PL231923B1 - Sposób enkapsulacji materiału zawierającego bakteriofagi, otrzymywana nim mikrokapsułka oraz jej zastosowania - Google Patents

Abstract

Wynalazek dotyczy sposobów kapsułkowania materiału, obejmujących następujące etapy: (a) przygotowanie roztworu lub zawiesiny materiału przeznaczonego do kapsułkowania, (b) podgrzewanie wodnego roztworu lub zawiesiny materiału do kapsułkowania do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia pierwszego biokompatybilnego polimeru, jednocześnie niewpływającej negatywnie na właściwości materiału przeznaczonego do kapsułkowania (c) rozpuszczenie pierwszego biokompatybilnego polimeru w roztworze/zawiesinie, (d) odpowietrzenie roztworu lub zawiesiny otrzymanych w etapie (c), (e) emulsyfikacja roztworu lub zawiesiny otrzymanych w etapie (d) w biokompatybilnym oleju z dodatkiem surfaktanta, do utworzenia mikrokropli, oraz (f) utwardzenie mikrokropli przez wkroplenie wodnego roztworu jonów cynku i drugiego biokompatybilnego polimeru, do utworzenia mikrokapsułek. Ponadto wynalazek dotyczy mikrokapsułek otrzymanych tym sposobem oraz ich zastosowań.

Description

Opis wynalazku

Dziedzina wynalazku

Wynalazek dotyczy sposobów enkapsulacji, w szczególności enkapsulacji bakteriofagów, enkaspułowanych cząstek oraz ich zastosowań.

Tło wynalazku

Alginiany sieciowane dwuwartościowymi jonami metali są stosowane do mikroenkapsulacji komórek, bakterii, leków i barwników przez kilkadziesiąt lat. Do sieciowania alginianu szeroko stosowane są dwuwartościowe jony wapnia (Ca²⁺). Do najbardziej popularnych technik enkapsulacji z wykorzystaniem alginianu jako materiału nośnika należą: wytłaczanie i emulsyfikacja/żelowanie (Fundueanu 1998, Krasaekoopt 2003, Yu 2008). W zależności od źródła jonów utwardzających stosowanych do sieciowania alginianu, metody emulsyfikacji/żelowania zostały dalej podzielone na „wewnętrzne”, w których nierozpuszczalna sól wapnia jest mieszana z alginianem i solubilizowana po emulsyfikacji przez zmianę pH i „zewnętrzne”, w których rozpuszczalna sól wapnia jest wkraplana do emulsji zawierającej, alginian (Poncelet 1992, Chan 2001b, Chan 2005, Ribeiro 2005, Ching 2008, Song 2013).

Inne dwuwartościowe jony metali (Zn²+, Sr²+ i Ba²+) mogą wiązać i sieciować grupy karboksylowe alginianu w silniejszy i mniej selektywny sposób (Gray 1987, Aslani 1996). Jednak bar i stront nie zostały dopuszczone w zastosowaniach do żywności i paszy. Uważa się, że mikrokapsułki sieciowane jedynie jonami cynku agregują i tworzą grudki o średnicach znacznie większych niż oczekiwane. W związku z tym, sieciowanie przeprowadza się stosując kombinacje jonów Ca²+ i Zn²+ lub tylko jony Ca²+ (Chan 2001a).

Gray (1987) opisał mikroenkapsulację insuliny. Jony cynku wiążą alginian mniej selektywnie niż jony wapnia, dając mniejsze pory w matrycach alginian - cynk. Jednak, nie zaobserwowano znaczących różnic między jonami Zn²+ i Ca²+. Wysoką retencję insuliny w alginianie cynku przypisano wiązaniu insuliny z cynkiem.

Poncelet (1992) opisał technikę emulsyfikacji/żelowania wewnętrznego z wykorzystaniem żelu alginianu wapnia do mikroenkapsulacji bakterii.

Smit (1995) opisał mikroenkapsulację bakterii do ochrony bakterii przed bakteriofagami z zastosowaniem alginianu i wapnia z wykorzystaniem techniki ekstruzji.

Aslani (1996) zaobserwował, że cynk wiąże alginian mniej selektywnie, dostarczając gęstszej matrycy, tak, że uwolnienie z alginianu cynku było opóźnione, w porównaniu do alginianu-wapnia. Jednak główny wniosek był taki, że nie było szczególnych korzyści stosowania jonów cynku zamiast jonów wapnia.

Fundueanu (1998) porównał mikroenkapsulację z alginianem wapnia techniką ekstruzji i emulsyfikacji.

Chan (2001) porównał metody sieciowania alginianu z zastosowaniem Ca²+ i Zn²+ i kombinacji obu i doszedł do wniosku, że kombinacja obu jonów dała najlepsze wyniki.

Chan (2001) porównał mikroenkapsulację metodami żelowania zewnętrznego i wewnętrznego. Wewnętrzne źródło wapnia okazało się korzystniejsze, mimo iż prowadzi do większych porów w mikrokapsułkach, ponieważ zewnętrzny dodatek wapnia powodował rozdzielenie się emulsji, co prowadziło do tworzenia się grudek.

Shu (2002) opisał mikroenkapsulację techniką ekstruzji z wykorzystaniem alginianu, jonów Ca²+ i chitozanu. Do utwardzania alginianu jony wapnia i chitozan zostały połączone w jednym roztworze.

Krasaekoopt (2003) porównał sposoby mikroenkapsulacji probiotyków technikami ekstruzji i emulsyfikacji z jonami wapnia i alginianem.

Chan (2005) porównał mikroenkapsulację metodami żelowania wewnętrznego i zewnętrznego i doszedł do wniosku, że w wyniku żelowania zewnętrznego otrzymuje się mikrokapsułki o mniejszych porach i gładszej powierzchni.

Ribeiro (2005) opisał mikroenkapsulację hemoglobiny techniką emulsyfikacji/żelowania wewnętrznego, w której alginian był sieciowany jonami wapnia i otoczkowany chitozanem.

Xu (2006) opisał metodę, w której roztwór alginianu zmieszano z proszkiem chitozanu i wytłoczono do roztworu Ca²+, po czym chitozan rozpuszczono przez nastawienie pH.

Ching (2008) opisał metodę, w której mikroenkapsułki były wytwarzane techniką żelowania zewnętrznego; alginian sieciowano stosując sole Ca²+ o różnych stopniach rozpuszczalności.

Ma (2008) opisał mikroenkapsulację bakteriofaga Felix O1 specyficznego dla Salmonella sp., prowadzoną techniką ekstruzji w kapsułkach z alginianu wapnia, otoczkowanych chitozanem.

PL 231 923 B1

Yu (2008) opisał mikroenkapsulację techniką ekstruzji. Alginian wtłaczano do mieszaniny jonów wapnia i chitozanu w jednoetapowym procesie utwardzania.

Puapermpoonsiri (2009) opisał mikroenkapsulację bakteriofagów specyficznych dla S. aureus i P. aeruginosa techniką podwójnej emulsji woda/olej/woda (w/o/w)/ekstrakcji rozpuszczalnikiem z wykorzystaniem PLGA, PVA i żelatyny. Wytwarzane mikrokapsułki z powodzeniem liofilizowano.

Ma (2010) opisał mikroenkapsulację bakteriofaga K specyficznego dla S. aureus w kapsułkach z alginianu wapnia otoczkowanego chitozanem techniką ekstruzji. Liofilizacja produktu wymagała dodatku cukrów, takich jak trehaloza.

Song (2013) porównał metody emulsyfikacji/żelowania wewnętrznego i zewnętrznego do mikroenkapsulacji probiotyków z wykorzystaniem matrycy z alginianu wapnia otoczkowanej chitozanem.

W opisie patentowym US 2012 263 826 opisano proces mikroenkapsulacji bakterii probiotycznych, w którym zastosowano mieszaninę alginianu sodu, zdenaturowanych białek i jonów Ca²+. Proces mikroenkapsulacji stosowano do wytworzenia mikrokapsułek dodawanych do napojów. W sposobie i mikrokapsułkach według wynalazku udało się uniknąć stosowania zdenaturowanych białek oraz jonów Ca²+, a wytwarzane mikrokapsułki nadają się w szczególności do stosowania w profilaktyce i terapii infekcji bakteryjnych.

W publikacji Song Chen i wsp. (2013, Journal of Microencapsulation, 30:2,103-115) oceniano wpływ chitozanu lub chitozanu tiolowanego na właściwości mukoadhezyjne mikrokapsułek, do wytworzenia których stosowano alginian sodu i jony Ca²+. W sposobie i mikrokapsułkach według wynalazku w celu utwardzenia mikrokapsułek zamiast jonów Ca²+ zastosowano jony Zn²+, co nieoczekiwanie znacznie zwiększyło efektywność procesu mikroenkapsulacji.

W zgłoszeniu EP 1 537 860 A1 opisano skład i sposób przygotowania szczepionki dla kręgowców, zawierającej antygen w zmodyfikowanych mikrocząsteczkach alginianowych. W procesie tworzenia mikrocząsteczek wykorzystano alginian, olej, jeden z jonów dwuwartościowych takich jak Ca²+ lub Zn²+. Zgodnie z wynalazkiem stosuje się również chitosan, co nieoczekiwanie prowadzi do zwiększenia wydajności procesu enkapsulacji. Badania przeprowadzone z wykorzystaniem mieszaniny jonów cynku i chitozanu podczas procesu mikroenkapsulacji bakteriofagów potwierdziły znaczące zwiększenie wydajności tego procesu z 20% do ponad 60%.

Celem wynalazku jest dostarczenie ulepszonych sposobów mikroenkapsulacji, mikrokapsułek otrzymanych takimi ulepszonymi sposobami oraz zastosowań tych mikrokapsułek.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób enkapsulacji materiału zawierającego bakteriofagi obejmujący etapy:

(a1) przygotowania wodnego roztworu lub zawiesiny materiału enkapsułowanego, (b1) podgrzewania wodnego roztworu lub zawiesiny materiału enkapsułowanego do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia pierwszego biokompatybilnego polimeru w wodnym roztworze lub zawiesinie, bez negatywnego wpływu na właściwości materiału enkapsułowanego, (c1) rozpuszczania pierwszego biokompatybilnego polimeru w wodnym roztworze lub zawiesinie materiału enkapsułowanego, albo (a2) przygotowania wodnego roztworu pierwszego biokompatybilnego polimeru, (b2) podgrzewania wodnego roztworu pierwszego biokompatybilnego polimeru do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia lub zawieszenia w wodnym roztworze materiały, enkapsułkowego lub negatywnego wpływu na jego właściwości, (c2) rozpuszczania lub zawieszania materiału enkapsułowanego w roztworze wodnym/zawiesinie, oraz (d) odpowietrzania roztworu lub zawiesiny otrzymanych w etapie c, (e) emulsyfikacji roztworu lub zawiesiny otrzymanych w etapie (d) w biokompatybilnym oleju zawierającym surfaktant, do utworzenia mikrokropli, (f) utwardzania mikrokropli przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego jony Zn²⁺ i drugi biokompatybilny polimer, do emulsji otrzymanej w etapie (e) w celu utworzenia mikrokapsułek, przy czym jako pierwszy biokompatybilny polimer stosuje się alginian, korzystnie alginian sodu, natomiast jako drugi biokompatybilny polimer stosuje się chitozan.

PL 231 923 B1

Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje dodatkowo etap (g) izolacji mikrokapsułek z biokompatybilnego oleju, korzystnie dodatkowo etap (h) przemywania mikrokapsułek wodą lub roztworem wodnym, korzystnie dodatkowo etap (i) suszenia mikrokapsułek.

Korzystnie sposób według wynalazku obejmuje dodatkowo formułowanie mikrokapsułek do kompozycji obejmującej dodatek do żywności lub pasz lub środek pomocniczy farmaceutycznie dopuszczalny.

Korzystnie, stosowany w sposobie według wynalazku enkapsułowany materiał zawiera substancję wybraną z grupy obejmującej: mieszaninę bakterii i bakteriofagów, jeden lub więcej szczepów bakteriofagów odpowiednich do zapobiegania lub zwalczania infekcji wywołanych przez patogenne szczepy z gatunku Salmonella sp., w szczególności S. enterica serowar Enteritidis, jeden lub więcej szczepów bakteriofagów wybranych spośród: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz/lub PCM F/00071 (szczep 3sent1) zdeponowanych 7 czerwca 2011 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów.

Korzystnie, enkapsułowany materiał zawiera jeden lub więcej szczepów bakterii probiotycznych, korzystnie wybranych spośród: Lactobacilli, Bifidobacteria oraz Lactococci.

Korzystnie, stosowany w sposobie według wynalazku enkapsułowany materiał jest podgrzewany do temperatury z zakresu 38-40°C.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku rozpuszczanie pierwszego biokompatybilnego polimeru w roztworze wodnym lub zawiesinie materiału enkapsułowanego jest wspomagane mieszaniem mechanicznym lub wstrząsaniem, zwłaszcza z wykorzystaniem wstrząsarki laboratoryjnej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku odpowietrzanie przeprowadza się przez pozostawienie roztworu lub zawiesiny do odstania w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku biokompatybilny olej jest wybrany spośród: olejów dopuszczonych do zastosowania w żywności lub farmaceutykach, olejów roślinnych, oleju kukurydzianego, słonecznikowego, rzepakowego oraz oliwy z oliwek.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku surfaktant jest wybrany spośród: Tween®80, lecytyny, Span®80 i Span®85.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku emulsyfikację przeprowadza się przez mieszanie mechaniczne roztworu lub zawiesiny.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku emulsyfikację przeprowadza się przez mieszanie mechaniczne roztworu lub zawiesiny, przez 17 do 25 minut, przy około 950 do około 1050 obr./min., w temperaturze w zakresie od około 20 do około 25°C.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku emulsyfikację prowadzi się przez mieszanie roztworu lub zawiesiny przez około 20 minut, przy około 1000 obr./min., w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku emulsyfikację prowadzi się przez mieszanie w 250 ml kolbach, przez około 20 minut, przy około 1000 obr./min., w temperaturze pokojowej.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku emulsyfikację prowadzi się przez homogenizację.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego jony cynku.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku utwardzanie kropli przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego ZnCl2.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku utwardzanie kropli przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego około 0,05M ZnCl2.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie oddzielonych od siebie mikrokropli.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie oddzielonych od siebie mikrokropli o średnicy około 4 do 8 mm.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie oddzielonych od siebie mikrokropli o średnicy około 6 mm.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku oddzielanie mikrokapsułek następuje poprzez wirowanie oraz usuwanie nadmiaru roztworu enkapsulacyjnego.

Korzystnie, w sposobie według wynalazku przemywanie mikrokapsułek prowadzi się w około 4°C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest mikrokapsułka zawierająca alginian cynku i chitozan oraz materiał enkapsułowany charakteryzująca się tym, że materiał enkapsułowany zawiera bakteriofagi, korzystnie bakterie i bakteriofagi.

PL 231 923 B1

Korzystnie mikrokapsułka według wynalazku zawiera materiał enkapsułowany, 3% alginianu cynku i 0,2% chitozanu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zdefiniowana powyżej mikrokapsułka według wynalazku do zastosowania jako środek leczniczy, zwłaszcza do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu infekcji bakteryjnych.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest pożywienie lub napoje dla ludzi lub zwierząt zawierające mikrokapsułki otrzymane zdefiniowanym powyżej sposobem według wynalazku lub zawierające zdefiniowane powyżej mikrokapsułki według wynalazku.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zdefiniowanej powyżej mikrokapsułki według wynalazku lub otrzymanej zdefiniowanym powyżej sposobem według wynalazku, do wytwarzania środków leczniczych, zwłaszcza do wytwarzania środków leczniczych stosowanych w profilaktyce lub leczeniu infekcji bakteryjnych.

Szczegółowy opis wynalazku

Wynalazek dostarcza sposobu enkapsulacji materiału, obejmującego następujące etapy:

(a) przygotowanie wodnego roztworu lub zawiesiny materiału enkapsułowanego, (b) podgrzanie roztworu wodnego lub zawiesiny do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia pierwszego biokompatybilnego polimeru w wodnym roztworze lub zawiesinie bez negatywnego wpływu na właściwości materiału enkapsułowanego, (c) rozpuszczenie pierwszego biokompatybilnego polimeru w wodnym roztworze/zawiesinie, (d) odpowietrzenie roztworu lub zawiesiny otrzymanej w etapie (c), (e) emulsyfikacja roztworu lub zawiesiny otrzymanej w (d) w biokompatybilnym oleju, zawierającym surfaktant, w celu utworzenia mikrokropli, (f) utwardzenie mikrokropli przez wkroplenie wodnego roztworu zawierającego jony Zn²+ i drugi biokompatybilny polimer do emulsji uzyskanej w (e), w celu utworzenia mikrokapsułek.

Odmiana wynalazku dostarcza sposobu enkapsulacji materiału obejmującego alternatywne etapy (a) do (c):

(a) przygotowanie wodnego roztworu pierwszego biokompatybilnego polimeru, (b) podgrzanie wodnego roztworu pierwszego biokompatybilnego do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia lub zawieszenia materiału enkapsułowanego w roztworze wodnym bez negatywnego wpływu na właściwości tego materiału, (c) rozpuszczenie lub zawieszenie materiału enkapsułowanego w wodnym roztworze/zawiesinie.

Wynalazek dostarcza sposobu utwardzania mikrokropli do uzyskania mikrokapsułek, obejmującego następujące etapy: (a) dostarczenie mikrokropli w emulsji zawierającej (i) wodny roztwór lub zawiesinę materiału enkapsułowanego i pierwszego biokompatybilnego polimeru i (ii) biokompatybilny olej zawierający surfaktant; oraz (b) utwardzanie mikrokropli przez wkroplenie do emulsji dodatku wodnego roztworu zawierającego jony Zn²+ i drugi biokompatybilny polimer z wytworzeniem mikrokapsułek.

Przewaga sposobów według wynalazku nad sposobami według stanu techniki wynika z wykorzystania techniki emulsyfikacji/żelowania zewnętrznego, gdzie dla uzyskania odrębnych mikrokapsułek pierwszy biokompatybilny polimer jest sieciowany roztworem, w którym połączone są jony Zn²+ i drugi biokompatybilny polimer, w procesie jednoetapowym. W sposobach według wynalazku unika się utraty wydajności przez agregację mikrokapsułek i wytwarza się mikrokapsułki, które wykazują dobrą retencję enkapsułowanego materiału.

Sposoby według wynalazku mogą obejmować również etap (g) odzyskiwania mikrokapsułek z biokompatybilnego oleju. Mikrokapsułki można izolować z biokompatybilnego oleju licznymi sposobami, na przykład przez odwirowanie lub sedymentację mikrokapsułek i usunięcie oleju z mikrokapsułek, np. przez dekantację lub odsysanie. Do oddzielenia mikrokapsułek od oleju można również wykorzystać filtrację.

Sposoby według wynalazku mogą obejmować jeszcze etap (h) przemywania mikrokapsułek wodą lub roztworem wodnym. Odpowiednie roztwory wodne do stosowania w etapie przemywania obejmują roztwór chlorku cynku w niskich stężeniach (na przykład ZnCI2 w stężeniu od 0,008 do 0,012 M, korzystnie około 0,01 M).

Sposoby według wynalazku mogą obejmować również etap (i) suszenia mikrokapsułek. Suszenie mikrokapsułek można przeprowadzić metodami takimi jak liofilizacja, suszenie na powietrzu, desykacja i suszenie sublimacyjne. Specjalista w dziedzinie będzie w stanie wybrać metody odpowiednie do suszenia mikrokapsułek bez niekorzystnego wpływania na właściwości enkapsułowanego materiału. Dla

PL 231 923 B1 mikrokapsułek zawierających zarówno bakterie jak i bakteriofagi lub same bakterie, suszenie można przeprowadzić przez liofilizację.

Mikrokapsułki otrzymane sposobem według wynalazku mogą być formułowane z substancjami pomocniczymi do kompozycji, na przykład kompozycji obejmującej materiał klasy spożywczej dla ludzi lub zwierząt lub farmaceutycznie dopuszczalną substancję pomocniczą.

Sposoby według wynalazku są użyteczne do enkapsulacji szerokiej gamy materiałów. Na przykład, materiał, który ma być enkapsułowany, może być wybrany spośród mieszaniny bakterii i bakteriofagów, bakterii, bakteriofagów, białek, peptydów, enzymów, środków o działaniu profilaktycznym, substancji terapeutycznie aktywnych, substancji leczniczych dla ludzi lub weterynaryjnych substancji leczniczych, barwników, tuszu, komórek roślinnych, komórek zwierzęcych, komórek drożdży, oligonukleotydów, probiotyków, witamin, pożywienia i dodatków do żywności.

W korzystnych wykonaniach wynalazku materiał, który ma być enkapsułowany, obejmuje bakterie i bakteriofagi. Bakteriofagi lizujące bakterie patogenne mogą być mieszane z bakteriami probiotycznymi i enkapsułowane sposobami według wynalazku z dostarczeniem mikrokapsułek według wynalazku. Takie mikrokapsułki są użyteczne w leczeniu lub zapobieganiu infekcjom bakteryjnym, np. u zwierząt, szczególnie u zwierząt hodowlanych. Mikrokapsułki mogą być podawane doustnie w odpowiedniej kompozycji. Mikrokapsułki mogą być dodawane do pasz, w formie stałej lub płynnej do podawania doustnego.

W korzystnym wykonaniu, materiał enkapsułowany może obejmować jeden lub więcej szczepów bakteriofagów odpowiednich do zapobiegania lub zwalczania infekcji patogennymi szczepami Salmonella, np. S. enterica serowar Enteritidis. Odpowiednio, materiał enkapsułowany może składać się z jednego lub kilku bakteriofagów wybranych spośród: PCM F/00069 (fag 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) i PCM F/00071 (szczep 3sent1), zdeponowanych 7 czerwca 2011 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów.

Enkapsułowane bakteriofagi są użyteczne do zwalczania i zapobiegania infekcjom u zwierząt hodowlanych, zwłaszcza u drobiu, zainfekowanych lub podatnych na patogenne szczepy bakterii wrażliwych na te bakteriofagi. Patogenne szczepy Salmonella stanowią poważne zagrożenie ekonomiczne dla ferm drobiu; zakażony drób wchodzący w łańcuch pokarmowy stanowi zagrożenie dla ludzkiego zdrowia. Enkapsułowane bakteriofagi, na przykład, tu opisane, mogą być podawane zagrożonym zwierzętom z wodą lub pożywieniem, z przerwami od jednego do siedmiu dni.

W sposobach według wynalazku, materiał enkapsułowany może obejmować jedną lub więcej bakterii probiotycznych, np. jedną lub więcej bakterii probiotycznych wybranych spośród Lactobacillus sp., Bifidobacterium sp. i Lactococcus sp.

W sposobach według wynalazku pierwszy biokompatybilny polimer może być wybrany spośród alginianu, chitozanu, maltodekstryny i celulozy. Korzystnym pierwszym biokompatybilnym polimerem jest alginian, taki jak alginian sodu.

Zgodnie z korzystnymi sposobami według wynalazku, szczególnie tymi do enkapsulacji mieszanin bakterii/bakteriofagów lub samych bakterii, materiał, który ma być enkapsułowany, jest dostarczony w roztworze lub zawiesinie, i jest podgrzewany do temperatury z zakresu 38-40°C. Podgrzewanie zawiesiny poprawia rozpuszczalność pierwszego bio-kompatybilnego polimeru, którym korzystnie jest alginian, najkorzystniej alginian sodu w zawiesinie materiału enkapsułowanego.

Rozpuszczanie pierwszego biokompatybilnego materiału w wodnym roztworze lub zawiesinie materiału enkapsułowanego można dalej wspomagać mieszaniem mechanicznym lub wstrząsaniem, stosując mieszalnik typu vortex.

Odpowietrzanie roztworu lub zawiesiny materiału enkapsułowanego można przeprowadzić przez pozostawienie roztworu lub zawiesiny do odstania w temperaturze pokojowej. Mogą być stosowane inne metody odpowietrzania, które determinowane są przez właściwości materiału enkapsułowanego. Do odpowietrzania można wykorzystać filtrację, jednak jest ona mniej korzystna, gdy materiałem enkapsułowanym są bakterie/bakteriofagi lub same bakterie, ponieważ filtracja może powodować utratę komórek bakteryjnych, które mają być enkapsułowane.

W metodach według wynalazku można stosować szeroką gamę olejów biokompatyblinych; odpowiedni biokompatybilny olej, na przykład, może być wybrany spośród oleju o jakości spożywczej lub farmaceutycznej, oleju roślinnego, oleju kukurydzianego, oleju słonecznikowego, oleju canola, oleju sojowego, oleju palmowego, oleju orzechowego, oleju rzepakowego, oleju kokosowego, oleju sezamowego i oliwy z oliwek.

PL 231 923 B1

Korzystnie biokompatybilny olej zawiera surfaktant; stosowanie surfaktantu jest zalecane, gdy wymagane są mikrokapsułki o jednorodnej wielkości, ponieważ bez surfaktanta krople wykazują tendencję do agregacji. W sposobach według wynalazku mogą być stosowane rozmaite surfaktanty znane w dziedzinie korzystnie surfaktanty obejmują Tween®80, lecytynę, Span®80 i Span®85; w konkretnych wykonaniach sposobów według wynalazku korzystnym surfaktantem jest Tween®80.

Emulsyfikację na ogół przeprowadza się przez mieszanie mechaniczne roztworu lub zawiesiny. Emulsyfikację można przeprowadzić przez mieszanie roztworu lub zawiesiny przez około 17 do około 25 minut, przy obrotach około 950 do około 1050 obr./min. w temperaturze w zakresie od około 20 do około 25°C. W korzystnych wykonaniach emulsyfikację prowadzi się przez mieszanie roztworu lub zawiesiny przez około 20 minut, przy około 1000 obr./min. w temperaturze pokojowej, najkorzystniej w 250 ml kolbach (Erlenmeyera) przez około 20 minut przy około 1000 obr./min. w temperaturze pokojowej.

W zależności od materiału enkapsułowanego emulsyfikację można również przeprowadzić przez homogenizację. Homogenizacja nie jest zazwyczaj stosowana do enkapsulacji bakteriofagów i bakterii lub samych bakterii, ponieważ może skutkować spadkiem ich przeżywalności.

Utwardzanie mikrokropli, które są sieciowane biokompatybilnym polimerem, przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego jony Zn²+, który może być dostarczony jako roztwór wodny zawierający ZnCl2. W korzystnych wykonaniach sposobów według wynalazku roztwór wodny zawiera około. 0,05 M ZnCl2. Jony Zn²+ są dostarczone w wodnym roztworze zawierającym drogi biokompatybilny polimer, przy czym korzystnie drogi biokompatybilny polimer jest wybrany spośród chitozanu, poli-L-lizyny, kappa-karagenu, żelatyny, kwasu borowego i polioctanu winylu.

W szczególnie korzystnych sposobach według wynalazku drogim biokompatybilnym polimerem jest chitozan.

Dla uzyskania oddzielnych mikrokapsułek, korzystnie, utwardzanie mikrokropelek prowadzone jest przez wkraplanie odrębnych mikrokropelek, korzystnie przez wkraplanie odrębnych mikrokropelek o średnicy około 4 do 8 mm, najkorzystniej przez wkraplanie odrębnych mikrokropelek o średnicy około 6 mm.

Mikrokapsułki o średnicach poniżej 1 mm można łatwo zastosować, jako dodatek do żywności i pasz, bez wpływania na konsystencję i smak żywności i paszy. Mikrokapsułki według wynalazku mogą być dodawane do podawanej żywemu inwentarzowi wody pitnej. Materiał enkapsułowany jest chroniony przed niekorzystnymi warunkami środowiska panującymi podczas pasażu przez układ pokarmowy. Enkapsulacja chroni również enkapsułowany materiał przed degradacją podczas przechowywania. Membrany mikrokapsułek według wynalazku zostały tak zaprojektowane, aby zapewnić zmniejszoną wielkość porów przy niskich wartościach pH, tak, że enkapsułowany materiał swobodnie przemieszcza się w rdzeniu i tak, że enkapsułowany materiał uwalnia się w obojętnym pH w jelicie. Ponadto, mikrokapsułki obejmujące alginian i chitozan zgodnie z wynalazkiem chronią enkapsułowany materiał podczas etapów suszenia, utrzymując jego integralność i żywotność.

Korzystnie, twórcy stwierdzili, że optymalizacja procesu emulsyfikacji, zapewniająca odpowiedni stosunek fazy ciągłej do nieciągłej i prędkość mieszania, przed utwardzeniem roztworem z Zn²+ i drugim biokompatybilnym polimerem, umożliwiła wytworzenie jednorodnych mikrokapsułek, o akceptowalnych zakresach wielkości, bez tworzenia się agregatów mikrokapsułek i związanego z tym spadku wydajności.

Po utworzeniu mikrokapsułki można izolować z nadmiaru roztworu emulgującego. W dziedzinie są opisane liczne metody oddzielania mikrokapsułek z roztworu emulgującego.

Odpowiednio, izolację mikrokapsułek można przeprowadzić przez wirowanie i usuwanie nadmiaru roztworu emulgującego. Po wyizolowaniu, mikrokapsułki mogą być poddane jednemu lub więcej etapom przemywania w celu usunięcia jakiejkolwiek pozostałości roztworu emulgującego. Przemywanie mikrokapsułek można przeprowadzić stosując wodę lub inny odpowiedni roztwór wodny. Temperatura, w której przeprowadza się etap przemywania, może być wybrana przez specjalistę w dziedzinie, w zależności od materiału, który był enkapsułowany. W korzystnych sposobach według wynalazku, szczególnie tych obejmujących enkapsulację bakteriofaga i bakterii lub samych bakterii, przemywanie mikrokapsułek przeprowadza się w około 4°C.

W sposobach według wynalazku jony Ca²+ nie są wykorzystywane do sieciowania/utwardzania mikrokapsułek.

Wynalazek dostarcza również mikrokapsułkę możliwą do otrzymania lub otrzymaną sposobem według wynalazku, na przykład mikrokapsułkę zasadniczo taką, jak tu opisana w opisie, przykładach i figurach.

PL 231 923 B1

Wynalazek dostarcza mikrokapsułkę składającą się z materiału enkapsułowanego, alginianu cynku i chitozanu; korzystnie zawierającą około 2 do 4% (wag./wag.) alginianu cynku i około 0,1 do 0,4% (wag./wag.) chitozanu; najkorzystniej obejmującą około 3% (wag./wag.) alginianu cynku i około 0,2% (wag./wag.) chitozanu.

Wynalazek dostarcza mikrokapsułkę obejmującą bakterie, bakteriofagi, alginian cynku i chitozan; korzystnie zawierającą około 2 do 4% (wag./wag.) alginianu cynku i około 0,1 do 0,4% (wag./wag.) chitozanu; najkorzystniej około 3% (wag./wag.) alginianu cynku i około 0,2% (wag./wag.) chitozanu, jeszcze korzystniej zawierającą 3% (wag./wag.) alginianu cynku i 0,2% (wag./wag.) chitozanu.

Mikrokapsułki według wynalazku nie zawierają alginianu wapnia i nie zawierają mieszaniny alginianu wapnia i alginianu cynku.

Wynalazek dostarcza mikrokapsułkę według wynalazku do zastosowania jako lek. Mikrokapsułki według wynalazku mogą być stosowane w profilaktyce lub leczeniu infekcji bakteryjnych. Wynalazek dostarcza dalej pożywienia lub napoju dla ludzi lub zwierząt zawierającego mikrokapsułki według wynalazku. Wynalazek dostarcza również zastosowania mikrokapsułki według wynalazku do wytwarzania leku.

Ponadto, wynalazek dostarcza zastosowania mikrokapsułki według wynalazku do wytwarzania leku do profilaktyki lub leczenia infekcji bakteryjnych.

Co więcej, wynalazek dostarcza zastosowania mikrokapsułki według wynalazku w produkcie użytecznym w dziedzinie wybranej spośród medycyny, weterynarii, środków farmaceutycznych, żywności dla ludzi i pasz, rolnictwa, nutraceutyków, probiotyków, oligonukleotydów, składników żywności i pasz wrażliwych na sole żółci, enzymów, fermentacji, fotografii, grafiki, poligrafii, przemysłu tekstylnego, barwników i oczyszczania ścieków.

Dostarczony jest również produkt zawierający mikrokapsułki według wynalazku.

Dodatkowo, wynalazek dostarcza sposobów leczenia ludzi lub zwierząt obejmujących podawanie mikrokapsułek według wynalazku.

Lista figur:

Figura 1 przedstawia porównanie wydajności mikroenkapsulacji dla różnych proporcji jonów utwardzających, a także samych jonów cynku lub wapnia.

Figury 2 A, B i C: Mikrokapsułki przedstawione na zdjęciach mikroskopowych (standardowy mikroskop, powiększenie 480x) zostały przygotowane według protokołu enkapsulacji opisanego w Przykładzie 3 i zawierają bakterie szczepu Lactobacillus casei. Widoczne krople oleju stanowią pozostałość po etapie emulsyfikacji.

Figura 3 przedstawia wydajność mikroenkapsulacji dla zoptymalizowanego procesu opisanego w Przykładzie 3. Wydajność obliczono w odniesieniu do stężenia fagów w mieszaninie enkapsulacyjnej (suma objętości oleju, roztworu alginianu i roztworu utwardzającego).

Figura 4 przedstawia częstość występowania cząstek o danej średnicy, która definiowana jest jako rozkład prawdopodobieństwa. Ciemnoszara seria danych oznacza gęstość prawdopodobieństwa. Dzięki temu częstość występowania cząstek w jednym rozmiarze mogła zostać porównana z częstością występowania cząstek w innym rozmiarze (skala po lewej stronie). Wspomniana skala przedstawia jedynie wzajemne proporcje między liczbą mikrokapsułek. Najważniejszą informacją uzyskaną na podstawie tego wykresu było potwierdzenie kompatybilności otrzymanych wyników z teoretycznym rozkładem Gaussa.

PL 231 923 Β1

Tabela 1

Wartości interpolowane	% mikrokapsułek o	średnica mikrokapsułek
[%>]	danej wielkości	[μπι]
97,94%	0,46%	100
97,48%	0,92%	200
96,56%	3,61%	300
92,95%	8,39%	400
84,56%	12,21%	500
72,35%	14,65%	600
57,80%	16,69%	700
42,21%	15,71%	800
26,50%	16,24%	900
11,26%	8,09%	1000
3,17%	1,41%	2000
1,76%	-	3000
SUMA	96,18%	-

Ponad 96% wytworzonych mikrokapsułek miało średnicę w zakresie 400-1000 μπι, co potwierdza wysoką powtarzalność sposobów według wynalazku (Tabela 1).

Przykłady

Przykład 1: Przygotowanie materiału do enkapsulacji - Przygotowanie zawiesiny bakteriofagów przy wykorzystaniu kultury bakterii

A: Przygotowanie płynnego podłoża L8 do propagacji szczepu bakterii gospodarzy

2,5 g podłoża LB (Bio-Shop) rozpuszczono w 90 ml wody kranowej. Dodano próbkę 20 μΙ 5M roztworu NaOH (przygotowanego w wodzie dejonizowanej) i uzyskany roztwór uzupełniono do 100 ml wodą kranową, następnie mieszano, aby zapewnić rozpuszczenie się podłoża LB. Otrzymane płynne podłoże LB rozlano do 5 kolb Erlenmeyera o pojemności 100 ml każda. 5 kolb Erlenmayera zawierających po 20 ml płynnego podłoża LB autoklawowano (15 min w 126°C, 1,4 * 10⁵ Pa) i przechowywano w temperaturze pokojowej.

B: Propagacja szczepu bakterii gospodarzy

Próbkę 10 μΙ bakterii z 25% zapasu glicerynowego przeniesiono do 20 ml płynnego podłoża LB w kolbie Erlenmeyera o pojemności 100 ml, przygotowanego jak opisano w (A). Zaszczepione płynne

PL 231 923 B1 podłoże LB hodowano w inkubatorze (Ecotron model, Infors) przez noc (16-18 godz.) w 37°C z mieszaniem (140 obr./min.). Uzyskana hodowla została wykorzystana bezpośrednio w etapach (D) lub (G) poniżej lub była przechowywana w 4°C do 1 tygodnia do dalszego użytku.

C: Przygotowanie płynnego podłoża M9+ do propagacji szczepu bakteriofagów

I, 13 g podłoża M9 (Bio-Shop) przelano do kolby Erlenmayera o pojemności 200 ml i dodano 97 ml wody kranowej, aby rozpuścić bulion M9. Uzyskane podłoże M9 autoklawowano (15 min w 126°C, 1,4 * 10⁵ Pa), a następnie ostudzono do temperatury pokojowej. Do wyautoklawowanego płynnego podłoża M9 dodano 1 ml 20% roztworu glukozy (w wodzie dejonizowanej), i 1 ml 1 M MgSO 2 ( wytworzonego w wodzie dejonizowanej) i 1 ml 0,1 M CaCI2 (wytworzonego w wodzie dejonizowanej), aby uzyskać płynne podłoże M9+.

Podłoże M9+ przeniesiono do zlewki o pojemności 200 ml i mieszano stosując mieszadło magnetyczne (model Maxi Direct, Thermo Scientific) przez co najmniej 1 minutę, następnie sterylizowano filtrem (filtr 0,22 μm) i przeniesiono do sterylnej 300 ml kolby Erlenmayera. Otrzymane sterylne płynne podłoże M9+ wykorzystano bezpośrednio w etapie (D) lub przechowywano w sposób sterylny.

D: Propagacja szczepu bakteriofagów

Próbkę 200 μl zawiesiny bakterii, otrzymanej jak opisano w (B) powyżej, przeniesiono do 100 ml płynnego podłoża M9+ (otrzymanego jak opisano w C powyżej) w kolbie Erlenmayera. Zaszczepione podłoże M9+ hodowano w 37°C, w inkubatorze (Ecotron model, Infors) z zastosowaniem mieszania (140 obr./min.) do uzyskania gęstości optycznej (OD600) od 0,5 do 0,8. Próbkę 100 μl bakteriofagów z 25% zapasu glicerynowego dodano do hodowli M9+ w celu namnożenia szczepu bakteriofaga w hodowli bakteryjnej. Zawiesinę bakterii/fagów inkubowano przez 3 godz. w 37°C w inkubatorze (Ecotron model, Infors) stosując opcję z mieszaniem (140 obr/min.). Otrzymaną płynną hodowlę M9+ bakteryjną/fagową oziębiono do 4°C i przechowywano przez noc (16-18godz.). Następnie zawiesinę bakteryjną/fagową sterylizowano przez filtr (0,22 μm), w celu usunięcia komórek bakterii oraz resztek komórkowych z zawiesiny bakteriofagów, aby uzyskać sterylną (wolną od bakterii) zawiesinę fagową w płynnym podłożu M9+. Jałową zawiesinę fagów w płynnym podłożu M9+ poddano testowi tworzenia łysinek (PFU), aby ocenić liczbę fagów, które wytworzyły specyficzne łysinki (czyste strefy) na bakteryjnej murawce rosnącej na płytce agarowej, w celu dostarczenia miana PFU/ml. Sterylną zawiesinę fagową w płynnym podłożu M9+ przechowywano w sposób sterylny w temperaturze 4°C lub stosowano bezpośrednio w etapie H, jeżeli PFU/ml było w zakresie od 1x10⁸do 1x10¹¹.

E: Przygotowanie płynnego podłoża LB do namnażania bakteriofagów g podłoża LB (Bio-Shop) wsypano do zlewki o pojemności co najmniej 1000 ml. Dodano około 900 ml wody kranowej do 25 g podłoża LB. Dodano próbkę 200 μl 5M roztworu NaOH (przygotowanego w wodzie dejonizowanej) i objętość uzupełniono do 1000 ml wodą kranową. Płynne podłoże LB mieszano stosując mieszadło magnetyczne (model Maxi Direct, Thermo Scientific) przez co najmniej 1 minutę. Płynne podłoże LB (1000 ml) przeniesiono do 2000 ml kolby BD Falcon Erlenmayera (BD BioSciences) i autoklawowano (15 min., 126°C, 1,4 * 10⁵ Pa), a następnie albo przechowywano w temperaturze pokojowej albo stosowano bezpośrednio w G poniżej.

F: Przygotowanie płynnego podłoża M9+ do namnażania bakteriofagów

II, 3 g podłoża M9 (Bio-Shop) wsypano do 2000 ml kolby Falcona Erlenmayera BD (BD BioSciences); do podłoża M9 dodano 970 ml wody z kranu i płynne M9 autoklawowano 15 min., 126°C, 1,4 * 10⁵ Pa), następnie ostudzono do temperatury pokojowej. Do autoklawowanego płynnego podłoża M9 dodano następujące dodatki: 10 ml 20% glukozy (przygotowanej w wodzie dejonizowanej) i 10 ml 1M MgSO4 (przygotowanego w wodzie dejonizowanej), i 10 ml 0,1 M CaCI2 (przygotowanego w wodzie dejonizowanej), uzyskano płynne podłoże M9+, które było mieszane z zastosowaniem mieszadła magnetycznego (model Maxi Direct, Thermo Scientific) przez co najmniej 1 minutę. Podłoże M9+ następnie sterylizowano przez filtr (0,22 μm) i albo przechowywano w sposób sterylny w temperaturze pokojowej w butli do przechowywania, albo stosowano bezpośrednio w H poniżej.

G: Proces namnażania bakteriofagów - pre-hodowla szczepu bakterii gospodarzy

Objętością 2 ml zawiesiny bakterii otrzymanej w etapie B powyżej zainokulowano 1000 ml płynnego podłoża LB (otrzymanego w E powyżej) w 2000 ml kolbie BD Falcon Erlenmeyera (BD Bio Science). Zaszczepione płynne podłoże LB hodowano w inkubatorze (Ecotron model, Infors) w 37°C z mieszaniem (140 obr./min.) do uzyskania gęstości optycznej hodowli (OD600) - 0,5 do 0,8. Płynną hodowlę LB przeniesiono do 2 x 500 butelek wirowniczych Falcon i umieszczono w wirniku (rotor 4784) wirówki (model Rotina 420R, Hettich). W celu oddzielenia bakterii od płynnego podłoża LB komórki

PL 231 923 B1 bakteryjne osadzono przez wirowanie (20 min, przy 4000 g, w 4°C), a supernatant zdekantowano ręcznie z każdej probówki Falcon. Komórki bakterii pozostające w osadzie na dnie obu probówek Falcon wykorzystywano bezpośrednio w etapie H.

H: Proces namnażania bakteriofagów w celu wytworzenia zawiesiny szczepu bakteriofaga

Każdy z osadów komórek bakterii gospodarzy (otrzymany jak opisano w G, po prehodowli w płynnym podłożu M9+) zawieszono w 500 ml płynnego podłoża M9+, które zostało wytworzone jak opisano w F powyżej. Obie 500 ml zawiesiny (całość 1000 ml) otrzymane w etapie H przeniesiono do kolby 2000 ml Falcon Erlenmeyera (BD BioSciences). Dla namnożenia bakteriofaga otrzymane zawiesiny bakteryjne inokulowano fagiem (w płynnym podłożu LB otrzymanym jak opisano powyżej) i zawiesinę bakteriofaga/faga hodowano przez 6 godz. w 37°C w inkubatorze (Ecotron model, Infors) z mieszaniem (140 obr./min.). Otrzymaną płynną hodowlę M9+ schłodzono do 4°C i przechowywano przez noc (16-18 godz.), komórki bakteryjne i reszty komórkowe usunięto z zawiesiny bakteriofagowej przez sterylizację na filtrze 0,22 μm. Miano faga (PFU/ml) w wysterylizowanej zawiesinie fagowej zmierzono przeprowadzając test PFU. W celu potwierdzenia jakości, sterylną, płynną zawiesinę faga w M9+ poddano procedurze izolacji DNA fagów przez zastosowanie testu Phage DT-B PCR.

P r z y k ł a d 2: Początkowe doświadczalne wytwarzanie mikrokapsułek zawierających bakteriofagi i/lub bakterie

We wstępnych eksperymentach zbadano wpływ dwóch parametrów na wydajność enkapsulacji.

2.1 Stężenie alginianu sodu

Pierwszym badanym parametrem było stężenie alginianu sodu. Dla uzyskania możliwie najgęstszego sieciowania, rozpatrywano wzrastające stężenie biopolimeru alginianu. Jednak powyżej 3% (wag./obj.) roztwory alginianu osiągały lepkość, która była wystarczająco wysoka, aby uniemożliwić emulsyfikację w następnych etapach procesu. Wyższe stężenia zostały również odrzucone ze względu na potencjalne trudności związane z powiększeniem skali produkcji kapsułek do skali półtechnicznej, a następnie do skali przemysłowej. Wytworzenie wysoce lepkiego roztworu polimeru wymagałoby wykorzystania silnych mieszadeł mechanicznych i dużych nakładów energii. W rezultacie podczas optymalizacji procesu przebadano tylko 2% i 3% roztwory alginianów.

2.2. Badano dodatek jonów utwardzających w różnych stężeniach i proporcjach.

Analizowano dodatek jonów utwardzających w różnych stężeniach i proporcjach. Dla każdej kombinacji, na podstawie wyników miareczkowania pośredniego odwróconego, stosowano nadmiar jonów wapnia lub cynku, aby zapewnić całkowite usieciowanie alginianu. Kationy wapnia i cynku wybrano do dalszych badań, ale kationy wapnia i cynku wiążą reszty kwasu alginowego z różną specyficznością. Zbadano sieciowanie z tymi dwoma wybranymi utwardzaczami w różnych proporcjach, w celu oceny czy można osiągnąć znaczącą poprawę zatrzymania w mikrokapsułkach badanego materiału enkapsułowanego, bakteriofagów.

Wyniki wyraźnie wskazują, że wyższe stężenie roztworu alginianu poprawiło wydajność zatrzymywania bakteriofagów w mikrokapsułkach. Jednak niezwykle zaskakujące były wyniki uzyskane dla kapsułek sieciowanych mieszaniną jonów wapnia i cynku (Figura 1).

Ze względu na różnice w powinowactwie kationów do reszt kwasu mannuronowego i glukuronowego, spodziewano się znacznej poprawy wydajności procesu. Tymczasem w praktyce zaobserwowano, że zastosowanie obu jonów utwardzających Ca²+ i Zn²+ jednocześnie, zmniejszyło „szczelność” membrany dla każdego przebadanego stosunku Ca²+ i Zn²+ kilka- a nawet kilkunastokrotnie, w porównaniu do mikrokapsułek sieciowanych jednym rodzajem kationów. Bez wiązania się z jakąkolwiek teorią, prawdopodobnie jony Ca²+ i Zn²+ oddziaływają ze sobą przez konkurowanie do tych samych reszt karboksylowych, co z kolei zwiększa przepuszczalność membran alginianowych. Ze względu na pomijalne różnice w wydajności immobilizacji, w kolejnych etapach optymalizacji procesu brany był pod uwagę 3% roztwór alginianu sodu usieciowany tylko jonami wapnia lub tylko jonami cynku.

Mimo zdecydowanej poprawy wydajności mikroenkapsulacji, z początkowych 10% do ponad 20%, proces pozostaje wciąż technologicznie nieakceptowany. Jak już wcześniej omówiono, zastosowano również chitozan. Pierwsza modyfikacja obejmowała przygotowanie kapsułek przy zmniejszonym o połowę stężeniu jonów sieciujących, a po usunięciu fazy olejowej i nadmiaru fazy wodnej, nakładanie drugiej warstwy biopolimeru, chitozanu.

Pomimo użycia roztworu alginianu o wyższym stężeniu, proces wykorzystujący zmodyfikowany protokół był istotnie mniej wydajny w porównaniu do protokołu wyjściowego.

PL 231 923 B1

W związku z tym, opracowano modyfikację protokołu zaproponowanego w 2002 roku przez X.Z. Shu z Uniwersytetu w Pekinie. Najważniejszą modyfikacją było rozpuszczanie alginianu sodu bezpośrednio w zawiesinie materiału enkapsułowanego. Następnie, zawiesinę emulgowano, sieciowano jonami utwardzającymi i po pierwszym wirowaniu otoczkowano chitozanem. Niestety nadal nie zaobserwowano poprawy wydajności procesu.

Pożądany był zasadniczy wzrost udziału materiału enkapsułowanego w całej mieszaninie enkapsulacyjnej.

Kwas alginowy i jego rozpuszczalne sole dają roztwory o dużej lepkości, które zazwyczaj są przygotowywane w wodzie dejonizowanej w stosunkowo wysokiej temperaturze około 60°C. Te warunki nie mogą być stosowane do materiałów wrażliwych na temperaturę. Na przykład, takie temperatury wpływają ujemnie na przeżycie bakteriofaga. Dlatego, kolejnym etapem badań było wyznaczenie możliwie najwyższej temperatury inkubacji, która zapewniłaby roztwory o odpowiedniej lepkości, bez niekorzystnego wpływu na miano żywotnych mikroorganizmów. Stwierdzono, że temperatura 40°C, będzie odpowiednia do osiągnięcia realnych lepkości alginianu, aby utrzymać żywotność bakteriofaga. Biorąc pod uwagę zaobserwowane wyniki, gdy inkubowano bakteriofaga i bakterie w podwyższonych temperaturach, tak zmodyfikowano sposoby mikroenkapsulacji, że obejmują, etap rozpuszczania alginianu sodu w zawiesinie materiału enkapsułowanego tj. materiału, który ma być enkapsułowany. Nieoczekiwanie stwierdzono, że sieciowanie alginianu jednocześnie jonami utwardzającymi w obecności chitozanu dostarcza wysoce wydajnego procesu. Występują znaczne różnice w szybkości reakcji między polimerem a jonami i między dwoma polimerami, alginianem i chitozanem. Jony wapnia lub cynku szybko wiążą reszty karboksylowe, ponieważ ich małe rozmiary ułatwiają penetrację łańcuchów polimerowych. Chitozan potrzebuje znacznie więcej czasu na przylgnięcie do warstwy alginianu.

Potencjalny problem w wiązaniu jonów utwardzających z chitozanem w roztworze mogą stanowić właściwości chelatujące polimeru. W przypadku kationów wapnia reakcja nie zachodzi, ale w przypadku kationów cynku tworzą się bardzo silne i stabilne chelaty. W związku z tym mogło to zaburzać wiązanie się obu składników z resztami karboksylowymi alginianu i ostatecznie zablokować tworzenie się mikrokapsułek. Z drugiej strony, ostateczny efekt zależy od siły powinowactwa jonów Zn²+ do obu polimerów, ponieważ część jonów może w dalszym ciągu wiązać się z alginianem, ale nadmiar może zapewnić bardziej wydajne sieciowanie drugiej otoczki.

Kapsułki otrzymane przez sieciowanie mieszaniną kationów cynku i chitozanu prezentowały porównywalną zawartość bakteriofaga z wcześniejszymi modyfikacjami procesu. Dla mikrokapsułek sieciowanych mieszaniną kationów cynku i chitozanu rezultaty przeprowadzonych eksperymentów były zaskakujące. Dla wszystkich trzech badanych bakteriofagów uzyskano wydajność mikroenkapsulacji przewyższającą wszystkie otrzymane wcześniej rezultaty dotychczasowych prób optymalizacji. W przypadku bakteriofaga 2sent1 otrzymano prawie 60% wydajność, dla 2st3 66%, natomiast dla 2styp4 aż 97% (Figura 3). Ponadto, kolejne powtórzenia procesu dały bardzo podobne rezultaty, co zostało potwierdzone niskimi wartościami odchylenia standardowego. Potwierdza to dużą powtarzalność zoptymalizowanego protokołu mikroenkapsulacji, jak opisany w Przykładzie 3.

P r z y k ł a d 3: Przygotowanie mikrokapsułek zawierających bakterie i/lub bakteriofagi

W celu przygotowania materiału do enkapsulacji, 30 ml zawiesiny faga/bakterii (w podłożu LAB w MRS z firmy BTL) lub bakteriofagów w podłożu LB lub M9+ (LabEmpire); otrzymanych według sposobu opisanego w Przykładzie 1 podgrzewano i utrzymywano w 40°C przez 25 minut w 50 ml probówce stożkowej (Immuniq) w łaźni wodnej. Następnie 0,9 g soli sodowej kwasu alginowego z brązowych alg (Sigma) rozpuszczano przez 2 minuty w zawiesinie fagowej/bakteryjnej w probówce stożkowej, na worteksie. Roztwór alginianu sodu otrzymany w probówce stożkowej odpowietrzano przez pozostawienie roztworu do odstania przez 30 minut w temperaturze pokojowej. Następnie roztwór zdyspergowano w oleju przez wlanie roztworu alginianu sodu z probówki stożkowej do kolby Erlenmeyera o pojemności 250 ml, zawierającej 50 ml oleju roślinnego (Kujawski) i 1,2 ml Tween®80 (POCH lub Sigma). Roztwór alginianu sodu pozostały na ściankach probówki stożkowej wypłukano 10 ml oleju przez 2 minuty na wstrząsarce typu worteks i przelano do 250 ml kolby Erlenmeyera.

Emulsyfikację prowadzono w kolbie Erlenmeyera przez mieszanie przez 20 minut przy 1000 obr./min. w temperaturze pokojowej z wykorzystaniem mieszadła magnetycznego (mieszadło magnetyczne T ARE, Velp Sdentifica; dipol magnetyczny 10 x 50 mm). Emulsyfikacja w oleju utworzyła mikrokrople materiału polimer alginianu/bakteria/bakteriofaga, które następnie utwardzano, przy czym stopień dyspersji determinował rozmiar mikrokapsułek.

PL 231 923 B1

W celu utwardzenia kropli do utworzenia mikrokapsułek, krople sieciowano stosując jony cynku i chitozan. Krople fazy wodnej utwardzano stosując 30 ml roztworu 0,05 M ZnCl2 (Sigma) z 0,2% (wag./obj.) chitozanem (podłoże MW, DA 75-85%, Sigma) w 1% (obj./obj.) kwasie octowym (CH3COOH, 99,5% DA, POCH) w wodzie dejonizowanej. Roztwór jon cynku/chitozan wkraplano przy użyciu pipetusa i jednorazowej pipety o średnicy wyjściowej 3 mm, aby utworzyć oddzielne krople o średnicy 6 mm i zapobiec tworzeniu łańcuchów mikrokapsułek. Emulsję mieszano przez 30 minut przy 1000 obr./min. w temperaturze pokojowej.

Emulsję rozlano do 2 probówek stożkowych, które umieszczono w wirówce, kolejne etapy przeprowadzono w 2 testowych probówkach stożkowych.

W celu usunięcia nadmiaru oleju, otrzymane mikrokapsułki oddzielono przez odwirowanie przez 10 minut przy 2000 obr./min. (340 RCF) w 4°C stosując wirówkę (Rotina 420R, Hettich, rotor 4784). Fazę olejową zdekantowano ręcznie, tak, że mikrokapsułki pozostały na dnie stożkowych probówek. Mikrokapsułki przemyto przez wstrząsanie z 20-30 ml wody dejonizowanej, następnie mikrokapsułki odzyskano przez wirowanie przez 10 minut przy 2000 obr./min. (340 RCF) w 4°C, supernatant zdekantowano ręcznie, tak, że mikrokapsułki pozostały na dnie probówek stożkowych. Etap przemywania i odzysku powtarzano, następnie supernatant zdekantowano ręcznie, a mikrokapsułki pozostały na dnie probówek stożkowych.

P r z y k ł a d 4: Ocena wydajności enkapsulacji

Aby oszacować wydajność inkapsulacji 400 pl mikrokapsułek z każdej partii przeniesiono pipetą automatyczną do oddzielnej probówki stożkowej z 19,6 ml 0,2 M buforu fosforanowego (NaH2PO4 (POCH), Na2HPO4 (POCH)). Mikrokapsułki rozpuszczono, wytrząsając je w inkubatorze z rotorem o ruchu obrotowym (Infors-HT Ecotron, 140 obr./min., 37°C). Następnie przygotowywano seryjne rozcieńczenia roztworu mikrokapsułek, stosując 0,1% Tween®80 (POCH lub Sigma) jako rozcieńczalnik. Z kolejnych rozcieńczeń wykonywano posiewy na 60 mm płytkach Petriego, stosując technikę płytek lanych. Pożądana wydajność enkapsulacji wynosiła co najmniej 60%. Dodatkowo DNA enkapsułowanych bakteriofagów izolowano i amplifikowano przez PCR, aby potwierdzić obecność w mikrokapsułkach bakteriofaga będącego przedmiotem zainteresowania.

Ocena skuteczności mikroenkapsulacji

Za pomocą ezy mikrobiologicznej pobrano 10 pl bakterii z 25% zapasowego roztworu bakterii i zainokulowano próbkę 20 ml płynnego podłoża LB Lab Empire w 50 ml probówce stożkowej (Immuniq) i hodowano w inkubatorze z wytrząsarką przez 18 godz. (Infors-HT Ecotron, 140 obr./min., 37°C). Następnie wykonano seryjne rozcieńczenia zawiesiny bakteryjnej, stosując jałowe podłoże LB jako rozcieńczalnik. Do każdego dołka w kolumnie A 96-dołkowej i do dołków B1-3 płytki titracyjnej dodano po 50 pl odczynnika Alamar-Blue (Invitrogen). Dołek B1 stanowił kontrolę czystości odczynnika AlamarBlue. Dołek B2, stanowiący kontrolę czystości mikrokapsułek, napełniono 100 pl odwirowanych mikrokapsułek i 100 pl podłoża LB. Do dołka B3, stanowiącego kontrolę wzrostu bakterii, dodano 100 pl nierozcieńczonej zawiesiny bakterii i 100 pl podłoża LB. Do następnych dołków w kolumnie A 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej (ThermoScientific) przeniesiono próbki po 100 pl odwirowanych mikrokapsułek i próbkę 100 pl z każdego z rozcieńczeń hodowli bakterii w podłożu LB. Płytkę titracyjną inkubowano przez 18 godz. (Infors-HT Ecotron, 37°C). Obecność niebieskiego zabarwienia w dołku wskazywała na zahamowanie wzrostu bakterii przez bakteriofaga. Obecność różowego zabarwienia w dołku wskazywała, że wzrost bakterii utrzymywał się. Skuteczność mikroenkapsulacji oznaczono jako najniższą możliwą liczbę cząstek fagowych potrzebną do lizy pojedynczej komórki bakterii.

Mikroskopia elektronowa

Rozmiar porów w mikrokapsułkach można zbadać pod mikroskopem elektronowym.

Przechowywanie

W celu przechowywania mikrokapsułki zawieszono w roztworze do przechowywania (20 ml 0,05 M ZnCI2 (Sigma w wodzie dejonizowanej) i przechowywano przez 1 miesiąc w 4°C.

Informacje o depozycie biologicznym

PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) i PCM F/00071 (szczep 3sent1), zostały zdeponowane dla potrzeb patentu zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, 7 czerwca 2011, w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów, Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk, ul. Weigla 12, 53-114 Wrocław, Polska.

PL 231 923 B1

Bibliografia

Aslani, P., & Kennedy R. A. (1996). Studies on diffusion in alginate beads. I. Effect of cross-linking with calcium or zinc ions on diffusion of acetaminophen. Journal of Controlled Release, 42,75-82.

Chan, L. W., Jin, Y., & Heng, P. W. S. (2002). Cross-linking mechanisms of calcium and zinc in production of alginate microspheres. Int J Pharm, 242(1-2), 255-258.

Chan, L. W., Lee, H. Y., Heng, P. W. S. (2002). Production of alginate microspheres by internal gelation using an emulsification method. International Journal of Pharmaceutics, 242, 259-262.

Chan, L. W., Jin, Y., & Heng, P. W. S. (2006). Mechanisms of external and internal gelaton and their impact on the functions of alginate as a coat delivery system. Carbohydrate Polymers, 63, 176-187.

Ching, A. L, Liew, C. V., Heng, P. W., & Chan, L. W. (2008). Impact of cross-linker on alginate matrix integrity and drug release. Int J Pharm, 355(1-2), 259-268.

Fundueanu, G., Esposito, E., Mihai, D., Carpov, A., Desbrieres, J., Rinaudo, M., & Nastruzzi, C. (1998). Preparation and characterization of Ca-alginate micropsheres by a new emulsification method. Int J Pharm, 170, 11 -21.

Gray, C. J., & Dowsett, J. (1988). Retention of insulin in alginate gel beads. Biotechnology and Bioengineering, 31, 607-612.

Krasaekoopt, W., Bhandari, B., & Death, H. (2003). Evaluation of encapsulation techniques of probiotics for yoghurt. International Dairy Journal, 13, 3-3.

Ma, Y., J. C. Pacan, Q. Wang, Y. Xu, X. Huang, A. Korenevsky and P. M. Sabour (2008). Microencapsulation of bacteriophage felix O1 into chitosan-alginate microspheres for oral delivery. Appl Environ Microbiol, 74(15), 4799-4805.

Ma, Y., Pacan, J. C., Wang, Q.( Sabour, P. M., Huang, X., & Xu, Y. (2010). Enhanced alginate microspheres as means of oral delivery of bacteriophage for reducing Staphylococcus aureus intestinal carriage. Food Hydrocolloids, 1-7.

Poncelet, D., Lencki, R., Beaulieu, C., Halle, J. P., Neufeld, R. J., & Fournier, A. (1992). Production of alginate beads by emulsification/internal gelation. I. Methodology. Appl Microbiol Biotechnol, 38(1), 39-45.

Puapermpoonsiri, U., Spencer, J., & van der Walle, C. F. (2009). A freeze-dried formulation of bacteriophage encapsulated in biodegradable microspheres. Eur J Pharm Biopharm, 72(1), 26-33.

Ribeiro, A. J., Silva, C., Ferreira, D., & Veiga, F. (2005). Chitosan-reinforced alginate microspheres obtained through the emulsification/internal gelation technique. Eur J Pharm Sci, 25(1), 31 -40.

Shu, X. Z., & Zhu, K. J. (2002). The release behavior of brilliant blue from calcium-alginate gel beads coated by chitosan: the method effect. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 193-201.

Smit, E., Wolters, A. C., Lee, H., Trevors, J. T., & van Elsas, J. D. (1996). Interactions between genetically marked Pseudomonas fluorescens strain and bacteriophage OR2f in soil: effects of nutrients, alginate encapsulation and the wheat rhizosphere. Microbial Ecology. 31, 125-140.

Song, H., Yu, W., Gao, M., Liu, X., & Ma, X. (2013). Microencapsulated probiotics using emulsification technique coupled with internal or external gelation process. Carbohydr Polym, 96(1), 181 -189.

Xu, Y., Zhan, C., Fan, L, Wang, L, & Zhang, H. (2007). Preparation of dual crosslinked alginatechitosan blend gel beads and in vitro controlled release in oral site-specific drug delivery system. International Journal of Pharmaceutics, 329-337.

Yu, C. Y„ Zhang, X. C., Zhou, F. Z., Zhang, X. Z., Cheng, S. X., & Zhuo, R. X. (2008). Sustained release of antineoplastic drugs from chrtosan-reinforced alginate microparticle drug delivery systems. Int J Pharm, 357(1-2), 15-21.

Claims (28)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób enkapsulacji materiału zawierającego bakteriofagi obejmujący etapy:

   (a1) przygotowania wodnego roztworu lub zawiesiny materiału enkapsułowanego, (b1) podgrzewania wodnego roztworu lub zawiesiny materiału enkapsułowanego do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia pierwszego biokompatybilnego polimeru w wodnym roztworze lub zawiesinie, bez negatywnego wpływu na właściwości materiału enkapsułowanego, (cl) rozpuszczania pierwszego biokompatybilnego polimeru w wodnym roztworze lub zawiesinie materiału enkapsułowanego, albo (a2) przygotowania wodnego roztworu pierwszego biokompatybilnego polimeru, (b2) podgrzewania wodnego roztworu pierwszego biokompatybilnego polimeru do temperatury wystarczającej do umożliwienia rozpuszczenia lub zawieszenia w wodnym roztworze materiały, enkapsułkowego lub negatywnego wpływu na jego właściwości, (c2) rozpuszczania lub zawieszania materiału enkapsułowanego w roztworze wodnym/zawiesinie, oraz (d) odpowietrzania roztworu lub zawiesiny otrzymanych w etapie (c), (e) emulsyfikację roztworu lub zawiesiny otrzymanych w etapie (d) w biokompatybilnym oleju zawierającym surfaktant, do utworzenia mikrokropli, (f) utwardzania mikrokropli przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego jony Zn²+ i drugi biokompatybilny polimer, do emulsji otrzymanej w etapie (e) w celu utworzenia mikrokapsułek, przy czym jako pierwszy biokompatybilny polimer stosuje się alginian, korzystnie alginian sodu, natomiast jako drugi biokompatybilny polimer stosuje się chitozan.
2. 2. Sposób według zastrzeżenia 1 obejmujący dodatkowo etap (g) izolacji mikrokapsułek z biokompatybilnego oleju, korzystnie dodatkowo etap (h) przemywania mikrokapsułek wodą lub roztworem wodnym, korzystnie dodatkowo etap (i) suszenia mikrokapsułek.
3. 3. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń obejmujący dodatkowo formułowanie mikrokapsułek do kompozycji obejmującej dodatek do żywności lub pasz lub środek pomocniczy farmaceutycznie dopuszczalny.
4. 4. Sposób według zastrz. 1, w którym enkapsułowany materiał zawiera substancję wybraną z grupy obejmującej: mieszaninę bakterii i bakteriofagów, jeden lub więcej szczepów bakteriofagów odpowiednich do zapobiegania lub zwalczania infekcji wywołanych przez patogenne szczepy z gatunku Salmonella sp., w szczególności S. enterica serowar Enteritidis, jeden lub więcej szczepów bakteriofagów wybranych spośród: PCM F/00069 (szczep 8sent1748), PCM F/00070 (szczep 8sent65) oraz/lub PCM F/00071 (szczep 3sent1) zdeponowanych 7 czerwca 2011 w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów.
5. 5. Sposób według zastrz. 4, w którym enkapsułowany materiał zawiera jeden lub więcej szczepów bakterii probiotycznych, korzystnie wybranych spośród: Lactobacilli, Bifidobacteria oraz Lactococci.
6. 6. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym enkapsułowany materiał jest podgrzewany do temperatury z zakresu 38-40°C.
7. 7. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym rozpuszczanie pierwszego biokompatybilnego polimeru w roztworze wodnym lub zawiesinie materiału enkapsułowanego jest wspomagane mieszaniem mechanicznym lub wstrząsaniem, zwłaszcza z wykorzystaniem wstrząsarki laboratoryjnej.
8. 8. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym odpowietrzanie przeprowadza się przez pozostawienie roztworu lub zawiesiny do odstania w temperaturze pokojowej.
9. 9. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym biokompatybilny olej jest wybrany spośród: olejów dopuszczonych do zastosowania w żywności lub farmaceutykach, olejów roślinnych, oleju kukurydzianego, słonecznikowego, rzepakowego oraz oliwy z oliwek.
10. 10. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym surfaktant jest wybrany spośród: Tween®80, lecytyny, Span®80 i Span®85.

    PL 231 923 B1
11. 11. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym emulsyfikację przeprowadza się przez mieszanie mechaniczne roztworu lub zawiesiny.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, w którym emulsyfikację przeprowadza się przez mieszanie mechaniczne roztworu lub zawiesiny, przez 17 do 25 minut, przy 950 do 1050 obr./min., w temperaturze w zakresie od 20 do 25°C.
13. 13. Sposób według zastrz. 12, w którym emulsyfikację prowadzi się przez mieszanie roztworu lub zawiesiny przez 20 minut, przy 1000 obr./min., w temperaturze pokojowej.
14. 14. Sposób według zastrz. 11, w którym emulsyfikację prowadzi się przez mieszanie w 250 ml kolbach, przez 20 minut, przy 1000 obr./min., w temperaturze pokojowej.
15. 15. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym emulsyfikację prowadzi się przez homogenizację.
16. 16. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego jony cynku.
17. 17. Sposób według zastrz. 16, w którym utwardzanie kropli przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego ZnCI2.
18. 18. Sposób według zastrz. 17, w którym utwardzanie kropli przeprowadza się przez wkraplanie wodnego roztworu zawierającego 0,05 M ZnCl2.
19. 19. Sposób według dowolnego z wcześniejszych zastrzeżeń, w którym utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie oddzielonych od siebie mikrokropli.
20. 20. Sposób według zastrz. 19, w którym utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie oddzielonych od siebie mikrokropli o średnicy1 d o 8 mm.
21. 21. Sposób według zastrz. 20, w którym utwardzanie mikrokropli przeprowadza się przez wkraplanie oddzielonych od siebie mikrokropli o średnicy 6 mm.
22. 22. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 2 do 21, w którym oddzielanie mikrokapsułek następuje poprzez wirowanie oraz usuwanie nadmiaru roztworu enkapsulacyjnego.
23. 23. Sposób według dowolnego z zastrzeżeń 2 do 22, w którym przemywanie mikrokapsułek prowadzi się w 4°C.
24. 24. Mikrokapsułka zawierająca alginian cynku i chitozan oraz materiał enkapsułowany, znamienna tym, że materiał enkapsułowany zawiera bakteriofagi, korzystnie bakterie i bakteriofagi.
25. 25. Mikrokapsułka według zastrzeżenia 24, zawierająca materiał enkapsułowany, 3% alginianu cynku i 0,2% chitozanu.
26. 26. Mikrokapsułka według zastrz. 24 lub 25 do zastosowania jako środek leczniczy, zwłaszcza do zastosowania w profilaktyce lub leczeniu infekcji bakteryjnych.
27. 27. Pożywienie lub napoje dla ludzi lub zwierząt zawierające mikrokapsułki otrzymane sposobem według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 23 lub zawierające mikrokapsułki według zastrz. 24 lub 25.
28. 28. Zastosowanie mikrokapsułki według zastrz. 24 lub 25 lub otrzymanej sposobem według dowolnego z zastrzeżeń od 1 do 23, do wytwarzania środków leczniczych, zwłaszcza do wytwarzania środków leczniczych stosowanych w profilaktyce lub leczeniu infekcji bakteryjnych.