PL234558B1 - Sposób otrzymywania pochodnej uracylu (5-selenocyjanianouracylu) - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób otrzymywania pochodnej uracylu (5-selenocyjanianouracylu) o potencjalnych właściwościach radiosensybilizujących.

Radioterapia to obok chemioterapii najpopularniejsza metoda leczenia stosowana u około 50% wszystkich chorych na nowotwory. Metoda ta wykorzystuje promieniowanie jonizujące, które działa głównie pośrednio, poprzez produkty radiolizy wody (szczególnie rodnik hydroksylowy) uszkadzające komórkowy DNA. Chociaż powszechnie stosowana, radioterapia wywołuje szereg skutków ubocznych, a wiele rodzajów nowotworów charakteryzuje zwiększona odporność na promieniowanie jonizujące (PJ), wynikająca z ich niedotlenienia - hipoksji, co pociąga za sobą konieczność zwiększenia dawek terapeutycznych PJ. Martwicze wewnątrz guzy, są nawet trzykrotnie bardziej odporne na promieniowanie jonizujące niż otaczające je zdrowe tkanki, ponieważ odpowiedzialne za większość uszkodzeń DNA rodniki hydroksylowe nie działają wydajnie w warunkach beztlenowych.

Jedną z metod pozwalającą zwiększyć wydajność uszkodzeń materiału genetycznego jest stosowanie radiosensybilizatorów działających w środowisku o obniżonej zawartości tlenu, np. odpowiednich pochodnych zasad nukleinowych, wcielających się do komórkowego DNA podczas jego biosyntezy. Mechanizm ich działania wykorzystuje solwatowane elektrony powstające w wyniku radiolizy wody w warunkach hipoksji. Pozornie drobna modyfikacja zasady pirymidynowej, jaką jest na przykład zastąpienie atomu wodoru w pozycji C5 uracylu atomem halogenu, prowadzi do zmiany jej właściwości elektronoakceptorowych oraz zdolności do tworzenia rodnika 5-urydylowego (dU·) w reakcji z solwatowanym elektronem. Utworzenie reaktywnego rodnika dU· w DNA może z kolei prowadzić do uszkodzenia materiału genetycznego, a w konsekwencji do śmierci komórki nowotworowej. Radiosensybilizujące właściwości 5-jodo- i 5-bromouracylu były w przeszłości badane tak in vitro, jak i in vivo. Mimo wyraźnego działania radiosensybilizującego in vitro tych związków, badania kliniczne nie zaowocowały ich wprowadzeniem do praktyki leczniczej. Stąd uzasadnione, jak i pożądane jest poszukiwanie nowych związków z tej grupy (radiosensybilizatorów działających w warunkach hipoksji), które mogłyby znaleźć zastosowanie w radioterapii.

Jedną z tego typu pochodnych wydaje się być 5-selenocyjanianouracyl ([U-SeCN]·^-). Po raz pierwszy związek ten został opisany w publikacji zatytułowanej „Electrophilic 5-Substituted Uracils as Potential Radiosensitizers: A Density Functional Theory Study” autorstwa S. Makurat, L. Chomicz-Mańka, J. Rak (ChemPhysChem, DOI: 10.1002/cphc.201600240; patrz załącznik nr 1). W publikacji tej zaproponowano i zweryfikowano na poziomie modelu komputerowego stabilność szeregu anionorodników pochodnych uracylu podstawionych w pozycji 5. Posługując się metodą DFT (Density Functional Theory) wyznaczono profile dysocjacyjnego przyłączenia elektronu (DEA) dla proponowanych pochodnych, wśród których znalazł się również 5-selenocyjanianouracyl. Model teoretyczny przewiduje, że dysocjacja rodnikoanionu [U-SeCN]·^- przebiega bez bariery kinetycznej i prowadzi do uwolnienia cytotoksycznego jonu CN oraz obojętnego rodnika U-Se*. Ponadto bodziec termodynamiczny procesu DEA wynosi około -80,0 kcal/mol i jest 15 kcal/mol większy niż ten związany z dysocjacją indukowaną przyłączeniem elektronu w 5-bromouracylu (BrU), powszechnie znanym radiosensybilizatorze.

Związek, którego sposób otrzymywania jest przedmiotem niniejszego wynalazku stanowi potencjalny sensybilizator procesu uszkadzania DNA przez promieniowanie jonizujące, co może zostać wykorzystane w radioterapii nowotworów. Jeśli zgłaszana pochodna uracylu będzie efektywnie wcielać się do DNA komórkowego, stan hipoksji charakterystyczny dla komórek nowotworów litych pozwoli na zaangażowanie solwatowanych elektronów, nieaktywnych wobec natywnego DNA, a generowanych przez promieniowanie jonizujące, w proces niszczenia materiału genetycznego. Zgodnie z naszą wiedzą tego typu uczulacze nie są jeszcze wykorzystywane w radioterapii, a między innymi, ze względu na hipoksję komórek nowotworowych efektywność indukowania ich śmierci przez PJ jest zasadniczo obniżona (około 3-krotnie względem komórek o fizjologicznym poziomie natlenienia). Ze względu na mechanizm działania, tj. konieczność wcielenia radiosensybilizatora (zgłaszana pochodna uracylu) do genomu komórki przy wykorzystaniu naturalnej maszynerii enzymatycznej wykorzystywanej do biosyntezy DNA, proponowane rozwiązanie wydaje się prowadzić do uniwersalnej metody wspomagania radioterapii nowotworów litych (każda komórka nowotworowa ulega intensywnym podziałom, do których wykorzystuje ten sam mechanizm biochemiczny służący powielaniu własnego materiału genetycznego).

Opracowano nowy sposób otrzymywania 5-selenocyjanouracylu (U-SeCN), a następnie zsyntezowano i oczyszczono związek. Zarejestrowano widma MS, NMR oraz IR potwierdzające tożsamość

PL 234 558 Β1 badanej pochodnej. Wodny roztwór zawierający U-SeCN poddano działaniu określonej dawki promieniowania X w warunkach redukujących, a następnie wykonano ilościową analizę HPLC. Zgodnie z przewidywaniami U-SeCN ulega wydajnemu rozkładowi pod wpływem solwatowanych elektronów wytwarzanych w wyniku radiolizy wody.

W dalszej części opisu wynalazku posługuje się następującymi wzorami:

NCSe

R1

CISeCN

R4

Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób otrzymywania pochodnej uracylu w postaci 5-selenocyjanianouracylu o wzorze R1, który charakteryzuje się tym, że w bezwodnym środowisku działa się na związek o wzorze R2 związkiem R4 w postaci CISeCN, wprowadzającym grupę selenocyjanianową SeCN, przy czym związek R2 poddaje się reakcji ze związkiem R4, który otrzymuje się ze związku R3 w postaci KSeCN i gazowego chloru.

Korzystnie, że związek R2 reaguje ze związkiem R4 w stosunku molowym 1:9.

Korzystnie, oddzielnie przygotowuje się odczynnik selenocyjanujący w postaci CISeCN, do którego dodaje się związek R2.

Wynalazek przybliżono w przykładach i na rysunku, na którym poszczególne figury obrazują:

Fig. 1. Chromatogram przedstawiający surowy produkt reakcji tworzenia U-SeCN.

Fig. 2. Widmo masowe TOF (-) surowego produktu U-SeCN.

Fig. 3. Chromatogram przedstawiający czysty U-SeCN.

Fig. 4. Widmo masowe TOF (-) czystego U-SeCN.

Fig. 5. Widmo masowe MSMS TOF (-) dla jonu o m/z 215,0198 czystego U-SeCN.

Fig. 6. Chromatogram przedstawiający U-SeCN (10 ⁴ M) w 0,03 M roztworze tert-butanolu przed napromienieniem.

Fig. 7. Chromatogram przedstawiający U-SeCN (10 ⁴ M) w 0,03 M roztworze tert-butanolu po napromienieniu (140 Gy).

PL 234 558 B1

Fig. 8. Analiza LC-MS U-SeCN (10^-4 M) w 0,03 M roztworze tert-butanolu po napromienieniu.

Fig. 9. Chromatogram przedstawiający U-SeCN (10^-4 M) w 0,03 M roztworze tert-butanolu po inkubacji w temperaturze 50°C (40 min).

Fig. 10. Chromatogram przedstawiający U-SeCN (10^-3 M) po 17 h (RT) inkubacji w 0,1% roztworze kwasu mrówkowego, pH 3.

Fig. 11. Chromatogram przedstawiający U-SeCN (10^-3 M) po 17 h (RT) inkubacji w 100 mM roztworze octanu amonu, pH 5.

Fig. 12. Chromatogram przedstawiający U-SeCN (10^-3 M) po 17 h (RT) inkubacji w 100 mM roztworze octanu amonu, pH 7.

Fig. 13. Widmo typu 1H NMR (500 MHz, DMSO-d6, 298 K) zarejestrowane dla pochodnej U-SeCN.

Fig. 14. Widmo typu ¹³C NMR (500 MHz, DMSO-d6, 298 K) zarejestrowane dla pochodnej U-SeCN.

Fig. 15. Widmo typu IR zarejestrowane dla pochodnej U-SeCN.

Wynalazek został przedstawiony w poniższym przykładzie, który nie ogranicza zakresu przedmiotowego wynalazku.

P r z y k ł a d:

Do 150 ml kwasu octowego wprowadza się 0,54 g (7,6 mmol) suchego gazowego chloru i 1,5 g (10,4 mmol) suchego selenocyjanianu potasu (KSeCN), uprzednio rozpuszczonego w niewielkiej ilości (2-3 ml) kwasu octowego. Po upływie 1,5 h do utworzonego chloroselenocyjanianu (CISeCN) wprowadza się 129 mg (1,15 mmol) uracylu. Po 20 h prowadzenia reakcji odsącza się powstały brunatny osad, a rozpuszczalnik odparowuje przy pomocy wyparki próżniowej.

Bezpośrednie, selektywne selenocyjanianowanie uracylu (R2) nie było dotychczas opisane.

Związek o wzorze R1 można otrzymać z wysoką wydajnością działając na związek R2 w bezwodnym środowisku związkiem R4, wprowadzającym grupę selenocyjanianową (SeCN). W opisywanym sposobie syntezy, związek R2 reaguje z chloroselenocyjanem o wzorze R4, otrzymanym z selenocyjanianu potasu o wzorze R3 i gazowego chloru. Szczególnie korzystny sposób postępowania polega na oddzielnym przygotowaniu odczynnika selenocyjanującego, do którego dodawany jest związek R2. W opisywanej metodzie syntezy R1 związek R2 reaguje chloroselenocyjanianem (R4) w stosunku molowym 1:9.

Do oczyszczania otrzymanego związku użyto:

(1) wysokosprawny chromatograf cieczowy LC 20AD oraz detektora UV SPD M20A (Shimadzu) oraz semi-preparatywną kolumnę Phenomenex Synergi Polar-RP o wymiarach 250 x 10,00 mm, wielkość ziarna 4 μm, wielkość porów 100 A, pracującą w odwróconym układzie faz. Fazę ruchomą stanowił odpowiednio dobrany gradient rozpuszczalników A i B, gdzie: A - 5 mM octan amonu, pH 5,5; B - 80% CH3CN. Objętościowe natężenie przepływu eluentów wynosiło 5 ml/min. Detekcja odbywała się przy długości fali 254 nm (Fig. 1).

Otrzymany związek zidentyfikowano za pomocą spektometrii mas, przy zastosowaniu wysokorozdzielczego spektrometru TripleTOF 5600 (DuoSpray Ion Source) firmy Sciex pracującego w trybie jonizacji dodatniej i ujemnej.

Warunki analizy MS: CUR: 25; GS1: 30; GS2: 30; ISIF: 4500(-); TEM: 300; CE: 10.00; DP: 100. (Fig. 2).

Czystość syntezowanego związku oznaczono za pomocą:

(1) wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz RP-HPLC, stosując chromatograf Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientyfic) oraz analityczną kolumnę Wakopak Handy ODS (150 x 4,6 mm). Fazę ruchomą stanowił układ rozpuszczalników A' i B', stosowany w 30-minutowym gradiencie 0-30% B', gdzie: A' - 0,1% HCOOH; B' - 80% CH3CN + 0,1% HCOOH. Objętościowe natężenie przepływu eluentów wynosiło 1 ml/min. Detekcja odbywała się przy długości fali 260 nm (Fig. 3); (2) wysokorozdzielczej spektrometrii mas TripleTOF 5600 (SCIEX)). Warunki analizy MS: CUR: 25; GS1: 30; GS2: 30; ISIF: 4500(-); TEM: 300; CE: 10.00; DP: 100. (Fig. 4, Fig. 5).

Do analizy struktury syntezowanego związku stosowano następujące metody badawcze: (1) spektroskopię w zakresie podczerwieni (IR) - rejestracja w pastylce KBr (aparat IFS66 firmy Bruker) (Tab. 2 i Fig. 15); (2) spektroskopię magnetycznego rezonansu jądrowego ¹H, ¹³C NMR (Bruker AVANCE III 500 MHz) (Tab. 2 i Fig. 13 oraz 14). Dodatkowo wyznaczony został molowy współczynnik absorpcji (spektrometr Perkin Elmer Lambda 45) (Tab. 2).

Uzyskany związek po oczyszczaniu poddano działaniu promieniowania jonizującego w komorze X-ray Cellrad firmy Faxitron. Produkty powstałe w wyniku napromieniania analizowane były przy użyciu (1) analitycznego chromatografu Dionex Ultimate 3000 (Thermo Scientyfic), na kolumnie Wakopak Handy ODS 4,6 x 150 mm (Fig. 7) oraz (2) LC-MS. Warunki analizy LC: chromatograf Nexera X2

PL 234 558 Β1

UHPLC, Shimadzu wyposażony w kolumnę Kinetex 2,6 gm, 08, 100 A, 2,1 x 150 mm. Fazę ruchomą stanowił układ rozpuszczalników A” i B”, stosowany w 15-minutowym gradiencie 0-15% B”, gdzie: A” - 0,2% HCOOH; B” - 80% CH3CN + 0,2% HCOOH. Objętościowe natężenie przepływu eluentów wynosiło 0,3 ml/min. Detekcja odbywała się przy długości fali 254 nm.

MS: TripleTOF 5600, SCIEX. MS: CUR: 25; GS1: 30; GS2: 30; ISIF: 4500(-); TEM: 300; CE: 10.00; DP: 100. (Fig. 8).

Badany związek rozpuszczono w wodzie, z dodatkiem tert-butanolu (0,03 M), uzyskując roztwór o stężeniu 10 ⁴ M. Próbka została przedmuchana argonem i napromieniona w kwarcowej kapilarze 3 x 3 x 50 mm. Objętość napromienianej próbki wynosiła 100 gl. Dawka promieniowania wynosiła 140 Gy, a moc źródła 3,5 Gy/min. (Fig. 6, Fig. 7, Fig. 8).

Zebrane wyniki pokazują, że użyta dawka promieniowania jonizującego wywołała około 13% zanik (patrz Tabela 1) zsyntezowanej pochodnej (porównaj powierzchnie sygnału o czasie retencji 5,4 min w próbce kontrolnej (Fig. 6) i napromienionej (Fig. 7). Napromienieniu towarzyszy również 4,7-krotne zwiększenie intensywności sygnału o czasie retencji 11,4 min (patrz Tabela 1) - produkt radiolizy dimer U-SeSe-U, którego masa została potwierdzona za pomocą analizy LC-MS (Fig. 8). Sygnał o czasie retencji 11,4 min jest obecny w próbce kontrolnej, co sugeruje powolną hydrolizę zsyntezowanej pochodnej U-SeCN. Celem weryfikacji stabilności związku roztwór zawierający U-SeCN inkubowano w 0,03 M roztworze tert-butanolu w temp. 50°C przez 40 min. Na Fig. 9 zamieszczono chromatogram roztworu po inkubacji temperaturowej, zaś w Tabeli 1 pokazano wartości integralnej intensywności sygnału o Rt 11,4 min przed i po inkubacji. Niewielka różnica powierzchni pod sygnałem, 0,215 vs 0,410, sugeruje powolną hydrolizę związku. Dodatkowo zagadnienie stabilności pochodnej U-SeCN w roztworze wodnym zostało przebadane w zależności od pH _roztworu. W tym celu pochodna U-SeCN została rozpuszczona, uzyskując stężenie 10 ³ M, w (1) 0,1% roztworze kwasu mrówkowego, pH 3, (2) 100 mM roztworze octanu amonu, pH 5. (3) 100 mM buforze Tris, pH 7. Tak przygotowane próbki inkubowane były w temperaturze pokojowej przez 17 godzin. Wyniki analizy chromatograficznej próbek inkubowanych w roztworach o rożnym pH (Fig. 10, Fig. 11) wskazują, że próbki inkubowane w roztworze o niskim pH (pH 3 i 5) są stabilne w badanych warunkach. Jedynie w wyniku inkubacji w roztworze o pH 7 dochodzi do zwiększenia powierzchni pod sygnałem o Rt 11,7 min, przy jednoczesnym zmniejszeniu powierzchni pod sygnałem o Rt 5,5 min, co sugeruje, że podwyższone pH (pH 7) nieco ułatwia hydrolizę pochodnej U-SeCN i tworzenie dimeru U-SeSe-U (Fig. 12).

Claims (3)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sposób otrzymywania pochodnej uracylu w postaci 5-selenocyjanianouracylu o wzorze R1:

   O

   R1 znamienny tym, że w bezwodnym środowisku działa się na związek R2 o wzorze:

   o

   związkiem R4 w postaci CISeCN, wprowadzającym grupę selenocyjanianową SeCN, przy czym związek R2 poddaje się reakcji ze związkiem R4, który otrzymuje się ze związku R3 w postaci KSeCN i gazowego chloru.
2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że związek R2 reaguje ze związkiem R4 w stosunku molowym 1:9.
3. 3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że oddzielnie przygotowuje się odczynnik selenocyjanujący R4 w postaci CISeCN, do którego dodaje się związek R2.