PL233963B1

PL233963B1 - Startery, zestaw starterów, sondy molekularne, zestaw sond molekularnych, zestaw starterów i sond oraz zastosowanie starterów i sond w technice dyskryminacji alleli do wykrywania mutacji w genie BRCA1 i diagnozowania raka piersi

Info

Publication number: PL233963B1
Application number: PL408373A
Authority: PL
Inventors: Jerzy Zygmunt Ostrowski; Paweł Roman Gaj
Original assignee: Centrum Medyczne Ksztalcenia Podyplomowego; Centrum Medyczne Kształcenia Podyplomowego; Centrum Onkologii Instytut Im Marii Sklodowskiej Curie; Centrum Onkologiiinstytut Im Marii Skłodowskiejcurie
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2019-12-31
Also published as: PL408373A1

Abstract

Przedmiotami wynalazku są starter do wykrywania mutacji w genie BRCA1, zestaw starterów, sonda molekularna do wykrywania obecności mutacji DNA oraz zestaw sond. Ujawniono również zestaw starterów i sond do wykrywania odpowiednich mutacji w genie BRCA1 oraz zastosowanie starterów i sond do genotypowania mutacji genu BRCA1 oraz wykrywania raka sutka.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są startery do wykrywania mutacji w genie BRCA1, zestaw starterów, sondy molekularne do wykrywania mutacji w genie BRCA1, zestaw sond oraz zestaw starterów i sond. Przedmiotem wynalazku jest również zastosowanie starterów i sond w technice dyskryminacji alleli do diagnozowania raka piersi. Wynalazek mieści się w zakresie dziedziny techniki związanej z zagadnieniami biologii medycznej.

Warianty genetyczne genów BRCA1 oraz BRCA2 wiążą się z dużą predyspozycją do zachorowania na nowotwory złośliwe. Geny te zostały sklonowane i dzięki poznaniu ich sekwencji są możliwe analizy wariantów genetycznych obu genów w powiązaniu z oceną ryzyka do rozwoju raka. Nie jest to jednak łatwe zadanie z uwagi na rozmiar wspomnianych powyżej genów. Osoby, które są nosicielami mutacji wspomnianych genów mają duże ryzyko zachorowania na raka piersi i jajnika. Opisanych zostało wiele mutacji związanych z predyspozycją do nowotworów w obrębie wskazanych powyżej genów.

Koreańskie zgłoszenie patentowe numer KR 200761088 ujawnia mutacje BRCA1 oraz BRCA2, występowanie których służy do przewidywania i wykrywania raka piersi lub jajnika. Rozwiązanie to dotyczy nowego polinukleotydu stosowanego w postaci sondy bądź startera do detekcji oraz diagnozowania raka piersi lub raka jajnika i wskazuje ponad 60 mutacji wykrywanych za pomocą zastrzeganego rozwiązania - sondy i startera.

Amerykańskie zgłoszenie patentowe numer US 13132335 ujawnia metody i zestawy do określania predyspozycji do zachorowania na raka poprzez określenie obecności bądź braku funkcjonalnego wariantu KLOTHO w formie heterozygotycznej. Bardziej szczegółowo rozwiązanie to dotyczy określania predyspozycji do zachorowania na raka piersi oraz raka jajnika, prognozy choroby, projektowania leczenia oraz samego leczenia i wskazuje na dwie mutacje (tj. 185delAG oraz 5382insC), do których zaprojektowane zostały cztery startery.

Międzynarodowe zgłoszenie patentowe - numer publikacji WO 2010093731 A2 - dotyczy sposobów i kompozycji do diagnozy bądź przewidywania zaburzeń genetycznych. Bardziej szczegółowo rozwiązanie ujawnia w jednym z zastrzeżeń sposób identyfikowania pacjenta pod względem ryzyka rozwoju raka piersi.

Polski patent numer PL 209 997 B1 ujawnia sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi i/lub jajnika u kobiet pochodzenia polskiego oraz zastosowanie wybranych mutacji występujących w obrębie genu BRCA1 do wykrywania takiej predyspozycji. Ogólnie wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej. Przedmioty wynalazku służą do syntezy DNA oraz identyfikacji anomalii w materiale genetycznym pacjenta, które są skorelowane z dziedziczną predyspozycją do zachorowania na wymienione nowotwory.

Polski patent numer PL 185 957 B1 ujawnia sposób wykrywania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 w polskich rodzinach z agregacją raków piersi i/lub jajnika oraz zestaw diagnostyczny służący do stosowania tego sposobu. Ujawnione w przedmiotowym patencie mutacje to 5382insC oraz 185delaAG.

Polskie zgłoszenie patentowe numer P 396 307 ujawnia sposób oraz zestaw, który ma zastosowanie w diagnozowaniu wysokiego genetycznie uwarunkowanego ryzyka raka piersi i polega na ocenie w materiale biologicznym badanej osoby występowania mutacji genów BRCA1 i BRCA2 charakterystycznych dla populacji regionu Morza Bałtyckiego.

Wytypowane, unikalne sekwencje starterów i sond nukleotydowych wykorzystywane są do wykrywania trzech rzadkich zmian (mutacji) w sekwencji DNA osób badanych (Tabela 1). Każda z trzech badanych mutacji wprowadza przesunięcie ramki odczytu kodu aminokwasowego białka, co niesie za sobą istotne ryzyko zmiany aktywności biologicznej produktu genu BRCA1 (RefSeq: NM_007294). Pośrednio, mutacje te mogą mieć wpływ na modyfikację podatności na występowanie raka wielu narządów, w tym przede wszystkim raka piersi.

Tabela 1 Mutacje badane w genie BRCA1

Badana mutacja	Pozycja (GRCh37/hgl9)	Lokalizacja	Typ	Alle] dominujący	Alle! rzadki
5382insC	chrl 7:41209082	ekson 20	insercja	C	CC
4153delA	chrl7;41243513	ekson 11	delccja	A	—
185delAG	chrl 7:41276045	ekson 2	delecja	AG	—

PL 233 963 B1

Analiza dyskryminacji alleli służy do wykrywania w znanym genie, znanej mutacji (lub polimorfizmu) polegającej na zamianie, insercji lub delecji jednej lub więcej zasad. Do analizy dyskryminacji stosuje się metodę PCR w czasie rzeczywistym (RealTime PCR), która polega na jednoczesnej amplifikacji fragmentu genu przy użyciu primerów/sond znakowanych znacznikami fluorescencyjnymi. Sonda jest tak skonstruowana, że rozpoznaje tylko fragment zawierający określony wariant genetyczny. Podczas reakcji PCR w próbce amplifikują się tylko te fragmenty DNA, które są komplementarne do sondy. W wyniku amplifikacji powstają znakowane fluorescencyjnie produkty.

Pomimo istniejącego szeregu rozwiązań związanych z wykrywaniem mutacji w genach BRCA1 oraz BRCA2, nadal istnieje potrzeba prowadzenia badań nad szybszym i bardziej efektywnym sposobem identyfikowania mutacji oraz diagnozowania ryzyka zachorowania na raka piersi i/lub jajnika.

Przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów do wykrywania mutacji w genie BRCA1, charakteryzujący się tym, że wybrany jest z grupy obejmującej sekwencje numer SEQ ID. 1 do SEQ. ID 6.

Korzystnie, gdy wykrywana mutacja w genie BRCA1 stanowi 5382insC, 4153delA oraz 185delAG, przy czym para starterów do wykrywania mutacji 5382insC określona jest SEQ. ID 1 oraz SEQ. ID 2, para starterów do wykrywania mutacji 4153delA określona jest SEQ. ID 3 oraz SEQ. ID 4, zaś para starterów do wykrywania mutacji 185delAG określona jest SEQ. ID 5 oraz SEQ. ID 6.

Korzystnie, gdy temperatura topnienia Tm starteru zawiera się w przedziale 58-60°C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw starterów określonych jak wyżej, charakteryzujący się tym, że służy do wykrywania mutacji 5382insC, 4153delA i 185delAG w genie BRCA1.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest sonda molekularna do wykrywania obecności mutacji DNA, charakteryzująca się tym, że wybrana jest z grupy obejmującej sekwencje numer SEQ. ID 7 do SEQ. ID 12.

Korzystnie sonda charakteryzuje się tym, że wykrywana mutacja DNA stanowi mutację w genie BRCA1: 5382insC, 4153delA i 185delAG, przy czym para sond do wykrywania mutacji 5382insC określona jest SEQ. ID 7 oraz SEQ. ID 8, para sond do wykrywania mutacji 4153delA określona jest SEQ. ID 9 oraz SEQ. ID 10, zaś para sond do wykrywania mutacji 185delAG określona jest SEQ. ID 11 oraz SEQ. ID 12.

Korzystnie sonda od końca 5' wyznakowana jest odpowiednią cząsteczką fluorescencyjną, od końca 3' zaś cząsteczką wygaszacza.

Korzystnie, gdy fluorochrom stanowi cząsteczka VIC® oraz FAM™, cząsteczkę wygaszacza zaś MGB (Minor Groove Binder).

Korzystnie gdy temperatura topnienia TM sondy zawiera się w przedziale 65-66°C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw sond opisanych jak wyżej, charakteryzujący się tym, że wykorzystywany jest do wykrywania mutacji 5382insC, 4153delA i 185delAG w genie BRCA1.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw reakcyjny starterów i sond opisanych powyżej, charakteryzujący się tym, że do wykrywania mutacji 5382insC wykorzystuje się startery określone SEQ. ID 1 i SEQ. ID 2 oraz sondy określone SEQ. ID 7 i SEQ. ID 8, do wykrywania mutacji 4153delA wykorzystuje się startery określone SEQ. ID 3 i SEQ. ID 4 oraz sondy określone SEQ. ID 9 i SEQ. ID 10, do wykrywania mutacji zaś 185delAG wykorzystuje się startery określone SEQ. ID 5 i SEQ. ID 6 oraz sondy określone SEQ. ID 11 i SEQ. ID 12.

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie starterów i sond opisanych jak wyżej do genotypowania trzech mutacji w genie BRCA1: 5382insC, 4153delA oraz 185delAG w technice dyskryminacji alleli.

Korzystnie wynalazek znajduje zastosowanie do wykrywania zwiększonego ryzyka rozwoju raka piersi i/lub jajnika.

Istotę wynalazku stanowi wybór ściśle określonych sekwencji starterów i sond molekularnych używanych w technologii dyskryminacji alleli, wykorzystywanej do wykrywania rzadkich alleli trzech loci genu BRCA1. Metoda dyskryminacji alleli pozwala na określenie genotypu badanej osoby, poprzez określenie czy badane loci występuje w formie homozygotycznej, składającej się z dwóch alleli o takiej samej sekwencji nukleotydowej, czy występuje ono w formie heterozygotycznej, której istotą jest występowanie w danym locus sekwencji różniących się od siebie sekwencją nukleotydową pomiędzy dwoma chromosomami obecnymi w genomie osoby badanej. Sekwencje starterów cyklicznej reakcji polimerazy (PCR), stanowiącej integralną część techniki dyskryminacji alleli, pozwalają na namnożenie fragmentu DNA genomowego obecnego w próbce DNA osoby badanej i tym samym powodują zawężenie obszaru badanego do fragmentu DNA długości od około 50 do około 250 par zasad. Niezwykle istotną kwestią jest, aby w trakcie reakcji PCR amplifikacji nie podlegały fragmenty DNA inne niż fragment, w którym

PL 233 963 Β1 zlokalizowana jest badana mutacja, oraz aby amplifikacja analizowanego fragmentu przebiegała z jak najlepszą wydajnością. Wymogiem poprawności działania zestawu starterów PCR w reakcji dyskryminacji alleli jest by para starterów charakteryzowała się temperaturą topnienia Tm w zakresie od 58 do 60°C. Pary starterów zaprojektowanych do wykrywania mutacji 5382insC, 4153delA oraz 185delAG przedstawione zostały odpowiednio w Tabeli 2 poniżej.

Tabela 2. Sekwencje starterów reakcji PCR. Sekwencje podane są w orientacji od 5’ do 3’

Badana mutacja	Sekwencja w orientacji od 5’ do 3’	Tm	%GC	L
5382insC Forward	TGAATGCCTTAAATATGACGTGTCT	57,9	36	25
5382insC Reverse	GCAAAGGGGAGTGGAATACAGA	59,1	50	22
4153delA Forward	TGGAAGACTTGACTGCAAATACAAA	58,9	36	25
4153delA Reverse	ACCTGGTTCCAATACCTAAGTTTGAAT	59,5	37	27
185delAG Forward	GAAGTTGTCATTTTATAAACCTTTTAAAAAGA	58,4	22	32
185delAG Reverse	GGAGATAATCATAGGAATCCCAAATTA	58,0	33	27

Sekwencje sond zaprojektowanych do wykrywania obecności mutacji w DNA osoby badanej podane w orientacji od 5’do 3’ przedstawione zostały w Tabeli 3 poniżej. Sekwencje sond opatrzone zostały odpowiednimi fluorochromami od końca 5’ sondy oraz cząsteczką MGB (ang. Minor Groove Binder) od końca 3’. Syntezę i znakowanie oligonukleotydów sond przeprowadzono w firmie Applied Biosystems.

Tabela 3 Sekwencje sond do wykrywania mutacji w orientacji od 5’ do 3’

Badana mutacja	Sekwencja w orientacji od 5’ do 3’	Tm	%GC	L
5382insC Dziki	VIC®-TTTCTGTCCTGGGATT-MGB	65	44	16
5382insC Mutant	FAM™-CTGTCCTGGGGATT-MGB	66	57	14
4153delA Dziki	FAM™-CAGATGATGAAGAAA-MGB	65	33	15
4153delA Mutant	VIC®-GTTTCAGATGATGAGAAA-MGB	66	33	18
185delAG Dziki	FAM™-AAATCTTAGAGTGTCCC-MGB	65	41	17
185delAG Mutant	VIC®-AGAAAATCTTAGTGTCCCAT-MGB	65	35	20

Przeprowadzono szereg reakcji sprawdzających poprawność działania reakcji dyskryminacji alleli przy wykorzystaniu zaprojektowanych sekwencji starterów i sond.

Wynalazek został bliżej objaśniony w przykładzie wykonania (poniżej) oraz na rysunku, na którym: figura 1 przedstawia analizę elektroforetyczną (1,5% agaroza) produktów reakcji dyskryminacji alleli (PCR) genu BRCA1 przeprowadzoną w oparciu o opracowane sekwencje starterów reakcji PCR. Na figurze przedstawiono produkty reakcji PCR oczekiwanych długości dla poszczególnych reakcji: (A) BRCA1 5382insC 242p.z„ (B) BRCA1 4153delA 200p.z., (C) BRCA1 185delAG 211p.z.. Na poszczególnych panelach przedstawiono wyniki otrzymane dla czterech przypadkowo dobranych osób badanych; figura 2 zaś przedstawia wyniki przeprowadzonych reakcji weryfikacyjnych - wynik reakcji dyskryminacji alleli dla zaprojektowanych zestawów reakcyjnych w odniesieniu do badanych mutacji genu BRCA1: 5382insC (A); 4153delA (B); 185delAG (C). Na panelach zaznaczono punkty odpowiadające badanym próbkom DNA, w których wystąpiły badane mutacje. Wszystkie trzy zaprojektowane zestawy reakcyjne poprawnie wyselekcjonowały pacjentki, u których uprzednio, metodą bezpośredniego sekwencjonowania, stwierdzono występowanie badanych mutacji. Oprócz wyszczególnionych próbek zawierających mutacje na każdym z wykresów widoczne są punkty odpowiadające próbkom „dzikim” pod względem wykrywanych mutacji. W lewej dolnej części każdego z wykresów widoczne są dwa punkty odpowiadające próbom „ślepym”, w których DNA badane zastąpiono wodą.

Przykład wykonania

Profil termiczny reakcji PCR składa się z czterdziestu cykli, z których każdy zawiera pojedynczą 10 sekundową inkubację w 95°C (denaturacja nici matrycy DNA), po której następuje 60 sekundowa inkubacja w 60°C (przyłączanie starterów, komplementarnych sond oraz wydłużanie starterów).

PL 233 963 B1

Do 384 dołkowej płytki dodano preparaty DNA, otrzymane z krwi obwodowej 34 pacjentek, u których uprzednio stwierdzono (wykorzystując bezpośrednie sekwencjonowanie) występowanie badanych trzech mutacji w sekwencji genu BRCA1, oraz 26 pacjentek kontrolnych, u których żadna z wykrywanych mutacji nie występowała. Stężenie preparatów DNA wahało się w granicach od 2 do 10 ng/μΙ. Następnie na płytkę rozpipetowane po 5 μΙ uprzednio przygotowanych mieszanin reakcyjnych, zawierających odpowiednio dwa startery dla każdej z reakcji PCR (900 μΙ^ każdego ze starterów), właściwą parę wyznakowanych fluorescencyjnie sond w stężeniu 200 μΙ^ każda oraz mieszaninę składników reakcji (SensiMix™ Probe Kit - Bioline Ltd UK), zawierająca między innymi termostabilną polimerazę DNA, mieszaninę deoksynukleotydów, fluorochrom referencyjny ROX w stężeniu 500 nM oraz 3 mM MgCl2.

Ze względu na bardzo niską częstość występowania badanych mutacji w populacji ogólnej zaleca się wykonywanie oznaczeń załączając do panelu badanych próbek próbki DNA, w których uprzednio potwierdzono występowanie opisanych mutacji.

Zaletą zastosowanej metody oraz zaprojektowanych sond i starterów jest możliwość jednoczesnej analizy wielu próbek w krótkim czasie (szybkość). Metoda ta wykazuje większą czułość niż inne metody cytogenetyczne.

Bibliografia

Gaj P, Kluska A, Nowakowska D, Bałabas A, Piątkowska M, Dąbrowska M, Niwińska A, Ostrowski J. High freąuency of BRCA1 founder mutations in Polish women with nonfamilial breast cancer. Fam Cancer. 2012; 11(4):623-8.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Starter do wykrywania mutacji w genie BRCA1, znamienny tym, że wybrany jest z grupy obejmującej sekwencje numer SEQ ID. 1 do SEQ. ID 6.
2. Starter według zastrz. 1, znamienny tym, że wykrywana mutacja w genie BRCA1 stanowi 5382insC, 4153delA oraz 185delAG, przy czym para starterów do wykrywania mutacji 5382insC określona jest SEQ. ID 1 oraz SEQ. ID 2, para starterów do wykrywania mutacji 4153delA określona jest SEQ. ID 3 oraz SEQ. ID 4, zaś para starterów do wykrywania mutacji 185delAG określona jest SEQ. ID 5 oraz SEQ. ID 6.
3. Starter według zastrz. 1, znamienny tym, że temperatura topnienia Tm startem zawiera się w przedziale 58-60°C.
4. Zestaw starterów określonych zastrzeżeniami od 1 do 3, znamienny tym, że służy do wykrywania mutacji 5382insC, 4153delA i 185delAG w genie BRCA1.
5. Sonda molekularna do wykrywania obecności mutacji DNA, znamienna tym, że wybrana jest z grupy obejmującej sekwencje numer SEQ. ID 7 do SEQ. ID 12.
6. Sonda według zastrz. 5, znamienna tym, że wykrywana mutacja DNA stanowi mutację w genie BRCA1: 5382insC, 4153delA i 185delAG, przy czym para sond do wykrywania mutacji 5382insC określona jest SEQ. ID 7 oraz SEQ. ID 8, para sond do wykrywania mutacji 4153delA określona jest SEQ. ID 9 oraz SEQ. ID 10, zaś para sond do wykrywania mutacji 185delAG określona jest SEQ. ID 11 oraz SEQ. ID 12.
7. Sonda według zastrz. 5, znamienna tym, że od końca 5' wyznakowana jest odpowiednią cząsteczką fluorescencyjną, a od końca 3' cząsteczką wygaszacza.
8. Sonda według zastrz. 5, znamienna tym, że temperatura topnienia Tm sondy zawiera się w przedziale 65-66°C.
9. Zestaw sond określonych zastrzeżeniami od 5 do 8, znamienny tym, że wykorzystywany jest do wykrywania mutacji 5382insC, 4153delA i 185delAG w genie BRCA1.
10. Zestaw reakcyjny starterów i sond określonych którymkolwiek z powyższych zastrzeżeń, znamienny tym, że do wykrywania mutacji 5382insC wykorzystuje się startery określone SEQ. ID 1 i SEQ. ID 2 oraz sondy określone SEQ. ID 7 i SEQ. ID 8, do wykrywania mutacji 4153delA wykorzystuje się startery określone SEQ. ID 3 i SEQ. ID 4 oraz sondy określone SEQ. ID 9 i SEQ. ID 10, do wykrywania mutacji zaś 185delAG wykorzystuje się startery określone SEQ. ID 5 i SEQ. ID 6 oraz sondy określone SEQ. ID 11 i SEQ. ID 12.

PL 233 963 Β1
11. Zastosowanie starterów i sond określonych którymkolwiek z powyższych zastrzeżeń do genotypowania trzech mutacji w genie BRCA1: 5382insC, 4153delA oraz 185delAG w technice dyskryminacji alleli.
12. Zastosowanie według zastrz. 11 do wykrywania raka piersi.