PL233572B1 - Sposob otrzymywania preparatu do pielegnacji skory oraz preparat do pielegnacji skory - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest sposób pozyskiwania, z zastosowaniem dwojakiego rodzaju ekstrakcji korzeń-woda i kora korzenia-olej lniany, dwóch biologicznie aktywnych substancji - alantoiny i szikoniny wraz z polifenolami o właściwościach antyoksydacyjnych, z jednego, łatwo dostępnego, naturalnego surowca zawierającego optymalnie wysokie zawartości wymienionych substancji. Przedmiotem zgłoszenia jest też preparat, który składa się z substancji aktywnych alantoiny i szikoniny wspomaganych dodatkowo polifenolami o właściwościach antyoksydacyjnych oraz składników oleju lnianego użytego do ekstrakcji.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania preparatu do pielęgnacji skóry z ekstraktów z korzenia żmijowca włoskiego Echium italicum L., będących źródłem biologicznie aktywnych substancji jak: alantoina, szikonina, czy też polifenole. Preparat otrzymany sposobem według wynalazku znajduje zastosowanie do pielęgnacji skóry po zranieniach, oparzeniach różnej etiologii, zakażeniach bakteryjnych czy grzybiczych.

Znane jest zastosowanie alantoiny jako substancji czynnej w różnego rodzaju preparatach dermatologicznych i pielęgnacyjnych w postaci maści lub zasypek służących do pielęgnacji skóry, zarówno dorosłych, jak i dzieci, a nawet niemowląt.

Znane jest również zastosowanie alantoiny w kosmetyce, przykładowo do produkcji nawilżających i zmiękczających skórę emulsji płynnych, kremów, żeli pod prysznic, antyperspirantów, a także kosmetyków pielęgnacyjnych dla dzieci. Jak podaje Fedoreyev i wsp. w artykule „Production of alantoin, rabdosiin and rosmarinic acid in callus cultures of the seacoastal plant Mertensia maritima (Boraginaceae)” (Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 2012, 110:183-188) alantoina znalazła zastosowanie w ponad 1300 preparatach kosmetycznych.

Alantoina stosowana w większości dostępnych na rynku preparatów pozyskiwana jest na drodze syntezy chemicznej. Jest to proces względnie skomplikowany. Z kolei znane sposoby wyizolowania alantoiny z ekstraktów roślin powszechnie występujących w Polsce takich jak żywokost lekarski, ograniczają się do otrzymywania tylko alantoiny, jako głównej substancji aktywnej występującej w tym surowcu, stąd preparaty zawierające alantoinę pochodzącą z tego rodzaju źródeł, np. maść żywokostowa czy żele żywokostowe, często pozbawione są innych komponentów o działaniu leczniczo pielęgnacyjnym.

Inną substancją aktywną pochodzenia roślinnego mającą istotne znaczenie dla funkcjonowania prawidłowych mechanizmów naprawczych skóry jest szikonina.

Jak podają m.in. Papageorgiou i wsp., w artykule „The chemistry and biology of alkannin, shikonin, andrelated naphthazarin naturalproducts (Angew. Chem. Int. Ed., 1999, 38:270-300); Ge i wsp., w artykule „Effects ofrare earth elements on the growth of Arnebia euchroma cells and the biosynthesis of shikonin (Plant Growth Regul., 2006, 48:283-290); Chen i wsp., w artykule „Cellular pharmacology studies of shikonin derivatives (Phytother. Res., 2002, 16:199-209) czy też Zare i wsp., w artykule „Bioprocess engineering of Echium italicum L.: induction of shikonin and alkannin derivativers by twoliquid-phase suspension cultures (Plant Cell Tiss. Organ. Cult., 2010, 100:157-164), szikonina wykazuje silną aktywność przeciwzapalną, przeciwnowotworową, przeciwzakrzepową oraz przeciwbakteryjną, zwłaszcza w stosunku do bakterii Gram-dodatnich.

Teresa Bujak w artykule p.t. „Maści aloesowe z wyciągami ziół chińskich” (Pol. J. Cosmetol. 2014, 17(3):231-237) opisuje, że szikonina ma silne właściwości przeciwbakteryjne, a korzeń nawrotu czerwonokorzeniowego, który obfituje w ten związek, stosowany jest przez medycynę azjatycką jako lek na egzemy skóry.

Yoo i wsp., w artykule „Lithospermum erythrorhizon extractprotects keratinocytes and fibroblasts against oxidative stress (J. Med. Food, 2014, 00(0):1-8) wykazali, że ekstrakt z nawrotu, bogaty w szikoninę działał ochronnie na ludzkie komórki skóry, zabezpieczając je przed stresem oksydacyjnym wywołanym nadtlenkiem wodoru i w konsekwencji opóźniał procesy jej starzenia.

Innym źródłem roślinnym do pozyskiwania szikoniny jest wyciąg z korzeni Alcanna tinctoria. Należy jednak podkreślić, że szikonina, na skalę przemysłową, pozyskiwana jest metodami biotechnologicznymi, a uzyskiwanie metabolitów w kulturach in vitro, powoduje względnie wysokie koszty prowadzenia takiego procesu.

Innym ważnym składnikiem preparatów dermatologicznych czy kosmetyków do pielęgnacji skóry są witaminy, a zwłaszcza witamina F, będąca mieszaniną nienasyconych linolenowych kwasów tłuszczowych wchodzących m.in. w skład olejów roślinnych. Jak podaje Ando i wsp., w artykule „Linolenic acid and α-linolenic acid lightens ultraviolet-induced hyperpigmentation of the skin (Arch. Dermatol. Res., 1998, 290(7):375-81), kwasy te odgrywają w organizmie człowieka bardzo ważną rolę fizjologiczną w procesie regeneracji nabłonka i tkanki łącznej skóry, co bezpośrednio wpływa na utrzymanie skóry w dobrej kondycji. Wykazano również, że niedobór witaminy F prowadzi wręcz do różnego rodzaju zmian skórnych takich jak, nadmierne łuszczenie naskórka, suchość skóry, łojotok czy skłonność do trądziku.

PL 233 572 B1

Celem wynalazku było opracowanie, prostego, ekologicznego i ekonomicznego sposobu pozyskiwania biologicznie aktywnych substancji głównie alantoiny i szikoniny, wzbogaconych o polifenolowe substancje antyoksydacyjne z jednego, łatwo dostępnego, naturalnego surowca, służących do opracowania prostego składu preparatu o dużej skuteczności w regeneracji i pielęgnacji uszkodzonej skóry.

Sposób otrzymywania preparatu do pielęgnacji skóry z wykorzystaniem korzenia żmijowca włoskiego Echium italicum L. do otrzymywania ekstraktów zawierających alantoinę i szikoninę wraz z mieszaniną polifenoli, według wynalazku charakteryzuje się tym, że uprzednio oczyszczony, oddzielony od kory, wysuszony, zmielony i przesiany przez sito o średnicy oczek nie większej niż 1,6 mm, korzeń Echium italicum L., zwilża się alkoholem etylowym i po odparowaniu alkoholu zalewa rozpuszczalnikiem polarnym w postaci wody destylowanej w stosunku wagowym korzeń/woda jak 1 do 4, wytrząsa przez co najmniej 4 godziny, a następnie ekstrahuje się w procesie kawitacji z użyciem łaźni ultradźwiękowej przez 30-60 minut, w temperaturze 35-45°C, powtarzając proces kilkukrotnie i po odwirowaniu części stałych otrzymuje się ekstrakt o zawartości od 0,25 do 0,35 g alantoiny w 100 ml roztworu. Dodatkowo ekstrakt zawiera mieszaninę polifenoli których zawartość wynosi od 75 do 120 mg ekwiwalentu kwasu galusowego na 100 ml ekstraktu.

Oddzieloną od korzenia Echium italicum L. korę, przygotowaną jak uprzednio korzeń, zalewa się tłoczonym na zimno olejem lnianym w stosunku wagowym kora korzenia/olej jak 1 do 10 i wytrząsa nieustannie przez 48-72 godzin, po czym części stałe mieszaniny odfiltrowuje się, otrzymując ekstrakt o zawartości szikoniny w ilości od 0,2 do 0,3 g na 100 ml olejowego ekstraktu wraz z zestawem cennych nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin pochodzących z oleju. W końcowym etapie, wodny ekstrakt zawierający alantoinę i polifenole emulguje się z lipofilnym podłożem maściowym, korzystnie z euceryną, w stosunku wagowym 1:1, ciągle rozcierając w porcelanowym moździerzu podgrzanym w łaźni wodnej 60-75°C, a po uzyskaniu homogennej postaci, dodaje się ekstrakt olejowy szikoniny w stosunku wagowym do poprzednich składników o połowę mniejszym, i po uzyskaniu homogennego mazidła chłodzi do temp. 8-7°C, otrzymując postać zestalonej maści.

Preparat otrzymany sposobem według wynalazku, na podłożu lipofilnej maści z mieszaniną biologicznie aktywnych substancji jak alantoina, szikonina, czy polifenole pochodzące z korzenia Echium italicum L., a także witamin wchodzących w skład oleju lnianego według wynalazku charakteryzuje się tym, że składniki takie jak, podłoże maściowe; wodny ekstrakt z korzenia EchiumitalicumL. o zawartości alantoiny w granicach od 0,25 do 0,35 g na 100 g ekstraktu wraz z mieszaniną polifenoli w ilości od 75 do 120 mg wyrażonej jako ekwiwalent kwasu galusowego w 100 g ekstraktu oraz ekstrakt olejowy z zawartością szikoniny w granicach od 0,2 do 0,3 g na 100 g ekstraktu wraz z zestawem nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin, występują w proporcjach wagowych jak, 1:1:0,5.

Zaletą wynalazku jest prosty, ekologiczny i ekonomiczny sposób pozyskiwania z zastosowaniem dwojakiego rodzaju ekstrakcji korzeń - woda i kora korzenia - olej lniany, dwóch biologicznie aktywnych substancji - alantoiny i szikoniny wraz z cennymi polifenolami o właściwościach antyoksydacyjnych z jednego, łatwo dostępnego naturalnego surowca zawierającego optymalnie wysokie zawartości wymienionych substancji.

Preparat według wynalazku ma prosty skład, z zawartością substancji aktywnych alantoiny i szikoniny wspomaganych dodatkowo przez antyoksydanty i składniki oleju lnianego jak, nienasycone kwasy tłuszczowe i witaminy, głównie witaminę F. Przeprowadzone badania wykazały dużą skuteczność preparatu w pielęgnacji skóry, a zarazem brak jego właściwości toksycznych.

Wynalazki przedstawiono w poniższych przykładach wykonania.

P r z y k ł a d 1

300 g uprzednio oczyszczonego, oddzielonego od kory, wysuszonego, zmielonego i przesianego przez sito o średnicy oczek 1,6 mm korzenia Echium italicum L., zwilżono alkoholem etylowym i po odparowaniu alkoholu zalano 1200 ml wody destylowanej i wytrząsano przez co najmniej 4 godziny, po czym w procesie kawitacji z użyciem łaźni ultradźwiękowej o mocy ultradźwięków 240 W oraz częstotliwości 35 kHz przeprowadzano ekstrakcję w ciągu 30 minut, w temperaturze 45°C, powtarzając proces kilkukrotnie. Następnie, części stałe mieszaniny oddzielono od roztworu poprzez przefiltrowanie mieszaniny przez jałową gazę. Z użyciem elektroforezy kapilarnej w odniesieniu do wzorc a alantoiny o czystości >98%, określono zawartość alantoiny na poziomie 0,25 g w 100 g wodnego ekstraktu. Dodatkowo, metodą Folina-Cicalteau oznaczono całkowitą zawartość związków polifenolowych na poziomie 75 mg ekwiwalentu kwasu galusowego na 100 g ekstraktu.

PL 233 572 B1

W drugim etapie 50 g oddzielonej od korzenia Echium italicum L. kory, uprzednio wysuszonej, zmielonej i przesianej przez sito o średnicy oczek 1,5 mm, zwilżono alkoholem etylowym i po odparowaniu alkoholu zalano, 500 ml tłoczonego na zimno oleju lnianego i wytrząsano nieustannie przez 48 godzin, po czym części stałe mieszaniny odwirowano z prędkością 5000 rpm przez 10 minut.

Otrzymany supernatant dodatkowo przefiltrowano przez jałową gazę poprzez przelanie ekstraktu olejowego przez kilkukrotnie złożoną i umieszczoną w lejku gazę jałową. W otrzymanym ekstrakcie metodą spektrofotometryczną przy długości fali 530 nm w odniesieniu do wzorca szikoniny o czystości >98% określono zawartości szikoniny w ilości 0,3 g na 100 g ekstraktu.

W końcowym etapie, 200 ml wodnego ekstraktu zawierającego alantoinę zemulgowano z 200 g euceryny, ciągle rozcierając w porcelanowym moździerzu podgrzanym w łaźni wodnej do 75°C, a po uzyskaniu homogennej postaci dodano 100 g ekstraktu olejowego, a następnie po uzyskaniu homogennego mazidła ochłodzono je do temp. 7°C, otrzymując postać zestalonej maści o wiśniowo-czerwonej barwie.

P r z y k ł a d 2

200 g uprzednio oczyszczonego, oddzielonego od kory, wysuszonego, zmielonego i przesianego przez sito o średnicy oczek 1,5 mm korzenia Echium italicum L., zwilżono alkoholem etylowym i po odparowaniu alkoholu zalano 800 ml wody destylowanej i wytrząsano przez co najmniej 4 godziny, po czym w procesie kawitacji z użyciem łaźni ultradźwiękowej o mocy ultradźwięków 240 W oraz częstotliwości 35 kHz przeprowadzano ekstrakcję w temperaturze 35°C w ciągu 60 minut, powtarzając proces kilkukrotnie. Następnie, części stałe mieszaniny odwirowano z prędkością 5000 rpm przez 10 minut, po czym z użyciem elektroforezy kapilarnej w odniesieniu do wzorca allantoiny o czystości >98%, określono zawartość alantoiny na poziomie 0,35 g w 100 g wodnego ekstraktu. Dodatkowo, metodą Folina-Cicalteau oznaczono całkowitą zawartość związków polifenolowych na poziomie 120 mg ekwiwalentu kwasu galusowego na 100 g ekstraktu.

W drugim etapie 100 g oddzielonej od korzenia Echium italicum L. kory, uprzednio wysuszonej, zmielonej i przesianej przez sito o średnicy oczek 1,6 mm, zwilżono alkoholem etylowym i po odparowaniu alkoholu zalano 1000 ml tłoczonego na zimno oleju lnianego i wytrząsano nieustannie przez 72 godziny. Części stałe mieszaniny odsączono na jałowej gazie a otrzymany supernatant dodatkowo przefiltrowano przez kilkukrotnie złożoną jałową gazę. W otrzymanym ekstrakcie określono zawartości szikoniny metodą spektrofotometryczną, przy długości fali 530 nm w odniesieniu do wzorca szikoniny o czystości >98%, w ilości 0,2 g na 100 g ekstraktu.

W końcowym etapie, 100 g wodnego ekstraktu zawierającego alantoinę zemulgowano ze 100 g euceryny, ciągle rozcierając w porcelanowym moździerzu podgrzanym w łaźni wodnej do 60°C, a po uzyskaniu homogennej postaci dodano 50 g ekstraktu olejowego i ochłodzono do temp. 8°C, otrzymując postać zestalonej maści o wiśniowo-czerwonej barwie.

P r z y k ł a d 3

Skład preparatu do pielęgnacji skóry:

- 50 g lipofilnej maści stanowiącej podłoże w postaci euceryny,

- 50 g ekstraktu wodnego korzeni E. italicum L. o zawartości alantoiny 0,35 g/100 g ekstraktu i zawartości polifenoli na poziomie 75 mg ekwiwalentu kwasu galusowego na 100 g ekstraktu,

- 25 g ekstraktu olejowego kory korzeni E. italicum L. o zawartości szikoniny 0,2 g/100 g wraz z zestawem cennych nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin.

P r z y k ł a d 4

Skład preparatu do pielęgnacji skóry:

- 250 g lipofilna maść stanowiąca podłoże w postaci euceryny,

- 250 g ekstraktu wodnego korzeni E. italicum L. o zawartości alantoiny 0,25 g/100 g ekstraktu i zawartości polifenoli na poziomie 120 mg ekwiwalentu kwasu galusowego na 100 g ekstraktu,

- 125 g ekstraktu olejowego kory korzeni E. italicum L. o zawartości szikoniny 0,3 g/100 g ekstraktu wraz z zestawem cennych nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin.

W kolejnym przykładzie badano wpływ preparatu na żywotność komórek skóry, wyrażoną poprzez aktywność dehydrogenazy burszytnianowej oraz stabilność błon komórkowych z wykorzystaniem ludzkich fibroblastów skóry właściwej.

P r z y k ł a d 5 g preparatu według wynalazku, rozpuszczono w 5 ml roztworu wodno-etanolowego w proporcji 1:1, z użyciem łaźni ultradźwiękowej o mocy 240 W oraz częstotliwości 35 kHz ogrzanej do temperatury 35°C. Z otrzymanego roztworu sporządzono kilka roztworów o stężeniach: 25, 50, 75, 100, 125 oraz

PL 233 572 Β1

150 p,g/ml, które wykorzystano do badań z użyciem hodowli komórkowych i analiz metodami spektrofotometrycznymi jak, MTT opartej na ocenie aktywności dehydrogenazy bursztynianowej żywych komórek oraz NR oceniającej stabilność błon komórkowych.

Wpływ preparatu o różnych stężeniach na aktywność dehydrogenazy bursztynianowej żywych komórek ludzkich fibroblastów skóry właściwej oraz stabilność ich błon przedstawiono w tabeli 1.

Tabela 1

Stężenie (μ^/ηιΐ)	Metoda
MTT	NR
Wyni	k w%
Kontrola	100 ±0,79	100 ±3,66
25	102,76 ±1,15	97,56 ±1,84
50	102,95 ±0,57	101,52 ±2,70
75	103,54 ± 0,76	100,00 ±4,88
100	104,33 ±3,96	100,91 ±1,51
150	105,12 ±2,43	100,30 ±2,43

Przedstawione wyniki wskazują, że wraz ze wzrostem stężenia preparatu wzrasta aktywność dehydrogenazy bursztynianowej będącej odzwierciedleniem pozytywnego wpływu preparatu na zwiększenie żywotności komórek badanych fibroblastów, co pośrednio świadczy o pielęgnacyjnych właściwościach preparatu w zakresie regeneracji uszkodzonej skóry.

Wyniki testu NR nie wykazują wpływu preparatu na stabilność błon komórkowych, co potwierdza fakt braku toksycznych właściwości preparatu.

Dodatkowo, w przykładzie wykazującym brak toksyczności preparatu, wykonano obserwację komórek ludzkich fibroblastów pod mikroskopem, z wykorzystaniem metody May-Grunwald-Giemsa, w której zabarwione jądra komórkowe widoczne są ciemno niebieskim kolorze, zaś cytoplazma w kolorze czerwono-fioletowym.

Obrazy mikroskopowe zamieszczono na rysunku, na którym widoczne są zdrowe komórki ludzkich fibroblastów wybarwione metodą May-Grunwald-Giemsa, ciemniejsze obszary to jądra komórkowe zaś jaśniejsze wokół nich to cytoplazma.

Fig. 1 przedstawia obraz kontrolny - bez zastosowania preparatu według wynalazku, zaś fig. 2 i fig. 3 - komórki ludzkich fibroblastów potraktowane roztworem preparatu odpowiednio o stężeniach 25 μg/ml i 75 μg/ml. Wizualizacja efektu działania preparatu na zdrowe komórki ludzkich fibroblastów nie wykazała istotnych różnic w morfologii tych komórek w stosunku do kontroli.

Claims (2)

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób otrzymywania preparatu do pielęgnacji skóry z wykorzystaniem korzenia żmijowca włoskiego Echium italicum L. do otrzymywania ekstraktów alantoiny i szikoniny wraz z polifenolami, znamienny tym, że uprzednio oczyszczony korzeń Echium italicum L. oddziela się od kory, suszy, miele, przesiewa przez sito o średnicy oczek nie większej niż 1,6 i zwilża alkoholem etylowym, a po odparowaniu alkoholu zalewa rozpuszczalnikiem polarnym w postaci wody destylowanej w stosunku wagowym korzeń/woda jak 1 do 4, wytrząsa przez co najmniej 4 godziny, a następnie ekstrahuje się w procesie kawitacji z użyciem łaźni ultradźwiękowej przez 30-60 minut, w temperaturze 35-45°C, powtarzając proces kilkukrotnie i po odwirowaniu części stałych otrzymuje się ekstrakt o zawartości od 0,25 do 0,35 g alantoiny w 100 g roztworu, dodatkowo ekstrakt zawiera polifenole których zawartość wynosi od 75 do 120 mg

PL 233 572 B1 ekwiwalentu kwasu galusowego na 100 g ekstraktu, zaś oddzieloną od korzenia Echium italicum L. korę, przygotowaną jak uprzednio korzeń, zalewa się tłoczonym na zimno olejem lnianym w stosunku wagowym kora korzenia/olej jak 1 do 10 i wytrząsa nieustannie przez 48-72 godzin, po czym części stałe mieszaniny odfiltrowuje się, otrzymując ekstrakt olejowy o zawartości szikoniny w ilości od 0,2 do 0,3 g na 100 g ekstraktu wzbogacony o zestaw nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin, pochodzących z oleju, przy czym w końcowym etapie, wodny ekstrakt zawierający alantoinę i polifenole emulguje się z lipofilnym podłożem maściowym, korzystnie z euceryną, w stosunku wagowym 1:1, ciągle rozcierając w porcelanowym moździerzu podgrzanym w łaźni wodnej do temperatury 60-75°C, a po uzyskaniu homogennej postaci dodaje się ekstrakt olejowy szikoniny w stosunku wagowym do poprzednich składników o połowę mniejszym, i po uzyskaniu homogennego mazidła chłodzi do temp. 8-7°C, otrzymując postać zestalonej maści.

2. Preparat do pielęgnacji skóry, na podłożu lipofilnej maści w postaci euceryny, będący homogeniczną mieszaniną biologicznie aktywnych substancji jak alantoina, szikonina czy polifenole pochodzące z korzenia Echium italicum L. oraz zestawem nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin zawartych w tłoczonym na zimno oleju lnianym, znamienny tym, że składniki takie jak, podłoże maściowe; wodny ekstrakt z korzenia Echium italicum L. o zawartości alantoiny w granicach od 0,25 do 0,35 g na 100 g ekstraktu wraz z mieszaniną polifenoli w ilości od 75 do 120 mg wyrażonej jako ekwiwalent kwasu galusowego w 100 g ekstraktu oraz ekstrakt olejowy z zawartością szikoniny w granicach od 0,2 do 0,3 g na 100 g ekstraktu wraz z zestawem nienasyconych kwasów tłuszczowych i witamin, występują w proporcjach wagowych jak, 1:1:0,5.