PL234898B1 - Sekwencje oligonukleotydów oraz ich zastosowanie, sposób wykrywania obecności DNA pasożyta we krwi oraz zestaw - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są sekwencje oligonukleotydów scharakteryzowane jako SEQ. ID No. 1 do SEQ. ID No. 8, sposób wykrywania obecności pasożyta we krwi, zestaw do wykrywania obecności DNA Trichinella spp oraz zastosowanie opisanych powyżej oligonukleotydów do produkcji zestawu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są sekwencje oligonukleotydów scharakteryzowane jako SEQ. ID No. 1 do SEQ. ID No. 8, sposób wykrywania obecności pasożyta we krwi, zestaw do wykrywania obecności DNA Trichinella spp. oraz zastosowanie opisanych powyżej oligonukleotydów do produkcji zestawu.

Choroby zakaźne są jednym z najbardziej istotnych i narastających zagrożeń zdrowia publicznego. Zaliczane do nich zoonozy pasożytnicze występują powszechnie u ludzi. Zarażenie ludzi następuje na skutek kontaktu ludzi z zanieczyszczoną żywnością, wodą lub glebą. Chociaż dokładne dane dotyczące liczby zarażonych osób nie są dostępne, szacuje się że najczęstszymi zoonozami pasożytniczymi są toksoplazmoza, echinokokoza, trichinelloza i schistosomatoza.

Włośnie (Trichinella) to rodzaj robaków obłych z gromady Nematoda o pasożytniczym sposobie życia. Pośrednimi i ostatecznymi gospodarzami są ssaki, ptaki, płazy, gady, ryby i ludzie. Głównymi nosicielami przenoszącymi je na ludzi są zwierzęta, których mięso jest zakażone włośniami albo surowe mięso tych zwierząt bądź też mięso niedostatecznie ugotowane, w szczególności świń, koni i zwierząt łownych. Włośnie można zniszczyć poprzez gotowanie oraz bardzo niskie temperatury. Włośnie występują jako różne gatunki na całym świecie. Istnieje osiem gatunków, a najważniejszymi występującymi w Europie są Trichinella spiralis, Trichinella britovi, Trichinella pseudospiralis i Trichinella nativa.

Pasożytniczy nicień Trichinella spp. jest zdolny do zakażania wielu gatunków, między innymi ludzi, świń, szczurów, dzików, niedźwiedzi, koni i ptaków. W krajach Europy Zachodniej, włośnie występują przede wszystkim w „cyklu zwierząt dzikich”, gdzie lisy i gryzonie roznoszą robaki poprzez zjadanie zakażonych zwierząt. W regionach północnych, również niedźwiedzie, psy pociągowe i foki mogą być gospodarzami pośrednimi. Istnieje również „cykl miejski”, w którym organizmy patogenne są roznoszone przede wszystkim przez szczury i świnie. Dojrzały włosień może mieć długość, odpowiednio do 4 mm (samice) i 1,5 mm (samce). Zgrubiała część tylna zawierająca jelito jest wyraźnie rozróżnialna. Larwa tworzy cystę w tkance mięśniowej i tworzy tam „kompleks komórki odżywczej”, tj. otoczkę, która jest zaopatrzona w liczne naczynia krwionośne, a zatem utrzymuje larwę przy życiu. Larwa może mieć długość około jednego milimetra i jest wysoce zakaźna. Cysty z tkanki mięśniowej rozpuszczają się w jelicie cienkim, gdzie dochodzi do uwolnienia larwy. Larwy penetrują do nabłonka jelita cienkiego i rozwijają się w dorosłe stadium w ciągu 30 godzin, po czym się krzyżują. W skutek namnażania się pasożyta w jelicie cienkim do mięśni poprzecznie prążkowanych trafia wielokrotnie więcej larw niż zostało spożytych z zarażonym mięsem. Każda samica może być zapłodniona kilka razy, a jej potencjał rozrodczy wynosi od 200 do 1500 larw, zależnie od gatunku. Obraz kliniczny powodowany przez włośnie jest określany jako trichinellosis - włośnica. Objawy kliniczne i patogeneza choroby są podobne w przypadku różnych gatunków Trichinella, a choroba może skończyć się śmiercią, gdy do organizmu trafi duża liczba larw z surowym mięsem lub wyrobem poddanym niedostatecznej obróbce termicznej (np. wędzenie na zimno). Zarówno niebezpieczne są skutki reakcji alergicznej (obrzęk powiek i twarzy, nastrzyknięcie spojówek) jak i objawy grypopodobne występujące w fazie jelitowej w pierwszych dniach po spożyciu zarażonego mięsa i uszkodzenia wielonarządowe w trakcie wędrówki larw drogą krwionośną i osiedlania w mięśniach szkieletowych. W tym czasie mogą pojawiać się objawy zapalenia płuc i opon mózgowordzeniowych, może dojść również do uszkodzenia nerek i mięśnia sercowego.

W wielu krajach europejskich, włośnica została uznana za chorobę, która musi być monitorowana, a dla państw członkowskich Unii Europejskiej, jest to obowiązkowe zgodnie z dyrektywą Unii Europejskiej w sprawie chorób odzwierzęcych, 2003/99/WE. Przypadki włośnicy muszą być zgłaszane, ale dalsze działania nie muszą być podjęte. Komisja Europejska (KE) zmieniła prawo ustanawiające przepisy dotyczące kontroli urzędowych dla włośni obecnych w mięsie, w celu poprawy bezpieczeństwa żywności dla konsumentów w krajach europejskich.

Zgodnie z rozporządzeniem (WE) nr 2075/2005, inspekcje mięsa są wymagane dla trzody chlewnej, koni, dzików oraz innych gatunków hodowlanych i dzikich zwierząt, które są podatne na zakażenie Trichinella i które są ubijane w celu spożycia.

Włośnica jest nie tylko zagrożeniem dla zdrowia publicznego, ale także stanowi duży problem ekonomiczny w produkcji świń i dla bezpieczeństwa żywności. W oficjalnej inspekcji mięsnej, używan e są tylko bezpośrednie sposoby wykrywania tego pasożyta. Jedynymi zalecanymi procedurami wykrywania larw Trichinella w tkance mięśniowej są sposoby trawienia. Inne sposoby nie są zalecane ze względu na brak skuteczności lub wiarygodności.

Aktualnie w diagnostyce człowieka stosowane są głównie sposoby takie jak: ELISA, Western Blot, testy immunoprecypitacji. Istniejące sposoby serologiczne niestety nie sprawdzają się w przypadku

PL 234 898 B1 wczesnej i gatunkowo specyficznej diagnostyki. Zalecane sposoby wykrywania Trichinella spp. z próbek mięśni (sposób kompresji, trawienie) są pracochłonne, czasochłonne, niewystarczająco czułe i nie różnicują na poziomie gatunku, a ponadto trudne do wykonania u ludzi.

Oprócz standardowych procedur diagnostycznych i badań serologicznych, zostały również opracowane sposoby molekularne do wykrywania i typowania włośni takie jak: multiplex PCR lub PCR w czasie rzeczywistym. Wszystkie dostępne sposoby molekularne pozwalają na diagnostykę do której niezbędna jest biopsja mięśnia.

U ludzi z podejrzeniem włośnicy ostateczne postawienie diagnozy uwzględnia: wywiad środowiskowy, objawy kliniczne i serodiagnostykę. Jednym ze sposobów wykorzystywanych do diagnozowania włośnicy u ludzi jest test immunoenzymatyczny ELISA. Polega on na oznaczeniu w surowicy krwi specyficznych przeciwciał (głównie klasy IgG) przeciwko antygenom pasożyta. Ponadto, w ostateczności wymagana jest znaczna interwencja chirurgiczna, a czułość diagnozy zależy od ilości próbki badanego mięśnia. Zwykle od 0,2 do 0,5 g tkanki mięśniowej bez tłuszczu i skóry pobrane z mięśnia naramiennego lub innego szkieletowego.

Testy ELISA są stosowane do wykrywania specyficznych przeciwciał anty-Trichinella w surowicy lub soku mięsnym. Jednak okazują się niewystarczające, by zaświadczyć, że człowiek lub zwierzę jest wolne od włośni, nawet w ciężkich zakażeniach, gdyż przeprowadzone badania sugerowały opóźnienie w wytwarzaniu specyficznych przeciwciał, co może prowadzić do fałszywych wyników negatywnych. Techniki takie jak PCR, PCR w czasie rzeczywistym charakteryzują się bardzo wysoką czułością i specyficznością. Chociaż sposoby te wydają się być obiecujące, wymagają użycia specjalistycznych, drogich urządzeń. Dodatkowo aktywność polimerazy Taq stosowanej w PCR jest często hamowana przez inhibitory reakcji PCR występujące w materiale biologicznym.

Międzynarodowe zgłoszenie WO2014/071946 ujawnia sposób oparty na wykrywaniu SSU rDNA za pomocą amplifikacji wszystkich SSU rDNA różnych od ludzkiego w ludzkich próbkach klinicznych za pomocą odpowiednio trzech lub czterech zestawów primerów, próbki o dużej zawartości ludzkiego DNA oraz próbki o malej zawartości ludzkiego DNA.

Z kolei w zgłoszeniu CN102424841 ujawnia się sposób diagnostyki włośnia za pomocą LAMP PCR przy użyciu wskazanych primerów oraz zestaw diagnostyczny. Primery zostały zaprojektowane zgodnie z powtarzającą się sekwencją Trichinella spiralis swoistą dla genu SB4.

W stanie techniki są zatem znane sposoby diagnozowania włośnia za pomocą technik PCR. Jednak ciągle dużym problemem pozostaje diagnostyka włośnicy ludzi, szczególnie w początkowym okresie inwazji.

Celem wynalazku jest zatem opracowanie sposobu, który umożliwia wykrywanie pasożyta na każdym etapie inwazji, co pozwoli w sposób czuły i specyficzny diagnozować ludzi i zwierzęta. Proponowane rozwiązanie pozwoli ograniczyć zarówno koszt jak i czas, a dodatkowo charakteryzować się będzie większą czułością i specyficznością. Co więcej opracowany sposób pozwala na diagnostykę patogenów bezpośrednio z krwi bez potrzeby stosowania kosztownego sprzętu laboratoryjnego i wykwalifikowanego personelu dzięki czemu mógłby również znaleźć szerokie zastosowanie w inspekcji mięsa przeznaczonego do spożycia, co z kolei pozwoliłoby na sprawniejsze monitorowanie i eliminowanie czynników zakaźnych w kraju.

Przedmiotem wynalazku są zatem sekwencje oligonukleotydów posiadające sekwencję przedstawioną jako: SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3, SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. ID No. 7 albo SEQ. ID No. 8.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania obecności DNA pasożyta we krwi żywiciela, charakteryzujący się tym, że pasożytem jest Trichinella spp. a sposób obejmuje następujące etapy: pobiera się krew na antykoagulant, następnie wiruje się krew w celu uzyskania osocza, po czym izoluje się DNA z osocza i ostatecznie przeprowadza się reakcję PCR lub LAMP PCR z zastosowaniem polimerazy Taq lub polimerazy Bst oraz odpowiednich oligonukleotydów opisanych powyżej.

Korzystnie DNA namnażanym w reakcji jest wolne DNA pasożyta (cfDNA) obecnego we krwi, którym jest DNA mitochondrialne.

Korzystnie, gdy do amplifikacji stosuje się wstępną denaturację w temp. 98°C, a następnie cykle termiczne w temp. 56°C.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wykrywania obecności DNA Trichinella spp., składający się z przynajmniej dwóch oligonukleotydów opisanych zastrzeżeniem numer 1 oraz ewentualnie odpowiednich odczynników do amplifikacji DNA.

PL 234 898 B1

Jeszcze kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie oligonukleotydów przedstawionych w zastrzeżeniu numer 1 do produkcji zestawu do wykrywania obecności DNA Trichinella spp.

Podstawową kwestią realizacji wynalazku jest namnażanie wolnego DNA pasożyta (cfDNA) obecnego we krwi, którym jest DNA mitochondrialne.

Na figurach przedstawiono wyniki reakcji PCR oraz LAMP PCR.

Fig. 1 to przedstawienie reakcji PCR ze starterami TsMT-F3, TsMT-B3 na matrycach DNA różnych gatunków Trichinella (1-T. spiralis, 2-T. nativa, 3-T. britovi, 4-T. pseudospiralis). 6 - wolne DNA (cfDNA) myszy zarażonej przez okres 2 lat T. spiralis. Ścieżka 5 - kontrola negatywna, M- DNA marker 100bp

Fig. 2 to przedstawienie reakcji LAMP PCR ze starterami TsMT-F3, TsMT-B3, TsMT-FIP, TsMT-BIP, TsMT-F2, TsMT-F1c, TsMT-B2, TsMT-B1c na matrycach DNA różnych gatunków Trichinella (2-T. spiralis, 3-T. nativa, 4-T. britovi, 5-T. pseudospiralis). Ścieżka 1 - kontrola negatywna, M- DNA marker 100bp

Fig. 3 to przedstawienie reakcji PCR ze starterami TsMT-F3, TsMT-B3 na matrycach (cfDNA) wyizolowanych od zwierząt zarażonych różną dawką larw T. spiralis (1 - szczur zarażony 50 T. spiralis, 2 - szczur 300 larw, 3 - szczur 700 larw, 4 - szczur 1000 larw, 7- szczur 4000 larw). 6 - Świnia zarażona 200 larwami T. spiralis. Ścieżka 8 - kontrola pozytywna na DNA T. spiralis, 9 - kontrola negatywna, M- DNA marker 100bp

Fig. 4 to przedstawienie reakcji PCR ze starterami TsMT-F3, TsMT-B3 na matrycach (cfDNA) wyizolowanych od zwierząt/człowieka zarażonych T. spiralis. Ścieżka 1 - kontrola negatywna, 3 - Świnia zarażona 200 larwami, 4 - zarażony człowiek, M- DNA marker 100bp

Fig. 5 to przedstawienie reakcji LAMP PCR ze starterami TsMT-F3, TsMT-B3, TsMT-FIP, TsMT-BIP, TsMT-F2, TsMT-F1c, TsMT-B2, TsMT-B1c na wolnym DNA wyizolowanym od szczura zarażonego 2 - 4000 larw, 3 - 8000 larw, 1- kontrola negatywna, M- DNA marker 100bp

Fig. 6 to przedstawienie reakcji PCR ze starterami TsMT-F3, TsMT-B3 na osoczu zwierzęcia zarażonego T. spiralis. Ścieżka 1 - osocze zarażonego zwierzęcia, 2 - kontrola negatywna, M- DNA marker 50bp

Wynalazek został przedstawiony w przykładach wykonania, które nie mają charakteru ograniczającego.

P r z y k ł a d 1

Sprawdzono specyficzność zaprojektowanego zestawu starterów do reakcji PCR i LAMP PCR gdzie jako matrycę zastosowano DNA różnych gatunków Trichinella (T. spiralis, T. nativa, T. britovi, T. pseudospiralis) (Fig. 1, Fig. 2). Do reakcji PCR zastosowano jednakową ilość DNA.

P r z y k ł a d 2

Sprawdzono czułość sposobu pod względem intensywności zarażenia. W tym celu zarażono zwierzęta (szczur rasy Lewis - samce w wieku 3 miesięcy) różnymi dawkami larw - 50, 300, 700, 1000, 4000, 8000. Zwierzęta uśmiercano i pobierano im krew na antykoagulant. Kolejnym etapem było uzyskanie osoczna poprzez wirowanie w 4°C. Następnie sprawdzono skuteczność sposobu PCR na wolnym DNA (cfDNA) wyizolowanym z osocza żywicieli. W przypadku szczurów zarażonych 300, 700, 1000, 4000, 8000 uzyskano pozytywny wynik. Szczury były zarażone przez okres 2 miesięcy (Fig. 3). Dodatkowo określono intensywność zarażenia izolując larwy z mięśni metodą trawienia i przeliczano liczbę larw na całkowitą masę mięśni, którą użyto do trawienia. Intensywność była adekwatna do wyjściowej dawki zarażeniowej. 98°C - 3 min, 98°C - 30 s, 56°C - 30 s, 72°C - 40 s - 35 cykli, 72°C - 5 min.

P r z y k ł a d 3

Dodatkowo skuteczność sposobu potwierdzono dla myszy zarażonej (samiec szczep C3H zarażony 500 larwami) od 2 lat, świni (samiec 24 kg zarażony przez okres 60 dni) eksperymentalnie zarażonej 200 larwami T. spiralis i w surowicy człowieka u którego potwierdzono zarażenie pasożytem techniką ELISA i biopsją (Fig. 1,3, 4).

P r z y k ł a d 4

Następnie podjęto próbę wykonania reakcji bezpośrednio na osoczu zarażonych zwierząt, co pozwoliłoby ominąć etap izolacji wolnego DNA i ułatwiłoby zastosowanie sposobu w diagnostyce zwierząt przeznaczonych do spożycia. Wynik przedstawiono na Fig. 6.

PL 234 898 Β1

Lista Sekwencji

SEQ. ID No. 1

TsMT-F3 TGAACAATAGCTATAACCAACC

SEQ. ID No. 2

TsMT-B3 GTTAGTGTATAACCGCGATAG

SEQ. ID No. 3

TsMT-FIP GAGAGAAGTGGTTTGTATTCCAGTACTCTATTCAACGACTAGAGAAGAC

SEQ. ID No. 4

TsMT-BIP TTGATGCATATTGCACAAACCAACTCACTTAGATCTTTAACTATGGC

SEQ. ID No. 5

TsMT-F2 CTCTATTCAACGACTAGAGAAGAC

SEQ. ID No. 6

TsMT-Flc GAGAGAAGTGGTTTGTATTCCAGTA

SEQ. ID No. 7

TsMT-B2 TCACTTAGATCTTTAACTATGGC

SEQ. ID No. 8

TsMT-Blc TTGATGCATATTGCACAAACCAAC.

Claims (6)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Sekwencje oligonukleotydów, znamienne tym, że posiadają sekwencję przedstawioną jako: SEQ. ID No. 1, SEQ. ID No. 2, SEQ. ID No. 3, SEQ. ID No. 4, SEQ. ID No. 5, SEQ. ID No. 6, SEQ. ID No. 7 albo SEQ. ID No. 8.
2. 2. Sposób wykrywania obecności DNA pasożyta we krwi żywiciela, znamienny tym, że pasożytem jest Trichinella spp., a sposób obejmuje następujące etapy: pobiera się krew na antykoagulant, następnie wiruje się krew w celu uzyskania osocza, po czym izoluje się DNA z osocza i ostatecznie przeprowadza się reakcję PCR lub LAMP PCR z zastosowaniem polimerazy Taq lub polirnerazy Bst oraz odpowiednich oligonukleotydów jak zdefiniowano w zastrz. 1.
3. 3. Sposób według zastrz. 2. przy czym DNA namnażanym w reakcji jest wolne DNA pasożyta (cfDNA) obecnego we krwi, którym jest DNA mitochondrialne.

   PL 234 898 Β1
4. 4. Sposób według zastrz. 2 do 3, znamienny tym, że do amplifikacji stosuje się wstępną denaturację w temp. 98°C, a następnie cykle termiczne w temp. 56°C lub PCR izotermiczny w temp. 65°C.
5. 5. Zestaw do wykrywania obecności DNA Trichinella spp., znamienny tym, że składa się z co najmniej dwóch oligonukleotydów opisanych zastrz. 1 oraz ewentualnie odpowiednich odczynników do amplifikacji DNA.
6. 6. Zastosowanie oligonukleotydów przedstawionych w zastrz. 1 do produkcji zestawu do wykrywania obecności DNA Trichinella spp.