp., 2000). Niestety omawiana metoda ma trzy podstawowe wady:

- brak możliwości identyfikacji poszczególnych prób nasienia (ponieważ nie ma możliwości znakowania indywidualnych porcji zamrożonego nasienia,

- potencjalne niebezpieczeństwo transmisji patogenów, przede wszystkim wirusów, pomiędzy próbami nasienia przechowywanymi w ciekłym azocie (ponieważ nasienie w kulkach nie jest odizolowane od ciekłego azotu),

- ograniczona możliwość manipulacji nasienia po rozmrożeniu

Dodatkowymi istotnymi czynnikami ograniczającymi szanse implementacji kriokonserwowanego nasienia do praktyki hodowli ryb są: niska jakość kriokonserwowanego nasienia (ok. 10% ruchliwości po rozmrożeniu) oraz zalecenia użycia nasienia natychmiast po rozmrożeniu. Konfekcjonowanie nasienia w kulkach wiąże się z koniecznością natychmiastowej aktywacji ruchu plemników po rozmrożeniu, co nie jest korzystne z powodu wyjątkowo krótkiego czasu ruchu plemników ryb łososiowatych (zaledwie 10-20 s). Z powyższych powodów zarzucono konfekcjonowanie nasienia w kulkach i w chwili obecnej stosuje się wyłącznie kriokonserwowane nasienie konfekcjonowane w słomkach, tj. w zamkniętych plastikowych rurkach o pojemności najczęściej 250 pl, ale jakość zamrożonego nasienia jest dalej ograniczona. Przyjmuje się, że do uzyskania podobnych wyników należy użyć 10 x więcej (tzn. 1000%) plemników kriokonserwowanych w porównaniu do nasienia świeżego (Billard, 1992), w ciągu 20 s po rozmrożeniu, co znacząco ogranicza czas wymagany do zapłodnienia (Lahnsteiner, 2000).

Celem wynalazku jest przeprowadzenie kriokonserwacji w czasie, kiedy jakość nasienia samców lub maskulinizowanych samic jest najwyższa, utworzenie banków nasienia podstawowych linii utrzymywanych w wylęgarni, wykorzystanie kriokonserwowanego nasienia do wielu specjalnych zastosowań w hodowli ryb w czasie, kiedy jakość ikry jest najwyższa.

Sposób kriokonserwacji nasienia ryb według wynalazku charakteryzuje się tym, że pozyskuje się nasienia z przygotowanych samców lub neosamców, kontroluje jego jakość, rozrzedza się nasienie przy pomocy rozrzedzalnika glukoza-metanol i następnie poddaje się je ekwilibracji przez 15 min po czym napełnia się słomki i zamyka przy pomocy specjalistycznego aparatu oraz nanosi się na słomkę oznaczenie nasienia i poddaje zamrożeniu w parach ciekłego azotu.

Przygotowanie samców lub neosamców w optymalnym stadium dojrzałości płciowej, jest niezmiernie ważne dla powodzenia kriokonserwacji. Ponieważ kriokonserwacja z definicji powoduje uszkodzenia komórek, dlatego dobra jakość materiału wyjściowego (nasienia) jest kluczowa.

Pozyskanie nasienia i kontrola jego jakości, polega na sprawdzeniu koncentracji i ruchliwości plemników. Koncentracja jest szacowana kolorymetrycznie, zaś ruchliwość poprzez obiektywną komputerową metodę analizy ruchliwości plemników, CASA). W wyniku tych testów nasienie będzie kwalifikowane do zamrażania. Rozrzedzenie nasienia przy pomocy rozrzedzalnika glukoza-metanol i krótka (15 min) ekwilibracja.

Napełnienie i zamknięcie słomek przy pomocy specjalistycznego aparatu oraz jednoczesne nadrukowanie informacji na słomki przy pomocy specjalistycznego aparatu.

PL 231 643 Β1

Zamrażanie w parach ciekłego azotu.

Kontrola jakości zamrożenia. Jakość nasienia jest sprawdzana na podstawie ruchliwości po rozmrożeniu i na tej podstawie kwalifikowana do przechowywania. Przechowywanie nasienia w ciekłym azocie i używanie go do realizacji zadań produkcyjnych.

Wyniki uzyskane w sezonie jesień 2013 - wiosna 2014 wskazują na uniwersalność opracowanego sposobu kriokonserwacji dla ryb łososiowatych. Uzyskano wysoką jakość nasienia po rozmrożeniu dla wszystkich badanych gatunków zarówno z rodzaju Salmo jak i Salvelinus. Także wyniki uzyskane dla nasienia siei dwukrotnie przewyższają uzyskane ostatnio rezultaty co zostało uwidocznione w poniższej tabeli.

Odsetek ruchliwych plemników i zdolność zapładniająca nasienia kriokonserwowanego z użyciem extendera glukoza-metanol (średnie ± SD). Przedstawiano bezwzględne dane dla odsetka zaoczkowania, wynoszą one 80-100% wartości kontrolnych.

Gatunek	Ruchliwość plemników (%)	Zaoczkowanie (%)
Pstrąg tęczowy	50 + 8	79 + 9
Pstrąg potokowy	74 + 7	93 + 7
Pstrąg źródlany	57 ±4	45 + 13
Sieja	54 + 6	61+9
Neosamce pstrąga tęczowego	54 ±12	79 ±6

Przeprowadzone zostały pierwsze doświadczenia ukierunkowane na przeskalowanie metodyki w kierunku zastosowania do zapłodnienia większej ilości ikry. Doświadczenia w tym kierunku są kluczowe dla wdrożenia metodyki do praktyki. Wstępne wyniki wskazują na wysokie wartości zapłodnienia (83-90%) dla liczby ziaren ikry w zakresie 100-1600, co oznacza 16-krotny wzrost w porównaniu do dotychczas stosowanej procedury. Może to stanowić przełomowe osiągnięcie w kierunku przeskalowania metodyki. Wbrew aktualnym poglądom, przedstawione wysokie wyniki zapłodnienia uzyskano dla nasienia maskulinizowanych samic wiosennego tarła (maj). Do tej pory uważano, że nasienia z tego okresu nie nadaje się do zamrażania. W drugim przykładzie, w warunkach produkcyjnych udało się zapłodnić trzy porcje ikry, po 10 000 ziaren każda.

Uzyskane wyniki potwierdzają skuteczność i uniwersalność opracowanej metodyki. Wynalazek umożliwił osiągnięcie pierwszych postępów w przeskalowaniu co zostało zobrazowane na zamieszczonym wykresie.

Liczba ziaren ikry

Zdolność zapładniająca kriokonserwowanych plemników maskulinizowanych samic pstrąga tęczowego w zależności od liczby ziaren ikry w czasie zapłodnienia.

Przedmiot wynalazku został przedstawiony w przykładowym wykonaniu z wykorzystaniem sposobu kriokonserwacji nasienia pstrąga tęczowego. W przykładzie ukazano przydatność czterech rozrzedzalników (I metanol, glukoza; II DMSO, glukoza; III metanol, sacharoza z dodatkiem żółtka,

PL 231 643 B1

IV metanol i sacharoza) do kriokonserwacji nasienia pstrąga tęczowego w słomkach (Ryc. 1, Nynca i in., 2013). Rozrzedzalniki l i II okazały się najbardziej skuteczne. Pomimo obniżonej ruchliwości i żywotności plemników nasienia mrożonego z użyciem rozrzedzalnika I i II, uzyskano wyniki wskazujące na utrzymanie zbliżonej zdolności zapładniającej nasienia mrożonego do nasienia świeżego. Należy podkreślić, że stosunek plemników na jajo w czasie zapłodnienia wynosił 2 mln, co jest niższe od ok. 3 mln plemników/jajo zalecanych w procedurach zapłodnienia z wykorzystaniem kriokonserwowanego nasienia (Billard 1992). W związku z tym osiągnięto założony cel polegający na wstępnym opracowaniu metodyki konfekcjonowania nasienia pstrąga tęczowego w słomach, alternatywnej dla tradycyjnej procedury kriokonserwacji w kulkach. Metodyka z wykorzystaniem metanolu i glukozy stanowiła punkt wyjściowy do dalszych prac ukierunkowanych na doskonalenie kriokonserwacji nasienia pstrąga tęczowego.

Kriokonserwowane nasienie będzie wykorzystywane do: zachowania materiału genetycznego cennych linii do pracy hodowlanej, wykorzystania nasienia do stymulacji gynogenezy, produkcji pożądanych krzyżówek towarowych, oraz zakonserwowania niewykorzystanych nadwyżek nasienia.

Zastrzeżenie patentowe

Claims (1)

1. Sposób kriokonserwacji nasienia ryb z wykorzystaniem jego zamrażania znamienny tym, że pozyskuje się nasienia z przygotowanych samców lub neosamców, kontroluje jego jakość, rozrzedza się nasienie przy pomocy rozrzedzalnika glukoza-metanol i następnie poddaje się je ekwilibracji przez 15 min po czym napełnia się słomki i zamyka przy pomocy specjalistycznego aparatu oraz nanosi się na słomkę oznaczenie nasienia i poddaje zamrożeniu w parach ciekłego azotu.