PL235062B1 - Sposób izolacji amin biogennych z moczu - Google Patents
Sposób izolacji amin biogennych z moczu Download PDFInfo
- Publication number
- PL235062B1 PL235062B1 PL422788A PL42278817A PL235062B1 PL 235062 B1 PL235062 B1 PL 235062B1 PL 422788 A PL422788 A PL 422788A PL 42278817 A PL42278817 A PL 42278817A PL 235062 B1 PL235062 B1 PL 235062B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- methanol
- analytes
- biogenic amines
- extraction
- urine
- Prior art date
Links
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 title claims description 47
- 230000000035 biogenic effect Effects 0.000 title claims description 41
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 41
- 239000012620 biological material Substances 0.000 title claims description 8
- 238000009413 insulation Methods 0.000 title 1
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 158
- VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N dopamine Chemical compound NCCC1=CC=C(O)C(O)=C1 VYFYYTLLBUKUHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 42
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 40
- QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N serotonin Chemical compound C1=C(O)C=C2C(CCN)=CNC2=C1 QZAYGJVTTNCVMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 39
- 238000002470 solid-phase micro-extraction Methods 0.000 claims description 35
- 239000002608 ionic liquid Substances 0.000 claims description 31
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 30
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 claims description 30
- 229960003638 dopamine Drugs 0.000 claims description 24
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 24
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 23
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 21
- SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N norepinephrine Natural products NCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- 229960002748 norepinephrine Drugs 0.000 claims description 21
- WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N L-Dopa Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N adrenaline Chemical compound CNCC(O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 UCTWMZQNUQWSLP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- -1 1-ethyl-3-methylimidazolium tetrafluoroborate Chemical compound 0.000 claims description 18
- SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N (-)-norepinephrine Chemical compound NC[C@H](O)C1=CC=C(O)C(O)=C1 SFLSHLFXELFNJZ-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 15
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 15
- WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N L-DOPA Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 WTDRDQBEARUVNC-LURJTMIESA-N 0.000 claims description 14
- 238000003795 desorption Methods 0.000 claims description 14
- 229920003053 polystyrene-divinylbenzene Polymers 0.000 claims description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 12
- 229940076279 serotonin Drugs 0.000 claims description 12
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 claims description 11
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 claims description 11
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 11
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 10
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 claims description 9
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 claims description 9
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 8
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 8
- HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N alpha-cyclodextrin Chemical compound OC[C@H]([C@H]([C@@H]([C@H]1O)O)O[C@H]2O[C@@H]([C@@H](O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O[C@H]3O[C@H](CO)[C@H]([C@@H]([C@H]3O)O)O3)[C@H](O)[C@H]2O)CO)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]3O[C@@H]1CO HFHDHCJBZVLPGP-RWMJIURBSA-N 0.000 claims description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 7
- 230000004913 activation Effects 0.000 claims description 6
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N sodium 2-[[2-[[hydroxy-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyphosphoryl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]-3-(1H-indol-3-yl)propanoic acid Chemical compound [Na+].C=1NC2=CC=CC=C2C=1CC(C(O)=O)NC(=O)C(CC(C)C)NP(O)(=O)OC1OC(C)C(O)C(O)C1O IFGCUJZIWBUILZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 229920001450 Alpha-Cyclodextrin Polymers 0.000 claims description 4
- 229940043377 alpha-cyclodextrin Drugs 0.000 claims description 4
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 claims description 4
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 4
- 238000004244 micellar electrokinetic capillary chromatography Methods 0.000 claims description 4
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 claims description 3
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 3
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 2
- 229960004502 levodopa Drugs 0.000 description 19
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 description 16
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 16
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 15
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 12
- 238000001012 micellar electrokinetic chromatography Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 8
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 8
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 8
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 description 8
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 description 7
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 6
- 238000011160 research Methods 0.000 description 6
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 6
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 5
- 239000013074 reference sample Substances 0.000 description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 4
- 238000002336 sorption--desorption measurement Methods 0.000 description 4
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000000622 liquid--liquid extraction Methods 0.000 description 3
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 3
- 238000004853 microextraction Methods 0.000 description 3
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 description 3
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 3
- ZXMGHDIOOHOAAE-UHFFFAOYSA-N 1,1,1-trifluoro-n-(trifluoromethylsulfonyl)methanesulfonamide Chemical compound FC(F)(F)S(=O)(=O)NS(=O)(=O)C(F)(F)F ZXMGHDIOOHOAAE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IBZJNLWLRUHZIX-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-methyl-2h-imidazole Chemical compound CCN1CN(C)C=C1 IBZJNLWLRUHZIX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CFFZDZCDUFSOFZ-UHFFFAOYSA-N 3,4-Dihydroxy-phenylacetic acid Chemical compound OC(=O)CC1=CC=C(O)C(O)=C1 CFFZDZCDUFSOFZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 2
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 230000003750 conditioning effect Effects 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002414 normal-phase solid-phase extraction Methods 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 2
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 2
- 125000001889 triflyl group Chemical group FC(F)(F)S(*)(=O)=O 0.000 description 2
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 2
- NJMWOUFKYKNWDW-UHFFFAOYSA-N 1-ethyl-3-methylimidazolium Chemical compound CCN1C=C[N+](C)=C1 NJMWOUFKYKNWDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-O 1-methylimidazole Chemical compound CN1C=C[NH+]=C1 MCTWTZJPVLRJOU-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- LMIQERWZRIFWNZ-UHFFFAOYSA-N 5-hydroxyindole Chemical class OC1=CC=C2NC=CC2=C1 LMIQERWZRIFWNZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N D-glucopyranuronic acid Chemical compound OC1O[C@H](C(O)=O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O AEMOLEFTQBMNLQ-AQKNRBDQSA-N 0.000 description 1
- 206010029260 Neuroblastoma Diseases 0.000 description 1
- GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N Nitric acid Chemical compound O[N+]([O-])=O GRYLNZFGIOXLOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNYAYWLBAHXHLL-UHFFFAOYSA-N Normetanephrine Chemical compound COC1=CC(C(O)CN)=CC=C1O YNYAYWLBAHXHLL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YNYAYWLBAHXHLL-MRVPVSSYSA-N Normetanephrine Natural products COC1=CC([C@H](O)CN)=CC=C1O YNYAYWLBAHXHLL-MRVPVSSYSA-N 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical class O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003113 alkalizing effect Effects 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004638 bioanalytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 230000007073 chemical hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 238000004193 electrokinetic chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000008030 elimination Effects 0.000 description 1
- 238000003379 elimination reaction Methods 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000003912 environmental pollution Methods 0.000 description 1
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 239000003517 fume Substances 0.000 description 1
- 229940097042 glucuronate Drugs 0.000 description 1
- 229910021389 graphene Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002460 imidazoles Chemical class 0.000 description 1
- 125000002883 imidazolyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 229940079865 intestinal antiinfectives imidazole derivative Drugs 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910017604 nitric acid Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 1
- 208000028591 pheochromocytoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 231100000027 toxicology Toxicity 0.000 description 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
- G01N33/5008—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics
- G01N33/502—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing or evaluating the effect of chemical or biological compounds, e.g. drugs, cosmetics for testing non-proliferative effects
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N27/00—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
- G01N27/26—Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
- G01N27/416—Systems
- G01N27/447—Systems using electrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Other Investigation Or Analysis Of Materials By Electrical Means (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób izolacji amin biogennych z moczu, który wykorzystuje ciecze jonowe do mikroekstrakcji w fazie stałej amin biogennych przed ich rozdzieleniem za pomocą miceralno-elektrokinetycznej chromatografii.
Oznaczanie amin biogennych w materiale biologicznym wzbudza ogromne zainteresowanie ze względu na duże znaczenie diagnostyczne tych związków. W związku z tym, że każdy materiał biologiczny jest skomplikowaną matrycą o różnorodnym składzie chemicznym, z którego anality muszą być selektywnie wyizolowane, to właśnie ten etap przysparza naukowcom najwięcej problemów. Najczęściej stosowaną matrycą do oznaczania amin biogennych jest mocz, rzadziej osocze czy surowica krwi. W celu izolacji amin stosowane są różne techniki ekstrakcyjne takie jak ekstrakcja ciecz-ciecz (LLE), mikroekstrakcja dyspersyjna ciecz-ciecz (DLLME), ekstrakcja do fazy stałej (SPE) wykorzystująca różne wypełnienia kolumienek ekstrakcyjnych (np. C18, HLB, MCX, SCX) pozwalające na wybiórcze izolowanie amin biogennych o zbliżonych właściwościach. W niektórych przypadkach techniki ekstrakcyjne są poprzedzane etapem hydrolizy chemicznej lub enzymatycznej, który z jednej strony pozwala uwolnić badany związek z połączenia z białkami osocza w przypadku analizy surowicy krwi lub z jego konjugatu (glukuronianu czy sulfonianu) w przypadku analizy próbek moczu. Należy jednak podkreślić, że ten etap jest dość czasochłonny i często nie przynosi oczekiwanego wzrostu wykrywalności metody.
Mając na uwadze techniki separacyjne stosowane w analizie amin biogennych, należy zwrócić uwagę, że najbardziej czułą metodą jest połączenie detekcji opartej o spektrometrię mas (MS) z dowolną techniką separacyjną, co pozwala na oznaczanie amin biogennych na poziomie kilku ng/mL a nawet pg/mL. Jednakże zastosowanie detekcji MS jest stosunkowo kosztowne i z tego względu nie jest powszechnie dostępne w laboratoriach analitycznych. Kolejnym czułym detektorem stosowanym w analizie amin biogennych jest detektor laserowo wzbudzany fluorescencją (LIF). Charakteryzuje się czułością zbliżoną do detektora MS, jednak wymaga zastosowania dodatkowego etapu konwersji chemicznej analitów przed analizą separacyjną. Odczynniki do tej reakcji są jednak kosztowne, zwykle toksyczne dla człowieka i mało przyjazne dla środowiska. Stąd najwięcej metod dotyczących oznaczania amin biogennych opiera się na detektorach spektrofotometrycznych (UV/VIS), które z jednej strony są najmniej czułe, ale z drugiej stosunkowo tanie i powszechnie dostępne w wielu laboratoriach diagnostycznych. Z tego względu metody oparte na detekcji UV/VIS są bardzo atrakcyjne do zastosowania w rutynowych analizach laboratoryjnych.
Obecnie zainteresowanie analityków skupione jest na poszukiwaniu sposobów poprawiających czułość metody już na etapie ekstrakcji analitów z matrycy lub na etapie wzmocnienia sygnału on-line w trakcie analizy separacyjnej.
Należy także zauważyć, że ze względu na zróżnicowane właściwości poszczególnych amin biogennych, dostępne w literaturze naukowej prace dotyczą zazwyczaj oznaczania od 2 do maksymalnie 5 związków charakteryzujących się podobnym charakterem fizyko-chemicznym. Sposób będący przedmiotem niniejszego wynalazku pozwala na jednoczesną ekstrakcję aż siedmiu amin biogennych.
Aminy biogenne były oznaczane także przy zastosowaniu innych cieczy jonowych, które stosowano na różnych etapach opracowanych metodyk analitycznych. Zastosowanie HMIMPF6 jako czynnika poprawiającego ekstrakcję w metodzie oznaczania zawartości 5-hydroksyindoli (aminy różne od amin będących przedmiotem niniejszego wynalazku) w osoczu pozwoliło na uzyskanie satysfakcjonującego wzmocnienia sygnałów analitów oraz uzyskanie niskich wartości granicy oznaczalności. Dwie inne ciecze jonowe, których struktura chemiczna oparta jest na pierścieniu imidazolowym (C16MImCI i C12MlmCI) pozwoliły na poprawę separacji dopaminy, noradrenaliny oraz adrenaliny i normetanefryny. Pomimo obniżenia wartości LOD (granicy wykrywalności metody) zabiegi te nie umożliwiły analizy ilościowej badanej próbki pod kątem oznaczenia amin biogennych.
Ciecze jonowe zastosowano także w postaci kompozytu unieruchomionego na płytce grafenowejchitozanowej, w metodzie biosensorycznego pomiaru stężeń amin, w tym dopaminy, uzyskując LOD 0,04 gM/L.
Ponadto, ciecze jonowe wpisują się doskonale w postulaty „zielonej chemii, głównie z uwagi na ich małą toksyczność, różnorodność struktur chemicznych i właściwości fizyko-chemicznych. Mogą spełniać rolę uniwersalnych odczynników, znajdujących zastosowanie w wielu dziedzinach nauki, w tym w toksykologii, chemii organicznej i analitycznej.
PL 235 062 B1
Ciecze jonowe stają się obiektem zainteresowania, szczególnie w metodach bioanalitycznych, opierających się na małych objętościach próbek i charakteryzujących się niskimi stężeniami oznaczanych związków. Do tego typu metod należą techniki elektromigracyjne, które są tanie w eksploatacji i przyjazne środowisku, ale ze względu na stosunkowo niską wykrywalność wymagają zastosowania efektywnych metod ekstrakcji analitów z próbek biologicznych.
W dzisiejszych czasach, gdy wymagania analityczne rosną, niezbędna jest:
- redukcja zużycia próbek biologicznych: dysponując niewielką objętością próbki biologicznej konieczne jest uzyskanie szeregu, istotnych klinicznie informacji o związkach, typowanych jako biomarkery, występujących w znikomych ilościach,
- redukcja lub wyeliminowanie toksycznych odczynników: z uwagi na zanieczyszczenie środowiska i niebezpieczeństwo dla analityka, wykonującego oznaczenia,
- uproszczenie procedur eksperymentalnych, by uniknąć dodatkowych kosztów, zminimalizować czas potrzebny na przeprowadzenie analizy i dostarczyć wiarygodnych wyników badań w stosunkowo krótkim czasie.
Przedmiotem badań było ulepszenie metody mikroekstracji do fazy stałej (ang. solid phase microextraction, SPME) poprzez zastosowanie cieczy jonowych. Wybór SPME wiązał się z faktem, że jest to technika wysoko przepustowa (możliwość przygotowywania jednoczesnego do 96-ciu próbek), cechująca się niskim zużyciem odczynników chemicznych i materiału biologicznego oraz dużą automatyzacją. Jednak uboga gama złóż SPME dostępnych komercyjnie na rynku i możliwych do zastosowania podczas ekstrakcji wielu ważnych biologicznie związków z grupy amin biogennych (adrenalina, noradrenalina, dopamina i serotonina) oraz ich aminokwasów prekursorowych (L-tyrozyna, L-tryptofan, LDOPA) jednocześnie, skłoniła twórców niniejszego wynalazku do zaproponowania bardzo wybiórczych dodatków do desorbentów - cieczy jonowych. Badania przeprowadzone przez twórców pozwoliły na optymalizację metody opartej o technikę SPME, podczas jednoczesnej ekstrakcji siedmiu wymienionych związków z próbek biologicznych z zastosowaniem desorbenta organicznego z dodatkiem cieczy jonowych. Wszystkie testowane ciecze jonowe należą do pochodnych imidazolowych, różniących się anionem, który wchodzi w skład danej cieczy (tetrafluoroboran 1-butylo-3-metyloimidazoliowy, tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy oraz bis(trifluorometylosulfonylo)imid 1-etylo-3-metyloimidazoliowy).
Celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie nowego sposobu ekstrakcji analitów z zastosowaniem cieczy jonowych jako desorbenta podczas procedury SPME, który może być zastosowany do wykrywania siedmiu amin biogennych i ich aminokwasów prekursorowych w materiale biologicznym. Nieoczekiwanie problem ten został rozwiązany w istotnym stopniu w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest nowy sposób izolacji amin biogennych z materiału biologicznego gdzie ekstrakcja siedmiu amin biogennych: serotoniny, dopaminy, noradrenaliny, adrenaliny oraz ich aminokwasów prekursorowych: L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-DOPA w moczu następuje poprzez:
- aktywację fazy stałej polistyrenu-diwinylobenzenu (PS-DVB) pokrywającej złoża mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), która następuje za pomocą mieszaniny metanol : woda (50:50; v/v) 30 minut; następnie płucze się przez 10 sekund wodą dejonizowaną;
- wprowadzenie na złoże próbek moczu, zakwaszonych do pH 3 przy użyciu 6M HCI, zawierających badane anality, gdzie czas adsorpcji wynosi 90 minut;
- przemycie wodą dejonizowaną poprzez zanurzenie złoża polistyrenu-diwinylobenzenu w 1 mL wody przez 10 sekund;
- desorpcję analitów przez 90 minut za pomocą 1 mL roztworu metanolu zawierającego ciecz jonową w postaci tetrafluoroboranu 1-etylo-3-metyloimidazoliowego o stężeniu 20 ng/mL;
- odparowanie odczynnika do desorpcji w urządzeniu do odparowywania próbek pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C;
- rozpuszczenie suchej pozostałości w 50 μL buforu tetraboranu sodu 2mM;
- analizę elektroforetyczną techniką micelarno-elektrokinetycznej chromatografii kapilarnej (MEKC) do identyfikacji wyizolowanych analitów.
Sposób izolacji gdzie do analizy elektroforetycznej zastosowano bufor separacyjny w postaci mieszaniny 10 mM tertraboranu sodu, 30 mM SDS, 15% (v/v) metanolu oraz 25 mM a-cyklodekstryny.
Sposób izolacji gdzie mieszaninę doprowadzono do pH 9,36 przy użyciu 1 M NaOH.
PL 235 062 B1
Opis figur:
Fig. 1 - przedstawia elektroferogram próbki wzorcowej zawierającej aminy biogenne o stężeniu 20 μg/mL (1) elektroferogramy próbek poddanych ekstrakcji SPME (każdy analit o stężeniu 20 μg/mL) z zastosowaniem różnych desorbentów: (2) Metanol, (3) Acetonitryl, (4) Aceton.
Legenda: DA - dopamina; A - adrenalina; NA - noradrenalina; L-Tyr - L-tyrozyna; L- Tryp - Ltryptofan; 5-HT - serotonina; L-DOPA - lewodopa
Fig. 2 - przedstawia elektroferogram próbki wzorcowej zawierającej aminy biogenne o stężeniu 20 μg/mL (1) elektroferogramy próbek poddanych ekstrakcji SPME (każdy analit o stężeniu 20 μg/mL) z zastosowaniem metanolu jako desorbenta w różnych warunkach pH (2-5): (2) czysty metanol, (3) metanol + 0,1 M HNO3 (pH 2), (4) metanol + 2,5 % NH4OH (pH 8), (5) metanol + 0,1 M NaOH (pH 9,5).
Legenda: DA - dopamina; A - adrenalina; NA - noradrenalina; L-Tyr - L-tyrozyna; L-Tryp - Ltryptofan; 5-HT - serotonina; L-DOPA - lewodopa
Fig. 3 - przedstawia elektroferogram próbki wzorcowej zawierającej aminy biogenne o stężeniu 20 μg/mL (1) oraz elektroferogramy próbek poddanych ekstrakcji SPME (każdy analit o stężeniu 20 μg/mL) z zastosowaniem różnych złóż pokrywających: C18 (2) oraz PS-DVB (3).
Legenda: DA - dopamina; A - adrenalina; NA - noradrenalina; L-Tyr - L-tyrozyna; L-Tryp - Ltryptofan; 5-HT - serotonina; L-DOPA - lewodopa
Fig. 4 - przedstawia elektroferogram próbki wzorcowej zawierającej aminy biogenne o stężeniu 20 μg/mL (1) oraz elektroferogramy próbek poddanych ekstrakcji SPME ze zmodyfikowanym czasem adsorpcji i desorpcji (każdy analit o stężeniu 20 μg/mL) oraz z zastosowaniem metanolu jako desorbenta (2-4): (2) 40 min adsorpcja/desorpcja, (3) 60 min adsorpcja/desorpcja, (4) 90 min adsorpcja/desorpcja
Legenda: DA - dopamina; A - adrenalina; NA - noradrenalina; L-Tyr - L-tyrozyna; L-Tryp - Ltryptofan; 5-HT - serotonina; L-DOPA - lewodopa
Fig. 5 - przedstawia elektroferogram próbki wzorcowej zawierającej aminy biogenne o stężeniu 20 μg/mL (1) oraz elektroferogramy próbek poddanych ekstrakcji SPME (każdy analit o stężeniu 20 μg/mL) z zastosowaniem różnych cieczy jonowych w desorbencie (2-5): (2) Metanol, (3) Metanol + IL1 (20 ng/mL), (4) Metanol + IL2 (20 ng/mL), (5) Metanol + IL3 (20 ng/mL)
Legenda: IL1 - tetrafluoroboran 1-butylo-3-metyloimidazolowy, IL2 - tetrafluoroboran 1-etylo-3metyloimidazolowy, IL3 - tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazolo bis(trifluorometylosulfonylo)imidowy
DA - dopamina; A - adrenalina; NA - noradrenalina; L-Tyr - L-tyrozyna; L-Tryp - L- tryptofan; 5-HT serotonina; L-DOPA - lewodopa
Fig. 6 - przedstawia elektroferogram próbki wzorcowej zawierającej aminy biogenne o stężeniu 20 μg/mL (1) oraz elektroferogramy próbek poddanych ekstrakcji SPME (każdy analit o stężeniu 20 μg/mL) z zastosowaniem różnych stężeń cieczy jonowej IL2 (tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazolowy) w metanolu (2-9): (2) Metanol + IL2 (10 ng/mL), (3) Metanol + IL2 (20 ng/mL), (4) Metanol + IL2 (50 ng/mL), (5) Metanol + IL2 (100 ng/mL), (6) Metanol + IL2 (200 ng/mL), (7) Metanol + IL2 (300 ng/mL), (8) Metanol + IL2 (400 ng/mL), (9) Metanol + IL2 (500 ng/mL).
Legenda: DA - dopamina; A - adrenalina; NA - noradrenalina; L-Tyr - L-tyrozyna; L- Tryp - Ltryptofan; 5-HT - serotonina; L-DOPA - lewodopa
Wynalazek ilustruje następujący przykład wykonania, nie stanowiący jego ograniczenia
P r z y k ł a d:
1.1. Wykonanie
Przygotowanie roztworów wzorcowych i odczynników do analizy
Dopamina (DA), adrenalina (A), noradrenalina (NA), L-tryptofan (L-Tryp), L-tyrozyna (L-Tyr), serotonina (5-HT) oraz lewodopa (L-DOPA), a także ciecze jonowe: tetrafluoroboran 1-butylo-3-metyloimidazolowy, tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy oraz tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazolo bis(trifluorometylosulfonylo)imidowy.
Metanol, laurylosiarczan sodu (SDS), a-cyklodekstryna (α-CD) oraz bezwodny tetraboran sodu (boraks), płyn regenerujący do aparatury zestawu elektroforezy, woda dejonizowana. Wszystkie odczynniki o czystości analitycznej (cz.d.a.) były stosowane bez dalszego oczyszczania.
PL 235 062 B1
Przygotowanie roztworów wzorcowych amin biogennych
Przygotowano roztwory wzorcowe badanych amin biogennych o stężeniu 1 mg/mL w następujący sposób. Na wadze analitycznej, odważono dokładnie 1 000 mg każdej substancji wzorcowej w oddzielnych probówkach typu eppendorf o pojemności 1,5 mL. Następnie roztwory wzorcowe substancji: Ltryptofanu, serotoniny oraz dopaminy przygotowano poprzez rozpuszczenie osobno każdej substancji w 1000 gL metanolu; podczas gdy roztwory L-tyrozyny, L-DOPA, noradrenaliny oraz adrenaliny przygotowano poprzez rozpuszczenie osobno każdej substancji w 950 gL metanolu, a następnie dodanie 50 gL 0,1 M HCI. Dodanie 50 gL 0,1 M kwasu solnego do roztworów wzorcowych czterech wspomnianych amin biogennych poprawiło ich rozpuszczalność w metanolu. Wszystkie roztwory mieszano przy użyciu vorteksu przez około 2 min oraz poddawano działaniu ultradźwięków w łaźni ultradźwiękowej przez 5-15 minut. Powyższe podstawowe roztwory wzorcowe przechowywano w zamrażarce w temperaturze -20°C, chroniąc od światła, przez dwa tygodnie. Roztwory robocze wszystkich wyżej wymienionych analitów o stężeniach 20 i 0,25 gg/mL przygotowywano codziennie poprzez odpowiednie rozcieńczenie roztworu podstawowego danego analitu w wodzie. Roztwory robocze przechowywano w 4°C w zamkniętym pojemniku maksymalnie przez 8-10 godzin.
Sporządzenie roztworu aktywacyjnego do SPME
Przygotowano roztwór aktywacyjny złoża do mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME) (metanol/woda, 50:50, v/v). W tym celu do szklanej kolby miarowej o pojemności 50 mL odmierzono przy pomocy pipety automatycznej 15 mL wody dejonizowanej oraz 15 mL metanolu. Kolbę zamknięto korkiem i wytrząsano manualnie przez 2 min. Roztwór aktywacyjny do SPME przechowywano w temperaturze pokojowej pod dygestorium.
Sporządzenie roztworów do desorpcji zawierających ciecze jonowe
Roztwór do desorpcji zawierający ciecz jonową (tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy) o stężeniu 20 ng/mL w metanolu przygotowywano poprzez odmierzenie przy użyciu pipety automatycznej 1,0 gL cieczy jonowej ([EMIM]+[BF4]- m.cz. 197,97) i rozpuszczenie w 10 mL metanolu.
Sporządzenie buforu do rozpuszczania próbek po ekstrakcji analitów z moczu
Sporządzono 2 mM roztwór tetraboranu sodu jako bufor do rozpuszczania próbek po przeprowadzeniu procesu ekstrakcji analitów z moczu i odparowaniu desorbentu. W tym celu odmierzono przy pomocy pipety automatycznej 1 mL 100 mM roztworu tetraboranu sodu i przeniesiono do kolby miarowej objętości 50 mL, a następnie uzupełniono wodą dejonizowaną do kreski.
Sporządzenie buforu separacyjnego do analizy elektroforetycznej
Bufor separacyjny (BGE) złożony z boraksu (10 mM), SDS (30 mM), a-cyklodekstryny (25 mM) oraz metanolu (15%, v/v) stosowany był podczas rozdzielania analitów metodą micelarno-elektrokinetycznej chromatografii (MEKC). Przygotowywano go kilkuetapowo. W pierwszym etapie do kolby miarowej o objętości 50 mL przeniesiono dokładnie odważone 1,216 g a-cyklodekstryny, dodano 5 mL roztworu boraksu o stężeniu 100 mM, 7,5 mL metanolu oraz 30 mL wody dejonizowanej. Następnie kolbę miarową umieszczono na 10 min w łaźni ultradźwiękowej. W kolejnym etapie odmierzono przy użyciu pipety automatycznej 7,5 mL 200 mM roztworu SDS i dodano do roztworu znajdującego się w kolbie miarowej. Ostatecznie roztwór buforu separacyjnego doprowadzono do pH 9,36 przy użyciu 1 M NaOH.
1.2 Procedura przygotowania próbek moczu
Zbieranie materiału
Próbki moczu zakwaszano do pH 3 przy użyciu 6 M HCI w następujący sposób: do każdej probówki o pojemności 15 mL dodawano 50 gL 6M HCI i uzupełniano próbką moczu (10 mL). Do czasu analizy próbki moczu przechowywano w stanie zamrożenia, w temperaturze -80°C (dotyczy próbek realnych użytych w sposobie będących przedmiotem wynalazku).
PL 235 062 B1
W trakcie opracowywania procedury ekstrakcji amin biogennych próbki moczu były wzbogacane dodatkiem każdego analitu w stężeniu 20 pg/mL, po czym mocz był zakwaszany do pH 3 za pomocą 6 M HCI (dotyczy walidacji sposobu będącego przedmiotem wynalazku).
Ekstrakcja SPME
W doświadczeniu wykorzystano manualny 96-dołkowy aparat do mikroekstrakcji do fazy stałej, w którym jako fazę stacjonarną zastosowano PS-DVB (polistyren-diwinylobenzen). Proces ekstrakcji składał się z kilku etapów: kondycjonowania złoża SPME za pomocą mieszaniny metanol : woda (50:50; v/v), wprowadzenia próbki na złoża PS-DVB (adsorpcja analitów) i wymywania analitów ze złoża (desorpcja). Pomiędzy etapami stosowano krótkie 10-sekundowe płukanie wodą dejonizowaną, w celu zapobiegania przenoszeniu roztworów oraz usunięcia polarnych substancji interferujących.
Procedura ekstrakcji SPME analitów z próbki biologicznej:
• Aktywacja fazy pokrywającej blaszki (PS-DVB) za pomocą mieszaniny metanol : woda (50:50; v/v) - 30 minut; następnie krótkie płukanie (10 sekund) wodą dejonizowaną • Wprowadzenie na złoże zakwaszonych próbek moczu (pH 3) zawierających badane anality (1 mL moczu) - czas adsorpcji 90 min • Przemycie włókna wodą dejonizowaną (10 sekund) • Desorpcja analitów przez 90 min za pomocą 1 mL roztworu metanolu zawierającego ciecz jonową (tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy) o stężeniu 20 ng/mL • Odparowanie odczynnika do desorpcji w urządzeniu do odparowywania próbek pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C • Rozpuszczenie suchej pozostałości w 50 pL buforu do próbek • Analiza elektroforetyczna (MEKC)
Analiza elektroforetyczna
Do analiz elektroforetycznych zastosowano aparat do elektroforezy kapilarnej wyposażony w automatyczny podajnik próbek (autosampler), detektor diodowy (DAD), urządzenie kontrolujące temperaturę oraz system gromadzenia danych dostarczony przez producenta. Parametry analizy elektroforetycznej techniką micelarno-elektrokinetycznej chromatografii kapilarnej (MEKC) były następujące: niemodyfikowana kapilara krzemionkowa o średnicy wewnętrznej 75 pm i całkowitej długości 60,20 cm; długość fali detektora DAD - λ = 200 nm; czas nastrzyku - 8 s; przyłożone napięcie - 22 kV; temperatura analizy - 22(± 0,1)°C. Pomiędzy każdym cyklem analiz przeprowadzano kondycjonowanie kapilary w celu zapewnienia powtarzalności analiz, które obejmowało płukanie 0,1 M NaOH przez 1 min pod ciśnieniem 50 psi (I etap), a następnie płukanie kapilary wodą Mili-Q przez 1 min pod ciśnieniem 50 psi (II etap) oraz buforem separacyjnym przez 1 min pod ciśnieniem 50 psi (III etap). Jako bufor separacyjny (BGE) zastosowano mieszaninę 10 mM tertraboranu sodu, 30 mM SDS, 15% (v/v) metanolu oraz 25 mM α-cyklodekstryny. Mieszaninę doprowadzono do pH 9,36 przy użyciu 1 M NaOH.
PL 235 062 Β1
Zestawienie warunków analizy elektroforetycznej realizowanej w odmianie micelarnoelektroforetycznej chromatografii
| PARAMETR | WARTOŚĆ PARAMETRU |
| Średnica wewnętrzna kapilary | 75 pm |
| Długość kapilary | 60,2 cm |
| Czas nastrzyku pneumatycznego | 8 sekund |
| Czas analizy | 15 minut |
| Analityczna długość fali UV | 200 nm |
| Napięcie | 22 kV |
| Bufor separacyjny | 10 mM Boraks, 30 mM SDS, 25 mM a-CD, 15% (v/v) metanolu (pH 9,36) |
1.3 Wyniki analizy
Wybór odpowiedniego desorbenta do ekstrakcji SPME
W eksperymencie sprawdzono trzy rozpuszczalniki organiczne - metanol, acetonitryl i aceton, z których metanol okazał się być najbardziej optymalnym desorbentem dla badanych amin biogennych z próbek moczu. Dane te potwierdzają wyniki przedstawione na Fig. 1, które obrazują przykładowe elektroforegramy próbek uzyskane po ekstrakcji analitów z moczu i ich desorpcji ze złoża SPME przy użyciu wyżej wymienionych desorbentów.
Wybór odpowiedniego pH desorbenta
W badaniach testowano pH w zakresie od 2 do 9,5, a uzyskane wyniki ilustruje Fig. 2, który potwierdza, że najwyższą wydajność ekstrakcji 5-HT i L-Tyr odnotowano przy pH kwaśnym, ale w przypadku innych analitów te warunki nie były efektywne. Alkalizacja metanolu przez dodanie 2,5% NH4OH do pH 8,0 lub 0,1 M NaOH do pH 9,5 pogorszyła wydajność ekstrakcji amin biogennych. Zatem, zmiana pH nie przyniosła zadowalających wyników wydajności ekstrakcji dla wszystkich analitów, i z tego względu wybrano czysty metanol bez modyfikacji pH do dalszych badań.
Wybór złoża pokrywającego blaszki do SPME
W badaniach wydajności izolacji amin biogennych z zakwaszonych próbek moczu (pH 3) wzięto pod uwagę dwie różne komercyjnie dostępne fazy stacjonarne (C18 i PS-DVB).
Doświadczalne dane potwierdziły, że badane anality w mniejszym stopniu są zatrzymywane na powłokach C18, podczas gdy faza stacjonarna typu PS-DVB była bardziej efektywna w przypadku ekstrakcji DA, A, NA, L-Tryp i L-Tyr (Fig. 3).
Wybór czasu adsorpcji i desorpcji
Czas trwania etapów adsorpcji i desorpcji amin biogennych na kolumienkach SPME ze złożem PS-DVB oszacowano przez ekstrakcję próbek moczu wzbogaconych dodatkiem badanych analitów (każdy o stężeniu 20 μg/mL), które ekstrahowano w środowisku kwaśnym (pH 3) i następnie desorbowano za pomocą czystego metanolu w różnych przedziałach czasowych od 40 do 90 minut. Uzyskane dane doświadczalne potwierdziły, że czas adsorpcji/desorpcji determinuje skuteczność ekstrakcji (Fig. 4), przy czym najwyższą wydajność uzyskano wówczas, gdy zarówno czas adsorpcji, jak i desorpcji wynosił 90 min.
PL 235 062 B1
Wybór rodzaju cieczy jonowej w desorbencie
W badaniach testowano trzy rodzaje cieczy jonowych: tetrafluoroboran 1-butylo-3-metyloimidazolowy (IL1), tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy (IL2), tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazolo bis(trifluorometylosulfonylo)imidowy (IL3), z których każda była dodawana do metanolu w stężeniu 20 ng/mL. Na Fig. 5 przedstawiono elektroforogramy próbek moczu z dodatkiem siedmiu amin biogennych, każde o stężeniu 20 μg/mL, które ekstrahowano z 1 mL próbki moczu (pH 3) przez 90 min i desorbowano ze złoża PS-DVB przez 90 min za pomocą wyżej wymienionych desorbentów. Uzyskane dane potwierdziły, że tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy (IL2) jest najbardziej efektywnym desorbentem spośród badanych cieczy jonowych.
Dobór stężenia tetrafluoroboranu 1 -etylo-3-metyloimidazolu w metanolu jako odczynniku desorbujqcym
Oceniono wpływ stężenia cieczy jonowej - tetrafluoroboranu 1-etylo-3-metyloimidazoliowego (IL2) w metanolu na wydajność ekstrakcji amin biogennych z moczu ludzkiego. W tym celu dodano do czystego metanolu tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy w stężeniu od 10 ng/mL do 500 ng/mL. Uzyskane dane wykazały, że najwyższą wydajność uzyskano wówczas, gdy stężenie cieczy jonowej w metanolu wynosiło 20 ng/mL. Niższe stężenie cieczy jonowej, jak i wzrost jej stężenia powyżej 20 ng/mL obniża skuteczność ekstrakcji (Fig. 6).
Podsumowanie wyników
Przeprowadzone badania umożliwiły wyznaczenie optymalnych warunków procesu przygotowania próbki do analizy, dzięki czemu uzyskano znaczący wzrost wartości odzysku w odniesieniu do wszystkich siedmiu badanych związków: dopaminy, adrenaliny, noradrenaliny, L-tyrozyny, L-tryptofanu, serotoniny i lewodopy. Najbardziej optymalną cieczą jonową okazał się tetrafluoroboran 1-etylo-3-metyloimidazoliowy w stężeniu 20 ng/mL jako dodatek do metanolu, który jest stosowany jako desorbent w procedurze izolacji tych analitów z próbek moczu techniką mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME). Dodatek cieczy jonowej spowodował wzrost wydajności procesu ekstrakcji, która umożliwia analizę śladowych ilości amin biogennych z zastosowaniem techniki MEKC z detekcją UV/VIS.
Nowość badań podjętych przez twórców niniejszego wynalazku polega na pionierskim zastosowaniu cieczy jonowej jako dodatku do desorbentu w SPME podczas jednoczesnej izolacji 7 amin biogennych z próbek moczu. Biorąc pod uwagę dużą labilność (foto- i termowrażliwość) wybranej grupy analitów, jak i ich zróżnicowane właściwości fizykochemiczne, metody stosowane do ich izolacji z próbek biologicznych, są często obarczone wieloma wadami (nie uwzględniają stopnia skomplikowania matrycy, warunków prawidłowego przechowywania próbek czy nie pozwalają na jednoczesną izolację tak dużej grupy analitów). Zaproponowana technika SPME z dodatkiem cieczy jonowej pozwala na szybsze, dokładniejsze i bardziej przyjazne środowisku oznaczanie amin biogennych w moczu.
PL 235 062 Β1
2.1 Porównanie sposobu według wynalazku z wcześniej opracowanymi metodami przez twórców niniejszego wynalazku
| Metoda analityczna i sposób detekcji | Materiał biologiczny | Sposób ekstrakcji analitów z matrycy biologicznej | Badane anality | Uzyskany limit oznaczalności (LOQ) [με/mL] | Uzyskany limit wykrywalności (LOD) [Rg/mL] |
| Natalia Miekus. Piotr K Adamkiewicz-Droży metabolites of catecho | owalski, Ilona Oledz | ka, Alina Pienis, Ewa Bień, Aleksandra Mie | kus, Małgorzata Kr | awczyk. Elżbieta dected acidic euroblastoma, Λ | |
| ńska, Tomasz Baczek Cyclodextrin-modified MEKC method for quantification of se amines in the presence of various biogenic amines : application to diagnosis of n Chromatogr. 8, 2015(1003) 27-34 | |||||
| MEKC z detekcją UV (λ 200 nm) | Mocz (1 mL) | Ekstrakcja typu cieczciecz (LLE) z zastosowaniem 1 mL eteru etylowego | VMA HVA DOPAC | 0,5 0,5 0,5 | 0,1 0,1 0,25 |
| Natalia Migkus, Ilona Olędzka, Alina Pienis, Piotr Kowalski, Ewa Bień, Aleksandra Migkus, Małgorzata Anna Krawczyk, Elżbieta Adamkiewicz-Droźyńska. Tomasz Baczek, Determination of urinary biogenic amines' biomarker profile in neuroblastoma and pheochromocytoma patients by MEKC method with preceding dispersive liq u id-li quid microextraction, J. Chromatogr. B 2016; yol. 1036-1037, s. 114-123 | |||||
| MEKC z detekcją UV (λ 200 nm) | Mocz (1 mL) | Dyspersyjna mikroekstrakcja typu ciecz-ciecz (DLLME) | DA A NA L-T ryp L-Tyr 5-HT L-DOPA | 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 | 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 0,15 |
| Przedstawiona metodologia z zastosowaniem cieczy jonowej | |||||
| MEKC z detekcją UV (λ 200 nm) | Mocz (1 mL) | Mikroekstrakcja do fazy stałej (SPME) z metanolem jako desorbentem z dodatkiem cieczy jonowej | DA A NA L-Tyr L-Tryp 5-HT L-DOPA | 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,5 0,5 | 0,08 0,08 0,08 0,08 0,08 0,15 0,15 |
Zastrzeżenia patentowe
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób izolacji amin biogennych z materiału biologicznego, znamienny tym, że ekstrakcja następujących amin biogennych: serotoniny, dopaminy, noradrenaliny, adrenaliny oraz ich aminokwasów prekursorowych: L-tryptofanu, L-tyrozyny, L-DOPA w moczu następuje poprzez:- aktywację fazy stałej polistyrenu-diwinylobenzenu (PS-DVB) pokrywającej złoża mikroekstrakcji do fazy stałej (SPME), która następuje za pomocą mieszaniny metanol: woda (50:50; v/v) - 30 minut; następnie płucze się przez 10 sekund wodą dejonizowaną;- wprowadzenie na złoże próbek moczu, zakwaszonych do pH 3 przy użyciu 6M HCl, zawierających badane anality, gdzie czas adsorpcji wynosi 90 minut;- przemycie wodą dejonizowaną poprzez zanurzenie złoża polistyrenu-diwunylobenzenu w 1 mL wody przez 10 sekund;- desorpcję analitów przez 90 minut za pomocą 1 mL roztworu metanolu zawierającego ciecz jonową w postaci tetrafluoroboranu 1-etylo-3-metyloimidazoliowego o stężeniu 20 ng/mL;- odparowanie odczynnika do desorpcji w urządzeniu do odparowywania próbek pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze 40°C;- rozpuszczenie suchej pozostałości w 50 μί buforu tetraboranu sodu 2mM;- analizę elektroforetyczną techniką micelarno-elektrokinetycznej chromatografii kapilarnej (MEKC) do identyfikacji wyizolowanych analitów.PL 235 062 Β1
- 2. Sposób izolacji według zastrz. 1, znamienny tym, że do analizy elektroforetycznej zastosowano bufor separacyjny w postaci mieszaniny 10 mM tertraboranu sodu, 30 mM SDS, 15% (v/v) metanolu oraz 25 mM a-cyklodekstryny.
- 3. Sposób izolacji według zastrz. 3, znamienny tym, że mieszaninę doprowadzono do pH 9,36 przy użyciu 1 M NaOH.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422788A PL235062B1 (pl) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Sposób izolacji amin biogennych z moczu |
| PCT/PL2018/000087 WO2019050420A1 (en) | 2017-09-08 | 2018-09-07 | NOVEL METHOD FOR ISOLATING BIOGENIC AMINES FROM BIOLOGICAL MATRICES |
| ES18789255T ES2975774T3 (es) | 2017-09-08 | 2018-09-07 | Método para el aislamiento de aminas biogénicas a partir de matrices biológicas |
| EP18789255.9A EP3679365B1 (en) | 2017-09-08 | 2018-09-07 | Method for the isolation of biogenic amines from biological matrices |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422788A PL235062B1 (pl) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Sposób izolacji amin biogennych z moczu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL422788A1 PL422788A1 (pl) | 2019-03-11 |
| PL235062B1 true PL235062B1 (pl) | 2020-05-18 |
Family
ID=63896608
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL422788A PL235062B1 (pl) | 2017-09-08 | 2017-09-08 | Sposób izolacji amin biogennych z moczu |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3679365B1 (pl) |
| ES (1) | ES2975774T3 (pl) |
| PL (1) | PL235062B1 (pl) |
| WO (1) | WO2019050420A1 (pl) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110441429A (zh) * | 2019-08-19 | 2019-11-12 | 福州大学 | 离子液体/poss复合涂层的制备及其在固相微萃取方面的应用 |
| CN111135809B (zh) * | 2020-02-18 | 2023-04-07 | 福州大学 | 一种自组装功能化氮掺杂碳纳米笼固相微萃取纤维的制备及应用 |
| CN111617750A (zh) * | 2020-04-20 | 2020-09-04 | 广东省测试分析研究所（中国广州分析测试中心） | 一种微孔聚合物聚多巴胺复合材料固相微萃取探针及其制备方法与应用 |
| CN113252823B (zh) * | 2021-06-15 | 2023-07-25 | 山西农业大学 | 一种基于环糊精的分散液液微萃取测定食品样品中农药残留的方法及试剂盒 |
-
2017
- 2017-09-08 PL PL422788A patent/PL235062B1/pl unknown
-
2018
- 2018-09-07 WO PCT/PL2018/000087 patent/WO2019050420A1/en not_active Ceased
- 2018-09-07 EP EP18789255.9A patent/EP3679365B1/en active Active
- 2018-09-07 ES ES18789255T patent/ES2975774T3/es active Active
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2975774T3 (es) | 2024-07-15 |
| WO2019050420A1 (en) | 2019-03-14 |
| EP3679365C0 (en) | 2024-01-17 |
| EP3679365A1 (en) | 2020-07-15 |
| EP3679365B1 (en) | 2024-01-17 |
| PL422788A1 (pl) | 2019-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Borecka et al. | A new approach for the estimation of expanded uncertainty of results of an analytical method developed for determining antibiotics in seawater using solid-phase extraction disks and liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry technique | |
| Inoue et al. | Determination of bisphenol A in human serum by high-performance liquid chromatography with multi-electrode electrochemical detection | |
| PL235062B1 (pl) | Sposób izolacji amin biogennych z moczu | |
| Colón et al. | Determination of methyl and ethyl esters of methanesulfonic, benzenesulfonic and p-toluenesulfonic acids in active pharmaceutical ingredients by solid-phase microextraction (SPME) coupled to GC/SIM-MS | |
| He et al. | Preparation and evaluation of molecularly imprinted solid-phase micro-extraction fibers for selective extraction of phthalates in an aqueous sample | |
| Barroso et al. | Role of microextraction sampling procedures in forensic toxicology | |
| Zhang et al. | Measurement of neurotransmitters from extracellular fluid in brain by in vivo microdialysis and chromatography–mass spectrometry | |
| Dabek-Zlotorzynska et al. | Determination of dimethylamine and other low-molecular-mass amines using capillary electrophoresis with laser-induced fluorescence detection | |
| Li et al. | Simultaneous determination of biogenic amines and estrogens in foodstuff by an improved HPLC method combining with fluorescence labeling | |
| JPWO2009133696A1 (ja) | 糖鎖標識方法 | |
| WO2009070233A1 (en) | Internal standards and methods for use in quantitatively measuring analytes in a sample | |
| Magiera et al. | Comparison of different sorbent materials for solid-phase extraction of selected drugs in human urine analyzed by UHPLC–UV | |
| Yan et al. | Chromatographic methods for the analysis of oligosaccharides in human milk | |
| CN109709255A (zh) | 人尿液中游离儿茶酚胺及其代谢物的高效液相色谱串联质谱检测方法 | |
| Sun et al. | Simultaneous analysis of two urinary biomarkers of oxidative damage to DNA and RNA based on packed-fiber solid phase extraction coupled with high-performance liquid chromatography | |
| US20170189902A1 (en) | Ready-to-constitute analytical platforms for chemical analyses and quantification | |
| Miękus et al. | Extraction and preconcentration of compounds from the l-tyrosine metabolic pathway prior to their micellar electrokinetic chromatography separation | |
| Deng et al. | Automated online solid-phase extraction-tandem mass spectrometry detection for simultaneous analysis of acidic and alkaline catecholamines and their metabolites in human urine | |
| Cháfer-Pericás et al. | Comparative study of the determination of trimethylamine in water and air by combining liquid chromatography and solid-phase microextraction with on-fiber derivatization | |
| EP4128321A1 (en) | Method for measuring or identifying a component of interest in specimens | |
| Sagrista et al. | Comparison of two extraction methods for the determination of selective serotonin reuptake inhibitors in sewage sludge by hollow fiber liquid‐phase microextraction | |
| Che et al. | Determination of parabens in domestic sewage by isotope-coded derivatization coupled with high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry | |
| WO2016040822A1 (en) | Ready-to-constitute analytical platforms for chemical analyses and quantification | |
| Ding et al. | Off-line elimination of carbohydrates for amino acid analysis of samples with high carbohydrate content by ion-exchange chromatography | |
| Herráez-Hernández et al. | Analysis of methylamine by solid-phase microextraction and HPLC after on-fibre derivatization with 9-fluorenylmethyl chloroformate |