PL232283B1

PL232283B1 - Nowa pochodna naftochinonu i jej zastosowanie medyczne

Info

Publication number: PL232283B1
Application number: PL419109A
Authority: PL
Inventors: Anna Kawiak; Anna Domachowska; Bartłomiej Borek; Roman BŁASZCZYK; Roman Błaszczyk
Original assignee: Univ Gdanski; Uniwersytet Gdanski
Priority date: 2016-10-13
Filing date: 2016-10-13
Publication date: 2019-05-31
Also published as: PL419109A1

Description

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna naftochinonu. Wynalazek dotyczy również nowej pochodnej naftochinonu do zastosowania medycznego w kierunku leczenia raka piersi, zwłaszcza jako inhibitor białka ERK.

Kinazy ERK (ang. extracellular signal-regulated kinases) należą do rodziny kinaz serynowo-treoninowych aktywowanych mitogenami (MAPK), które tworzą ścieżki sygnalizacyjne w postaci kaskad enzymatycznych indukujących aktywację kolejnych enzymów poprzez ich fosforylację. Szlak MAPK/ERK aktywowany jest dzięki przekazaniu sygnału przez cząsteczkę sygnałową z zewnątrzkomórkowej domeny receptorowej kinazy tyrozynowej do białka wewnątrzkomórkowego. Kaskada kinaz MAPK/ERK jest określana jako główna ścieżka wzrostu i różnicowania komórek, a także odgrywa kluczową rolę w transdukcji sygnału, który prowadzi do proliferacji komórek, nowotworzenia oraz rozwoju nowotworu, co ujawniono w publikacji: Roberts PJ. I wsp. Targeting the Raf-MEK-ERK mitogen-activated protein kinase cascade for the treatment of cancer. Oncogene. 2007: 26:3291-3310.

Wykazano, że szlak MAPK/ERK jest konstytutywnie aktywny w wielu typach ludzkich nowot worów, w tym w raku piersi. Aktywacja ta może przyczyniać się do oporności komórek nowotworowych na chemioterapeutyki, dlatego też selektywne hamowanie białka ERK może stać się potencjalnym rozwiązaniem w leczeniu raka piersi. Wiele niskocząsteczkowych związków zdolnych do hamowania kolejnych białek szlaku MAPK/ERK zostało odkrytych i poddanych badaniom klinicznym w celu oceny ich bezpieczeństwa, toksyczności oraz aktywności wobec różnych typów ludzkich nowotworów. To potencjalnie ukierunkowane leczenie obejmuje inhibitory specyficznie hamujące szlak MAPK/ERK. Inhibitory MEK są pierwszymi inhibitorami szlaku MAPK/ERK, które zostały podane fazie badań przedklinicznych i klinicznych, co opisano w publikacji: Wang D. i wsp. Clinical experience of MEK inhibitors in cancer therapy. Biochemical et Biophysical Acta. 2007: 1773:1248-1255.

Pierwszymi odkrytymi inhibitorami szlaku MAPK/ERK są dwa niskocząsteczkowe inhibitory MEK1/2: U0126 oraz PD98059. Działanie tych inhibitorów polega na niekompetycyjnym wiązaniu się w sąsiedztwie miejsca wiązania ATP kinazy wywołując zmiany konformacyjne i zapobiegając przejściu kinazy w postać aktywną, ufosforylowaną. Przeprowadzone testy in vitro pokazały, że inhibitory te działają na dużą grupę białek należących do szlaku MAPK/ERK, między innymi na białko ERK, co opisano w publikacji: Davies S.P. i wsp. Specificity and mechanism of action of some commonly used protein kinase inhibitors. Biochem. J. 2000: 351:95-105. Inhibitor PD98059 jest stosowany głównie w układach komórkowych do analizy biologicznych funkcji tego szlaku. Nie został zakwalifikowany do pierwszej fazy badań klinicznych ze względu na zbyt małą rozpuszczalność oraz zbyt małą aktywność w badaniach in vitro. Drugi inhibitor szlaku MAPK/ERK - U0126 pomimo, że wykazywał większy potencjał od poprzedniego, ze względu na ograniczenia farmakologiczne również nie wszedł do pierwszej fazy badań klinicznych i jest stosowany wyłącznie jako odczynnik laboratoryjny, co opisano w publikacji: Fremin C. i wsp. From basic research to clinical development of MEK1/2 inhibitors for cancer therapy. J Hematol Oncol. 2010: 3:8.

Jednym z pierwszych inhibitorów szlaku MAPK/ERK, który został dopuszczony do badań klinicznych (I i II faza badań klinicznych) był związek o nazwie CI-1040 (PD184352). Związek ten był pierwszym allosterycznym inhibitorem MEK1/2, który hamował rozwój guza w warunkach in vivo. Działanie tego związku zostało przetestowane zarówno u myszy z rakiem okrężnicy jak i w guzach pochodzenia ludzkiego. W obu przypadkach wzrost guzów został zahamowany, co korelowało z niską toksycznością tego związku oraz zmniejszonym poziomem fosforylacji białka ERK pERK, co ujawniono w publikacji: Sebolt-Leopold J.S. i wsp. Blockade of the MAP kinase pathway suppresses growth of colon tumors in vivo. Nat. Med. 1999:5: 810-816. Środek ten podano pacjentom z rakiem okrężnicy, rakiem trzustki oraz z rakiem piersi. Pomimo, tego że związek ten był dobrze tolerowany przez pacjentów w podawaniu doustnym, jak opisano w publikacji: Lorusso P.M. i wsp. Phase I and pharmacodynamic study of the oral MEK inhibitor Cl-1040 in patients with advanced malignancies. J Clin Oncol. 2005: 23: 5281 -5293, wykazywał on zbyt małą aktywność przeciwnowotworową, stabilność metaboliczną oraz biodostępność.

Kolejnym inhibitorem syntetyzowanym na bazie związku CI-1040, który został dopuszczony do I i II fazy badań klinicznych, był związek o nazwie PD0325901. Niewielkie zmiany strukturalne w budowie tego związku spowodowały zwiększenie jego aktywności i przyswajalności, jednakże z względu na poważne skutki uboczne występujące u pacjentów, toksyczne działanie tego związku wykluczyło podawanie jego skutecznych dawek, co opisano w publikacji: Rinehart J i wsp. Multicenter phase II study of the

PL 232 283 Β1 orał MEK inhibitor, CI-1040, in patients with advanced non-small-cell lung, breast, colon, and pancreatic cancer. J Clin Oncol. 2004: 22: 4456-4462.

Selumetinib (AZD6244, ARRY-142886) jest jednym z najszerzej testowanych inhibitorów szlaku MAPK/ERK. Charakteryzował się dużą aktywnością przeciwnowotworową oraz zdolnością do indukcji apoptozy. W publikacji: Adjei A.A. i wsp. Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of the MEK Inhibitor AZD6244 (ARRY-142886), International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics 2006, ujawniono największą skuteczność terapeutyczną w stosunku do pacjentów z rakiem skóry, czerniakiem. Szesnastu z pośród dwudziestu pacjentów chorych na tego raka skóry ukończyło co najmniej jeden cykl leczenia. Inhibitor ten był również testowany w terapii skojarzonej z różnymi chemioterapeutykami.

Do innych inhibitorów szlaku MAPK/ERK należą takie związki jak: GDC-0973 (XL-518, RG7421), BAY 86-9766 (RDEA119), Trametinib (GSK1120212), Pimasertib (AS703026, MSC1936369B), MEK162 (ARRY-438162), AZD8330 (ARRY-424704), RO4987655 (CH4987655), RO5126766, WX-554, E6201 i TAK-733. Wszystkie z wyżej wymienionych inhibitorów zostały zakwalifikowane przynajmniej do I fazy badań klinicznych. Mimo dostępności dużej liczby inhibitorów szlaku MAPK/ERK, nie wykazały one dużego potencjału terapeutycznego, dlatego też obecnie testuje się terapie skojarzone z różnymi lekami cytotoksycznymi. Lek został wprowadzony przez firmę Bayer pod nazwą Nexavar do leczenia zaawansowanego raka nerek i raka wątrobowo komórkowego, co opisano m.in. w publikacji: Adjei A.A. i wsp. Phase I Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Study of the MEK Inhibitor AZD6244 (ARRY-142886), International Conference on Molecular Targets and Cancer Therapeutics, EORTC, 2006.

Do selektywnych inhibitorów kinazy ERK 1/2 należą takie związki jak: VTX-11e, FR18020414, 5-ITU oraz SCH772984. Obecnie w fazie badań przedklinicznych są dwa związki: SCH772984 oraz VTX11e, co opisano w publikacji: Chaikuad A. i wsp. A unique inhibitor binding site in ERK1/2 is associated with slow binding kinetics. Nat Chem Biol. 2014: 10: 853-860.

Nowa pochodna naftochinonu, w badaniach in vitro, okazała się skutecznym inhibitorem białka ERK wobec komórek raka piersi. Pochodna naftochinonu może być wykorzystana do badań in vitro jako inhibitor białka ERK w układzie komórkowym do analizy biologicznej funkcji tego szlaku. Może również znaleźć zastosowanie jako związek cytotoksyczny wykorzystany w badaniach in vitro w celu zahamowania wzrostu komórek linii raka piersi.

Zastosowanie to może być wykorzystane w badaniach przedklinicznych oraz w badaniach klinicznych w celu zahamowania wzrostu guzów nowotworowych. Sposób zakłada wykorzystanie guzów piersi wobec których zastrzeżony środek wykazuje aktywność cytostatyczną.

Przedmiotem wynalazku jest nowy związek o wzorze:

który stanowi pochodną naftochinonu o nazwie chemicznej 5-metoksy-2-(-2-propoksyetylo)naftochinon.

Przedmiotem wynalazku jest nowa pochodna naftochinonu, określona powyżej, do medycznego zastosowanie jako środek cytotoksyczny przeznaczony do stosowania w zahamowaniu wzrostu komórek raka piersi. W szczególności zastosowanie medyczne dotyczy mechanizmu działania jako inhibitor białka ERK.

Wynalazek przybliżono na rysunku opisanym poniżej.

Fig. 1. Wynik eksperymentu przedstawiający wpływ cytotoksyczny pochodnej naftochinonu wobec linii komórkowych raka piersi MDA-MB-468 i BT474. W przypadku linii MDA-MB-468 uzyskano wartość IC50 przy stężeniu 2,5 μΜ, a dla linii BT474 wartość IC50 osiągnięto przy stężeniu 6 μΜ.

Fig. 2. Wynik eksperymentu przedstawiający wpływ pochodnej naftochinonu wobec białka ERK i jego ufosforylowanej formy p-ERK. Zdjęcia przedstawiają wynik uzyskany przy pomocy techniki Western biot obrazujący spadek poziomu białka p-ERK w wyniku traktowania komórek pochodną naftochinonu.

PL 232 283 Β1

Fig. 3. Wynik eksperymentu przedstawiający wpływ pochodnej naftochinonu wobec białka ERK i jego ufosforylowanej formy p-ERK. Wykresy przedstawiają wynik pomiaru luminescencji uzyskany przy pomocy techniki Alphascreen, obrazujący spadek poziomu białka p-ERK w wyniku traktowania komórek pochodną naftochinonu.

Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie ograniczające jego zakresu.

Przykład 1

Synteza

Do roztworu o-bromoanizolu 1 (3.14 g, 16.8 mmol) w Et2O (10 ml) w -78°C w atmosferze argonu wkroplono roztwór n-butylolitu (7 ml, 17.6 mmol). Całość mieszano przez 5 minut w -78°C, a następnie dodano zawiesinę kompleksu chromu (3.7 g, 16,8 mmol) w Et2O (6 ml). Mieszaninę reakcyjną ogrzano do 0°C przez 3 h. Lotne związki odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w DCM (20 ml) i ochłodzono do 0°C. Następnie dodano trifluorometanosulfonianu metylu (2.76 ml, 25.2 mmol) i całość mieszano w temperaturze 0°C przez godzinę i kolejno w temperaturze pokojowej przez 2 godziny. Rozpuszczalniki odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt 2 (metoksy(o-metoksyfenylo)metylenopentakarbonylochrom) oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej otrzymując 3.4 g (60%) w postaci czerwonego osadu.

¹H-NMR (DMSO-de, 500 MHz) δ: 7.59 (d, 1H, J=7.53Hz), 7.50 (t, 1H, J=7.34Hz), 7.11 (d, 1H, J=8.47Hz), 6.97 (t, 1H, 7.53Hz), 3.77 (s, 3H), 3.74 (s, 3H).

TT

Prl, KOH, DMSO

Wodorotlenek potasu (17.6 g, 0.31 mol) zawieszono w DMSO i dodano 3-butyn-1-ol 3 (20 g, 0.29 mol). Całość mieszano w temperaturze pokojowej przez 30 minut, a następnie dodano jodek propylu (30 ml, 0.31 mol). Mieszanie kontynuowano w temperaturze pokojowej przez noc. Górną warstwę oddzielono i przemyto wodą oraz solanką. Następnie suszono nad bezwodnym siarczanem (VI) magnezu.

PL 232 283 Β1

Produkt 4 (eter but-3-yn-1-ylo-propylowy) oczyszczono za pomocą destylacji (b.p. 124°C). Otrzymano 16 g (50%) w postaci bezbarwnego oleju.

¹H-NMR (CDCIs, 500 MHz) δ: 3.53 (t, 2H, J=7.15Hz), 3.39 (t, 2H, J=6.59Hz), 2.44 (td, 2H, J=2.63, 6.96Hz), 1.95 (t, 1H, J=2.63Hz), 1.61-1.54 (m, 2H), 0.90 (t, 3H, J=7.34Hz).

III

OMe Cr(CO)₅

OMe +

Do roztworu związku 2 (1.7 g, 4.97 mmol) w THF w atmosferze argonu dodano związek 4 (0.83 g, 7.45 mmol). Całość mieszano w temperaturze 45°C przez noc. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Pozostałość rozpuszczono w MeCN/H2O 1:1 (20 ml) i dodano azotan amonowo cerowy (5.4 g, 9.93 mmol). Otrzymany roztwór mieszano przez 2,5 godziny w temperaturze pokojowej. Następnie mieszaninę rozcieńczono wodą i ekstrahowano octanem etylu. Połączone warstwy organiczne przemyto solanką. Suszono nad bezwodnym siarczanem (VI) magnezu. Rozpuszczalnik odparowano pod zmniejszonym ciśnieniem. Produkt 5 (5-metoksy-2-(-2-propoksyetylo)naftochinon) oczyszczono za pomocą chromatografii kolumnowej otrzymując 350 mg (26%) w postaci półstałego kryształu.

¹H-NMR (CDCIs, 500 MHz) δ: 7.73 (dd, 1H, J=1.13, 7.72Hz), 7.64 (t, 1H, J=8.28Hz), 7.26 (dd, 1H, J=0.75, 8.47Hz), 6.77 (t, 1H, 1.32 Hz), 3.98 (s, 3H), 3.63 (t, 2H, J=6.21Hz), 3.37 (t, 2H, J=6.78Hz), 2.77 (td, 2H, J=1.13, 6.21 Hz), 1.56-1.51 (m, 2H), 0.86 (t, 3H, 7.53Hz).

Przykład 2

Zastosowanie pochodnej naftochinonu w indukcji efektu cytotoksycznego wobec komórek linii raka piersi w badaniach in vitro:

a) Przygotowanie hodowli komórkowej

Źródłem linii komórkowych raka piersi MDA-MB-468 oraz BT474 jest firma Celi Linę Services (Niemcy). Komórki hoduje się w inkubatorze w warunkach 37°C, w obecności 5% CO2. Komórki pasażuje się 2 razy w tygodniu w komorze laminarnej Biohazard. Komórki linii MDA-MB-468 hoduje się w pożywce DMEM (firmy Sigma, nr kat. D5796) natomiast linię BT474 hoduje się w pożywce DMEM (firmy Sigma, nr kat. D6421). Pożywki uzupełnia się 10% płodową surowicą bydlęcą (FBS, firmy Sigma, nr kat. F9665) oraz antybiotykami 100 j.m./ml penicyliny oraz 10 mg/ml streptomycyny (firmy Sigma, nr kat. P4333).

b) Przeprowadzenie doświadczenia oceny aktywności cytotoksycznej

Komórki wysiewa się na płytki 96-dołkowe w objętości 100 μΙ zawiesiny i ilości 5x10³ komórek na dołek. Komórki inkubuje się przez 24 godziny w inkubatorze w 37°C, w obecności 5% CO2, następnie dodaje się świeżą pożywkę zawierająca roztwór pochodnej naftochinonu (roztwór naftochinonu w DMSO, dodany w stężeniu końcowym 0,5%) w różnych stężeniach (0,5-100 μΜ). Jako kontrolę, komórki traktuje się DMSO o końcowym stężeniu 0,5%. Komórki inkubuje się przez 72 godziny w inkubatorze po czym dodaje się 10 μΙ roztworu soli tetrazolowej (Sigma, nr kat. M2128) rozpuszczonej w buforze PBS o stężeniu 5 mg/ml. Komórki inkubuje się przez 2 godziny w inkubatorze następnie odciąga się pożywkę i dodaje 100 μΙ DMSO. Absorbancję roztworu mierzy się spektrofotometrycznie w zakresie długości fal 492-570 nm i przelicza przeżywałność w stosunku do próby kontrolnej.

Wyniki:

Analiza danych pozwoliła stwierdzić, że pochodna naftochinonu ma działanie cytotoksyczne wobec linii raka piersi MDA-MB-468 oraz BT474. Na Fig. 1 przedstawiono wynik eksperymentu. Obserwowany efekt ma charakter cytotoksyczny, gdyż spadek przeżywalności o 50% (wartość IC50) wynosi 2,5 oraz 6 μΜ odpowiednio dla linii raka piersi MDA-MB-468 oraz BT474.

Przykład 3

Zahamowanie aktywności białka ERK

1. Wykazanie zahamowanie białka ERK przy pomocy metody Western biot

PL 232 283 B1

a) Przygotowanie lizatów komórkowych

Komórki wysiewa się na płytki 6-dołkowe w ilości 5x10⁵ komórek na dołek i objętości 2 ml zawiesiny. Komórki inkubuje się przez 24 godziny w inkubatorze w 37°C, w obecności 5% CO2, następnie dodaje się świeżą pożywkę zawierająca roztwór pochodnej naftochinonu (roztwór naftochinonu w DMSO, dodany w stężeniu końcowym 0,5%) w różnych stężeniach (0,5-10 μΜ). Jako kontrolę, komórki traktuje się DMSO o końcowym stężeniu 0,5%. Po godzinnej inkubacji z badanymi związkami, dodaje się roztworu EGF (rozpuszczony w DMSO; firma Cell Signaling, nr kat. 8916SC) do końcowego stężenia 50 ng/ml i inkubuje kolejne 0,5 godziny w inkubatorze. Po inkubacji pożywkę usuwa się, a komórki przemywa 500 μΙ buforu PBS i inkubuje przez 0,5 h w 500 μl buforu lizującego RIPA Lysis Buffer System (firma Santa Cruz, nr kat. sc-24948A). Stężenie białka w próbach określa się za pomocą metody Bradford (Bradford, nr kat. 500-00006).

b) Elektroforeza poliakrylamidowa i metoda Western blot

Do studzienek żelu poliakrylamidowego (firma Bio-Rad, nr kat. 4561083EDU) nanosi się roztwór lizatów w ilości 50 μg białka oraz standard białkowy w ilości 6 μl (firma Thermo Scientific, USA, nr kat. 26616). Rozdział elektroforetyczny prowadzi się w aparacie (Mini-PROTEAN Tetra System, Bio-Rad) przez ok. 2,5 h pod napięciem 100 V.

Po rozdziale elektroforetycznym białka przenosi się na membranę nitrocelulozową (Amersham Hybond ECL, Life Science, nr kat. RPN303D) metodą elektroblotingu, prowadzoną w aparacie (Cleaver Scientific Ltd., UK). Transfer prowadzi się przez ok. 3 h pod napięciem 80 V.

Błonę nitrocelulozową inkubuje się w 5% odtłuszczonym mleku w proszku, rozpuszczonym w PBS. Następnie membranę inkubuje się przez noc, w temperaturze 4°C na wytrząsarce z roztworem odpowiednich przeciwciał I-rzędowych przygotowanych w 5% odtłuszczonym mleku przygotowanym w buforze PBS. Stosuje się odpowiednio przeciwciała I-rzędowe: przeciwciała phospho-p44/42 MAPK (Erk1/2) (Thr202/Tyr204) (firma Cell Signaling Technology, nr kat. 9102S) w rozcieńczeniu 1:1000, przeciwciała p44/42 MAPK (Erk1/2) (firma Cell Signaling Technology, nr kat. 4695S) w rozcieńczeniu 1:1000 oraz jako kontrolę przeciwciała β-actin (firma Cell Signaling Technology, nr kat. 8457S) w rozcieńczeniu 1:1000. Po nocnej inkubacji, membranę przepłukuje się w temperaturze pokojowej na wytrząsarce ok. 1 h w buforze PBS, wymieniając bufor co 10 minut. Membranę następnie inkubuje się z przeciwciałami II-rzędowymi: przeciwciałami anti-rabbit IgG, HRP-linked (firma Cell Signaling Technology, nr kat. 7074S) w rozcieńczeniu 1:1000 przygotowanym w 5% odtłuszczonym mleku rozpuszczonym w PBS, w temperaturze pokojowej na wytrząsarce ok. 1 h. Po inkubacji, membranę przepłukuje się w temperaturze pokojowej na bujawce przez 1 godzinę w buforze BPS, wymieniając bufor co 10 minut. W celu wywołania błony, na osuszoną membranę nanosi się 150 μl roztworu, zestawu SuperSignal West Dura Extended Duration Substrate (firma Thermo Fisher Scientific, nr kat. 34075), i analizuje w aparacie (Molecular Imager, ChemiDoc XRS, Bio-Rad, USA).

Wyniki:

Analiza danych pozwoliła stwierdzić, że pochodna naftochinonu hamuje aktywność białka ERK w liniach raka piersi MDA-MB-468 oraz BT474. Pochodna naftochinonu hamuje aktywność białka ERK, gdyż na przedstawionej Fig. 2 obserwuje się spadek poziomu ufosforylowanej formy białka ERK.

2. Wykazanie zahamowanie białka ERK przy pomocy techniki pomiaru wzmocnionej luminescencji w fazie jednorodnej (AlphaScreen - Amplified Luminescence Proximity Homogenous Assay).

Komórki linii MDA-MB-468 oraz BT474 wysiewa się na 96-dołkową płytkę, w ilości 2x10⁴ na dołek i w 100 μl objętości zawiesiny. Komórki inkubuje się 24 h w inkubatorze. Test wykonuje się według wskazówek producenta PerkinElmer zestawu AlphaScreen SureFire p-ERK1/2 (Thr202/Tyr204) Assay Kit (nr kat. TGRES500) oraz zestawu AlphaScreen SureFire ERK1/2 Total Assay Kit (nr kat. TGRTES500). Do każdego dołka dodaje się po 2 μl roztworu pochodnej naftochinonu (roztwór naftochinonu w DMSO, końcowe stężenie DMSO 0,5%) w różnych stężeniach (0,5-10 μM). Jako kontrolę, komórki traktuje się DMSO o końcowym stężeniu 0,5%. Komórki inkubuje się przez 1 godzinę w inkubatorze po czym do dołków (z wyjątkiem kontroli DMSO) dodaje się po 2 μl roztworu EGF (rozpuszczonego w DMSO; firma Cell Signaling, nr kat. 8916SC) do końcowego stężenia 50 ng/ml i inkubuje 0,5 godziny w inkubatorze. Po inkubacji, pożywkę znad komórek ściąga się, dodaje 50 μl buforu lizującego (1x stężony) z zestawu „AlphaScreen SureFire Assay Kit”, i wytrząsa się na worteksie przez 10 minut, z prędkością 400 rpm. Zgodnie z instrukcją zestawu „AlphaScreen SureFire ERK1/2 Assay Kit” przygotowuje się roztwór mikrocząsteczek - dawcy stanowiące tzw. „donor bead” i biorcy tzw. „acceptor bead”,

PL 232 283 Β1 z zastosowaniem buforu aktywującego i buforu do reakcji. Do dołków 384-dołkowej płytki (ProxiPlate 384 Plus, PerkinElmer) dodaje się po 4 μΙ odpowiedniego lizatu i 7 μΙ mieszaniny zawierającej: bufor aktywujący, bufor reakcyjny - do przeprowadzenia reakcji, kulki donorowe czyli mikrocząsteczki dawcy oraz kulki akceptorowe czyli mikrocząsteczki biorcy. Płytkę inkubuje się przez 1 godzinę w inkubatorze i wynik odczytuje w aparacie EnVision Multilabel Platę Reader, PerkinElmer.

Wyniki:

Analiza danych pozwoliła stwierdzić, że pochodna naftochinonu hamuje aktywność białka ERK w liniach raka piersi MDA-MB-468 oraz BT474. Na Fig. 3 przedstawiono wyniki eksperymentu, na którym obserwuje się istotny spadek poziomu ufosforylowanej formy białka ERK już przy stężeniu 1 μΜ dla linii raka piersi MDA-MB-468 oraz BT474.

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Pochodna naftochinonu w postaci 5-metoksy-2-(-2-propoksyetylo)naftochinon o wzorze:

2. Pochodna naftochinonu w postaci 5-metoksy-2-(-2-propoksyetylo)naftochinon o wzorze:

do zastosowania w leczeniu nowotworów piersi.

3. Pochodna do zastosowania według zastrz. 2 jako inhibitor białka ERK.