PL232043B1 - Sposób wykrywania Paecilomyces variotii - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania Paecilomyces variotii w surowcach pochodzenia biologicznego.

Znany z opisu patentowego nr EP2765191A1 sposób wykrywania Paecilomyces variotii, obejmuje dwa etapy identyfikacji. Pierwszy etap obejmuje amplifikację częściowej sekwencji nukleotydów genu β-tubuliny z użyciem reakcji łańcuchowej polimerazy (PCR) w której stosuje się oligonukleotydy (A) i (B); (A) i (C); lub (A), (B) i (C) jako startery w amplifikacji DNA, gdzie: (A) jest to oligonukleotyd reprezentowany przez sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID NO: 7 (5’-GAGCACGGCCTTGACGGCT-5’ - JC583689), lub oligonukleotydy o 95% lub wyższym poziomie podobieństwa do sekwencji SEQ ID NO: 7, które mogą zostać wykorzystane jako startery w amplifikacji DNA zamiast SEQ ID NO: 7. Oligonukleotyd (B) reprezentowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID NO: 8 (5’-GCATATGGAGCGTCCTTATC-3’ - JC583689), lub oligonukleotydy o sekwencji nukleotydowej o 95% lub wyższym poziomie podobieństwa do sekwencji SEQ ID NO: 8, które mogą być stosowane jako startery w amplifikacji DNA zamiast SEQ ID NO: 8. Oligonukleotyd (C) reprezentowany jest przez sekwencję nukleotydową przedstawioną w SEQ ID NO: 9 (5’-GCTCATGGGGCGTTCCTCTT-3’ - JC583690) lub oligonukleotydy charakteryzujące się 95% lub wyższym poziomem podobieństwa do sekwencji SEQ ID NO: 9, które mogą zostać wykorzystane jako startery w amplifikacji DNA zamiast SEQ ID NO: 9. Drugim etapem jest potwierdzenie, czy powielony produkt jest obecny, przy czym wykrycie amplifikowanego produktu jest wskaźnikiem obecności Paecilomyces variotii.

Znana jest ze zgłoszenia patentowego nr P. 400319 dezynfekcja drewna liściastego w celu eliminacji rozwoju grzyba Paecilomyces variotii w trakcie procesu suszenia, przy czym suszenie właściwe drewna rozpoczyna się przy wilgotności drewna >40%, charakteryzuje się tym, że w tej fazie procesu suszenia drewna liściastego, przeprowadza się dezynfekcję wstępną drewna, wprowadzając bezwodnik kwasu octowego, kwas octowy lub kwas propionowy o stężeniu 0,5 do 5%, w postaci aerozolu rozprowadzanego w strumieniu powietrza o szybkości 1 do 2 m/s, przy zamkniętych kominkach, przez okres 1-2 godzin a następnie przeprowadzając przegrzew drewna, zwiększający efekt działania dezynfekcji wstępnej w temperaturze powyżej 50°C przez okres co najmniej 1 godziny na każde 10 mm grubości drewna, przy czym nagrzewanie komory do tej temperatury odbywa się w tempie 5°C na godzinę, przy zapewnieniu wilgotności względnej powietrza w komorze na poziomie 95% i przepływie powietrza 1-2 m/s, a po osiągnięciu temperatury dezynfekcji wyłącza się wentylatory, powodując brak przepływu powietrza.

Powyższe rozwiązania cechuje mała czułość i jest to metoda, w której wykorzystuje się techniki LAMP i PCR, a wykorzystanie sekwencji docelowej w połączeniu z techniką Real-Time PCR wymaga dodatkowych badań i optymalizacji sekwencji sondy molekularnej, wykorzystanych starterów oraz składu mieszaniny reakcyjnej.

Celem wynalazku jest opracowanie metody wykrywania Paecilomyces variotii pozwalającej na wykrywanie zakażeń na początkowych etapach rozwoju, w momencie gdy łatwo zauważalne objawy nie są jeszcze widoczne, aby zapobiec wprowadzeniu zakażonych materiałów do kolejnych etapów produkcji, co pozwala zaoszczędzić koszty związane z utratą zakażonych partii surowców bądź produktów.

Cel ten osiągnięto w rozwiązaniu wg wynalazku, w którym sposób wykrywania Paecilomyces variotii, z użyciem sondy molekularnej i starterów w amplifikacji DNA, które na zasadzie hybrydyzacji specyficznie łączą się z sekwencją docelową, polega na wykorzystaniu występującej u Paecilomyces variotii sekwencji docelowej charakteryzuje się tym, że oparty jest na wykrywaniu sekwencji docelowej, stanowiącej sekwencję nukleotydów CACGCTTCAATAGAACCGGCCGGCTTGCTGGCCA będącej markerem obecności Paecilomyces variotii w materiale biologicznym. Sposób wykrywania Paecilomyces variotii charakteryzuje się tym, że podobieństwo sekwencji docelowej i/lub sekwencji do niej komplementarnej z wykorzystaną sondą molekularną wykazuje 95% lub więcej podobieństwa na odcinku co najmniej 8 nukleotydów, lub podobieństwo sekwencji docelowej i/lub sekwencji do niej komplementarnej z co najmniej jednym z użytych starterów w amplifikacji DNA wynosi 95% lub więcej podobieństwa na odcinku co najmniej 10 nukleotydów. Sposób wykrywania Paecilomyces variotii charakteryzuje się tym, że w detekcji sekwencji docelowej opartej na technice Real-Time PCR, oprócz sondy molekularnej wykorzystywane są oligonukleotydy wykazujące 95% lub więcej podobieństwa do oligonukleotydów 5’CGGTCCTCGAGCGTATG-3’ i/lub 5’-TCCGAGGTCAACCTAAGAGAA-3’.

PL 232 043 B1

Metoda wykrywania P. variotii w próbkach materiałów biologicznych zaspokaja potrzebę szybkiego i rutynowego testowania partii surowców na obecność P. variotii i może być stosowana np. w przemyśle drzewnym, spożywczym czy kosmetycznym.

Sposób wykrywania Paecilomyces variotii w pierwszej kolejności polega na wykonaniu ekstrakcji DNA z próbki drewna według następującej procedury. Do sproszkowanej próbki drewna dodawany jest bufor ekstrakcyjny o składzie: 4% CTAB, 100 mM Tris-HCI (pH 8,5), 1,4 M NaCI, 20 mM EDTA(Na2), 1% PVP, 01% β-merkaptoetanol, w ilości 700 pl. Mieszaninę ekstrakcyjną następnie inkubuje się w temperaturze 65°C przez 20 minut w łaźni wodnej, po czym dodaje się 600 pl mieszaniny chloroformu z alkoholem izoamylowym (24:1 V/V) oraz wytrząsa przez 10 minut. Następnie mieszaninę ekstrakcyjną wiruje się przez 10 minut przy 18000G w temperaturze pokojowej w mikrowirówce (np. 5804R marki Eppendorf), a po wirowaniu pobiera 500 pl fazy wodnej rozdzielonej zawiesiny. Z pobranej fazy wodnej wytrąca się osad kwasów nukleinowych poprzez dodanie 500 pl wychłodzonego do temperatury -20°C izopropanolu. Po ponownym odwirowaniu (10 minut przy 18000G) uzyskuje się osad kwasów nukleinowych, który po płukaniu 70% etanolem rozpuszcza się w 50 pl wody dejonizowanej. Powyższa procedura wykonywana jest niezależnie dla każdej badanej próbki drewna.

Następnie w opisanym sposobie wykrywania Paecilomyces variotii wykonywana jest reakcja Real-Time PCR wykorzystując uzyskany w trakcie ekstrakcji DNA preparat DNA jako matrycę według następującej procedury. Sporządzona zostaje mieszanina reakcyjna o składzie: 100 mM KCl, 100 mM (NH4)2SO4, 200 mM Tris-HCl (pH 8,5), 20 mM MgSO4 oraz 1% Triton X-100, 5 mM MgCl2, 0,2 mM każdego z czterech dNTP, 0,3 pM starter 5’-CGGTCCTCGAGCGTATG-3’, 0,3 pM starter 5’-TCCGAGGTCAACCTAAGAGAA-3’, 0,1 pM podwójnie znakowana sonda molekularna 6-FAM-GCTTCAGTAGAACCGGCC-BHQ-1, 0,5u polimerazy DNA, oraz 1 pl preparatu DNA o nieznanym stężeniu uzyskanego w trakcie ekstrakcji DNA. Z użyciem tak przygotowanej mieszaniny reakcyjnej wykonuje się sterowaną termicznie reakcję Real-Time PCR z użyciem termocyklera wyposażonego w funkcję pomiaru emisji fluorescencji w każdym cyklu (np. Mastercycler RealPlex marki Eppendorf) według programu: 10 minut w 94°C oraz 40 cykli złożonych z 15 sekund w 94°C i 55 sekund w 60°C. Odczyt sygnału fluorescencji następuje z końcem każdego cyklu. W trakcie amplifikacji wyznaczana jest krzywa przyrostu fluorescencji w kolejnych cyklach, na podstawie której odczytywany jest wynik testu. Wynik interpretowany jest jako pozytywny w przypadku, gdy w przebiegu krzywej obserwuje się fazę logarytmicznego przyrostu sygnału fluorescencji oraz gdy krzywa przebija wartość progową ustaloną na dziesięciokrotność średniej fluorescencji linii bazowej. Wynik interpretowany jest jako negatywny, w przypadku gdy w przebiegu krzywej nie obserwuje się fazy logarytmicznego przyrostu sygnału fluorescencji i/lub gdy krzywa nie przebija wartości progowej ustalonej na dziesięciokrotność średniej fluorescencji linii bazowej. Powyższa procedura wykonywana jest niezależnie dla każdej badanej próbki drewna.

Claims (4)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wykrywania Paecilomyces variotii, z użyciem sondy molekularnej i starterów w amplifikacji DNA, które na zasadzie hybrydyzacji specyficznie łączą się z sekwencją docelową polegający na wykorzystaniu występującej u Paecilomyces variotii sekwencji docelowej znamienny tym, że oparty jest na wykrywaniu sekwencji docelowej, stanowiącej sekwencję nukleotydów CACGCTTCAATAGAACCGGCCGGCTTGCTGGCCA będącej markerem obecności Paecilomyces variotii w materiale biologicznym.

2. Sposób wykrywania Paecilomyces variotii wg zastrz. 1, znamienny tym, że podobieństwo sekwencji docelowej i/lub sekwencji do niej komplementarnej z wykorzystaną sondą molekularną wykazuje 95% lub więcej podobieństwa na odcinku co najmniej 8 nukleotydów.

3. Sposób wykrywania Paecilomyces variotii wg zastrz. 1, znamienny tym, że podobieństwo sekwencji docelowej i/lub sekwencji do niej komplementarnej z co najmniej jednym z użytych starterów w amplifikacji DNA wynosi 95% lub więcej podobieństwa na odcinku co najmniej 10 nukleotydów.

4. Sposób wykrywania Paecilomyces variotii wg zastrz. 1 oraz 3, znamienny tym, że w detekcji sekwencji docelowej opartej na technice Real-Time PCR oprócz sondy molekularnej wykorzystywane są oligonukleotydy wykazujące 95% lub więcej podobieństwa do oligonukleotydów 5’-CGGTCCTCGAGCGTATG-3’ i/lub 5’-TCCGAGGTCAACCTAAGAGAA-3’.