PL233566B1 - Zastosowanie lipopolisacharydu (LPS) w leczeniu stanów lub chorób związanych z nadmierną odpowiedzią odpornościową organizmu wywołanych schorzeniami układu pokarmowego zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i/lub alergii pokarmowych - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie lipopolisacharydu (LPS) w leczeniu stanów lub chorób związanych z nadmierną odpowiedzią odpornościową organizmu wywołanych schorzeniami układu pokarmowego zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i/lub alergii pokarmowych.

Lipopolisacharyd (LPS) to termostabilna cząsteczka stanowiąca integralny składnik błony zewnętrznej ściany komórkowej bakterii Gram-ujemnych. LPS jest endotoksyną, o znanej aktywności biologicznej. Natomiast nieswoiste zapalenia jelit (ang. Inflammatory Bowel Diseases, IBD) to grupa przewlekłych chorób zapalnych przewodu pokarmowego, głównie jelita grubego lub cienkiego, takich jak choroba Leśniowskiego-Crohna lub wrzodziejące zapalenie jelita grubego. Etiologia IBD nie jest w pełni poznana, lecz najczęściej jako czynniki warunkujące tę chorobę wymienia się czynniki środowiskowe i alergeny. Uważa się również, że alergie pokarmowe mogą prowadzić do rozwoju IBD.

Uzyskiwane ex vivo regulatorowe limfocyty Cd4+CD25+FoxP3+ (Treg) mają zastosowania terapeutyczne w utrzymywaniu przeszczepów, hamowaniu autoagresji, proponuje się także ich stosowanie w leczeniu alergii, w tym alergii pokarmowych i IBD. patrz np. Berin MC, Mayer L. Can we produce true tolerance in patients with food allergy? The Journal of allergy and clinical immunology.2013;131(l):10.1016/j.jaci.2012.10.058.doi:10.1016/j.jaci.2012.10.058.

W stanie techniki istnieją rozwiązania dotyczące sposobów i kompozycji do leczenia dysfunkcji układu pokarmowego.

W publikacji naukowej Rink i wsp. (Overproduction of monokines by leukocytes after stimulation with lipopolysaccharide in the elderly, Experimental Gerontology, tom 37, nr 2-3, str. 235-247, 2002) ujawniono, że podwyższone uwalnianie cytokin zapalnych przez monocyty i neutrofile, w wyniku stymulacji LPS, może być odpowiedzialne choćby częściowo za wiele objawów obserwowanych u starszych osób u których stwierdzono zakażenie Salmonellą.

Zgłoszenie amerykańskie US 20130224216 ujawnia z kolei sposób i kompozycje do leczenia dolegliwości związanych z dysfunkcją wątroby, nietolerancją glukozy i innych, poprzez podawanie kompozycji, zawierającej immunoglobulinę anty-LPS wzbogacaną preparatami siary.

Inne zgłoszenie amerykańskie US 20040228837 ujawnia sposób oceny efektywności leczenia choroby zapalnej jelit u ssaków, jak również zestaw do prowadzenia takiego sposobu. Sposób ten obejmuje m. in. etap pomiaru poziomu co najmniej jednej anty-zapalnej cytokiny i co najmniej jednej pro-zapalnej cytokiny w próbce biologicznej ssaka, korzystnie biologiczna próbka zawiera m. in. osocze, komórki mononuklearne krwi obwodowej po stymulacji in vitro i bez stymulacji in vitro. Korzystnie, stymulacja in vitro obejmuje zastosowanie mitogenu, a mitogen może obejmować korzystnie lipopolisacharyd, lektynę, superantygen lub ich mieszaninę.

Jeszcze kolejne zgłoszenie amerykańskie US 20060216283 ujawnia sposób hamowania wydzielania z nie-neuronalnych komórek zapalnych, obejmujący podawanie środka zawierającego co najmniej pierwszą i drugą domenę, przy czym pierwsza domena rozszczepia jedno lub więcej białek istotnych/wskazanych dla egzocytozy i drugą domenę translokalizującą pierwszą domenę do komórki zapalnej. Korzystnie środek obejmuje trzecią domenę wprowadzającą środek do komórki zapalnej nieneuronalnej. Korzystnie trzecia domena zawiera ligand, którym może być - dla makrofagów, monocytów i neutrofili - bakteryjny LPS i β-glukany drożdżowe, które wiążą się z CR3.

Z kolei amerykańskie zgłoszenie US 2005238651 ujawnia sposób leczenia wrzodziejącego zapalenia jelit, obejmujący podawanie pacjentowi potrzebującemu takiego leczenia ligandu antygenu B7, wiążącego się do komórek prezentujących antygen w przewodzie pokarmowym pacj enta w ilości wywołującej immunotolerancję. Ligandem antygenu B7, który jest induktorem 2,3-dioksygenazy indoloaminowej może być bakteryjny LPS. Zgłoszenie ujawnia również sposób leczenia wrzodziejącego zapalenia jelit obejmujący: wybranie środka na bazie czynnika skutecznego w indukowaniu 2,3-dioksygenazy indolaminowej w komórkach zawierających antygen, efektywnego w blokowaniu ko-stymulacji (ang. costimulation) aktywności komórki T lub efektywnego zarówno w indukowaniu 2,3-dioksygenazy indolaminowej oraz w blokowaniu aktywności limfocytów T; podawanie efektywnej ilości środka choremu pacjentowi. Korzystnie środkiem efektywnym w indukowaniu 2,3-dioksygenazy indolaminowej w komórkach zawierających antygen jest lipopolisacharyd bakteryjny, interferon γ lub białko fuzyjne, obejmujące antygen 4, występujący na cytotoksycznych limfocytach T oraz immunoglobuliny (CTLA-4, Ig).

PL 233 566 B1

Z kolei zgłoszenie australijskie AU 2004237888 ujawnia kompozycję immunogenną, zawierającą fragment peptydu immunogennego czynnika wzrostu fibroblastu i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie, składnikiem kompozycji jest adjuwant, którym może być lipopolisacharyd pochodzący z bakterii gram-ujemnych. Dokument ten ujawnia również sposób leczenia raka albo dolegliwości hiperproliferacyjnych u ludzi lub zwierząt, obejmujący podawanie efektywnej ilości kompozycji, zawierającej fragment peptydu immunogennego czynnika wzrostu fibroblastu i farmaceutycznie dopuszczalny nośnik. Korzystnie dolegliwością leczoną niniejszą kompozycją jest choroba Crohn'a.

W opisie patentowym EP 1031347 natomiast ujawniono zastosowanie środka przenikającego w kompozycji ze składnikiem farmaceutycznie aktywnym lub alergenem lub antygenem, przy czym kompozycja ta jest podawana donosowo do leczenia m. in. choroby Crohn'a. Korzystnie kompozycja farmaceutyczna jest w postaci szczepionki, w której adjuwantem jest lipopolisacharyd, taki jak lipid A lub jego pochodna czy modyfikacja.

Ponadto, w zgłoszeniu patentowym W O2007061102 ujawniono ekstrakt z acetobakterii, zawierający lipopolisacharyd do zastosowania w leczeniu zespołu jelita nadwrażliwego (ang. irritable bowel syndrome, IBS) i alergii pokarmowych. W odróżnieniu do niniejszego zgłoszenia, powyższy dokument ujawnia ekstrakt z Acetobacter, zawierający lipopolisacharyd, jednakże nie lipopolisacharyd wyizolowany z bakterii E. coli 0111:B4, do zastosowania w leczeniu nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD)/zespołu jelita drażliwego (IBS) i alergii jako takich, bez szczególnego wskazania alergii pokarmowych.

Podobnie, w innym zgłoszeniu patentowym WO2012085183 ujawniono ekstrakt z bakterii należących do klasy Betaproteobacteria, podrodziny Neisseriaceae, o ściśle określonej sekwencji nukleotydowej, zawierający lipopolisacharydy do zastosowania w leczeniu zespołu jelita nadwrażliwego (IBS). W stanie techniki nie są znane z kolei rozwiązania, dotyczące zastosowania LPS pochodzącego z bakterii E. coli ze szczepu 0111:B4, ewentualnie w kombinacji z kwasem winowym, do zapobiegania i leczenia nadmiernej odpowiedzi odpornościowej organizmu, u osobników cierpiących na schorzenia układu pokarmowego, zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i alergii pokarmowych.

Z uwagi na zwiększającą się liczbę osobników cierpiących na schorzenia z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i alergie pokarmowe, istnieje potrzeba dostarczenia rozwiązań do zapobiegania i leczenia nadmiernej odpowiedzi odpornościowej organizmu.

Nieoczekiwanie niniejszy wynalazek rozwiązuje ten problem.

Przedmiotem wynalazku jest LPS do zastosowania w leczeniu stanów lub chorób związanych z nadmierną odpowiedzią odpornościową organizmu, wywołaną schorzeniami układu pokarmowego, zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i/lub alergii pokarmowych, charakteryzujący się tym, że stosuje się LPS pochodzący z bakterii E. coli ze szczepu 0111 :B4, który jest podawany osobnikowi w formie roztworu w soli fizjologicznej lub innym akceptowalnym farmaceutycznie nośniku przez okres 3 kolejnych dni, przy czym, przy podawaniu dootrzewnowym podaje się go w dawce dobowej wynoszącej 200 gg/kg masy ciała a przy podawaniu doustnym podaje się go dawce dobowej wynoszącej 4000 gg/kg masy ciała osobnika.

Korzystnie w zastosowaniu według wynalazku, LPS, pochodzący z bakterii E. coli ze szczepu 0111:B4, podaje się w kombinacji z kwasem D-winowym Jeszcze korzystniej, LPS, pochodzący z bakterii E. coli ze szczepu 0111:B4, jest podawany doustnie we wstępnej fazie choroby w kombinacji z kwasem D-winowym przez okres 3 kolejnych dni, przy czym dawka dobowa LPS wynosi 4000 gg/kg masy ciała osobnika zaś dawka dobowa kwasu D-winowego wynosi 300 mg/kg masy ciała osobnika.

Zgodnie z publikacją Shannon i wsp. pt.: „Acute Inflammatory Response to Endotoxin in Mice and Humans”, CLINICAL AND DIAGNOSTIC LABORATORY IMMUNOLOGY, styczeń 2005, str. 6067, tom 12, nr 1, organizm myszy jest 250 razy mniej wrażliwy na działanie endotoksyn, niż organizm człowieka.

Dawka 500 ng/kg endotoksyny u myszy odpowiada dawce 2 ng/kg u człowieka. W opisie wynalazku stosowane zgodnie z wynalazkiem dawki LPS wyrażono w gg/kg masy ciała osobnika, przy czym w przypadku podawania LPS ludziom dawki LPS należy odpowiednio ekstrapolować zgodnie z podanym przelicznikiem.

Wielokrotnie podawanie LPS w małych dawkach dobowych powoduje pojawienie się w jamie otrzewnej komórek mieloidalnych o fenotypie CD11b^midF4/80^mid, które migrują do grasicy i indukują w niej powstawanie regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ (Treg). Komórki Treg, jako komórki o aktywności supresyjnej, zapobiegają rozwojowi lub łagodzą nadmierną odpowiedź odporno

PL 233 566 B1 ściową organizmu wywołaną chorobą układu pokarmowego zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i/lub alergii pokarmowych.

W zależności od stanu osobników cierpiących na choroby z grupy IBD lub alergie pokarmowe można podawać LPS w kombinacji z kwasem D-winowym. Zadaniem kwasu D-winowego jest rozszczelnienie ściany jelita, co jest korzystne w przypadku wczesnego stadium chorób IBD oraz alergii pokarmowych. Indukcja generowania w grasicy regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ powoduje indukcję supresji czyli hamowanie nadmiernej, niekorzystnej odpowiedzi odpornościowej, w tym stanów zapalnych jelit np. IBD.

W przypadku osobników, u których rozwój chorób z grupy IBD lub alergii pokarmowych doprowadził już do rozszczelnienia ściany jelita, do indukcji generowania w grasicy regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ wystarczy podawanie samego LPS. Natomiast w przypadku wczesnego stadium chorób z grupy IBD lub alergii pokarmowych podaje się LPS w kompozycji z kwasem D-winowym, którego zadaniem jest rozszczelnienie ściany jelita i w ten sposób zwiększenie jego przepuszczalności.

Podawanie przez okres 3 dni dawki dobowej LPS, pochodzącego z bakterii E. coli ze szczepu 0111 :B4, wynoszącej 4000 μg/kg masy ciała osobnika, ewentualnie w kompozycji z kwasem D-winowym, w dawce dobowej wynoszącej 300 mg/kg masy ciała osobnika, powoduje ukierunkowaną stymulację układu odpornościowego, która prowadzi do szybkiego osiągnięcia stanu immunosupresji, co jest szczególnie istotne w przypadku wystąpienia u osobnika zaostrzonych stanów chorobowych związanych z IBD lub wystąpienia gwałtownych reakcji alergicznych.

Zgodnie z wynalazkiem, LPS, ewentualnie w kompozycji z kwasem D-winowym, można stosować także do odczulania. Wówczas, oprócz LP S i kwasu D-winowego podaje się dodatkowo alergen.

Dodatkowo, zgodnie z wynalazkiem, LPS można zastosować do leczenia chorób autoimmunizacyjnych. W takim wskazaniu LPS podaje się w kompozycji z autoantygenem i kwasem D winowym.

LPS stosowany w praktycznej realizacji wynalazku jest pochodzenia bakteryjnego (pochodzi z bakterii E. coli ze szczepu 0111:B4), natomiast kwas D-winowy jest komercyjnie dostępnym środkiem spożywczym.

W zależności od drogi podawania LPS, dobiera się odpowiedni nośnik, którym może być na przykład sól fizjologiczna, woda destylowana czy inny farmaceutycznie akceptowalny nośnik.

Kompozycja farmaceutyczna do zastosowania jak określone powyżej może mieć postać dowolnej typowej postaci leku znanej w technologii wytwarzania leku, która jest odpowiednia do stosowania doustnego lub dootrzewnowego (wstrzykiwanie pod powłoki brzuszne). Przykłady takich postaci farmaceutycznych stanowią roztwory, zawiesiny, wlewy itp. Postać preparatu jest określana po uwzględnieniu rodzaju zastosowanego podłoża (nośnika).

Substancje czynne stosowane dotychczas w stanach lub chorobach związanych z nadmierną odpowiedzią odpornościową organizmu u osobników cierpiących na schorzenia układu pokarmowego zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i alerg ii pokarmowych jedynie łagodzą objawy choroby i mogą prowadzić do okresów remisji, jednakże wymagane jest stosowanie leków przez cały czas trwania choroby. W przypadku ciężkich zaostrzeń chorób z grupy IBD terapią z wyboru jest resekcja zajętych chorobowo fragmentów jelita. Co więcej, u osobników chorych na IBD obserwuje się zwiększoną zapadalność na nowotwory jelit. Poza tym, w przypadku standardowego leczenia chorób IBD lub alergii stosuje się leki przeciwzapalne, leki immunosupresyjne, antybiotyki, leki przeciwbólowe i inne, które mogą powodować powstawanie różnorodnych skutków ubocznych. Dlatego zastosowanie LPS według wynalazku stanowi tańszą i bardziej efektywną alternatywę leczenia stanów lub chorób związanych z nadmierną odpowiedzią odpornościową organizmu.

Dzięki zastosowaniu małych dawek LPS, pochodzącego z bakterii E. coli ze szczepu 0111:B4, ewentualnie w kompozycji z kwasem D-winowym, które zgodnie z wynalazkiem podaje się przez okres 3 dni, można w szybki sposób uzyskać stan immunosupresji, który utrzymuje się przez dłuższy czas po podaniu LPS, bez konieczności ciągłego podawania i wywoływania niekorzystnych skutków ubocznych. Dlatego LPS, zgodnie z wynalazkiem, można stosować w schorzeniach objawiających się nadmierną aktywnością układu odpornościowego, związaną z długotrwałym stanem zapalnym, np. w chorobach autoimmunizacyjnych i alergicznych.

PL 233 566 B1

Ze względu na charakterystykę działania regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ zastosowanie LPS zgodnie z wynalazkiem będzie indukować supresję zarówno specyficzną antygenowo jaki i niespecyficzną antygenowo.

Przedmiot wynalazku został zilustrowany na figurach, na których:

Fig. 1 przedstawia wykres ilustrujący odsetek regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy myszy po podawaniu raz na dobę LPS (LPS) dootrzewnowe w dawce 200 μg/kg ciała myszy przez 3 kolejne dni oraz w grasicy myszy, którym podawano w tym samym schemacie sól fizjologiczną (myszy kontrolne, K).

Fig. 2 przedstawia diagram porównawczy odsetka komórek mieloidalnych o fenotypie CD11b^midF4/80^mid (zaznaczone prostokątem) w jamie otrzewnowej myszy po podawaniu raz na dobę LPS dootrzewnowo w dawce 200 μg/kg ciała myszy przez 3 kolejne dni (prawy panel) oraz w grasicy myszy kontrolnych (K), którym podawano w tym samym schemacie sól fizjologiczną (lewy panel).

Fig. 3 (prawy panel) przedstawia zdjęcie mikroskopowe z mikroskopu konfokalnego dla skrawków grasicy myszy C57BL/6, u której wykonano dootrzewnowy adoptywny transfer komórek mieloidalnych o fenotypie CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ (myszy biorcy). Komórki mieloidalne o fenotypie CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ do transferu pobrano z myszy C57BL/6 Tg(UBC-GFP)30SchaGFP (myszy transgenicznych, u których wszystkie komórki układu odpornościowego wyrażają GFP-ang. Green Fluorescent Protein - czyli białko fluoryzujące na zielono), której wcześniej podawano LPS (trzykrotnie, raz na dobę) w dawce 200 μg/kg ciała myszy (myszy dawcy);

(lewy panel) przedstawia zdjęcie mikroskopowe z mikroskopu konfokalnego dla skrawków grasicy myszy C57BL/6, u której wykonano dootrzewnowy adoptywny transfer komórek mieloidalnych o fenotypie CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ (myszy biorcy). Komórki mieloidalne o fenotypie CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ do transferu pobrano z myszy C57BL/6 Tg(UBC-GFP)30SchaGFP (myszy transgenicznych, u których wszystkie komórki układu odpornościowego wyrażają GFP), której wcześniej podawano sól fizjologiczną (myszy dawcy). Komórki do transferu pochodziły z myszy, u których wszystkie komórki układu odpornościowego wyrażają GFP (szczep C57BL/6 Tg(UBC-GFP).

Fig. 4 przedstawia wykres ilustrujący odsetek regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy myszy B6.Cg-Foxp3^tm2Tch/J (myszy, u których jedynie komórki wykazujące ekspresję FoxP3 równocześnie wykazują ekspresję GFP), po wykonaniu dootrzewnowego adoptywnego transferu komórek mieloidalnych o fenotypie CD19-CD11c^lo11b+F4/80+ pobranych z jamy otrzewnej myszy, której podawano LPS (po trzykrotnym, wykonywanym raz na dobę podaniu LPS) w dawce 200 μg/kg ciała myszy (LPS) oraz odsetek regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy myszy C57BL/6, u której wykonano dootrzewnowy adoptywny transfer komórek mieloidalnych o fenotypie CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ pobranych z myszy, którym podawano w tym samym schemacie sól fizjologiczną (K). Komórki do transferu pochodziły z myszy u których wszystkie komórki układu odpornościowego wyrażają GFP (szczep C57BL/6 Tg(UBC-GFP)).

Fig. 5 przedstawia wykres ilustrujący odsetek limfocytów regulatorowych CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy myszy z rozwiniętym IBD, wywołanym przy użyciu DSS (1% w wodzie pitnej przez 30 dni), po dożołądkowym, trzykrotnym, wykonywanym raz na dobę podaniu LPS w dawce 4000 μg/kg ciała myszy (LPS) oraz myszy którym podawano w tym samym schemacie wodę (K).

Fig. 6 przedstawia wykres ilustrujący odsetek regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy zdrowych myszy po dożołądkowym, trzykrotnym, wykonywanym raz na dobę podaniu LPS w dawce 4000 μg/kg ciała myszy w kombinacji z kwasem winowym w dawce 300 mg/kg ciała myszy (LPS KW) oraz myszy, którym podawano w tym samym schemacie sam kwas winowy w dawce 300 mg/kg ciała myszy (KW), LPS lub wodę (K).

Przedmiot niniejszego wynalazku został bliżej opisany w zamieszczonych poniżej przykładach wykonania, które zamieszczono jedynie w celach ilustracyjnych.

P r z y k ł a d 1

Indukcja rozwoju regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+

Indukcję rozwoju regulatorowych limfocytów T CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy przy zastosowaniu LPS zgodnie z wynalazkiem sprawdzono na modelu mysim, stosując myszy laboratoryjne. Masa myszy wynosiła 28-31 g.

Roztwór LPS

W sterylnych warunkach przygotowano podstawowy roztwór LPS (uzyskany z bakterii E. coli 0111 :B4) w wodzie destylowanej, o stężeniu 1 μg/pl, gotowy roztwór przechowywano w temp. poniżej

PL 233 566 B1

10°C w lodówce. Każdorazowo przed podaniem roztwór był ogrzewany do temperatury 36°C i intensywnie mieszany.

Roztwór kwasu D-winowego

W sterylnych warunkach przygotowano podstawowy roztwór kwasu D-winowego o stężeniu 100g/l, gotowy roztwór przechowywano w temperaturze poniżej 10°C w lodówce. Każdorazowo przed podaniem roztwór był ogrzewany do temperatury 36°C i intensywnie mieszany.

Bezpośrednio przed podaniem sporządzano świeży roztwór kwasu D-winowego mieszając 100 μΙ roztworu podstawowego kwasu D-winowego ze 400 μ! sterylnej wody lub 100 μ! roztworu podstawowego kwasu D-winowego ze 100 μΙ roztworu podstawowego LPS i z 300 μΙ sterylnej wody. 0,5 ml tak przygotowanego roztworu kwasu D-winowego podawano myszy sondą dożołądkową.

Podawanie LPS w dawce 200 μg/kg ciała myszy

Myszy podzielono na dwie grupy. Jednej grupie podawano dootrzewnowo LPS w dawce 200 μg/kg ciała myszy (100 μl roztworu podstawowego zmieszane z 400 μl soli fizjologicznej) przez kolejne 3 dni, natomiast grupie kontrolnej podawano sól fizjologiczną.

Następnie oceniano ilości komórek mieloidalnych o fenotypie CD11b^midF4/80^mid w jamie otrzewnej oraz odsetek limfocytów Treg w grasicy, w obu grupach myszy. W tym celu komórki pobrane z jamy otrzewnej lub grasicy myszy znakowano przeciwciałami monoklonalnymi, znakowanymi różnymi fluorochromami. Następnie, w cytometrze przepływowym (BD FACSAria) dokonywano pomiaru, na podstawie którego ustalano skład odsetkowy poszczególnych populacji komórek. W celu ustalenia odsetka limfocytów CD4+CD8-CD25+FoxP3+ (Treg), znakowano następujące markery powierzchniowe komórek grasicy: CD4, CD8, CD25, czynnik transkrypcyjny FoxP3 nie był znakowany, ponieważ w eksperymentach używano myszy B6.Cg-Foxp3^tm2Tch/J (w których komórki eksprymujące FoxP3 eksprymują równocześnie GFP ). Wyniki badań przedstawia Fig. 1.

Na komórkach z jamy otrzewnej przy użyciu przeciwciał znakowano następujące markery powierzchniowe: CD19, CD11c, CD11b, F4/80 w celu ustalenia odsetka komórek mieloidalnych o fenotypie CD19-CD11c^loCD11b^midF4/80^mid. Wyniki badań przedstawia Fig. 2.

Na podstawie wyników badań stwierdzono, że pod wypływem 3-krotnego podania LPS w dawce 200 μg/kg masy ciała, w jamie otrzewnej pojawia się populacja komórek mieloidalnych o fenotypie CD11b^midF4/80mid oraz podwyższony odsetek Treg w grasicy. Zjawisko to nie występowało u myszy kontrolnych, którym podawano jedynie sól fizjologiczną.

W celu potwierdzenia czy powstałe po podaniu LPS komórki mieloidalne powodują zwiększenie odsetka limfocytów Treg w grasicy przeprowadzono eksperyment, w którym zbadano zdolność migracji komórek mieloidalnych o fenotypie CD11 b^midF4/80^mid z jamy otrzewnej do grasicy, wykonując adoptywny transfer otrzewnowych komórek CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ z myszy C57BL/6 Tg(UBC-GFP)30SchaGFP (w których wszystkie komórki układu odpornościowego eksprymują GFP do jamy otrzewnej myszy C57BL/6.

Myszy C57BL/6 Tg(UBC-GFP)30SchaGFP podzielono na dwie grupy. Jednej grupie podawano dootrzewnowo LPS w dawce 200 μg/kg ciała myszy przez kolejne 3 dni, natomiast grupie kontrolnej podawano sól fizjologiczną. Następnie po 24h od ostatniego podania LPS lub soli fizjologicznej, z myszy pobrano komórki, z jamy otrzewnej, i przy pomocy cytometru sortującego BD FACSAria wysortowano z nich komórki mieloidalne CD19-CD11c^loC11b+F4/80+. Wykonano transfer adoptywny podając wysortowane komórki CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ do jamy otrzewnej myszy C57BL/6, a po 3 dniach od transferu pobrano grasice z tych myszy i standardową techniką przygotowano z ich grasic mrożone skrawki histologiczne. Przy użyciu mikroskopu konfokalnego oceniono obecność komórek eksprymujacych GFP w grasicy. Wyniki badań przedstawia Fig. 3.

W skrawkach histologicznych grasic myszy z grupy kontrolnej, którym wykonano adoptywny transfer otrzewnowych komórek mieloidalnych CD 19-CD11c^loC11b+F4/80+ z myszy traktowanych LPS, zaobserwowano obecność komórek eksprymujacych GFP (wykazujących zieloną fluorescencję).

Natomiast, w skrawkach histologicznych z grasic myszy u których wykonano adoptywny transfer otrzewnowych komórek mieloidalnych CD 19-CD11c^loC11b+F4/80+ z myszy którym podawano sól fizjologiczną nie zaobserwowano obecności komórek eksprymujacych GFP.

Uzyskane wyniki potwierdzają, że otrzewnowe komórki mieloidalne myszy traktowanych LPS mają zdolność do migracji z jamy otrzewnej do grasicy.

W celu ustalenia związku migracji otrzewnowych komórek mieloidalnych CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ z indukcją różnicowania limfocytów Treg w grasicy, zbadano odsetek limfocytów Treg w grasicach myszy, u których wykonano transfer komórek mieloidalnych CD19

PL 233 566 B1

-CD11c^loC11b+F4/80+ wysortowanych z obu grup myszy (traktowanych LPS oraz myszy kontrolnych, którym podawano sól fizjologiczną). Biorcami komórek mieloidalnych CD19-CD11 c^loC11 b+F4/80+ były nietraktowane myszy B6.Cg-Foxp3^tm2Tch/J .

Odsetek limfocytów Treg ustalono techniką cytometrii przepływowej po wyznakowaniu komórek grasicy przeciwciałami monoklonalnymi wiążących markery powierzchniowe: CD4, CD8, CD25. Wyniki badań przedstawia Fig. 4.

Myszy, którym wykonano dootrzewnowy, adoptywny transfer komórek mieloidalnych CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ pochodzących z myszy traktowanych LPS, zaobserwowano wyższy odsetek limfocytów Treg w grasicy, niż u myszy, u których wykonano dootrzewnowy, adoptywny transfer komórek mieloidalnych CD19-CD11 c^loC11 lb+F4/80+ pochodzących z myszy z grupy kontrolnej.

Uzyskane wyniki potwierdzają, iż otrzewnowe komórki mieloidalne CD19-CD11c^loC11b+F4/80+ myszy traktowanych LPS mają zdolność do indukowania różnicowania limfocytów Treg w grasicy.

P r z y k ł a d 2

Zastosowanie LPS do leczenia IBP

W celu eksperymentalnego wywołania IBD zastosowano standardową procedurę podawania soli sodowej siarczanu dekstranu (DSS).

Myszom C57BL/6 podawano DSS (standardowa techniką 1% roztworu soli sodowej siarczanu dekstranu w wodzie pitnej przez okres miesiąca), który wywoływał stan zapa lny jelit. Stan zapalny jelit potwierdzano obecnością krwi w kale (ocena przy użyciu testu Hemoccult SENSA, Beckman Coulter).

Tak przygotowane myszy z IBD podzielono na dwie grupy. Jednej grupie podawano za pomocą sondy dożołądkowej LPS w dawce 200 μg/kg ciała myszy (100 μl roztworu podstawowego zmieszane z 400 ul soli fizjologicznej) przez kolejne 3 dni, natomiast drugiej grupie (kontrolnej) podawano sól fizjologiczną.

Następnie oceniano odsetek komórek Treg CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy w obu grupach myszy, analogicznie jak w przykładzie 1. Wyniki badań przedstawia Fig. 5.

W grupie myszy z IBD, które otrzymały LPS, zaobserwowano większy odsetek Treg CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy, niż u myszy z IBD (grupa kontrolna).

Podawanie LPS osobnikom z IBD według podanego schematu prowadzi do indukcji regulatorowych komórek T CD4+CD25+FoxP3+, prowadząc do supresji stanu zapalnego, a tym samym do hamowania postępu choroby i w konsekwencji do wyleczenia IBD.

P r z y k ł a d 3

Zastosowanie kombinacji LPS + kwas winowy do leczenie IBD we wstępnej fazie.

Dodatek kwasu winowego do LPS ma na celu zwiększenie przepuszczalności ściany jelit osobnika, co powoduje że LPS indukuje rozwój komórek Treg w grasicy w sytuacjach gdy ściana jelita nie jest zmieniona chorobowo na tyle by LPS mógł już przez nią przenikać.

Kompozycja LPS w dawce 4000 ug/kg ciała myszy z kwasem winowym w dawce 300 mg/kg masy ciała myszy.

100 ul roztworu podstawowego kwasu D-winowego oraz 100 ul roztworu podstawowego LPS zmieszano z 300 ul sterylnej wody. Jedna mysz o masie ciała 28-30g dostawała 0,5 ml tak przygotowanego roztworu uzyskując w ten sposób kompozycję LPS i kwasu D-winowego (dalej jako LPSKW).

Sporządzono również świeży roztwór kwasu D-winowego poprzez zmieszanie 100 ul roztworu podstawowego kwasu D-winowego z 400 ul sterylnej wody Jedna mysz o wadze 28-30g dostawała 0,5 ml tak przygotowanego roztworu uzyskując w ten sposób dawkę 300 mg/kg ciała, (dalej jako KW). Sporządzano roztwór LPS mieszając 100 ul roztworu podstawowego LPS z 400 ul sterylnej wody (LPS), lub podawano 0,5 ml wody (K).

Do eksperymentu użyto zdrowych myszy B6.Cg-Foxp3^tm2Tch/J.

Myszy podzielono na 4 grupy. Przez trzy kolejne dni jednej grupie podawano sondą dożołądkową LPSKW, drugiej grupie podawano sondą dożołądkową KW, zaś trzeciej grupie podawano sondą dożołądkową LPS, czwartej grupie wodę (K).

Następnie u myszy z wszystkich grup eksperymentalnych oceniano odsetek limfocytów Treg w grasicy, techniką cystometrii przepływowej po wyznakowaniu komórek grasicy przeciwciałami monoklonalnymi wiążących markery powierzchniowe: CD4, CD8, CD25, podobnie jak w przykładzie 1.

PL 233 566 B1

Wyniki badań przedstawia Fig. 6.

W grupie myszy, które otrzymały LPSKW zaobserwowano większy odsetek Treg CD4+CD25+FoxP3+ w grasicy, niż u myszy z grup kontrolnych (grupa 2-KW i 3-K).

Podawanie LPS osobnikom z niezmienioną przepuszczalnością ściany jelita, u których LPS podawano według podanego schematu prowadzi do indukcji regulatorowych komórek T CD4+CD25+FoxP3+, a tym samym do przesunięcia równowagi układu odpornościowego w stronę supresji. Prowadzi to do zahamowania rozwoju niekorzystnej lub nadmiernej odpowiedzi odpornościowej np. w początkowej fazie rozwoju IBD czy przy alergiach pokarmowych.

U tak traktowanych myszy w grasicy obserwowano zwiększony odsetek Treg CD4+CD25+FoxP3+ w stosunku do myszy kontrolnych, co świadczy o tym że podanie LPS drogą pokarmową u zwierząt zdrowych prowadzi do indukcji generowania limfocytów Treg w grasicy o ile LPS podawany jest równocześnie z kwasem winowym.

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. LPS do stosowania w leczeniu stanów lub chorób związanych z nadmierną odpowiedzią odpornościową organizmu wywołanych schorzeniami układu pokarmowego zwłaszcza z grupy nieswoistych stanów zapalnych jelit (IBD) i/lub alergii pokarmowych, znamienny tym, że stosuje się LPS pochodzący z bakterii E. coli ze szczepu 0111:B4, który podaje się osobnikowi w formie roztworu w soli fizjologicznej lub innym akceptowalnym farmaceutycznie nośniku przez okres 3 kolejnych dni, przy czym, przy podawaniu dootrzewnowym podaje się go w dawce dobowej wynoszącej 200 μg/kg masy ciała a przy podawaniu doustnym podaje się go dawce dobowej wynoszącej 4000 μg/kg masy ciała osobnika,
2. 2. LPS według zastrz. 1, znamienny tym, że podaje się go w kombinacji z kwasem D-winowym.
3. 3. LPS według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że LPS podaje się we wstępnej fazie choroby doustnie w kombinacji z kwasem D-winowym przez okres 3 kolejnych dni, przy czym dawka dobowa LPS wynosi 4000 μg/kg masy ciała osobnika zaś dawka dobowa kwasu D-winowego wynosi 300 mg/kg masy ciała osobnika.