PL232671B1 - Nowy szczep Lactobacillus plantarum AMT12 i kompozycja zawierająca szczep Lactobacillus plantarum AMT12 - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum AMT12 i kompozycja zawierająca nowy szczep Lactobacillus plantarum AMT12.

Lactobacillus plantarum jest zaliczany do bakterii kwasu mlekowego, która pełni istotną funkcję przemysłową (Parente E., Ciocia F., Ricciardi A., Zotta T., Felis G.E., Torriani S. 2010. Diversity of stress tolerance in Lactobacillus plantarum, Lactobacillus pentosus and Lactobacillus paraplantarum: a multivariate screening study. International Journal of Food Microbiology 144, 270-279). Bakterie te powszechnie występują w żywności fermentowanej, oliwkach, serach, winie i kiszonkach (Tanganurat W., Quinquis B., Leelawatcharamas V., Bolotin A., 2009. Genotypic andphenotypiccharacterization of Lactobacillus plantarum strains isolated from Thai fermented fruits and vegetables, Journal Basic Microbiology 49, 377-385). W związku z tym szczepy z tego gatunku, posiadające właściwości probiotyczne, mają zastosowanie przy produkcji żywności funkcjonalnej, terapeutycznej oraz jako potencjalne doustne, żywe szczepionki (Shah N.P., 2007. Functional cultures and health benefits. International Dairy Journal 17, 1262-1277).

Mechanizm działania bakterii probiotycznych jest wieloczynnikowy i swoisty dla poszczególnych szczepów (Tuohy K.M., Probert H.M., Smejkal C.W., Gibson G.R., 2003. Using probiotics and prebiotics to improve gut health. Drug Discovery 8, 692-700). Jednym z lepiej poznanych sposobów działania probiotyków wobec patogenów jest antagonizm oparty na wydzielaniu przez probiotyki do środowiska substancji bakteriostatycznych i/lub bakteriobójczych opisany przez Kesarcodi-Watson i wsp., (Kesar-codi-Watson A., Kaspar Hl., Lategan M.J., Gibson L., 2008. Probiotics in aquaculture: The need, principles andmechanisms of action and screeningprocesses. Aquaculture, 274, 1-14). Uważa się, że obecność probiotyków w jelicie lub na powierzchni, skórze gospodarza hamuje rozwój bakterii potencjalnie chorobotwórczych (Verschuere L., Heang H., Criel G., Dafnis S., Sorgeloos P., Verstraete W., 2000. Protection of Artemia against the pathogenic effects of Vibrio proteolyticus CW8T2 by selected bacterial strains. Applied and Environmental Microbiology, 66, 1139-1146). To przeciwbakteryjne działanie wywołują poszczególne lub w połączeniu ze sobą substancje wytwarzane przez bakterie takie jak: antybiotyki, bakteriocyny, lizozym, proteazy, nadtlenek wodoru, amoniak, diacetyl, siderofory, kwasy organiczne pojedyncze (Verschuere L., Rombaut G., Sorgeloos P., Verstraete W., 2000. Probiotic bacteria as biological control agents in aquaculture. Microbiology and Molecular Biology Review, 64, 655-671). Efektywność antagonizmu opartego na wydzielaniu do środowiska inhibitorów jest w dużej części zależna od warunków w jakich prowadzone jest doświadczenie. Biedrzycka i wsp. (Biedrzycka E., Markiewicz L.H, Bielecka M., Siwicki A.K., 2007. Kształtowanie mikroekosystemu przewodu pokarmowego, Sterowanie rozwojem układu pokarmowego u nowonarodzonych ssaków, pod red. Zabiel-skiego R., Wydawnictwo Rolne i Leśne, 5, 126-140) wykazali, że antagonistyczna aktywność szczepów probiotycznych to nie tylko wytwarzanie inhibitorów, ale również uniemożliwienie kolonizacji poprzez koagregację komórek bakterii probiotycznych z komórkami patogenów i rywalizacja o miejsce przyłączenia do błon śluzowych gospodarza. W proces ten zaangażowane są różne mechanizmy np.: interakcje elektrostatyczne, oddziaływania hydrofobowe, kwasy lipotejchojowe (Gómez R., Geovanny D., Balcazar J.L., Shen M, 2007. Probiotics as control agents in aquaculture, Journal of Ocean University of China, 6, 76-79 ). Właściwości te umożliwiają i pomagają bakteriom w utrzymaniu znacznej przewagi w przewodzie pokarmowym ludzi i zwierząt. Dynamiczna i bardzo złożona reakcja mikroorganizmów jest niezwykle ważna dla komórek nabłonka jelit i układu odpornościowego gospodarza (Shi HN, Walker A. Bacterial colonization and the development of intestinal defenses, 2004, Can. J Gastroenterol, 18, 493-500). Umożliwia zachowanie homeostazy i inicjuje odpowiednie reakcje organizmu przeciw patogenom.

Przewód pokarmowy człowieka i zwierząt hodowlanych (drób, bydło, trzoda, konie, owce, kozy itp.) może się różnić anatomicznie i funkcjonalnie. Stwierdzono jednakże pewne podobieństwo mikroflory jelitowej, zarówno pod względem ilości, jak i obecności takich samych dominujących grup bakterii. Wśród mikroflory kolonizującej jelita zwierząt występuje wiele bakterii komensalnych, które są patogenne dla organizmu zwierzęcego, stanowią przyczynę zoonoz. Do najbardziej powszechnych bakterii patogennych pochodzenia zwierzęcego należą: Salmonella, E. coli 0157:H7, Campylobacter, inne, jak Yersinia enterolitica, Listeria monocytogenes, Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Shigella sp. i Clostridium sp., które mogą, ale nie muszą być przenoszone przez żywność pochodzenia zwierzęcego. W pionierskiej pracy pt. Probiotics: Intestinal inoculants for production animals przedstawiono omówienie dostępnych probiotyków, stosowanych podczas hodowli różnych zwierząt, w tym kurcząt, świń i cieląt (Fox Veterinary Medicine, 08/1988). W opisie WO 89/05849 opisano bakterie Lactobacillus z przewodu pokarmowego świni o tolerancji względem kwasu i żółci, które według autorów można użyć do fermentacji mleka, którym następnie można karmić prosięta zapobiegając biegunce. W publikacjach opisów patentowych US 5 705 160, EP 353581, PL 179 838, PL 195 089, PL 214 583 opisano właściwości wielu szczepów Lactobacillus plantarum posiadających właściwości wytwarzania dużych ilości substancji bakteriostatycznych.

Zakażenia bakteriami Salmonella zaliczane są do najczęstszych chorób ludzi przekazywanych drogą pokarmową, skażone produkty pochodzenia drobiowego stanowią jedno z podstawowych źródeł zakażenia. Wysiłki podejmowane w celu kontrolowania zakażeń Salmonella wśród drobiu domowego wynikają, z nielicznymi wyjątkami, z troski o zdrowie publiczne, a w mniejszym stopniu z dążenia do istotnego zwiększenia wydajności produkcji drobiarskiej. W związku z tym uważa się za zasadne i bardzo pożądane stosowanie naturalnych dodatków w żywieniu drobiu, których efektem będzie obniżenie liczby bakterii Salmonella w treści przewodu pokarmowego jelit.

Wykazano, że stosowane preparaty probiotyczne wywierają korzystny wpływ na skórę poprzez ich działanie na oś „jelito-mózg-skóra”. Według tego założenia, niewłaściwa dieta uboga w błonnik pokarmowy, stres, terapie antybiotykowe powodują nadmierny rozwój w jelitach mikroorganizmów potencjalnie patogennych i/lub patogennych. Efektem tego jest osłabienie bariery jelitowej i wchłanianie do krwiobiegu substancji toksycznych wywołujących proces zapalny. Co u osób predysponowanych do trądziku pospolitego, trądziku różowanego i alergii może prowadzić do zaostrzenia zmian skórnych. Dlatego za zasadne uznaje się zastosowanie bakterii probiotycznych o potwierdzonych właściwościach, w kremach lub maściach jako tzw. swoistej „tarczy” chroniącej przed patogenami. Działanie to opiera się na hamowaniu kolonizacji patogenów występujących na skórze przez blokowanie ich adherencji przy jednoczesnej produkcji substancji działających antybakteryjnie. Ponadto bakterie probiotyczne hamują odpowiedź immunologiczną i w efekcie zmniejszają stan zapalny w skórze. Dodatkowo rozkładają sebum i inne wydzieliny skóry sprawiając tym samym łatwiejsze przyswajanie składników odżywczych zawartych w kremie.

Celem wynalazku jest wyizolowanie nowego szczepu Lactobacillus plantarum o właściwościach probiotycznych, a w szczególności wykazującego zdolności bakteriobójcze wobec potencjalnych i/lub patogenów ludzi i zwierząt. Szczep będzie miał optymalne oddziaływanie na układ pokarmowy i skórę ludzi i zwierząt.

Istotą wynalazku jest nowy szczep Lactobacillus plantarum AMT12 oraz kompozycja zawierająca nowy szczep Lactobacillus plantarum AMT12 i nośnik, wyróżniająca się wybitnymi właściwościami pro-biotycznymi ze szczególnym uwzględnieniem aktywności antagonistycznej wobec bakterii należących do gatunków Staphylococcus aureus, Salmonella enterica, Escherichia coli będącymi patogenami ludzi i zwierząt. Stosowana do wytwarzania kremów i maści, preparatów/produktów parafarmaceutycznych, farmaceutycznych, spożywczych oraz dodatków do żywności i wody dla ludzi i zwierząt. Szczep Lactobacillus plantarum AMT12 został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu, nr depozytu B/00107.

Identyfikacja szczepu

Szczep Lactobacillus plantarum AMT12 pochodzi ze środowiska roślinnego. Szczep został zdeponowany zgodnie z postanowieniami Traktatu Budapesztańskiego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk. Depozyt złożono w dniu 03-02-2016 r. i oznaczono numerem B/00107.

Oznaczenie przynależności gatunkowej szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 W celu zbadania przynależności gatunkowej szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 wykonano genotypowanie metodą PCR z zastosowaniem gatunkowo swoistych starterów.

Genotypowanie metodą PCR

Identyfikacja wyizolowanych szczepów przeprowadzona była z wykorzystaniem metody sekwen-cjonowania DNA. Zabezpieczony materiał posłużył do izolacji DNA.

Izolowanie DNA

Izolację DNA przeprowadzono zgodnie z procedurą: 1. Do probówki Eppendorfa przenoszono 1 ml hodowli bakteryjnej, zwirowano (1 min, maksymalne obroty) i wylano supernatant. Czynność tą powtórzono 3 razy. 2. Do probówki z komórkami dodano 100 μl buforu lizującego LT oraz po 10 μl proteinazy K i lizozymu. 3. Probówkę inkubowano w temperaturze 50°C przez 60 minut (mieszając poprzez worteksowanie co 15 minut). 4. Po inkubacji probówkę intensywnie worteksowano przez 20 sekund. 5. Próbę wirowano 3 minuty (12 tys. obrotów, wirówka Eppendorf). 6. Supernatant przelewano do wcześniej opisanej minikolumny do oczyszczania DNA. 7. Wirowano 1 minutę (12 tys. obrotów, wirówka Eppendorf). 8. Do minikolumny dodawano 500 μΙ roztworu płuczącego A1. 9. Wirowano 1 minutę (12 tys. obrotów, wirówka Eppendorf). 10. Przenoszono minikolumnę do nowej probówki (2 ml) i dodawano do minikolumny 300 μΙ roztworu płuczącego A1. 11. Wirowano 3 minuty (12 tys. obrotów, wirówka Eppendorf). 12. Minikolumnę przeniesiono do nowej probówki (1,5 ml) i do złoża znajdującego się na dnie minikolumny dodawano 60 μΙ dejonizowanej wody. 13. Inkubowano próbkę przez 5 minut w temperaturze pokojowej. 14. Wirowano 1 minutę (12 tys. obrotów, wirówka Eppendorf). 15. Minikolumnę usuwano, a oczyszczone DNA znajdujące się w probówce przechowywano w lodówce. 16. Jakość i ilość DNA analizowano metodą spektrofotometryczną.

PCR i sekwencjonowanie DNA

Wyizolowane DNA ampilifikowano techniką PCR

Składniki mieszaniny PCR: 1. 10 x Bufor polimerazy DNA 6 μΙ 2. MgCb 25 mM, 2,4 μΙ 3. Wolne nukleotydy 2 mM, 1,3 μΙ 4. starter R 20 pmol, 0,5 μΙ 5. starter F 20 pmol, 0,5 μΙ 6. Η2Ο15μΙ 7. Polimeraza DNA 2u/1 μΙ, 0,15 μΙ

Starter R: 341: 5’- CCTACGGGAGGCAGCAG -3’ (Muyzer et al. 1993)

Starter F: 16SR: 5’ - TACCTTGTTACGACTTCACCCCA-3’ (Rossau et al. 1991)

Uzyskane produkty PCR poddano reakcji sekwencjonowania co było przeprowadzone w specjalistycznym laboratorium GENOMED (Warszawa, ul. Ponczowa 12). Elmer ABI 373 Automated DNA Sequencer(PE Applied Biosystems, FosterCity, CA, USA). W wyniku sekwencjonowania uzyskano sekwencję DNA fragmentu genu 16S rRNA każdego z analizowanych szczepów.

GTCTGATGGAGCACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAACT

CTGTTGTTAAAGAAGAACATATCTGAGAGTAACTGTTCAGGTATTGACGGT

ATTTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACG

TAGG TGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGCG TAAAGCGAGCGCAGGCGG

TTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTCAACCGAAGAAGTGCATCGG

AAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGC

GGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTC

TGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGTATGGGTAGCAAACAGGATTA

GATACCCTGGTAGTCCATACCGTAAACGATGAATGCTAAGTGTTGGAGGGT

TTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGT

ACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCG

GTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTT

GACATACTATGCAAATCTAAGAGATTAGACGTTCCCTTC

Każda z uzyskanych sekwencji o długości około 650 pz była identyczna. Analiza porównawcza z sekwencjami DNA zdeponowanymi w Banku genów (NCBI) wykazała, że analizowana sekwencja jest identyczna z sekwencją Lactobacillus plantarum.

Przeprowadzone badania metodą genotypową potwierdziły, że badany szczep AMT12 należy do gatunku Lactobacillus plantarum.

Badanie in vitro antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 wobec czynników patogennych przewodu pokarmowego i skóry W badaniach użyto szczepy z gatunków Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis (szczepy: Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS 64, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 65/s/10) i Escherichia coli (szczepy: Escherichia coli 0157:H7 - szczep en-terokrwotoczny, Escherichia coli Nissle 1917 - szczep wyizolowany z komercyjnego suplementu diety o nazwie Mutaflor), Staphylococcus aureus ATTC 33862. Użyte w badaniach in vitro szczepy patogenne pochodziły z Krajowego Ośrodka Salmonelli w Gdyni (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS 64), Zakładu Higieny Weterynaryjnej (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 65/s/10 - szczep terenowy, wyizolowany od chorych ptaków) i Instytutu Rozrodu Zwierząt i Badań Żywności Polskiej Akademii Nauk w Olsztynie (Escherichia coli 0157:H7, Escherichia coli Nissle 1917, Staphylococcus aureus ATTC 33862).

Szczep L. plantarum AMT12 pochodził z kolekcji własnej mikroorganizmów firmy PROBIOS Sp. z o. o. Szczepy patogenne przechowywano w postaci liofilizatu w temperaturze 4°C i bezpośrednio przed badaniem uaktywniano przez dwukrotny pasaż w płynnym podłożu tryptonowo-sojowym (TSB, Merck, nr kat. 1054590500). W celu określenia zdolności antybakteryjnych bakterii L. plantarum AMT12 wobec wybranych patogenów należących do gatunków Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis, Escherichia coli i Staphylococcus aureus poprowadzono wspólne hodowle w płynnym podłożu tryptonowo-so-jowym (TSB, Merck, nr kat. 1054590500) zapewniającym dobry wzrost szczepowi hamującemu - Lactobacillus plantarum AMT12 i hamowanym - Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS 64, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 65/s/10, Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli Nissle 1917, Staphylococcus aureus ATTC 33862.

Hodowle wspólne (próby badane) inokulowano liofilizowanym szczepem Lactobacillus plantarum AMT12 na poziomie 109 jednostki tworzące kolonie/ml (opisanych dalej powszechnie przyjętym polskim skrótem jtk/ml) i aktywną monokulturą szczepu patogennego z gatunku Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis w ilości od 105 do 106 jtk/ml, Escherichia coli w ilości od 106 do 107 jtk/ml, Staphylococcus aureus w ilości 106 jtk/ml. Próbami kontrolnymi w przeprowadzonym doświadczeniu były pojedyncze szczepy bakterii patogennych (Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS 64, Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis 65/s/10, Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli Nissle 1917, Staphylococcus aureus ATTC 33862) i monokultura Lactobacillus plantarum AMT12 z zastosowaniem poziomu inokulum oraz płynnego podłoża jak w hodowlach wspólnych.

Hodowle wspólne i pojedyncze przygotowywano w czterech równoległych probówkach w trzech powtórzeniach. Inkubację prowadzono w warunkach tlenowych w temp. 37°C przez 0 (tzw. próba zerowa określająca inokulum) 24, 48 i 72 godziny. Po inkubacji określono liczbę żywych komórek bakterii Lactobacillus plantarum i patogenów we wspólnych hodowlach i w kontrolnych, metodą płytkową z zastosowaniem odpowiednich podłoży agarowych (Tabela nr 1). Badany materiał rozcieńczano 1% wodą peptonową z zastosowaniem metody seryjnych dziesięciokrotnych rozcieńczeń i wysiewano na dno płytki Petriego, następnie zalewano upłynnioną pożywką agarową o temperaturze około 45°C. Bezpośrednio po zestaleniu podłoża, płytki odwracano dnem do góry i inkubowano w temperaturze 37°C przez 24 lub 48 godzin w warunkach tlenowych lub względnie beztlenowych.

Warunki hodowli podano w tabeli nr 1.

Po inkubacji zliczono kolonie bakterii w hodowlach wspólnych i porównywano z liczbą bakterii w hodowlach kontrolnych (pojedynczych).

Tabela 1

Warunki hodowli badanych szczepów bakterii

Wyniki badań in vitro antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 wobec czynników patogennych przewodu pokarmowego i skóry przedstawiono w tabeli nr 2.

Tabela 2

Badanie in vitro antagonistycznego działania szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 wobec czynników patogennych przewodu pokarmowego i skóry

*A!b — nieobecne w 1 ml hodowli W przeprowadzonych badaniach in vitro stwierdzono całkowitą redukcję liczby bakterii Salmonella enterica subsp. enterica serovar Enteritidis KOS64, Salmonella enterica subsp. enteńca serovar Enteritidis 65/s/IO, Escherichia coli O157:H7, Escherichia coli Nissle 1917 / Staphylococcus aureus ATTC 33862 po 24 godzinnej inkubacji z Lactobacillus plantarum AMT12.

Określenie zdolności namnażania się Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności myko-toksyn, deoksyniwalenonu i zearalenonu Płynną pożywkę MRS (Merck, nr kat. 1106610500) inokulowano szczepem Lactobacillus plantarum AMT12 w dawce 2,8 χ 106 jednostek tworzących kolonie/ml i mykotoksyną deoksyniwalenon (Sigma-Aldrich, nr kat. 32943-5MG) lub zearalenon (Sigma-Aldrich, nr kat. 32939-5MG) o stężeniu końcowym w próbie 2 μg/ml każdy.

Hodowlę prowadzono w trzech równoległych probówkach w warunkach tlenowych w temperaturze 37°C przez 24 i 48 godziny. Dodatkowo równolegle prowadzono hodowlę kontrolną badanego szczepu bez dodatku badanych mykotoksyn w warunkach tlenowych i optymalnej temperaturze wzrostu tj. 37°C. Liczbę żywych komórek oznaczano bezpośrednio po inokulacji i po 24 i 48 godzinach. Inkubację bakterii na płytkach Petriego prowadzono w temperaturze 37°C przez 48 godzin w warunkach względnie beztlenowych.

Dane przedstawiono w tabeli nr 3

Tabela 3

Określenie zdolności namnażania się Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności mykotoksyn, deoksyniwalenonu i zearalenonu

Lactobacillus plantarum AMT12 wykazał zdolność wzrostu w obecności badanych mykotoksyn tj. deoksyniwalenonu i zearalenonu w odniesieniu do prowadzonej równolegle hodowli kontrolnej szczepu AMT12 (Tabela nr 3). W pierwszej dobie inkubacji liczebność L. plantarum AMT12 była na poziomie 109 jednostek tworzących kolonie/ml (jtk/ml). W 48 godzinie inkubacji we wszystkich badanych próbach stwierdzono spadek liczby bakterii szczepu AMT12 do poziomu 108 jtk/ml.

Na podstawie przeprowadzonych badań można sadzić, że szczep Lactobacillus plantarum AMT12 posiada unikalne właściwości wzrostu i namnażania się w obecności jednych z najgroźniejszych mykotoksyn, deoksyniwalenonu lub zearalenonu.

Określenie zdolności wzrostu Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności wybranych antybiotyków najczęściej stosowanych w terapii leczenia zwierząt

Badanie zdolności wzrostu Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności wybranych 20 antybiotyków wykonywane było przy zastosowaniu metody hodowli wspólnych. W tym celu płynną pożywkę M RS (Merck, nr kat. 1106610500) inokulowano szczepem Lactobacillus plantarum AMT12 w dawce 2,1 χ 106 jednostek tworzących kolonie/ml i jednym z 20 antybiotyków w stężeniu odpowiadającym dawce antybiotyku stosowanej u zwierząt w przeliczeniu na kilogram masy ciała (Tabela nr 4).

Hodowlę prowadzono w trzech równoległych probówkach w warunkach tlenowych w temperaturze 37°C przez 24 godziny. Dodatkowo równolegle prowadzono hodowlę kontrolną badanego szczepu bez dodatku badanych antybiotyków. Liczbę żywych komórek oznaczano bezpośrednio po inokulacji i po 24 godzinach.

Dane dotyczące zdolności wzrostu Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności wybranych antybiotyków stosowanych w terapii leczenia zwierząt zebrano w tabeli nr 4.

Tabela 4

Określenie zdolności wzrostu Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności wybranych antybiotyków najczęściej stosowanych w terapii leczenia zwierząt

Lactobacillus plantarum AMT12 wykazał unikalne szerokie spektrum antybiotykooporności wobec badanych antybiotyków. W obecności 11 antybiotyków (wodorofumaran tiamuliny, enrofloksacyna, kolistyna, tylmykozyna, toltrazuryl, amprolium, chlorowodorek lewamizolu, flubendazol, neomecyna, sul-fachloropirazyna sodowa, linkomycyna), spośród 20 badanych antybiotyków, stwierdzono znakomitą zdolność namnażania się szczepu AMT12 w odniesieniu do liczebności jaką szczep osiągnął w hodowli kontrolnej. Natomiast w obecności florfenikolu, doksycyliny, fenoksymetylopenicyliny i tylozyny liczebność L. plantarum AMT12 utrzymała się na poziomie inokulum. W przypadku hodowli wspólnych z sulfmetoksazolem, amoksycyliną, linkomycyną w połączeniu z spektrynomycyną, tylwalozyną odnotowano spadek liczby bakterii szczepu AMT12 od 1 do 3 rzędów wielkości w porównaniu do kontroli. Lactobacillus plantarum AMT12 nie wykazał antybiotykooporności tylko wobec jednego dwuskładnikowego preparatu tj. amoksycyliny z dodatkiem kwasu klawulanowego.

Określenie zdolności namnażania się Lactobacillus plantarum AMT12 w temperaturach: 15 i 20°C Płynną pożywkę MRS (Merck, nr kat. 1106610500) inokulowano szczepem Lactobacillus plantarum AMT12 w dawce ok. 107 jednostek tworzących kolonie/ml. Hodowlę prowadzono w trzech równoległych probówkach w warunkach tlenowych w temperaturach 15 i 20°C przez 24, 48 i 72 godziny. Dodatkowo równolegle prowadzono hodowlę kontrolną badanego szczepu w warunkach tlenowych i optymalnej temperaturze wzrostu tj. 37°C. Liczbę żywych komórek oznaczano bezpośrednio po inokulacji i po 24, 48 i 72 godzinach.

Tabela 5

Określenie możliwości wzrostu szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 w temperaturze 15 i 20°C

Lactobacillus plantarum AMT12 wykazał zdolność wzrostu w temp. 15 i 20°C. Badany szczep Lactobacillus plantarum AMT12 nieznacznie wolniej namnażał się w pierwszej dobie inkubacji prowadzonej w temp. 15°C, w której to osiągnął liczebność 1,4 x 108 jednostek tworzących kolonie/ml (jtk/ml), w odniesieniu do prowadzonej równolegle hodowli kontrolnej - 1,5 x 109 jtk/ml. W 48 i 72 godzinie inkubacji jego liczebność wynosiła odpowiednio: 1,6 x 109 i 2,3 x 109 jtk/ml. Natomiast w hodowli kontrolnej w kolejnych dobach inkubacji stwierdzono obniżenie liczby komórek do poziomu ~108 jtk/ml. Natomiast liczebność populacji L. plantarum AMT12 w temp. 20°C była porównywalna z liczbą komórek jaką szczep AMT12 osiągał w optymalnej temperaturze wzrostu tj. 37°C.

Po 24 i 48 godzinach inkubacji w 20°C jego liczebność wynosiła odpowiednio: 2,0 χ 109, 2,9 x 109jtk/ml i w kolejnej dobie inkubacji pozostała niezmieniona.

Stwierdzono, że szczep Lactobacillus plantarum AMT12 posiada unikalne właściwości wzrostu w niskich temperaturach tj. poniżej 16°C.

Oznaczenie przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 w niskim pH oraz w obecności soli żółciowych

Przeżywalność szczepu Lactobacillusplantarum AMT12 w niskim pH oznaczono przez obniżenie kwasowości hodowli Lactobacillus plantarum AMT12 będącej w stacjonarnej fazie wzrostu do wartości pH równej 3. Natomiast w przypadku oznaczenia przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności soli kwasów żółciowych, na początku podwyższono wartości pH hodowli Lactobacillus plantarum AMT12 do wartości równej 6, a następnie dodano sole żółciowe w ilości stanowiącej 3%

hodowli. Oznaczenia przeżywalności szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 w niskim pH wykonano przed obniżeniem pH hodowli (próba kontrolna) tuż po obniżeniu pH hodowli do wartości równej 3 tzw. 0 minuta, a następnie po 40 i 180 minutach inkubacji w temperaturze 37°C w warunkach beztlenowych. Przeżywalność Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności soli żółci wykonano przed dodaniem soli żółci (próba kontrolna), tuż po dodaniu soli żółci tzw. 0 minuta oraz po 1,3 i 6 godzinach inkubacji w temperaturze 37°C w warunkach beztlenowych. Żywe komórki bakterii Lactobacillus plantarum AMT12 oznaczono w jednostkach tworzących kolonie (jtk/ml) z zastosowaniem techniki płytek lanych. Przeżywalność szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 wyrażono w procentach w odniesieniu do liczby komórek Lactobacillus plantarum AMT12 po 180 minutach w przypadku oznaczenia przeżywalności w pH równym 3 i po 6 godzinach w przypadku oznaczenia liczebności Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności soli żółci, w porównaniu odpowiednio do liczebności szczepu Lactobacillus plantarum AMT 12 w kontroli.

Tabela 6

Przeżywalność szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 w pH = 3

Tabela 7

Przeżywalność szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 w obecności 3% soli kwasów żółciowych

Badany szczep Lactobacillus plantarum AMT12 wykazał 100% przeżywalność w niskim pH = 3 oraz 89% przeżywalność w obecności soli żółci o stężeniu.

Wyniki wykazały dużą oporność szczepu Lactobacillus plantarum AMT12 na niskie pH jak i na sole żółci, co świadczy o przystosowaniu tego szczepu do warunków panujących w przewodzie pokarmowym.

Wynalazek ilustrują poniższe przykłady wykonania.

Przykład 1

Kompozycja probiotyczna stanowiąca dodatek do pasz lub wody dla drobiu stanowi produkt w formie liofilizowanych bakterii i substancji wiążącej i jako szczep bakteryjny zawiera szczep Lactobacillus plantarum AMT12 PCM B/00107 w ilości 2,5 x 106 jednostek tworzących kolonie - jtk/ml.

Przykład 2

Kompozycja probiotyczna stanowiąca dodatek do pasz lub wody dla akwakultury stanowi produkt w formie liofilizowanych bakterii i substancji wiążącej, oraz zawiera jako szczep bakteryjny Lactobacillus plantarum AMT 12 PCM B/00107 w ilości 2,0 x 107 jednostek tworzących kolonie - jtk/ml.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Szczep bakterii Lactobacillus plantarum AMT12, PCM B/00107.

2. Kompozycja do wytwarzania kremów i maści, preparatów/produktów parafarmaceutycznych, farmaceutycznych, spożywczych oraz dodatków do żywności i wody dla ludzi i zwierząt składająca się z nowego szczepu bakterii nośnika i substancji wypełniającej, znamienna tym, że jako szczep bakteryjny zawiera Lactobacillus plantarum AMT12 zdeponowany w PCM B/00107 w ilości od 103 do 1013 jednostek tworzących kolonie/g.