PL233537B1

PL233537B1 - Zastosowanie szczepu Lactobacillus buchneri M w procesie kiszenia roślin lignocelulozowych

Info

Publication number: PL233537B1
Application number: PL413809A
Authority: PL
Inventors: Marta Kupryś-Caruk; Mieczysław Błaszczyk; Sławomir Podlaski
Original assignee: Szkola Glowna Gospodarstwa Wiejskiego W Warszawie
Priority date: 2015-09-03
Filing date: 2015-09-03
Publication date: 2019-10-31
Also published as: PL413809A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest szczep bakterii Lactobacillus buchneri M zdeponowany w Polskiej Kolekcji Drobnoustrojów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu pod numerem B/00077, do zastosowania do konserwacji biomasy lignocelulozowej przeznaczonej do produkcji biogazu. Zgłoszenie obejmuje także zastosowanie nowego szczepu Lactobacillus buchneri M w procesie kiszenia roślin lignocelulozowych przeznaczonych do produkcji biogazu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie nowego szczepu Lactobacillus buchneri M w procesie kiszenia roślin lignocelulozowych przeznaczonych do produkcji biogazu.

Technologia produkcji biogazu (mieszaniny ditlenku węgla i metanu) opiera się na procesie beztlenowego rozkładu substancji organicznej przez liczne grupy drobnoustrojów. Substratami stosowanymi w produkcji biogazu rolniczego w praktyce są surowce roślinne, głównie odpady i pozostałości z przemysłu rolno-spożywczego oraz pochodzące z celowych upraw. Biomasa lignocelulozowa - rośliny o wysokiej zawartości polisacharydów strukturalnych (celulozy, hemicelulozy, ligniny) może być również stosowana w produkcji biogazu, wymaga jednak odpowiedniej obróbki wstępnej przed procesem fermentacji metanowej. Wynika to z faktu, że polisacharydy strukturalne są trudno rozkładalne, a długotrwały, wstępny etap ich hydrolizy wydłuża cały proces fermentacji metanowej.

Celuloza i hemiceluloza stanowią główną część całej biomasy roślinnej. Biomasa lignocelulozowa charakteryzuje się wysoką zawartością (ponad 30% w suchej masie) zawartością celulozy. Celuloza występuje w bliskim związku z hemicelulozą i ligniną, które razem stanowią główne składniki włókien roślinnych. Celuloza składa się z długich łańcuchów reszt β-glikozydowych związanych w pozycjach 1,4. Hemiceluloza natomiast jest bezpostaciowym heteropolimerem zbudowanym z różnych polisacharydów. W skład hemicelulozy, według podziału Schulzego, wchodzą celulozany, pentozany i heksozany. Ksylan zaliczany jest do pentozanów i jest bardzo rozpowszechniony w przyrodzie. Jego głównym składnikiem jest łańcuch reszt ksylopiranozowych połączonych wiązaniem 3-1,4-glikozydowym. Zależnie od pochodzenia tego polimeru, łańcuch główny może być podstawiony bocznymi grupami L-arabinofuranozowymi, acetylowymi lub 4-0-metyloglukuronowymi oraz kwasem ferulowym lub p-kumarowym. W celu całkowitego rozkładu rozgałęzionego acetyloksylanu konieczne jest współdziałanie wielu enzymów hydrolitycznych: endo-3-1,4-ksylanazy, egzo-3-1,4-D-ksylozydazy, a-D-glukuronidazy, a-L-arabinofuranozydazy, esterazy octanowej lub acetyloksylanoesterazy.

Biomasa lignocelulozowa stanowi odnawialne źródło energii i może być bezpośrednio spalana bądź przetwarzana na paliwo ciekłe i gazowe. Ograniczenia w zastosowaniu biomasy lignocelulozowej do produkcji paliwa gazowego (biogazu) wynikają z długotrwałego etapu hydrolizy polisacharydów strukturalnych, który obniża szybkość fermentacji metanowej. Aby przyspieszyć hydrolizę polisacharydów strukturalnych można zastosować różne metody rozkładu substancji lignocelulozowej, jednak o ich zastosowaniu w praktyce decydują przede wszystkim względy ekonomiczne.

Istnieje obecnie wiele opracowanych sposobów rozkładu biomasy lignocelulozowej opartych na procesach fizycznych i chemicznych. W PL 351393 (A1) opisano sposób rozdzielania biomasy zawierającej lignocelulozę, polegający na tym, że wstępna hydroliza opierała się na działaniu na biomasę wodą lub parą wodną. W PL 2007945 (T3) opisano frakcjonowanie lignocelulazy oparte na rozpuszczaniu celulozy. W PL 366371 (A1) opisano sposób etapowego oddzielania hemiceluloz z biomasy poprzez (a) tworzenie rozpuszczalnego w wodzie kompleksu hem icelulozy ze związkiem kompleksowym i następcze (b) oddzielenie skompleksowanych hemiceluloz z zawiesiny biomasy.

W PL 310828 (A1) ujawniono metodę wytwarzania cukrów z biomasy zawierającej celulozę i hemicelulozę przy zastosowaniu hydrolizy stężonym kwasem. Celuloza i hemiceluloza w biomasie najpierw są poddawane dekrystalizacji, a następnie hydrolizie z wytworzeniem hydrolizatu zawierającego zarówno cukry, jak i kwas.

Procesy enzymatycznej hydrolizy biomasy opisano w PL 2188381 (T3) i PL 1828373 (T3).

Opracowane zostały również biologiczne metody rozkładu biomasy lignocelulozowej. W WO2009137574 (A2) przedstawiono zmodyfikowany genetycznie szczep drożdży z gatunku Hansenula polymorpha, który zastosowano do rozkładu ksylanu (będącego częścią hemicelulozy). W WO2011038393 (A2) opisano zastosowanie termofilnego, celulo- i ksylanolitycznego szczepu bakterii z rodzaju Clostridium.

Jedną z metod traktowania biomasy lignocelulozowej w celu jej hydrolizy może być poddanie jej konserwacji poprzez kiszenie przy zastosowaniu wyspecjalizowanych szczepów bakterii fermentacji mlekowej. Bakterie należące do tej grupy mikroorganizmów z cukrów prostych w warunkach beztlenowych wytwarzają kwas mlekowy, który obniża pH zakiszanej biomasy i przez to hamuje rozwój niepożądanej mikroflory, przyczyniając się do zachowania trwałości biomasy podczas jej przechowywania. Bakterie mlekowe charakteryzują się zdolnością do częściowego rozkładu polisacharydów strukturalnych, hydrolizując ich wiązania i uwalniając ich monomery - cukry proste. Zastosowanie bakterii fermentacji mlekowej w procesie konserwacji biomasy lignocelulozowej może więc być sposobem na

PL 233 537 B1 zwiększenie stopnia hydrolizy polisacharydów strukturalnych, w skład których wchodzi ksylan będący heteropolimerem ksylozy. Poprzez zwiększenie stopnia rozkładu tej frakcji hemicelulozy można jednocześnie zwiększyć wydajność procesu fermentacji metanowej biomasy roślinnej.

Opatentowane zostały metody zastosowania różnych szczepów bakterii fermentacji mlekowej charakteryzujących się pewnymi szczególnymi cechami technologicznymi w procesie konserwacji biomasy roślinnej. Przykładowo w US 2014178528 (A1) zgłoszono metodę otrzymywania kiszonek z roślin wysokoskrobiowych z dodatkiem wieloskładnikowego preparatu, zawierającego nowy szczep Lactobacillus buchneri A o zdolności do syntezy i metabolizowania 1,2-propanodiolu. Patent o numerze US8697423 (B2) dotyczy zastosowania nowego szczepu Lactobacillus plantarum S do usuwania ochratoksyny A z pasz nią skażonych. W PL 190162 (B1) opatentowano metodę kiszenia pasz z zastosowaniem nowego szczepu Lactobacillus plantarum C charakteryzującego się aktywnością ksylanoliotyczną i celulolityczną. Natomiast w PL 179838 (B1) opisano kiszenie pasz z zastosowaniem szczepu Lactobacillus plantarum K, który charakteryzuje się zdolnością do hydrolizy skrobi.

Istotą wynalazku jest zastosowanie szczepu bakterii Lactobacillus buchneri M wyizolowanego z samorzutnie zakiszonej biomasy spartiny preriowej (Spartina pectinata), będącego Gram dodatnią laseczką, która na pożywce agarowej MRS tworzy kremowo-białe kolonie w kształcie dysków o średnicy 0,5-0,7 mm, o optimum wzrostu w temperaturze 30-37°C, i który fermentuje następujące węglowodany: L-arabinoza, D-ksyloza, ryboza, galaktoza, glukoza, fruktoza, mannoza, sorbitol, mannitol, rafmoza, melezitoza, turanoza, sacharoza, maltoza, laktoza, melibioza, L-ramnoza, ksylan, celuloza, natomiast nie fermentuje skrobi, o aktywności zewnątrzkomórkowej endo-ksylanazy w zakresie 0,01-0,05 U/ml w czasie 1-6 dni, do konserwacji biomasy lignocelulozowej przeznaczonej do produkcji biogazu.

Szczep do zastosowania według wynalazku został wyizolowany z samorzutnie zakiszonej biomasy spartiny preriowej (Spartina pectinata), charakteryzującej się wysoką zawartością polisacharydów strukturalnych. Szczep został zidentyfikowany do gatunku Lactobacillus buchneri na podstawie analizy sekwencji genu podjednostki 16S rRNA, która to następnie została porównana do sekwencji zamieszczonych w bazie GenBank. Szczep został wyselekcjonowany na podstawie zdolności do rozkładu ksylanu, czego miarą była ilość kwasu octowego powstałego w wyniku fermentacji ksylanu w płynnym podłożu hodowlanym. Szczep został zdeponowany w Polskiej Kolekcji Drobnoustrojów w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej we Wrocławiu pod numerem B/00077. Szczep charakteryzuje się zdolnością do efektywnego rozkładu ksylanu, w procesie konserwacji biomasy lignocelulozowej przeznaczonej do produkcji biogazu.

Szczep w postaci zawiesiny żywych komórek jako inoculum wprowadzany jest do ubijanej, przeznaczonej do zakiszenia biomasy roślinnej. W wyniku hydrolizy polisacharydów strukturalnych przez bakterie, uwalniane są pentozy, w tym ksyloza - cukier prosty, która następnie fermentowana jest również przez znajdujące się w biomasie, epifityczne heterofermentacyjne bakterie fermentacji mlekowej. W wyniku fermentacji ksylozy powstaje kwas octowy, którego stężenie w kiszonce znacznie wzrasta w porównaniu do kiszonek nie poddanych działaniu nowego szczepu. Kiszonka bogata w kwas octowy poddawana jest następnie mezofilnej fermentacji metanowej. Wydajność produkcji biogazu z kiszonek przygotowanych z zastosowaniem nowego szczepu jest istotnie wyższa w porównaniu do uzysku biogazu otrzymanego w wyniku fermentacji kiszonek bez dodatku nowego szczepu bakterii.

Korzystnie proces konserwacji biomasy lignocelulozowej z zastosowaniem szczepu Lactobacillus buchneri M prowadzi się tak, że biomasę o zawartości celulozy powyżej 30% sm. i suchej masie 25-35%, pociętą na kawałki o długości około 2 cm miesza się z 24-godzinną zawiesiną komórek bakterii Lactobacillus buchneri M zawierającą około 1 χ 10¹⁰ jtk/ml, namnożoną w płynnym podłożu MRS. Zawiesinę bakterii rozprowadza się poprzez rozpylenie takiej ilości, aby uzyskać koncentrację bakterii w biomasie około 10⁸ jtk/g. Biomasę ubija się, a następnie zamyka szczelnie i przechowuje w warunkach zewnętrznych przez co najmniej 8 tygodni. Po tym czasie zakiszoną biomasę poddaje się mezofilnej fermentacji metanowej (w temperaturze 39°C). Po 21 dniach fermentacji uzyskuje się co najmniej 10% więcej biogazu niż w przypadku kiszonki uzyskanej z tej samej biomasy, ale nie poddanej działaniu nowego szczepu.

W wyniku zastosowania szczepu Lactobacillus buchneri M otrzymuje się kiszonki o zwiększonej zawartości kwasu octowego i strawności suchej masy, zmniejszonej zawartości hemicelulozy i o zwiększonym potencjale biogazotwórczym w porównaniu do kiszonek wykonanych bez udziału nowego szczepu.

PL 233 537 Β1

Przedmiot wynalazku został bliżej przedstawiony w przykładach.

Przykład 1

Zdolność nowego szczepu do efektywnego rozkładu ksylanu została określona w warunkach laboratoryjnych na podstawie porównania zawartości kwasów mlekowego i octowego syntetyzowanych przez badany szczep po 24-godzinnej hodowli w płynnej pożywce zawierającej jako jedyne źródło węgla jeden z wymienionych cukrów: glukozę, ksylozę lub ksylan. Wyniki doświadczenia przedstawia tabela 1.

Tabela 1. Zawartości kwasów organicznych w podłożu po 24-godzinnej hodowli nowego szczepu Lactobacillus buchneri M w zależności od źródła węgla w pożywce

Źródło węgla	pH	Kwas mlekowy (g/1)	Kwas octowy (g/1)
glukoza	4,06	2,58	4,22
ksyloza	4,04	2,34	4,32
ksylan	4,18	2,49	4,93

Nowy szczep Lactobacillus buchneri M w wyniku fermentacji ksylanu wytworzył porównywalną ilość kwasów mlekowego i octowego, jak w przypadku hodowli w pożywce zawierającej cukry proste - glukozę czy ksylozę. Świadczy to o jego zdolności do efektywnej syntezy enzymów odpowiedzialnych za szybką hydrolizę ksylanu do monocukrów. Ponadto stosunek zawartości kwasów wytworzonych w wyniku fermentacji badanych cukrów wskazuje, że badany szczep przeprowadza heterofermentację mlekową, czego wynikiem jest wyższa zawartość kwasu octowego w stosunku do kwasu mlekowego.

Aktywność zewnątrzkomórkowej endo-ksylanazy, oznaczoną w podłożu po hodowli Lactobacillus buchneri M w pożywce zawierającej ksylan jako jedyne źródło węgla w temperaturze 37°C przedstawia tabela 2.

Tabela 2. Aktywność zewnątrzkomórkowej endo-ksylanazy w podłożu po hodowli Lactobacillus buchneri M na ksylanie jako jedynym źródle węgla

Czas hodowli (dni)	Aktywność endo-ksylanazy U/ml*
1	0,01
3	0,02
6	0,05
* jednostka aktywności enzymu (U) wyrażona jest jako ilość gmoli ksylozy uwolnionej w wyniku działania enzymu zawartego w 1 ml podłoża pohodowlanego na 1% roztwór ksylanu, w czasie 30 min. w temp 40°C
Ponadto aktywność ksylanolityczną nowego szczepu stwierdzono doświadczalnie, oznaczając zmiany lepkości płynnego podłoża hodowlanego zawierającego 2% ksylanu, które zaszczepiono 24-godzinną zawiesiną Lactobacillus buchneri M w stosunku 9:1. Lepkość podłoża wzrosła po pierwszej i drugiej dobie hodowli w stosunku do lepkości podłoża w czasie tuż po zaszczepieniu, co jest powodowane rozkładem ksylanu przez te bakterie.
Tabela 3. Wzrost lepkości podłoża w wyniku aktywności ksylanolitycznej Lactobacillus buchneri M (temp. 30°C).
Czas hodowli (dni)	Lepkość (cP)
0	3,6
1	45,3
2	48,4

PL 233 537 Β1

Przykład 2

Pociętą na kawałki o długości około 2 cm biomasę spartiny preriowej (Spartina pectinata), zebraną w czerwcu z pola doświadczalnego w Skierniewicach, należącego do Szkoły Głównej Gospodarstwa Wiejskiego, zakiszono w ilości około 10 kg w plastikowych beczkach. Spartina charakteryzuje się dużą zawartością węgla oraz polisacharydów strukturalnych (celulozy, hemicelulozy), co przedstawiono w tabeli 4.

Tab. 4. Skład chemiczny biomasy spartiny zebranej w czerwcu

Sucha masa [%]	Popiół [% sm]	Włókno surowe [% sm]	Cukry proste [% sm]	Celuloza [% sm]	Hemiceluloza [% sm]	Węgiel [%]	Strawność suchej masy [%]
32,9	5,5	41,0	2,1	36,4	22,9	38,7	20,8

sm- sucha masa

W czasie ubijania na materiał roślinny rozpylano świeżą, 24-godzinną zawiesinę komórek szczepu Lactobacillus buchneri M (inokulum). Inokulum sporządzone zostało przez namnożenie bakterii w komercyjnym, płynnym podłożu MRS, liczba bakterii w inokulum wynosiła ok. 1 x 10¹⁰ jtk/ml. Na 10 kg biomasy rozprowadzono około 100 ml świeżego inokulum, co odpowiadało około 10⁸ jtk/g roślin. Wykonano także kiszonki ze spartiny z dodatkiem płynnego, komercyjnego preparatu enzymatycznego MEGE-XYRU6 (Megazyme) o wysokiej aktywności ksylanolitycznej (2100 U/ml). Rozprowadzono taką ilość preparatu, aby uzyskać około 0,05 U/g roślin. Jakość kiszonek doświadczalnych po 12 tygodniach od sporządzenia kiszonek, porównywano z kiszonkami kontrolnymi, które wykonano bez dodatku bakterii ani enzymów. Każdy rodzaj kiszonki wykonano w trzech powtórzeniach. Wyniki analiz fizykochemicznych kiszonek przedstawiono w tabeli 5.

Tab. 5. Skład chemiczny kiszonek doświadczalnych

Kiszonka	Sucha masa [%]	Popiół [% sm]	Cukry proste 1% sin]	Celuloza [% sm]	Hemiceluloza [% sm]	Kwasy org. [g/kg sm]	Strawność suchej masy [%]	pH
mlekowy	octowy
K	26,7 a	5,7 a	5,8 a	32,5 a	10,7 a	no	12,3 a	60,7a	5,23a
E	26,9 a	5,4 a	5,0 a	29,0 a	12,6 a	7,0	17,5b	62,7b	4,77b
LAB	26,5 a	5,0 a	5,2 a	28,6 a	6,5 b	no	23,2 c	63, lb	5,09c

K kiszonka kontrolna

E kiszonka wykonana z dodatkiem enzymu

LAB kiszonka wykonana z dodatkiem nowego szczepu Lb. buchneri M no - nie oznaczono (poniżej granicy oznaczalności metody) a, b, c - grapy jednorodne (dla danego parametru) wyznaczone testem Tukey’a przy poziomie istotności 0,05

Kiszonka wykonana z dodatkiem nowego szczepu Lactobacillus buchneri M charakteryzowała się istotnie niższym pH w porównaniu do kiszonki kontrolnej. W wyniku aktywności enzymatycznej bakterii w kiszonce istotnie obniżyła się zawartość hemicelulozy, a wzrosła zawartość kwasu octowego w porównaniu do kontroli. Obniżenie zawartości hemicelulozy spowodowało także istotny wzrost strawności suchej masy. Istotne różnice w składzie chemicznym zaobserwowano także między kiszonką wykonaną z bakteriami oraz enzymem. Kiszonka wykonano przy udziale komercyjnej ksylanazy charakteryzowała się pH poniżej 5,0, co wynikało z tego, że z części cukrów po

PL 233 537 B1 wstał kwas mlekowy, stąd także niższa zawartość kwasu octowego w kiszonce w porównaniu do kiszonki z dodatkiem bakterii.

Różnice w składzie chemicznym kiszonek miały wpływ na uzysk z nich biogazu, co przedstawiono na Fig. 1, na której K oznacza kiszonkę kontrolną, E oznacza kiszonkę sporządzoną z dodatkiem ksylanazy, LAB oznacza kiszonkę sporządzoną z nowym szczepem Lactobacillus buchneri M.

W wyniku mezofilnej fermentacji metanowej w temperaturze 39°C otrzymano po 21 dniach procesu 159,3 ± 3,76 m³ biogazu z kiszonki kontrolnej, 145,5 ± 4,03 m³ biogazu z kiszonki wykonanej z enzymem oraz 179,9 ± 3,05 m³ biogazu z kiszonki sporządzonej z nowym szczepem bakterii. Z kiszonki wykonanej z Lactobacillus buchneri M otrzymano więc o 12,9% więcej biogazu niż z kiszonki kontrolnej i była to różnica istotna statystycznie (p < 0,05).

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Zastosowanie szczepu bakterii Lactobacillus buchneri M wyizolowanego z samorzutnie zakiszonej biomasy spartiny preriowej (Spartina pectinata), będącego Gram dodatnią laseczką, która na pożywce agarowej MRS tworzy kremowo-białe kolonie w kształcie dysków o średnicy 0,5-0,7 mm, o optimum wzrostu w temperaturze 30-37°C, który fermentuje następujące węglowodany: L-arabinoza, D-ksyloza, ryboza, galaktoza, glukoza, fruktoza, mannoza, sorbitol, mannitol, rafmoza, melezitoza, turanoza, sacharoza, maltoza, laktoza, melibioza, L-ramnoza, ksylan, celuloza, natomiast nie fermentuje skrobi, o aktywności zewnątrzkomórkowej endo-ksylanazy w zakresie 0,01-0,05 U/ml w czasie 1-6 dni, do konserwacji biomasy lignocelulozowej przeznaczonej do produkcji biogazu.
2. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że biomasę o zawartości celulozy powyżej 30% sm. i suchej masie 25-35%, miesza się z zawiesiną komórek bakterii Lactobacillus buchneri M zawierającą około 1 χ 10¹⁰ jtk/ml, namnożoną w płynnym podłożu MRS, przy czym zawiesinę dodaje się w takiej ilości, aby uzyskać koncentrację bakterii w biomasie około 108 jtk/g, biomasę ubija się, a następnie przechowuje się przez co najmniej 8 tygodni, a po tym czasie zakiszoną biomasę poddaje się mezofilnej fermentacji metanowej.