PL235163B1 - Sekwencja nukleotydowa syntetycznego genu Cas9, kaseta kierująca sgRNA do edytowania genomu roślinnego i wydajny system do ukierunkowanej mutagenezy wybranego regionu genomu roślinnego - Google Patents

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia jest syntetyczny gen endonukleazy Cas9 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw.nr1. Zgłoszenie obejmuje także pustą kasetę kierująca sgRNA, oraz wypełnioną kasetę kierującą sgRNA. Ponadto przedmiotem zgłoszenia jest też zestaw do wytwarzania systemu Cas9/sgRNA oraz sposób edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sekwencja nukleotydowa syntetycznego genu Cas9, kaseta kierująca sgRNA do edytowania genomu roślinnego i wydajny system Cas9/sgRNA do ukierunkowanej mutagenezy wybranego regionu genomu roślinnego.

System CRISPR/Cas9 jest unikatowym narzędziem umożliwiającym wprowadzenie zmian sekwencji nukleotydowej w ściśle określonym regionie genomu (Jinek i in., 2012; Cong i in., 2013; Bortesi i in., 2015; Ma i in., 2015). Tak wprowadzone zmiany określane są również terminem edytowania genomu.

Wprowadzona zmiana / mutacja sekwencji nukleotydowej może w konsekwencji powodować: i) zmianę regulacji genu, ii) całkowite wyłączenie ekspresji, iii) zmiany sekwencji aminokwasów kodowanego białka, iv) zmiany sekwencji nukleotydowej regulatorowego RNA. Uzyskane zmiany są trwałe tzn. są przekazywane do roślin potomnych rozmnażanych generatywnie lub wegetatywnie i są nieodróżnialne od mutacji powstałej w sposób naturalny lub mutacji będącej efektem mutagenezy (Pan i in. 2016; Mao i in. 2017). Do edytowania genomu używa się bakteryjnego systemu CRISPR/Cas9, dlatego wydajność i precyzja tego procesu zależą od struktury modyfikowanego genomu. W przypadku rośliny modelowej Arabidopsis thaliana o małym genomie optymalizacja metody polegała m.in. na użyciu różnych promotorów do podniesienia ekspresji genu Cas9 (praca przeglądowa Mao i in. 2017). Innym sposobem było użycie sekwencji nukleotydowej Cas9 zawierającej zoptymalizowane sekwencje kodonów przystosowane do genomu zmienianej rośliny (Bortesi i Fischer, 2015). Wykazano również, że czynnikiem wpływającym na wydajność systemu może być stres temperaturowy (LeBlanc i in. 2018).

Technologia edytowania genów jest coraz szerzej stosowana zarówno w badaniach jak i do otrzymywania ulepszonych roślin użytkowych (Liu i in., 2017; Sun i in., 2016). Przydatność tej technologii jest szczególnie ważna w przypadku bardzo dużych i złożonych genomów zbóż, dla których uzyskanie i zidentyfikowanie mutacji w ściśle określonym locus przy użyciu metod mutagenezy konwencjonalnej jest praktycznie niemożliwe. Ponadto opisywana technologia pozwala generować określone mutacje bezpośrednio w zaawansowanym materiale hodowlanym lub w odmianach eliminując konieczność czasochłonnego i pracochłonnego wprowadzania mutacji do tych materiałów lub odmian w procesie krzyżowania roślin.

Celem wynalazku jest dostarczenie wydajnego, syntetycznego systemu CRISPR/Cas9, w dalszej części opisu określanego jako system Cas9/sgRNA, nadającego się do uzyskiwania mutacji w zdefiniowanym miejscu genomu roślinnego ze szczególnym uwzględnieniem roślin jednoliściennych w tym zbóż.

Nieoczekiwanie okazało się, że użycie nowo zaprojektowanej sekwencji genu Cas9 oraz sekwencja kasety sgRNA według wynalazku wraz z sekwencjami modyfikowanych genów w systemie Cas9/sgRNA umożliwia uzyskiwanie mutacji w tych genach z wysoką wydajnością. W zależności od zaproponowanej konstrukcji mutacje można uzyskać w jednym lub wielu genach natywnych jednocześnie.

Istota wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest syntetyczny gen endonukleazy Cas9 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 1.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest pusta kaseta kierująca sgRNA składająca się z:

a) promotora U6 posiadającego sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 2 oraz

b) sekwencji kodującej gRNA posiadającej sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 3 połączonych operacyjnie ze znajdującą się pomiędzy nimi

c) sekwencją kodującą miejsce do klonowania sekwencji komplementarnej do sekwencji edytowanej, korzystnie zawierającą sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny.

Korzystnie, sekwencja kodująca miejsce do klonowania sekwencji komplementarnej do sekwencji edytowanej zawiera dwa miejsce restrykcyjne Bsal służące do kierunkowego klonowania sekwencji komplementarnej do sekwencji edytowanej. Korzystnie, pusta kaseta kierująca sgRNA posiada sekwencję przedstawioną jako sekw. nr 4.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest wypełniona kaseta kierująca sgRNA składająca się z:

a) promotora U6 posiadającego sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 2 oraz

b) sekwencji kodującej gRNA posiadającej sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 3 połączonych operacyjnie ze znajdującą się pomiędzy nimi

PL235 163 Β1

c) sekwencją komplementarną do sekwencji edytowanej, korzystnie wklonowaną w dwa miejsca rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Bsal.

Korzystnie, wypełniona kaseta kierująca sgRNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że jako sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej:

a) sekwencję zawierającą 21 nukleotydową sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej docelowego genu (spacer), korzystnie w postaci dwuniciowego oligonukleotydu DNA o następującej strukturze:

5'-CTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5' gdzie N oznacza dowolnie wybrany nukleotyd,

b) sekwencję PTG (polycistronic tRNA/g RN A) o strukturze przedstawionej na Fig. 4 zawierającą kilka pojedynczych sekwencji zawierających 20 lub 21 nukleotydową sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej docelowego genu (spacerów) rozdzielonych krótkimi sekwencjami tRNA.

Korzystnie, wypełniona kaseta kierująca sgRNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera 21 nukleotydową sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej docelowego genu (spacer) wybraną spośród: sekw. nr 5-7.

Korzystnie, wypełniona kaseta kierująca sgRNA według wynalazku charakteryzuje się tym, że zawiera sekwencję PTG posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną, jako sekw. nr 8.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zestaw do wytwarzania systemu Cas9/sgRNA do edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia, charakteryzujący się tym, że zawiera syntetyczny gen endonukleazy Cas9 według wynalazku zdefiniowany powyżej oraz pustą kasetę kierującą sgRNA według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest system Cas9/sgRNA do edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia, charakteryzujący się tym, że zawiera syntetyczny gen endonukleazy Cas9 według wynalazku zdefiniowany powyżej oraz wypełnioną kasetę kierującą sgRNA według wynalazku zdefiniowaną powyżej.

Korzystnie, zestaw według wynalazku albo system według wynalazku ma postać wektora plazmidowego.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia, charakteryzujący się tym, że do komórki roślinnej wprowadza się system Cas9/sgRNA według wynalazku zdefiniowany powyżej, następnie izoluje się komórki, które uległy transformacji i odtwarza z nich rośliny transgeniczne.

Korzystnie, system Cas9/sgRNA wprowadza się do komórek niedojrzałych zarodków jęczmienia za pomocą Agrobacterium tumefaciens.

Wszystkie zastrzegane produkty są niewystępującymi w naturze, sztucznymi, izolowanymi cząsteczkami DNA lub ich kompozycjami.

W korzystnej realizacji wynalazku, sekwencja genu endonukleazy Cas9 jest przeznaczona do stosowania w roślinach, zwłaszcza w roślinach jednoliściennych, w szczególności w zbożach, i pozwala na wydajną translację i otrzymywanie aktywnego białka endonukleazy w komórkach roślinnych. Szczegółowy opis wynalazku

Przedmiotem zgłoszenia jest wydajny, syntetyczny system do uzyskiwania mutacji w zdefiniowanym miejscu genomu roślinnego. W skład tego systemu wchodzą: i) nowo zaprojektowana sekwencja nukleotydową syntetycznego genu Cas9 oraz ii) sekwencja kasety kierującej sgRNA.

Sekwencja nukleotydową Cas9 została zaprojektowana ze szczególnym uwzględnieniem jej wydajnej ekspresji i translacji w roślinach jednoliściennych (zbożach) i jest opisana w przykładzie 1.1. Zmodyfikowano w niej sekwencję kodonów, sygnał lokalizacji jądrowej (ang. nuclear localization signals NLSs) oraz wprowadzono sekwencję intronową.

Kaseta kierująca sgRNA zawiera DNA o sekwencji nukleotydowej komplementarnej do sgRNA (single guided RNA) i jest opisana w przykładzie 1.2.

Końcowy wektor z systemem Cas9/sgRNA zawierający obydwa składniki systemu: tj.: syntetyczny gen Cas9 oraz kasetę kierującą sgRNA został zbudowany w następujący sposób: sekwencja syntetycznego genu Cas9 została wbudowana do wektora pBract211 pomiędzy promotorem Ubił

PL 235 163 B1 a terminatorem nos a następnie, do tak wzbogaconego wektora, wbudowano, w miejscu restrykcyjnym Sphl, kasetę do klonowania Gateway uzyskując w ten sposób wektor tzw. Gateway Destination.

Jednocześnie w następujący sposób przygotowano drugi wektor tzw. Gateway Entry: do zlinearyzowanego wektora pCR8/GW/TOPO wbudowano DNA komplementarne do sgRNA z fragmentem zawierającym dwa miejsca restrykcyjne Bsal pozwalające na kierunkowe wbudowanie sekwencji tzw. spacera, co w efekcie pozwalało uzyskać kompletną kasetę sgRNA.

Obydwa wektory tzn. Gateway Destination i Gateway Entry z kompletną kasetą kierującą sgRNA zostały poddane procesowi rekombinacji Gateway uzyskując w efekcie wektor z systemem Cas9/sgRNA.

Weryfikację skuteczności systemu przeprowadzono w następujących dwóch seriach eksperymentów.

I seria: weryfikacja skuteczności kasety do edytowania przeprowadzona dla dwóch natywnych genów jęczmienia: HvCKX1 i Nud (przykład 2).

Do sprawdzenia skuteczności systemu Cas9/sgRNA skonstruowano wektor w którym, kompletna kaseta kierująca sgRNA zawierała sgRNA z sekwencją tzw. spacera komplementarną do wybranego 21-nukleotydowego fragmentu genu jęczmienia HvCKX1 lub Nud. Wektor ten został użyty do transformacji genetycznej niedojrzałych zarodków jęczmienia za pomocą Agrobacterium tumefaciens.

II seria: sprawdzenie skuteczności jednoczesnego edytowania dwóch genów. W tym celu skonstruowano wektor z kasetą kierującą sgRNA, która zawierała sgRNA z jednocześnie dwoma sekwencjami spacerów, takimi, że sekwencja pierwszego spacera była komplementarna do wybranego 21-nukleotydowego fragmentu genu jęczmienia HvCKX1 a sekwencja drugiego spacera była komplementarna do wybranego 21-nukleotydowego fragmentu genu jęczmienia HvCKX1. Sekwencje sgRNA wraz ze spacerami rozdzielone były krótkimi sekwencjami tRNA-Gly pochodzącymi z jęczmienia. Wektor ten został użyty do transformacji genetycznej niedojrzałych zarodków jęczmienia za pomocą Agrobacterium tumefaciens.

Wyniki

W niezależnych eksperymentach I serii uzyskano około 100 roślin transgenicznych z niezależnych zdarzeń transformacyjnych (przykład 2.1). Udokumentowano, że zdarzenia mutacyjne w przypadku zastosowanego rozwiązania zachodziły z bardzo wysoką częstotliwością; dla genu HvCKX1 wystąpiły w 66% transgenicznych roślin a w przypadku genu Nud w 64% transgenicznych roślin (przykład 2.2). Ponadto udokumentowano, że prawie wszystkie tak zaindukowane zmiany sekwencji / mutacje są stabilnie przekazywane do następnych pokoleń generatywnych (przykład 2.3). W II serii eksperymentów udokumentowano skuteczność zastosowanej kasety kierującej sgRNA w jednoczesnym indukowaniu zdarzeń mutacyjnych w dwóch różnych genach: HvCKX1 i HvCKX3. Uzyskano ponad 70 roślin transgenicznych z niezależnych zdarzeń transformacyjnych, spośród których 9 posiadało mutację zarówno w genie HvCKX1 jak i HvCKX3.

P r z y k ł a d 1. System Cas9/sgRNA do edytowania genomu rośliny jednoliściennej i jego elementy składowe

W opisanym przykładzie wykonania zaprojektowany system Cas9/sgRNA do edytowania genomu rośliny jednoliściennej składa się z syntetycznej sekwencji genu endonukleazy Cas9, sekwencji kierującej sgRNA (single guided RNA) oraz dodatkowo sekwencji wektora pBract211, w tym m.in. sekwencji prawej i lewej granicy T-DNA warunkującej integrację T-DNA w genomie roślinnym oraz sekwencji promotorów i terminatorów warunkujących ekspresję kasety w komórkach roślin jednoliściennych.

Uzyskano wektory plazmidowe stanowiące przykładowe realizacje systemu Cas9/sgRNA przeznaczone do edytowania wybranych genów jęczmienia (tj. genu HvCKX1, genu Nud oraz jednocześnie genów HvCKX1 i HvCKX3).

Wektor plazmidowy stanowiący przykład realizacji systemu Cas9/sgRNA do edytowania genu HvCKX1 został schematycznie przedstawiony na Fig. 1, a jego sekwencja zaprezentowana jako Sekw. Nr 9.

Analogiczny wektor plazmidowy stanowiący przykład realizacji systemu Cas9/sgRNA do edytowania genu Nud został schematycznie przedstawiony na Fig. 1, a jego sekwencja zaprezentowana jako Sekw. Nr 10.

Wektor plazmidowy stanowiący przykład realizacji systemu Cas9/sgRNA do jednoczesnego edytowania genów HvCKX1 i HvCKX3 został schematycznie przedstawiony na Fig. 2, a jego sekwencja zaprezentowana, jako Sekw. Nr 11.

PL235 163 Β1

1.1. Otrzymanie sekwencji nukleotydowej syntetycznego genu endonukleazy Cas9

Syntetyczny gen Cas9 został uzyskany w oparciu o natywne sekwencje białek endonukleaz Cas9, w tym Cas9 z bakterii Streptococcus pyogenes. Dobór kodonów został zoptymalizowany do wydajnej translacji w komórkach roślin jednoliściennych. Region końca 5’ został wzbogacony o sekwencję intronu pochodzącego z Arabidopsis thaliana oraz sygnał lokalizacji jądrowej. Sekwencja nr 1 przedstawia sekwencję nukleotydową genu Cas9 według wynalazku.

1.2. Otrzymanie sekwencji nukleotydowej kasety sgRNA

Kaseta kierująca sgRNA jest elementem systemu CRISPR, odpowiedzialnym za nakierowanie endonukleazy Cas9 do określonej sekwencji DNA w genomie edytowanej rośliny.

Kaseta ta składa się z: i) promotora genu U6RNA pochodzącego z pszenicy (Triticum aesń'vu/77)[1], ii) fragmentu z miejscami restrykcyjnymi Bsal umożliwiającymi kierunkowe wbudowanie 20-21 nukleotydowej sekwencji DNA komplementarnej do edytowanego genu (tzw. spacera) w układzie pojedynczym lub zwielokrotnionym (policistronowym) oraz iii) sekwencji gRNA (guided RNA).

Sekwencję kasety kierującej sgRNA (sekw. nr 4) przedstawiono na Fig. 3; pojedynczym podkreśleniem (sekw. nr 2) zaznaczono sekwencję promotora U6, bez podkreśleń przedstawiono fragment z dwoma miejscami restrykcyjnymi Bsal do kierunkowego wbudowania sekwencji spacera za pomocą enzymu restrykcyjnego Bsal (miejsca restrykcyjne Bsal wytłuszczono), podwójnym podkreśleniem (sekw. nr 3) oznaczono sekwencję gRNA.

Po umieszczeniu kasety sgRNA w wektorze Gateway Entry i rozcięciu enzymem Bsal, możliwe jest wstawienie:

i) dowolnej, pojedynczej sekwencji DNA docelowej edytowanego genu (spacera) w postaci dwuniciowego oligonukleotydu DNA o następującej strukturze:

5' -CTTGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5' gdzie N oznacza dowolnie wybrany nukleotyd, ii) kilku pojedynczych sekwencji docelowych edytowanych genów {spacerów), rozdzielonych krótkimi sekwencjami tRNA (PTG - polycistronic tRNA/gRNA) o strukturze przedstawionej na Fig. 4.

Przygotowano dwie pojedyncze kasety sgRNA dla dwóch genów jęczmienia: HvCKX1 i Nud oraz jedną kasetę z fragmentem PTG do jednoczesnego edytowania genów HvCKX1 i HvCKX3. Dla genów tych zastosowano następujące sekwencje docelowe:

HvCKXl 5'-GATCACCGCGGCGTCTCCTA-3' (sekw. nr 5)

HvCKX3 5'-GCAAGTTCATCCAGAGCCCCA-3' (sekw. nr 6)

Nud 5'-GTTGGGCACCTTTGAGACGG-3' (sekw. nr 7)

Na Fig. 5 przedstawiono sekwencję fragmentu PTG (sekw. nr 8) z wyszczególnionymi spacerami (bez podkreśleń), fragmentami tRNA (pojedyncze podkreślenie) oraz gRNA (podwójne podkreślenie):

1.3. Otrzymanie wektora binarnego z systemem Cas9/sgRNA do transformacji genetycznej roślin jednoliściennych.

Syntetyczny gen Cas9 umieszczono w wektorze binarnym pBract211, przeznaczonym do tranformacji genetycznej roślin jednoliściennych. Następnie wektor ten, poprzez wstawienie odpowiedniej sekwencji (tzw. kasety Gateway), przystosowano do klonowania w systemie Gateway. Gotowa kaseta kierująca sgRNA umieszczana jest bezpośrednio za terminatorem nos syntetycznego genu Cas9 w miejscu przeznaczonym do klonowania Gateway.

Schemat wektora pBract211 z systemem Cas9/sgRNA przedstawiono na Fig. 6, na którym zaprezentowano schemat wektora pBract211 zawierającego syntetyczny gen Cas9 i kasetę do klonowania Gateway (kaseta GW) (A), a także schemat kompletnej kasety z systemem Cas9/sgRNA składającej się z i) promotora Ubi, syntetycznego genu Cas9 i terminatora nos oraz ii) kasety kierującej sgRNA (B).

Przykład 2. Weryfikacja skuteczności kasety do edytowania genów u roślin 2.1.

2.1. Uzyskanie roślin transgenicznych

Ocenę skuteczności systemu Cas9/sgRNA w wydajności indukowania ukierunkowanych mutacji przeprowadzono w oparciu o rośliny jęczmienia. W tym celu wektor pBract211 zawierający odpowiedni

PL235 163 Β1 system Cas9/sgRNA został użyty do transformacji genetycznej niedojrzałych zarodków jęczmienia za pomocą Agrobacterium tumefaciens. Przeprowadzono trzy niezależne eksperymenty transformacji genetycznej przy użyciu trzech różnych kaset kierujących sgRNA, jednej dla genu HvCKX1 (ckx1-sgRNA), drugiej dla genu Nud (nud-sgRNA) oraz trzeciej do jednoczesnego edytowania genów HvCKX1 i HvCKX3 (PTG-ckx1-3) W wyniku przeprowadzonej transformacji uzyskano 71 roślin transgenicznych zawierających kasetę ckx1-sgRNA, 28 roślin zawierających kasetę nud-sgRNA i 72 rośliny zawierające kasetę PTG-ckx1-3. Wszystkie rośliny transgeniczne w trzech eksperymentach powstały w wyniku niezależnych zdarzeń transformacyjnych.

2.2. Detekcja mutacji indukowanych przez system Cas9/sgRNA

Mutacje indukowane w genach jęczmienia przez system Cas9/sgRNA identyfikowano na drodze reakcji PCR połączonej z analizą restrykcyjną. Dodatkowo, obecność mutacji weryfikowano poprzez sekwencjonowanie sklonowanych fragmentów DNA genomowego, obejmujących edytowaną sekwencję. Obecność mutacji w genie HvCKX1 zaobserwowano u 47 spośród 71 testowanych roślin transgenicznych, natomiast mutacje w genie Nud zaobserwowano u 18 spośród 28 testowanych roślin transgenicznych. W obu eksperymentach, skuteczność systemu Cas9/sgRNA była zatem na poziomie powyżej 60% (tabela 1).

Tabela 1. Wyniki transformacji genetycznej jęczmienia przy użyciu trzech różnych kaset kierujących sgRNA

Kaseta kierująca sgRNA 9	Liczba transformowanych zarodków	Liczba zdarzeń transformacyjnych	Liczba roślin transgenicznych	Liczba zmutowanych roślin (%)
ckxl-sgRNA	1143	137	71	47 (66%)
nud-sgRNA	1209	96	28	18 (64%)
PTG-ckxl-3	1320	142	72	9 (12,5%)1

'Liczba roślin posiadających mutacje zarówno w genie HvCKXl jak i HvCKX3.

2.3. Analiza dziedziczenia mutacji indukowanych przez system Cas9/sgRNA

Dziedziczenie mutacji indukowanych przez system Cas9/sgRNA badano w pierwszym pokoleniu generatywnym roślin transgenicznych. Do analizy wybrano 20 linii T1, których rośliny mateczne posiadały mutację w genie HvCKX1. Z każdej linii testowano po 10 roślin, pod kątem obecności mutacji. Dziedziczenie mutacji w genie HvCKX1 zaobserwowano u 93 roślin (47%) w 18 liniach T1.

Literatura:

Bortesi, L. and Fischer, R. (2015) The CRISPR/Cas9 system for plant genome editing and beyond. Biotechnol. Adv. 33(1), 41-52.

Cong, L., Ran, F.A., Cox, D. et al. (2013) Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science, 339(6121), 819-823.

Jinek, M., Chyliński, K., Fonfara, I., Hauer, M., Doudna, J.A. and Charpentier, E. (2012) A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science, 337(6096), 816-821. LeBlanc, Ch., Zhang F., Mendez J., Lozano Y., Chatpar K., Irish V.F., and Jacob Y. (2018) Increased efficiency of targeted mutagenesis by CRISPR/Cas9 in plants using heat stress. Plant J. 93: 377-386. Liu, H„ Ding, Y.D., Zhou, Y.Q., Jin, W.Q„ Xie, K.B. and Chen, L.L. (2017) CRISPR-P 2.0: an improved CRISPR-Cas9 tool for genome editing in plants. Mol. Plant, 10, 530-532.

Ma, X., Zhang, Q., Zhu, Q., Liu, W., Chen, Y., Qiu, R., et al. (2015). A Robust CRISPR/Cas9 system for convenient, high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants. Mol. Plant 8, 12741284. doi: 10.1016/j.molp.2015.04.007.

Mao, Y., Botella, J.R. and Zhu, J.K. (2017) Heritability of targeted gene modifications induced by plantoptimized CRISPR systems. Cell. Mol. Life Sei. 74(6), 1075-1093.

Pan, C., Ye, L., Qin, L., Liu, X., He, Y., Wang, J., et al. (2016). CRISPR/Cas9mediated efficient and heritable targeted mutagenesis in tomato plants in the first and later generations. Sci. Rep. 6:24765. doi: 10.1038/srep24765.

Shan Q, Wang Y, Li J, Zhang Y, Chen K, Liang Z, Zhang K, Liu J, Xi JJ, Qiu JL etal. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system. Naturę Biotechnology 2013, 31(8):686-688. Sun, Y.W., Li, J.Y. and Xia, L.Q. (2016) Precise genome modification via sequence-specific nucleasesmediated gene targeting for crop improvement. Front. Plant Sci. 7, 1928.

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt

SEQUENCE LISTING <110> Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin - Państwowy

Instytut Badawczy

Uniwersytet Warszawski <12Θ> Sekwencja nukleotydowa syntetycznego genu Cas9_, kaseta kierująca sgRNA do edytowania genomu roślinnego i wydajny system do ukierunkowanej mutagenezy wybranego regionu genomu roślinnego <130> PK/5270/RW <160> 11 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 4464 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> Syntetyczny gen endonukleazy Cas9 <400> 1

cccgggatcc	gccatggccc	cgaagaagaa	gaggaaggtg	ggcatggaca	agaagtactc	60
catcggcctg	gacatcggga	ccaactctgt	aggctgggcg	gtgatcacgg	acgagtataa	12Θ
ggtgccctcg	aagaagttca	aggtcctggg	aaacaccgac	cgtcacagca	tcaagaagaa	180
cctgataggg	gccctcctgt	tcgactcagg	taaatttctg	tgttccttat	tctctcaaaa	240
tcttcgattt	tgttttcgtt	cgatcccaat	ttcgtatatg	ttctttggtt	tagattctgt	3Θ0
taatcttaga	tcgaagacga	ttttctgggt	ttgatcgtta	gatatcatct	taattctcga	360
ttagggtttc	atagatatca	tccgatttgt	tcaaataatt	tgagttttgt	cgaataatta	420
ctcttcgatt	tgtgatttct	atctagatct	ggtgttagtt	tctagtttgt	gcgatcgaat	480
ttgtcgatta	atctgagttt	ttctgattaa	caggtgagac	tgctgaggcg	accaggctga	540
agcgtactgc	aagaagacgt	tacacgaggc	ggaagaacag	gatctgctac	ctccaagaga	6ΘΘ
tcttcagcaa	cgagatggcg	aaggtcgacg	actcgttctt	ccaccgtctc	gaggagagct	660
tcctggtcga	ggaagacaag	aagcacgaga	ggcacccgat	cttcgggaac	atcgtggacg	720
aagtggcgta	ccacgagaag	taccccacaa	tctaccacct	ccggaagaag	ctggttgact	780
ccactgacaa	ggctgacctg	cgtctcatct	acctggccct Strona	cgcccacatg 1	atcaagttca	840

PL235 163 Β1 ggggtcactt cctcatagag ggggacctga tcatccagct ggtgcaaacc tacaaccagc gagttgacgc caaggctatc ctgtctgcta taatcgctca gcttccgggg gagaagaaga gtctgggcct gaccccgaac ttcaaaagca agctgtcaaa ggacacatac gacgacgacc agtacgccga cctctttctg gcagctaaga tcctccgagt caacactgag atcaccaagg acgacgagca ccaccaggac ctgactctcc agaagtacaa ggagatcttc ttcgaccagt gcggggcttc tcaagaggag ttctacaagt gcaccgagga gctgctcgtt aagttgaaca ttgataacgg gtcgatcccg caccagatcc gccaagagga cttctacccc ttcctcaagg cattccgaat cccgtactac gtcgggcctc tgacccgcaa gtcggaggag actatcacac gcgcatctgc ccagagtttc atcgagagga agaaggtgct cccgaagcac tctctgctct cgaaggtcaa gtacgtgacc gagggtatgc agaaggccat cgtcgatctc ctgttcaaga aggaggacta cttcaagaag atcgagtgct acaggttcaa cgcaagcctg gggacctacc acttcctcga caacgaggag aatgaggaca tcttcgagga ccgcgagatg atcgaggagc acaaggtgat gaagcaactg aagaggcgca agctgatcaa cggcatcagg gacaagcaga

SEQLTXT.txt accctgacaa tagcgacgtc gacaagctgt tcttcgagga gaaccccatc aacgctagtg ggctgtccaa aagccgacgc ttggagaact acggactctt cgggaacctg attgccctga acttcgacct cgccgaggac gcgaaactcc tggacaacct gttagcacag atcggggacc acctgtctga cgccatcctc ctgtccgaca ccccactgag cgcctctatg ataaaacgct tgaaggctct cgtacgtcag cagctgcctg cgaagaacgg ctacgccggg tacattgatg tcatcaagcc catcctcgag aagatggacg gagaggacct gctccgaaag cagaggacct atctcggtga gctccatgct atcctgcgac acaaccgcga gaagattgag aagatcctga ttgcaagggg caacagccgg ttcgcttgga cctggaactt tgaggaggtc gtggacaagg tgaccaactt cgataagaac ctcccgaacg acgagtactt caccgtgtac aacgagctga ggaagcctgc gttcctgagc ggggagcaaa ccaaccgcaa ggtgaccgtc aagcagctca tcgactccgt cgagatctcg ggcgttgagg atgacctgct caagattatc aaggacaagg ttctagagga catcgtgctc acgctgaccc gcctcaagac ctacgcccac ctcttcgacg ggtatactgg atgggggagg ctctcaagga gcggcaagac gatcctcgac ttcctgaagt

90Θ

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

18Θ0

1860

1920

1980

2040

2100

2160

2220

2280

2340

2400

Strona 2

PL235 163 Β1 ctgacggctt cgctaaccgc aacttcatgc aggaagacat ccagaaggcg caggtaagcg ctaacctcgc cggctccccc gcaatcaaaa acgagctggt taaagtgatg ggcaggcaca gcgagaatca gacgactcag aagggccaga aggagggtat caaggaactc ggcagccaga agctccagaa tgagaagctg tacctctact accaagagct ggacatcaac aggctgtccg gtttcctcaa ggacgactcg atcgacaaca gcaagtctga caacgtgcca agcgaggagg agctcctgaa cgccaagctc atcacccagc gaggaggcct gtcggagctt gataaggcgg ggcagatcac gaagcacgtg gcgcagatcc agaacgacaa gctcatccgc gaggtgaagg acttccgcaa ggatttccag ttctacaagg acgacgccta cctgaacgcg gtagttggca agagcgagtt cgtgtacggc gactacaagg cggagcagga gatcggcaag gcgaccgcca tcttcaagac cgagatcacg ctggccaacg ctaatggtga gactggcgag atcgtgtggg aggttctgag tatgcctcag gtgaacatcg tcagcaagga gtcaatcctc ccgaagagga actgggaccc aaagaagtac ggcgggttcg tggtggcgaa ggtcgagaag ggtaagtcca gcatcaccat catggagcgg tccagcttcg agggctataa ggaggtcaag aaggacctca

SEQLTXT.txt agctcatcca cgacgactcg ctcacgttca gccagggtga ttctctgcat gagcatatcg agggaatcct ccagaccgtc aaggtcgtgg agcctgagaa catcgtgatc gagatggcgc agaactcgcg cgagcgcatg aagagaattg tcctcaagga gcacccagtt gagaacaccc acctgcagaa cggcagggac atgtacgtgg actacgacgt tgaccatatc gtgccccaaa aggtgctcac gaggtccgac aagaaccgcg tcgtgaagaa gatgaagaac tactggcggc gcaagttcga caacttgaca aaggcagaga gcttcattaa gaggcagctc gtcgagacta tggatagcag gatgaacacg aagtacgacg tcatcaccct caagtccaag ctggtgagcg tccgcgagat caacaactac caccacgccc cggccctcat caagaagtac cctaagctcg tgtacgacgt gcgcaagatg atcgcgaagt agtacttctt ctacagcaac atcatgaact gcgagatcag aaagaggccg ctcattgaga ataagggaag ggacftcgcg actgtgcgca tcaagaagac cgaggtccag accggcggct acagcgataa gctgattgcg aggaagaagg atagcccaac cgtggcttac agtgtgctgg agaagctcaa gtccgtgaag gagctgctcg agaagaaccc aatcgacttc ctcgaggcca tcatcaagct gccaaagtac tccctgttcg

Strona 3

246Θ

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

330Θ

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt agcttgagaa cggccgcaag aggatgctcg cttctgcagg agagttgcag aaaggcaacg 4020 agcttgcgct cccgtccaag tacgtcaact tcctgtacct cgccagccac tacgagaagc 4080 tg^agggctc tccagaggac aatgagcaga agcagctatt cgtcgagcag cacaagcact 4140 acctggacga gatcatcgag cagatcagcg agttcagcaa gagggtgatc ctcgccgacg 420Θ cgaacctgga taaggtgctc tccgcctaca acaagcaccg cgacaagcca attcgcgaac 4260 aggccgaaaa cattatacac ctgtttacgc tcacaaacct gggtgcgcca gcagccttca 4320 agtacttcga taccaccatc gaccgcaagc ggtacacctc cactaaggag gtgctcgacg 4380 cgaccctgat ccaccagtct atcaccggtc tctacgaaac aaggatcgac ctgtctcagc 4440 tcggaggtga ttgagctcac tagt 4464 <210> 2 <211> 363 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> promotor U6 <400> 2

gaccaagccc	gttattctga	cagttctggt	gctcaacaca	tttatattta	tcaaggagca	60
cattgttact	cactgctagg	agggaatcga	actaggaata	ttgatcagag	gaactacgag	120
agagctgaag	ataactgccc	tctagctctc	actgatctgg	gtcgcatagt	gagatgcagc	180
ccacgtgagt	tcagcaacgg	tctagcgctg	ggcttttagg	cccgcatgat	cgggcttttg	240
tcgggtggtc	gacgtgttca	cgattgggga	gagcaacgca	gcagttcctc	ttagtttagt	300
cccacctcgc	ctgtccagca	gagttctgac	cggtttataa	actcgcttgc	tgcatcagac	360
ttg						363

<210> 3 <211> 83 <212> DNA <213> artificial <22Θ>

<223> sekwencja kodująca gRNA

Strona 4

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt <400> 3 gttttagagc tagaaatagc aagttaaaat aaggctagtc cgttatcaac ttgaaaaagt ggcaccgagt cggtgctttt ttt 83 <210> 4 <211> 467 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> Kaseta sgRNA <400> 4 gaccaagccc gttattctga cagttctggt gctcaacaca tttatattta tcaaggagca 60 cattgttact cactgctagg agggaatcga actaggaata ttgatcagag gaactacgag 120 agagctgaag ataactgccc tctagctctc actgatctgg gtcgcatagt gagatgcagc 180 ccacgtgagt tcagcaacgg tctagcgctg ggcttttagg cccgcatgat cgggcttttg 240 tcgggtggtc gacgtgttca cgattgggga gagcaacgca gcagttcctc ttagtttagt 300 cccacctcgc ctgtccagca gagttctgac cggtttataa actcgcttgc tgcatcagac 360 ttgcgagacc aacacaaggt ctccgtttta gagctagaaa tagcaagtta aaataaggct 420 agtccgttat caacttgaaa aagtggcacc gagtcggtgc ttttttt 467 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> HvCKXl <400> 5 gatcaccgcg gcgtctccta <210>

<211>

<212>

<213>

<220>

<223>

DNA artificial

HvCKX3

Strona 5

PL235 163 Β1 <400> 6 gcaagttcat ccagagcccc a

SEQLTXT.txt <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> Nud <400> 7 gttgggcacc tttgagacgg <210> 8 <211> 356 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> PTG <400> 8 caacaaagcg catctggtgt agtggtatca tagtaccctc ccacggtact gaccagggtt 60 cgattccctg gatgcgcaga tcaccgcggc gtctcctagt tttagagcta gaaatagcaa 12Θ gttaaaataa ggctagtccg ttatcaactt gaaaaagtgg caccgagtcg gtgccaacaa 18Θ agcgcatctg gtgtagtggt atcatagtac cctcccacgg tactgaccag ggttcgattc 240 cctggatgcg cagcaagttc atccagagcc ccagttttag agctagaaat agcaagttaa 308 aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa agtggcaccg agtcggtgct tttttt 356 <210> 9 <211> 11887 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> System Cas9/sgRNA do edytowania genu HvCKXl <400> 9 tttttatccc cggaagcctg tggatagagg gtagttatcc acgtgaaacc gctaatgccc60 cgcaaagcct tgattcacgg ggctttccgg cccgctccaa aaactatcca cgtgaaatcg120 ctaatcaggg tacgtgaaat cgctaatcgg agtacgtgaa atcgctaata aggtcacgtg180

Strona 6

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt aaatcgctaa tcaaaaaggc acgtgagaac gctaatagcc ctttcagatc aacagcttgc246 aaacacccct cgctccggca agtagttaca gcaagtagta tgttcaatta gcttttcaat30® tatgaatata tatatcaatt attggtcgcc cttggcttgt ggacaatgcg ctacgcgcac360 cggctccgcc cgtggacaac cgcaagcggt tgcccaccgt cgagcgccag cgcctttgcc42© cacaacccgg cggccggccg caacagatcg ttttataaat tttttttttt gaaaaagaaa48Θ aagcccgaaa ggcggcaacc tctcgggctt ctggatttcc gatccccgga attagatctt540 ggcaggatat attgtggtgt aacgtatcac aagtttgtac aaaaaagcag gctccgcggc660 cgcccccttc acctagactc gacgcgtcct agagatccgt caacatggtg gagcacgaca660 ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga72Θ cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc780 acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata840 aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac900 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt96Θ gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc1020 cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac gaccccgata tgaaaaagcc1080 tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga1140 cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg12ΘΘ tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta1260 tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag1320 cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc1380 tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcaggt aaatttctag tttttctcct tcattttctt1440 ggttaggacc cttttctctt tttatttttt tgagctttga tctttcttta aactgatcta1500 tWrttaatt gattggttat ggtgtaaata ttacatagct ttaactgata atctgattac1560 tttatttcgt gtgtctatga tgatgatgat aactgcagcc ggtcgcggag gccatggatg162© cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa168© tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc174©

Strona 7

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc 18ΘΘ tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct 186Θ ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga 1920 tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt 1980 gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc 2Θ4Θ ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg 2100 gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag 2160 ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct 2220 gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg 2280 aatagagtag atgccgaccg ggatccggag agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt 2340 tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 24Θ0 tttctgttga attacgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 2460 agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 252Θ atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 2580 gaattcatcg atgatatcag atcaagggtg ggcgcgccga accagctttc ttgtacaaag 2640 tggtgatccc cctcgaatcg aattccgtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 2700 ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 2760 gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 2820 taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 2880 catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 294Θ tgtgcatgtg ttctcctrtt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 3000 ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 3060 acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 3120 ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 3180 taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 3240 cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 330Θ

Strona 8

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg336Θ agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga3420 gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc acggcagcta3480 cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag3540 acaccccctc cacaccctct ttccccaacc tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa3600 ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc3660 cccccccccc cctctctacc ttctctagat cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt3720 agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag3780 cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt3840 ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga3900 ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc3960 gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg4Θ20 gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg tttcaaacta cctggtggat4Θ8Θ ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg4140 atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat42Θ0 atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc4260 attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg4320 gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc4380 gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata444Θ tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg45Θ0 ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg4560 gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga4620 tgctcaccct gttgtttggt gttacttcgc cccccgggat ccgccatggc cccgaagaag4680 aagaggaagg tgggcatgga caagaagtac tccatcggcc tggacatcgg gaccaactct4740 gtaggctggg cggtgatcac ggacgagtat aaggtgccct cgaagaagtt caaggtcctg48O0 ggaaacaccg accgtcacag catcaagaag aacctgatag gggccctcct gttcgactca4860

Strona 9

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt ggtaaatttc tgtgttcctt attctctcaa aatcttcgat tttgttttcg ttcgatccca 4920 atttcgtata tgttctttgg tttagattct gttaatctta gatcgaagac gattttctgg 4980 gtttgatcgt tagatatcat cttaattctc gattagggtt tcatagatat catccgattt 5040 gttcaaataa tttgagtttt gtcgaataat tactcttcga tttgtgattt ctatctagat 5100 ctggtgttag tttctagttt gtgcgatcga atttgtcgat taatctgagt ttttctgatt 5160 aacaggtgag actgctgagg cgaccaggct gaagcgtact gcaagaagac gttacacgag 5220 gcggaagaac aggatctgct acctccaaga gatcttcagc aacgagatgg cgaaggtcga 5280 cgactcgttc ttccaccgtc tcgaggagag cttcctggtc gaggaagaca agaagcacga 5340 gaggcacccg atcttcggga acatcgtgga cgaagtggcg taccacgaga agtaccccac 5400 aatctaccac ctccggaaga agctggttga ctccactgac aaggctgacc tgcgtctcat 5460 ctacctggcc ctcgcccaca tgatcaagtt caggggtcac ttcctcatag agggggacct 5520 gaaccctgac aatagcgacg tcgacaagct gttcatccag ctggtgcaaa cctacaacca 558Θ gctcttcgag gagaacccca tcaacgctag tggagttgac gccaaggcta tcctgtctgc 5640 taggctgtcc aaaagccgac gcttggagaa cttaatcgct cagcttccgg gggagaagaa 5700 gaacggactc ttcgggaacc tgattgccct gagtctgggc ctgaccccga acttcaaaag 5760 caacttcgac ctcgccgagg acgcgaaact ccagctgtca aaggacacat acgacgacga 5820 cctggacaac ctgttagcac agatcgggga ccagtacgcc gacctctttc tggcagctaa 5880 gaacctgtct gacgccatcc tcctgtccga catcctccga gtcaacactg agatcaccaa 594Θ ggccccactg agcgcctcta tgataaaacg ctacgacgag caccaccagg acctgactct 60ΘΘ cctgaaggct ctcgtacgtc agcagctgcc tgagaagtac aaggagatct tcttcgacca 6060 gtcgaagaac ggctacgccg ggtacattga tggcggggct tctcaagagg agttctacaa 6120 gttcatcaag cccatcctcg agaagatgga cggcaccgag gagctgctcg ttaagttgaa 6180 cagagaggac ctgctccgaa agcagaggac ctttgataac gggtcgatcc cgcaccagat 6240 ccatctcggt gagctccatg ctatcctgcg acgccaagag gacttctacc ccttcctcaa 63Θ0 ggacaaccgc gagaagattg agaagatcct gacattccga atcccgtact acgtcgggcc 6360 tcttgcaagg ggcaacagcc ggttcgcttg gatgacccgc aagtcggagg agactatcac 6420

Strona 10

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt accctggaac tttgaggagg tcgtggacaa gggcgcatct gcccagagtt tcatcgagag 6480 gatgaccaac ttcgataaga acctcccgaa cgagaaggtg ctcccgaagc actctctgct 6540 ctacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gacgaaggtc aagtacgtga ccgagggtat 6600 gcggaagcct gcgttcctga gcggggagca aaagaaggcc atcgtcgatc tcctgttcaa 6660 gaccaaccgc aaggtgaccg tcaagcagct caaggaggac tacttcaaga agatcgagtg 6720 cttcgactcc gtcgagatct cgggcgttga ggacaggttc aacgcaagcc tggggaccta 6780 ccatgacctg ctcaagatta tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg agaatgagga 6840 cattctagag gacatcgtgc tcacgctgac cctcttcgag gaccgcgaga tgatcgagga 6900 gcgcctcaag acctacgccc acctcttcga cgacaaggtg atgaagcaac tgaagaggcg 6960 caggtatact ggatggggga ggctctcaag gaagctgatc aacggcatca gggacaagca 7020 gagcggcaag acgatcctcg acttcctgaa gtctgacggc ttcgctaacc gcaacttcat 7Θ80 gcagctcatc cacgacgact cgctcacgtt caaggaagac atccagaagg cgcaggtaag 714Θ cggccagggt gattctctgc atgagcatat cgctaacctc gccggctccc ccgcaatcaa 720Θ aaagggaatc ctccagaccg tcaaggtcgt ggacgagctg gttaaagtga tgggcaggca 7260 caagcctgag aacatcgtga tcgagatggc gcgcgagaat cagacgactc agaagggcca 7320 gaagaactcg cgcgagcgca tgaagagaat tgaggagggt atcaaggaac tcggcagcca 7380 gatcctcaag gagcacccag ttgagaacac ccagctccag aatgagaagc tgtacctcta 7440 ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt ggaccaagag ctggacatca acaggctgtc 7500 cgactacgac gttgaccata tcgtgcccca aagtttcctc aaggacgact cgatcgacaa 7560 caaggtgctc acgaggtccg acaagaaccg cggcaagtct gacaacgtgc caagcgagga 762Θ ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg gcagctcctg aacgccaagc tcatcaccca 768Θ gcgcaagttc gacaacttga caaaggcaga gagaggaggc ctgtcggagc ttgataaggc 774© gggcttcatt aagaggcagc tcgtcgagac taggcagatc acgaagcacg tggcgcagat 7800 cctggatagc aggatgaaca cgaagtacga cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtgaa 7860 ggtcatcacc ctcaagtcca agctggtgag cgacttccgc aaggatttcc agttctacaa 7920 ggtccgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg cggtagttgg 7980

Strona 11

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cacggccctc atcaagaagt accctaagct ggtgtacgac gtgcgcaaga tgatcgcgaa caagtacttc ttctacagca acatcatgaa cggcgagatc agaaagaggc cgctcattga ggataaggga agggacttcg cgactgtgcg cgtcaagaag accgaggtcc agaccggcgg gaacagcgat aagctgattg cgaggaagaa cgatagccca accgtggctt acagtgtgct caagaagctc aagtccgtga aggagctgct cgagaagaac ccaatcgact tcctcgaggc catcatcaag ctgccaaagt actccctgtt cgcttctgca ggagagttgc agaaaggcaa cttcctgtac ctcgccagcc actacgagaa gaagcagcta ttcgtcgagc agcacaagca cgagttcagc aagagggtga tcctcgccga caacaagcac cgcgacaagc caattcgcga gctcacaaac ctgggtgcgc cagcagcctt gcggtacacc tccactaagg aggtgctcga tctctacgaa acaaggatcg acctgtctca gaattcgatg agtcaagcag atcgttcaaa tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat aataattaac atgtaatgca tgacgttatt caattataca tttaatacgc gatagaaaac tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat acagttctgg tgctcaacac atttatattt gagggaatcg aactaggaat attgatcaga cgagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa gtcggagcag gagatcggca aggcgaccgc cttcttcaag accgagatca cgctggccaa gactaatggt gagactggcg agatcgtgtg caaggttctg agtatgcctc aggtgaacat cttcagcaag gagtcaatcc tcccgaagag ggactgggac ccaaagaagt acggcgggtt ggtggtggcg aaggtcgaga agggtaagtc cggcatcacc atcatggagc ggtccagctt caagggctat aaggaggtca agaaggacct cgagcttgag aacggccgca agaggatgct cgagcttgcg ctcccgtcca agtacgtcaa gctgaagggc tctccagagg acaatgagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag cgcgaacctg gataaggtgc tctccgccta acaggccgaa aacattatac acctgtttac caagtacttc gataccacca tcgaccgcaa cgcgaccctg atccaccagt ctatcaccgg gctcggaggt gattgagctc actagttcta catttggcaa taaagtttct taagattgaa ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt tatgagatgg gttttttgat tagagtcccg aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta cgaccggcat ggaccaagcc cgttattctg atcaaggagc acattgttac tcactgctag ggaactacga gagagctgaa gataactgcc

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

Strona 12

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt ctctagctct cactgatctg ggtcgcatag tgagatgcag cccacgtgag ttcagcaacg 9600 gtctagcgct gggcttttag gcccgcatga tcgggctttt gtcgggtggt cgacgtgttc 966Θ acgattgggg agagcaacgc agcagttcct cttagtttag tcccacctcg cctgtccagc 972Θ agagttctga ccggtttata aactcgcttg ctgcatcaga cttgatcacc gcggcgtctc 9780 ctagttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 9840 agtggcaccg agtcggtgct ttttttcaag ctgatccttg acaggatata ttggcgggta 9900 aactaagtcg ctgtatgtgt ttgtttgaga tctcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 996Θ caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 10020 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 1ΘΘ80 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 10140 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 10200 taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 10260 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 1Θ32Θ acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 10380 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 10440 atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga agaagagttg gtagctcttg 1Θ5Θ0 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 10560 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 1062Θ gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 1068Θ ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgtgtaaca 10740 ttggtctagt gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc 108ΘΘ aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc 1Θ260 gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac 1Θ920 atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc 1098Θ atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta tgcatttctt tccagacttg 11040 ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt 11100

Strona 13

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cattcgtgat tgcgcctgag aacaggaatc gaatgcaacc tgaatcagga tattcttcta taaccatgca tcatcaggag cgtcagccag tttagtctga atgtttcaga aacaactctg tgattgcccg acattatcgc atttaatcgc ggccttgagc attactgttt atgtaagcag aatgtaacat cagagatttt tgagttgaag gatcagatca aaagttcaaa atcaccaact cactttctgg ctggatgatg cgagacgaaa tacgcgatcg ggcgcaggaa cactgccagc atacctggaa tgctgttttc tacggataaa atgcttgatg ccatctcatc tgtaacaaca gcgcatcggg cttcccatac gagcccattt atacccatat aagacgtttc ccgttgaata acagttttat tgttcatgat gagacacaac gtggctttgt cgcatcttcc cgacaacgca ggtccaccta caacaaagct gggcgattca ggcgatcccc ctgttaaaag gacaattaca gcatcaacaa tattttcacc cctgggatcg cagtggtgag gtcggaagag gcataaattc ttggcaacgc tacctttgcc aatcggtaga ttgtcgcacc aaatcagcat ccatgttgga tggctcataa caccccttgt gatatatttt tatcttgtgc tgaataaatc gaacttttgc gaccgttccg tggcaaagca ctcatcaacc gtggctccct atccaacagc ccgccgtcga gcgggct

11160

11220

11280

11340

11400

11460

11520

11580

11640

11700

11760

11820

11880

11887 <21Θ> 10 <211> 11887 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> System Cas9/sgRNA do edytowania genu Nud <400> 10 tttttatccc cggaagcctg tggatagagg gtagttatcc acgtgaaacc gctaatgccc cgcaaagcct tgattcacgg ggctttccgg cccgctccaa aaactatcca cgtgaaatcg ctaatcaggg tacgtgaaat cgctaatcgg agtacgtgaa atcgctaata aggtcacgtg aaatcgctaa tcaaaaaggc acgtgagaac gctaatagcc ctttcagatc aacagcttgc aaacacccct cgctccggca agtagttaca gcaagtagta tgttcaatta gcttttcaat tatgaatata tatatcaatt attggtcgcc cttggcttgt ggacaatgcg ctacgcgcac cggctccgcc cgtggacaac cgcaagcggt tgcccaccgt cgagcgccag cgcctttgcc

120

180

240

300

360

420

Strona 14

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cacaacccgg cggccggccg caacagatcg ttttataaat tttttttttt gaaaaagaaa 480 aagcccgaaa ggcggcaacc tctcgggctt ctggatttcc gatccccgga attagatctt 54Θ ggcaggatat attgtggtgt aacgtatcac aagtttgtac aaaaaagcag gctccgcggc 600 cgcccccttc acctagactc gacgcgtcct agagatccgt caacatggtg gagcacgaca 660 ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga 720 cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc 780 acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag gtggcaccta caaatgccat cattgcgata 840 aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac 900 ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt 960 gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc 102® cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tggagaggac gaccccgata tgaaaaagcc 1080 tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga 114Θ cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg 12ΘΘ tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta 126© tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat tccggaagtg cttgacattg gggaattcag 1320 cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc 1380 tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcaggt aaatttctag tttttctcct tcattttctt 1440 ggttaggacc cttttctctt tttatttttt tgagctttga tctttcttta aactgatcta 1560 ttttttaatt gattggttat ggtgtaaata ttacatagct ttaactgata atctgattac 1560 tttatttcgt gtgtctatga tgatgatgat aactgcagcc ggtcgcggag gccatggatg 1620 cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa 1680 tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc 1740 actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc 180Θ tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct 1860 ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca taacagcggt cattgactgg agcgaggcga 1920 tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca acatcttctt ctggaggccg tggttggctt 1980

Strona 15

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc 2040 ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg 2100 gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag 216Θ ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct 2220 gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg 228Θ aatagagtag atgccgaccg ggatccggag agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt 2340 tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa 2400 tttctgttga attscgttaa gcatgtaata attaacatgt aatgcatgac gttatttatg 2460 agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa 2520 atatagcgcg caaactagga taaattatcg cgcgcggtgt catctatgtt actagatcgg 2580 gaattcatcg atgatatcag atcaagggtg ggcgcgccga accagctttc ttgtacaaag 2640 tggtgatccc cctcgaatcg aattccgtgc agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag 2760 ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa aaattaccac atattttttt tgtcacactt 276Θ gtttgaagtg cagtttatct atctttatac atatatttaa actttactct acgaataata 2820 taatctatag tactacaata atatcagtgt tttagagaat catataaatg aacagttaga 2880 catggtctaa aggacaattg agtattttga caacaggact ctacagtttt atctttttag 2940 tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa tagcttcacc tatataatac ttcatccatt 3000 ttattagtac atccatttag ggtttagggt taatggtttt tatagactaa tttttttagt 3Θ6Θ acatctattt tattctattt tagcctctaa attaagaaaa ctaaaactct attttagttt 3120 ttttatttaa taatttagat ataaaataga ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa 318Θ taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc 3240 cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg 3300 cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg 3360 agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga 3420 gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cctcctcctc ctctcacggc acggcagcta 348Θ cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag 3540

Strona 16

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt acaccccctc cacaccctct ttccccaacc ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cccccccccc cctctctacc ttctctagat agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gtctggttgg gcggtcgttc tsgatcggag ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atggatggaa atatcgatct aggataggta atacagagat gctttttgtt cgcttggttg attcgttcta gatcggagta gaatactgtt gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg ttttataatt attttgatct tgatatactt gattttttta gccctgcctt catacgctat tgctcaccct gttgtttggt gttacttcgc aagaggaagg tgggcatgga caagaagtac gtaggctggg cggtgatcac ggacgagtat ggaaacaccg accgtcacag catcaagaag ggtaaatttc tgtgttcctt attctctcaa atttcgtata tgttctttgg tttagattct gtttgatcgt tagatatcat cttaattctc gttcaaataa tttgagtttt gtcgaataat tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt gccgttccgc agacgggatc gatttcatga ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg tagaattctg tttcaaacta cctggtggat atacatattc atagttacga attgaagatg tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc tcaaactacc tggtgtattt attaattttg agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc gttttactga tgcatataca tgatggcata agtacctatc tattataata aacaagtatg ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga cccccgggat ccgccatggc cccgaagaag tccatcggcc tggacatcgg gaccaactct aaggtgccct cgaagaagtt caaggtcctg aacctgatag gggccctcct gttcgactca aatcttcgat tttgttttcg ttcgatccca gttaatctta gatcgaagac gattttctgg gattagggtt tcatagatat catccgattt tactcttcga tttgtgattt ctatctagat

3600

3660

3720

3780

3840

3900

3960

4020

4080

4140

4200

4260

4320

4380

4440

4500

4560

4620

4680

4740

4800

4860

4920

4980

5040

5100

Strona 17

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt ctggtgttag tttctagttt gtgcgatcga atttgtcgat taatctgagt ttttctgatt 516Θ aacaggtgag actgctgagg cgaccaggct gaagcgtact gcaagaagac gttacacgag 5220 gcggaagaac aggatctgct acctccaaga gatcttcagc aacgagatgg cgaaggtcga 5280 cgactcgttc ttccaccgtc tcgaggagag cttcctggtc gaggaagaca agaagcacga 5340 gaggcacccg atcttcggga acatcgtgga cgaagtggcg taccacgaga agtaccccac 5400 aatctaccac ctccggaaga agctggttga ctccactgac aaggctgacc tgcgtctcat 546Θ ctacctggcc ctcgcccaca tgatcaagtt caggggtcac ttcctcatag agggggacct 5520 gaaccctgac aatagcgacg tcgacaagct gttcatccag ctggtgcaaa cctacaacca 5580 gctcttcgag gagaacccca tcaacgctag tggagttgac gccaaggcta tcctgtctgc 564Θ taggctgtcc aaaagccgac gcttggagaa cttaatcgct cagcttccgg gggagaagaa 5700 gaacggactc ftcgggaacc tgattgccct gagtctgggc ctgaccccga acttcaaaag 5760 caacttcgac ctcgccgagg acgcgaaact ccagctgtca aaggacacat acgacgacga 5820 cctggacaac ctgttagcac agatcgggga ccagtacgcc gacctctttc tggcagctaa 588Θ gaacctgtct gacgccatcc tcctgtccga catcctccga gtcaacactg agatcaccaa 5940 ggccccactg agcgcctcta tgataaaacg ctacgacgag caccaccagg acctgactct 6000 cctgaaggct ctcgtacgtc agcagctgcc tgagaagtac aaggagatct tcttcgacca 6060 gtcgaagaac ggctacgccg ggtacattga tggcggggct tctcaagagg agttctacaa 612Θ gttcatcaag cccatcctcg agaagatgga cggcaccgag gagctgctcg ttaagttgaa 618Θ cagagaggac ctgctccgaa agcagaggac ctttgataac gggtcgatcc cgcaccagat 624Θ ccatctcggt gagctccatg ctatcctgcg acgccaagag gacttctacc ccttcctcaa 6300 ggacaaccgc gagaagattg agaagatcct gacattccga atcccgtact acgtcgggcc 6360 tcttgcaagg ggcaacagcc ggttcgcttg gatgacccgc aagtcggagg agactatcac 6420 accctggaac tttgaggagg tcgtggacaa gggcgcatct gcccagagtt tcatcgagag 648Θ gatgaccaac ttcgataaga acctcccgaa cgagaaggtg ctcccgaagc actctctgct 654Θ ctacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gacgaaggtc aagtacgtga ccgagggtat 6600 gcggaagcct gcgttcctga gcggggagca aaagaaggcc atcgtcgatc tcctgttcaa 6660

Strona 1S

PL235 163 Β1 gaccaaccgc aaggtgaccg tcaagcagct cttcgactcc gtcgagatct cgggcgttga ccatgacctg ctcaagatta tcaaggacaa cattctagag gacatcgtgc tcacgctgac gcgcctcaag acctacgccc acctcttcga caggtatact ggatggggga ggctctcaag gagcggcaag acgatcctcg acttcctgaa gcagctcatc cacgacgact cgctcacgtt cggccagggt gattctctgc atgagcatat aaagggaatc ctccagaccg tcaaggtcgt caagcctgag aacatcgtga tcgagatggc gaagaactcg cgcgagcgca tgaagagaat gatcctcaag gagcacccag ttgagaacac ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt cgactacgac gttgaccata tcgtgcccca caaggtgctc acgaggtccg acaagaaccg ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg gcgcaagttc gacaacttga caaaggcaga gggcttcatt aagaggcagc tcgtcgagac cctggatagc aggatgaaca cgaagtacga ggtcatcacc ctcaagtcca agctggtgag ggtccgcgag atcaacaact accaccacgc cacggccctc atcaagaagt accctaagct ggtgtacgac gtgcgcaaga tgatcgcgaa caagtacttc ttctacagca acatcatgaa cggcgagatc agaaagaggc cgctcattga

SEQLTXT.txt caaggaggac tacttcaaga agatcgagtg ggacaggttc aacgcaagcc tggggaccta ggacttcctc gacaacgagg agaatgagga cctcttcgag gaccgcgaga tgatcgagga cgacaaggtg atgaagcaac tgaagaggcg gaagctgatc aacggcatca gggacaagca gtctgacggc ttcgctaacc gcaacttcat caaggaagac atccagaagg cgcaggtaag cgctaacctc gccggctccc ccgcaatcaa ggacgagctg gttaaagtga tgggcaggca gcgcgagaat cagacgactc agaagggcca tgaggagggt atcaaggaac tcggcagcca ccagctccag aatgagaagc tgtacctcta ggaccaagag ctggacatca acaggctgtc aagtttcctc aaggacgact cgatcgacaa cggcaagtct gacaacgtgc caagcgagga gcagctcctg aacgccaagc tcatcaccca gagaggaggc ctgtcggagc ttgataaggc taggcagatc acgaagcacg tggcgcagat cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtgaa cgacttccgc aaggatttcc agttctacaa ccacgacgcc tacctgaacg cggtagttgg cgagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa gtcggagcag gagatcggca aggcgaccgc cttcttcaag accgagatca cgctggccaa gactaatggt gagactggcg agatcgtgtg

6720

6780

6840

6900

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

Strona 19

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt ggataaggga agggacttcg cgtcaagaag accgaggtcc gaacagcgat aagctgattg cgatagccca accgtggctt caagaagctc aagtccgtga cgagaagaac ccaatcgact catcatcaag ctgccaaagt cgcttctgca ggagagttgc cttcctgtac ctcgccagcc gaagcagcta ttcgtcgagc cgagttcagc aagagggtga caacaagcac cgcgacaagc gctcacaaac ctgggtgcgc gcggtacacc tccactaagg tctctacgaa acaaggatcg gaattcgatg agtcaagcag tcctgttgcc ggtcttgcga aataattaac atgtaatgca caattataca tttaatacgc tcgcgcgcgg tgtcatctat acagttctgg tgctcaacac gagggaatcg aactaggaat ctctagctct cactgatctg gtctagcgct gggcttttag acgattgggg agagcaacgc agagttctga ccggtttata cgactgtgcg caaggttctg agaccggcgg cttcagcaag cgaggaagaa ggactgggac acagtgtgct ggtggtggcg aggagctgct cggcatcacc tcctcgaggc caagggctat actccctgtt cgagcttgag agaaaggcaa cgagcttgcg actacgagaa gctgaagggc agcacaagca ctacctggac tcctcgccga cgcgaacctg caattcgcga acaggccgaa cagcagcctt caagtacttc aggtgctcga cgcgaccctg acctgtctca gctcggaggt atcgttcaaa catttggcaa tgattatcat ataatttctg tgacgttatt tatgagatgg gatagaaaac aaaatatagc gttactagat cgaccggcat atttatattt atcaaggagc attgatcaga ggaactacga ggtcgcatag tgagatgcag gcccgcatga tcgggctttt agcagttcct cttagtttag aactcgcttg ctgcatcaga agtatgcctc aggtgaacat gagtcaatcc tcccgaagag ccaaagaagt acggcgggtt aaggtcgaga agggtaagtc atcatggagc ggtccagctt aaggaggtca agaaggacct aacggccgca agaggatgct ctcccgtcca agtacgtcaa tctccagagg acaatgagca gagatcatcg agcagatcag gataaggtgc tctccgccta aacattatac acctgtttac gataccacca tcgaccgcaa atccaccagt ctatcaccgg gattgagctc actagttcta taaagtttct taagattgaa ttgaattacg ttaagcatgt gttttttgat tagagtcccg gcgcaaacta ggataaatta ggaccaagcc cgttattctg acattgttac tcactgctag gagagctgaa gataactgcc cccacgtgag ttcagcaacg gtcgggtggt cgacgtgttc tcccacctcg cctgtccagc cttgttgggc acctttgaga

8280

8340

8400

8460

8520

8580

8640

8700

8760

8820

8880

8940

9000

9060

9120

9180

9240

9300

9360

9420

9480

9540

9600

9660

9720

9780

Strona 20

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cgggttttag agctagaaat agcaagttaa aataaggcta gtccgttatc aacttgaaaa 984Θ agtggcaccg agtcggtgct ttttttcaag ctgatccttg acaggatata ttggcgggta 9900 aactaagtcg ctgtatgtgt ttgtttgaga tctcatgtga gcaaaaggcc agcaaaaggc 9960 caggaaccgt aaaaaggccg cgttgctggc gtttttccat aggctccgcc cccctgacga 10020 gcatcacaaa aatcgacgct caagtcagag gtggcgaaac ccgacaggac tataaagata 10Θ80 ccaggcgttt ccccctggaa gctccctcgt gcgctctcct gttccgaccc tgccgcttac 10140 cggatacctg tccgcctttc tcccttcggg aagcgtggcg ctttctcata gctcacgctg 1Θ20Θ taggtatctc agttcggtgt aggtcgttcg ctccaagctg ggctgtgtgc acgaaccccc 10260 cgttcagccc gaccgctgcg ccttatccgg taactatcgt cttgagtcca acccggtaag 10320 acacgactta tcgccactgg cagcagccac tggtaacagg attagcagag cgaggtatgt 10380 aggcggtgct acagagttct tgaagtggtg gcctaactac ggctacacta gaagaacagt 1Θ44Θ atttggtatc tgcgctctgc tgaagccagt taccttcgga agaagagttg gtagctcttg 10500 atccggcaaa caaaccaccg ctggtagcgg tggttttttt gtttgcaagc agcagattac 10560 gcgcagaaaa aaaggatctc aagaagatcc tttgatcttt tctacggggt ctgacgctca 19620 gtggaacgaa aactcacgtt aagggatttt ggtcatgaga ttatcaaaaa ggatcttcac 1Θ680 ctagatcctt ttaaattaaa aatgaagttt taaatcaatc taaagtatat atgtgtaaca 10740 ttggtctagt gattagaaaa actcatcgag catcaaatga aactgcaatt tattcatatc 10800 aggattatca ataccatatt tttgaaaaag ccgtttctgt aatgaaggag aaaactcacc 10860 gaggcagttc cataggatgg caagatcctg gtatcggtct gcgattccga ctcgtccaac 10920 atcaatacaa cctattaatt tcccctcgtc aaaaataagg ttatcaagtg agaaatcacc 16980 atgagtgacg actgaatccg gtgagaatgg caaaagttta tgcatttctt tccagacttg 11Θ40 ttcaacaggc cagccattac gctcgtcatc aaaatcactc gcatcaacca aaccgttatt 11100 cattcgtgat tgcgcctgag cgagacgaaa tacgcgatcg ctgttaaaag gacaattaca 11160 aacaggaatc gaatgcaacc ggcgcaggaa cactgccagc gcatcaacaa tattttcacc 11220 tgaatcagga tattcttcta atacctggaa tgctgttttc cctgggatcg cagtggtgag 11280 taaccatgca tcatcaggag tacggataaa atgcttgatg gtcggaagag gcataaattc 11340

Strona 21

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cgtcagccag tttagtctga ccatctcatc tgtaacaaca ttggcaacgc tacctttgcc 11400 atgtttcaga aacaactctg gcgcatcggg cttcccatac aatcggtaga ttgtcgcacc 11460 tgattgcccg acattatcgc gagcccattt atacccatat aaatcagcat ccatgttgga 1152Θ atttaatcgc ggccttgagc aagacgtttc ccgttgaata tggctcataa caccccttgt 11580 attactgttt atgtaagcag acagttttat tgttcatgat gatatatttt tatcttgtgc 11640 aatgtaacat cagagatttt gagacacaac gtggctttgt tgaataaatc gaacttttgc 11760 tgagttgaag gatcagatca cgcatcttcc cgacaacgca gaccgttccg tggcaaagca 11760 aaagttcaaa atcaccaact ggtccaccta caacaaagct ctcatcaacc gtggctccct 11320 cactttctgg ctggatgatg gggcgattca ggcgatcccc atccaacagc ccgccgtcga 11880 gcgggct 11887 <210> 11 <211> 12140 <212> DNA <213> artificial <220>

<223> System Cas9/sgRNA do jednoczesnego edytowania genów HvCKXl i

HvCKX3 <460> 11 tttttatccc cggaagcctg tggatagagg gtagttatcc acgtgaaacc gctaatgccc 60 cgcaaagcct tgattcacgg ggctttccgg cccgctccaa aaactatcca cgtgaaatcg 12Θ ctaatcaggg tacgtgaaat cgctaatcgg agtacgtgaa atcgctaata aggtcacgtg 180 aaatcgctaa tcaaaaaggc acgtgagaac gctaatagcc ctttcagatc aacagcttgc 240 aaacacccct cgctccggca agtagttaca gcaagtagta tgttcaatta gcttttcaat 300 tatgaatata tatatcaatt attggtcgcc cttggcttgt ggacaatgcg ctacgcgcac 360 cggctccgcc cgtggacaac cgcaagcggt tgcccaccgt cgagcgccag cgcctttgcc 420 cacaacccgg cggccggccg caacagatcg ttttataaat tttttttttt gaaaaagaaa 480 aagcccgaaa ggcggcaacc tctcgggctt ctggatttcc gatccccgga attagatctt 54Θ ggcaggatat attgtggtgt aacgtatcac aagtttgtac aaaaaagcag gctccgcggc 6ΘΘ

Strona 22

PL235 163 Β1 cgcccccttc acctagactc gacgcgtcct ctctcgtcta ctccaagaat atcaaagata cttttcaaca aagggtaata tcgggaaacc acttcatcaa aaggacagta gaaaaggaag aaggaaaggc tatcgttcaa gatgcctctg ccacgaggag catcgtggaa aaagaagacg gatgtgatat ctccactgac gtaagggatg cttcctctat ataaggaagt tcatttcatt tgaactcacc gcgacgtctg tcgagaagtt cctgatgcag ctctcggagg gcgaagaatc tggatatgtc ctgcgggtaa atagctgcgc tcggcacttt gcatcggccg cgctcccgat cgagagcctg acctattgca tctcccgccg tgaaaccgaa ctgcccgctg ttctgcaggt ggttaggacc cttttctctt tttatttttt ttttttaatt gattggttat ggtgtaaata tttatttcgt gtgtctatga tgatgatgat cgatcgctgc ggccgatctt agccagacga tcggtcaata cactacatgg cgtgatttca actggcaaac tgtgatggac gacaccgtca tgatgctttg ggccgaggac tgccccgaag ccaacaatgt cctgacggac aatggccgca tgttcgggga ttcccaatac gaggtcgcca gtatggagca gcagacgcgc tacttcgagc ggctccgggc gtatatgctc cgcattggtc gcaatttcga tgatgcagct tgggcgcagg

SEQLTXT.txt agagatccgt caacatggtg gagcacgaca cagtctcaga agaccaaagg gctattgaga tcctcggatt ccattgccca gctatctgtc gtggcaccta caaatgccat cattgcgata ccgacagtgg tcccaaagat ggacccccac ttccaaccac gtcttcaaag caagtggatt acgcacaatc ccactatcct tcgcaagacc tggagaggac gaccccgata tgaaaaagcc tctgatcgaa aagttcgaca gcgtctccga tcgtgctttc agcttcgatg taggagggcg cgatggtttc tacaaagatc gttatgttta tccggaagtg cttgacattg gggaattcag tgcacagggt gtcacgttgc aagacctgcc aaatttctag tttttctcct tcattttctt tgagctttga tctttcttta aactgatcta ttacatagct ttaactgata atctgattac aactgcagcc ggtcgcggag gccatggatg gcgggttcgg cccattcgga ccgcaaggaa tatgcgcgat tgctgatccc catgtgtatc gtgcgtccgt cgcgcaggct ctcgatgagc tccggcacct cgtgcacgcg gatttcggct taacagcggt cattgactgg agcgaggcga acatcttctt ctggaggccg tggttggctt ggaggcatcc ggagcttgca ggatcgccgc ttgaccaact ctatcagagc ttggttgacg gtcgatgcga cgcaatcgtc cgatccggag

660

72Θ

78Θ

84Θ

900

960

1020

1080

1140

1200

1260

1320

1380

1440

1500

1560

1620

1680

1740

1800

1860

1920

1980

2040

2100

2160

Strona 23

PL235 163 Β1 ccgggactgt cgggcgtaca caaatcgccc gtgtagaagt actcgccgat agtggaaacc aatagagtag atgccgaccg ggatccggag tggcaataaa gtttcttaag attgaatcct tttctgttga attacgttaa gcatgtaata agatgggttt ttatgattag agtcccgcaa atatagcgcg caaactagga taaattatcg gaattcatcg atgatatcag atcaagggtg tggtgatccc cctcgaatcg aattccgtgc ataatgagca ttgcatgtct aagttataaa gtttgaagtg cagtttatct atctttatac taatctatag tactacaata atatcagtgt catggtctaa aggacaattg agtattttga tgtgcatgtg ttctcctttt tttttgcaaa ttattagtac atccatttag ggtttagggt acatctattt tattctattt tagcctctaa ttttatttaa taatttagat ataaaataga taccctttaa gaaattaaaa aaactaagga cagcctgtta aacgccgtcg acgagtctaa cgtcgggcca agcgaagcag acggcacggc agagttccgc tccaccgttg gacttgctcc gcggcagacg tgagccggca cggcaggcgg cgggggattc ctttcccacc gctccttcgc acaccccctc cacaccctct ttccccaacc ccagatctcc cccaaatcca cccgtcggca cccccccccc cctctctacc ttctctagat

SEQLTXT.txt gcagaagcgc ggccgtctgg accgatggct gacgccccag cactcgtccg agggcaaagg agctcgaatt tccccgatcg ttcaaacatt gttgccggtc ttgcgatgat tatcatataa attaacatgt aatgcatgac gttatttatg ttatacattt aatacgcgat agaaaacaaa cgcgcg&tgt catctatgtt actagatcgg ggcgcgccga accagctttc ttgtacaaag agcgtgaccc ggtcgtgccc ctctctagag aaattaccac atattttttt tgtcacactt atatatttaa actttactct acgaataata tttagagaat catataaatg aacagttaga caacaggact ctacagtttt atctttttag tagcttcacc tatataatac ttcatccatt taatggtttt tatagactaa tttttttagt attaagaaaa ctaaaactct attttagttt ataaaataaa gtgactaaaa attaaacaaa aacatttttc ttgtttcgag tagataatgc cggacaccaa ccagcgaacc agcagcgtcg atctctgtcg ctgcctctgg acccctctcg gctgtcggca tccagaaatt gcgtggcgga cctcctcctc ctctcacggc acggcagcta tttcccttcc tcgcccgccg taataaatag tcgtgttgtt cggagcgcac acacacacaa cctccgcttc aaggtacgcc gctcgtcctc cggcgttccg gtccatggtt agggcccggt

2220

2280

2340

2400

2460

2520

2580

2640

2700

2760

2820

2880

2940

3000

3060

3120

3180

3240

3300

3360

3420

3480

3540

3600

3660

3720

Strona 24

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt agttctactt ctgttcatgt ttgtgttaga tccgtgtttg tgttagatcc gtgctgctag 3780 cgttcgtaca cggatgcgac ctgtacgtca gacacgttct gattgctaac ttgccagtgt 3840 ttctctttgg ggaatcctgg gatggctcta gccgttccgc agacgggatc gatttcatga 390O ttttttttgt ttcgttgcat agggtttggt ttgccctttt cctttatttc aatatatgcc 3960 gtgcacttgt ttgtcgggtc atcttttcat gctttttttt gtcttggttg tgatgatgtg 4020 gtctggttgg gcggtcgttc tagatcggag tagaattctg fttcaaacta cctggtggat 4Θ8Θ ttattaattt tggatctgta tgtgtgtgcc atacatattc atagttacga attgaagatg 414Θ atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgcgggtttt actgatgcat 42Θ0 atacagagat gctttttgtt cgcttggttg tgatgatgtg gtgtggttgg gcggtcgttc 426Θ attcgttcta gatcggagta gaatactgtt tcaaactacc tggtgtattt attaattttg 432Θ gaactgtatg tgtgtgtcat acatcttcat agttacgagt ttaagatgga tggaaatatc 4388 gatctaggat aggtatacat gttgatgtgg gttttactga tgcatataca tgatggcata 4440 tgcagcatct attcatatgc tctaaccttg agtacctatc tattataata aacaagtatg 4500 ttttataatt attttgatct tgatatactt ggatgatggc atatgcagca gctatatgtg 4560 gattttttta gccctgcctt catacgctat ttatttgctt ggtactgttt cttttgtcga 4620 tgctcaccct gttgtttggt gttacttcgc cccccgggat ccgccatggc cccgaagaag 4680 aagaggaagg tgggcatgga caagaagtac tccatcggcc tggacatcgg gaccaactct 4740 gtaggctggg cggtgatcac ggacgagtat aaggtgccct cgaagaagtt caaggtcctg 4800 ggaaacaccg accgtcacag catcaagaag aacctgatag gggccctcct gttcgactca 4860 ggtaaatttc tgtgttcctt attctctcaa aatcttcgat tttgttttcg ttcgatccca 4920 atttcgtata tgttctttgg tttagattct gttaatctta gatcgaagac gattttctgg 4980 gtttgatcgt tagatatcat cttaattctc gattagggtt tcatagatat catccgattt 5040 gttcaaataa tttgagtttt gtcgaataat tactcttcga tttgtgattt ctatctagat 5100 ctggtgttag tttctagttt gtgcgatcga atttgtcgat taatctgagt ttttctgatt 5160 aacaggtgag actgctgagg cgaccaggct gaagcgtact gcaagaagac gttacacgag 5220 gcggaagaac aggatctgct acctccaaga gatcttcagc aacgagatgg cgaaggtcga 5280

Strona 25

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cgactcgttc ttccaccgtc tcgaggagag cttcctggtc gaggaagaca agaagcacga 5340 gaggcacccg atcttcggga acatcgtgga cgaagtggcg taccacgaga agtaccccac 5400 aatctaccac ctccggaaga agctggttga ctccactgac aaggctgacc tgcgtctcat 5460 ctacctggcc ctcgcccaca tgatcaagtt caggggtcac ttcctcatag agggggacct 5520 gaaccctgac aatagcgacg tcgacaagct gttcatccag ctggtgcaaa cctacaacca 5580 gctcftcgag gagaacccca tcaacgctag tggagttgac gccaaggcta tcctgtctgc 5640 taggctgtcc aaaagccgac gcttggagaa cttaatcgct cagcttccgg gggagaagaa 5700 gaacggactc ttcgggaacc tgattgccct gagtctgggc ctgaccccga acttcaaaag 5760 caacttcgac ctcgccgagg acgcgaaact ccagctgtca aaggacacat acgacgacga 5820 cctggacaac ctgttagcac agatcgggga ccagtacgcc gacctctttc tggcagctaa 5880 gaacctgtct gacgccatcc tcctgtccga catcctccga gtcaacactg agatcaccaa 5940 ggccccactg agcgcctcta tgataaaacg ctacgacgag caccaccagg acctgactct 60Θ0 cctgaaggct ctcgtacgtc agcagctgcc tgagaagtac aaggagatct tcttcgacca 6060 gtcgaagaac ggctacgccg ggtacattga tggcggggct tctcaagagg agttctacaa 6120 gttcatcaag cccatcctcg agaagatgga cggcaccgag gagctgctcg ttaagttgaa 6180 cagagaggac ctgctccgaa agcagaggac ctttgataac gggtcgatcc cgcaccagat 6240 ccatctcggt gagctccatg ctatcctgcg acgccaagag gacttctacc ccttcctcaa 6360 ggacaaccgc gagaagattg agaagatcct gacattccga atcccgtact acgtcgggcc 6360 tcttgcaagg ggcaacagcc ggttcgcttg gatgacccgc aagtcggagg agactatcac 6420 accctggaac tttgaggagg tcgtggacaa gggcgcatct gcccagagtt tcatcgagag 6480 gatgaccaac ttcgataaga acctcccgaa cgagaaggtg ctcccgaagc actctctgct 6540 ctacgagtac ttcaccgtgt acaacgagct gacgaaggtc aagtacgtga ccgagggtat 660Θ gcggaagcct gcgttcctga gcggggagca aaagaaggcc atcgtcgatc tcctgttcaa 6660 gaccaaccgc aaggtgaccg tcaagcagct caaggaggac tacttcaaga agatcgagtg 6720 cttcgactcc gtcgagatct cgggcgttga ggacaggttc aacgcaagcc tggggaccta 6780 ccatgacctg ctcaagatta tcaaggacaa ggacttcctc gacaacgagg agaatgagga 6840

Strona 26

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cattctagag gacatcgtgc tcacgctgac cctcttcgag gaccgcgaga tgatcgagga gcgcctcaag acctacgccc acctcttcga cgacaaggtg atgaagcaac tgaagaggcg caggtatact ggatggggga ggctctcaag gaagctgatc aacggcatca gggacaagca gagcggcaag acgatcctcg acttcctgaa gtctgacggc ttcgctaacc gcaacttcat gcagctcatc cacgacgact cgctcacgtt caaggaagac atccagaagg cgcaggtaag cggccagggt gattctctgc atgagcatat cgctaacctc gccggctccc ccgcaatcaa aaagggaatc ctccagaccg tcaaggtcgt ggacgagctg gttaaagtga tgggcaggca caagcctgag aacatcgtga tcgagatggc gcgcgagaat cagacgactc agaagggcca gaagaactcg cgcgagcgca tgaagagaat tgaggagggt atcaaggaac tcggcagcca gatcctcaag gagcacccag ttgagaacac ccagctccag aatgagaagc tgtacctcta ctacctgcag aacggcaggg acatgtacgt ggaccaagag ctggacatca acaggctgtc cgactacgac gttgaccata tcgtgcccca aagtttcctc aaggacgact cgatcgacaa caaggtgctc acgaggtccg acaagaaccg cggcaagtct gacaacgtgc caagcgagga ggtcgtgaag aagatgaaga actactggcg gcagctcctg aacgccaagc tcatcaccca gcgcaagttc gacaacttga caaaggcaga gagaggaggc ctgtcggagc ttgataaggc gggcttcatt aagaggcagc tcgtcgagac taggcagatc acgaagcacg tggcgcagat cctggatagc aggatgaaca cgaagtacga cgagaacgac aagctcatcc gcgaggtgaa ggtcatcacc ctcaagtcca agctggtgag cgacttccgc aaggatttcc agttctacaa ggtccgcgag atcaacaact accaccacgc ccacgacgcc tacctgaacg cggtagttgg cacggccctc atcaagaagt accctaagct cgagagcgag ttcgtgtacg gcgactacaa ggtgtacgac gtgcgcaaga tgatcgcgaa gtcggagcag gagatcggca aggcgaccgc caagtacttc ttctacagca acatcatgaa cttcttcaag accgagatca cgctggccaa cggcgagatc agaaagaggc cgctcattga gactaatggt gagactggcg agatcgtgtg ggataaggga agggacttcg cgactgtgcg caaggttctg agtatgcctc aggtgaacat cgtcaagaag accgaggtcc agaccggcgg cttcagcaag gagtcaatcc tcccgaagag gaacagcgat aagctgattg cgaggaagaa ggactgggac ccaaagaagt acggcgggtt

69ΘΘ

6960

7020

7080

7140

7200

7260

7320

7380

7440

7500

7560

7620

7680

7740

7800

7860

7920

7980

8040

8100

8160

8220

8280

8340

8400

Strona 27

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt cgatagccca accgtggctt acagtgtgct ggtggtggcg aaggtcgaga agggtaagtc 8460 caagaagctc aagtccgtga aggagctgct cggcatcacc atcatggagc ggtccagctt 8520 cgagaagaac ccaatcgact tcctcgaggc caagggctat aaggaggtca agaaggacct 8580 catcatcaag ctgccaaagt actccctgtt cgagcttgag aacggccgca agaggatgct 8640 cgcttctgca ggagagttgc agaaaggcaa cgagcttgcg ctcccgtcca agtacgtcaa 8700 cttcctgtac ctcgccagcc actacgagaa gctgaagggc tctccagagg acaatgagca 876Θ gaagcagcta ttcgtcgagc agcacaagca ctacctggac gagatcatcg agcagatcag 8820 cgagttcagc aagagggtga tcctcgccga cgcgaacctg gataaggtgc tctccgccta 8880 caacaagcac cgcgacaagc caattcgcga acaggccgaa aacattatac acctgtttac 8940 gctcacaaac ctgggtgcgc cagcagcctt caagtacttc gataccacca tcgaccgcaa 90Θ0 gcggtacacc tccactaagg aggtgctcga cgcgaccctg atccaccagt ctatcaccgg 906Θ tctctacgaa acaaggatcg acctgtctca gctcggaggt gattgagctc actagttcta 9120 gaattcgatg agtcaagcag atcgttcaaa catttggcaa taaagtttct taagattgaa 9180 tcctgttgcc ggtcttgcga tgattatcat ataatttctg ttgaattacg ttaagcatgt 9240 aataattaac atgtaatgca tgacgttatt tatgagatgg gttttttgat tagagtcccg 93ΘΘ caattataca tttaatacgc gatagaaaac aaaatatagc gcgcaaacta ggataaatta 9360 tcgcgcgcgg tgtcatctat gttactagat cgaccggcat ggaccaagcc cgttattctg 9420 acagttctgg tgctcaacac atttatattt atcaaggagc acattgttac tcactgctag 9480 gagggaatcg aactaggaat attgatcaga ggaactacga gagagctgaa gataactgcc 9540 ctctagctct cactgatctg ggtcgcatag tgagatgcag cccacgtgag ttcagcaacg 96ΘΘ gtctagcgct gggcttttag gcccgcatga tcgggctttt gtcgggtggt cgacgtgttc 9660 acgattgggg agagcaacgc agcagttcct cttagtttag tcccacctcg cctgtccagc 972Θ agagttctga ccggtttata aactcgcttg ctgcatcaga cttgcaacaa agcgcatctg 9780 gtgtagtggt atcatagtac cctcccacgg tactgaccag ggttcgattc cctggatgcg 9849 cagatcaccg cggcgtctcc tagttttaga gctagaaata gcaagttaaa ataaggctag 9900 tccgttatca acttgaaaaa gtggcaccga gtcggtgcca acaaagcgca tctggtgtag 9960

Strona 28

PL235 163 Β1

SEQLTXT.txt tggtatcata gtaccctccc acggtactga ccagggttcg attccctgga tgcgcacaag 10020 ttcatccaga gccccagttt tagagctaga aatagcaagt taaaataagg ctagtccgtt 10080 atcaacttga aaaagtggca ccgagtcggt gctttttttc aagctgatcc ttgacaggat 10140 atattggcgg gtaaactaag tcgctgtatg tgtttgtttg agatctcatg tgagcaaaag 18200 gccagcaaaa ggccaggaac cgtaaaaagg ccgcgttgct ggcgtttttc cataggctcc 10260 gcccccctga cgagcatcac aaaaatcgac gctcaagtca gaggtggcga aacccgacag 1032Θ gactataaag ataccaggcg tttccccctg gaagctccct cgtgcgctct cctgttccga 16380 ccctgccgct taccggatac ctgtccgcct ttctcccttc gggaagcgtg gcgctttctc 16440 atagctcacg ctgtaggtat ctcagttcgg tgtaggtcgt tcgctccaag ctgggctgtg 16500 tgcacgaacc ccccgttcag cccgaccgct gcgccttatc cggtaactat cgtcttgagt 10560 ccaacccggt aagacacgac ttatcgccac tggcagcagc cactggtaac aggattagca 10620 gagcgaggta tgtaggcggt gctacagagt tcttgaagtg gtggcctaac tacggctaca 10680 ctagaagaac agtatttggt atctgcgctc tgctgaagcc agttaccttc ggaagaagag 10740 ttggtagctc ttgatccggc aaacaaacca ccgctggtag cggtggtttt tttgtttgca 10800 agcagcagat tacgcgcaga aaaaaaggat ctcaagaaga tcctttgatc ttttctacgg 10860 ggtctgacgc tcagtggaac gaaaactcac gttaagggat tttggtcatg agattatcaa 1Θ920 aaaggatctt cacctagatc cttttaaatt aaaaatgaag ttttaaatca atctaaagta 1Θ980 tatatgtgta acattggtct agtgattaga aaaactcatc gagcatcaaa tgaaactgca 11Θ40 atttattcat atcaggatta tcaataccat atttttgaaa aagccgtttc tgtaatgaag 111Θ0 gagaaaactc accgaggcag ttccatagga tggcaagatc ctggtatcgg tctgcgattc 11160 cgactcgtcc aacatcaata caacctatta atttcccctc gtcaaaaata aggttatcaa 11220 gtgagaaatc accatgagtg acgactgaat ccggtgagaa tggcaaaagt ttatgcattt 1128Θ ctttccagac ttgttcaaca ggccagccat tacgctcgtc atcaaaatca ctcgcatcaa 11340 ccaaaccgtt attcattcgt gattgcgcct gagcgagacg aaatacgcga tcgctgttaa 11400 aaggacaatt acaaacagga atcgaatgca accggcgcag gaacactgcc agcgcatcaa 11460 caatattttc acctgaatca ggatattctt ctaatacctg gaatgctgtt ttccctggga 11520

Strona 29

PL235 163 Β1

5EQLTXT.txt tcgcagtggt gagtaaccat gcatcatcag gagtacggat aaaatgcttg atggtcggaa gaggcataaa ttccgtcagc cagtttagtc tgaccatctc atctgtaaca acattggcaa cgctaccttt gccatgtttc agaaacaact ctggcgcatc gggcttccca tacaatcggt agattgtcgc acctgattgc ccgacattat cgcgagccca tttataccca tataaatcag catccatgtt ggaatttaat cgcggccttg agcaagacgt ttcccgttga atatggctca taacacccct tgtattactg tttatgtaag cagacagttt tattgttcat gatgatatat ttttatcttg tgcaatgtaa catcagagat tttgagacac aacgtggctt tgttgaataa atcgaacttt tgctgagttg aaggatcaga tcacgcatct tcccgacaac gcagaccgtt ccgtggcaaa gcaaaagttc aaaatcacca actggtccac ctacaacaaa gctctcatca accgtggctc cctcactttc tggctggatg atggggcgat tcaggcgatc cccatccaac agcccgccgt cgagcgggct

11580

11640

11700

11760

11820

11880

11940

12000

12060

12120

12140

Claims (12)

1. Zastrzeżenia patentowe

   1. Syntetyczny gen endonukleazy Cas9 posiadający sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 1.
2. 2. Pusta kaseta kierująca sgRNA składająca się z:

   a) promotora U6 posiadającego sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 2 oraz

   b) sekwencji kodującej gRNA posiadającej sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 3 połączonych operacyjnie ze znajdującą się pomiędzy nimi

   c) sekwencją kodującą miejsce do klonowania sekwencji komplementarnej do sekwencji edytowanej, korzystnie zawierającą sekwencję rozpoznawaną przez enzym restrykcyjny.
3. 3. Pusta kaseta kierująca sgRNA według zastrz. 2, znamienna tym, że sekwencja ta zawiera dwa miejsce restrykcyjne Bsal służące do kierunkowego klonowania sekwencji komplementarnej do sekwencji edytowanej, przy czym korzystnie kaseta posiada sekwencję przedstawioną jako sekw. nr 4.
4. 4. Wypełniona kaseta kierująca sgRNA składająca się z:

   a) promotora U6 posiadającego sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 2 oraz

   b) sekwencji kodującej gRNA posiadającej sekwencję nukleotydową przedstawioną jako sekw. nr 3 połączonych operacyjnie ze znajdującą się pomiędzy nimi

   c) sekwencją komplementarną do sekwencji edytowanej, korzystnie wklonowaną w dwa miejsca rozpoznawane przez enzym restrykcyjny Bsal.
5. 5. Wypełniona kaseta kierująca sgRNA według zastrz. 4, znamienna tym, że jako sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej zawiera sekwencję wybraną z grupy obejmującej:

   a) sekwencję zawierającą 21-nukleotydową sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej docelowego genu (spacer), korzystnie w postaci dwuniciowego oligonukleotydu DNA o następującej strukturze:

   5'-CT TGNNNNNNNNNNNNNNNNNNN-3'

   3'-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNCAAA-5' gdzie N oznacza dowolnie wybrany nukleotyd,

   b) sekwencję PTG (polycistronic tRNA/gRNA) o strukturze przedstawionej na Fig. 4 zawierającą kilka pojedynczych sekwencji zawierających 20 lub 21-nukleotydową sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej docelowego genu (spacerów) rozdzielonych krótkimi sekwencjami tRNA.
6. 6. Wypełniona kaseta kierująca sgRNA według zastrz. 4 albo 5, znamienna tym, że zawiera 21-nukleotydową sekwencję komplementarną do sekwencji edytowanej docelowego genu (spacer) wybraną spośród: sekw. nr 5-7.
7. 7. Wypełniona kaseta kierująca sgRNA według zastrz. 5 albo 6, znamienna tym, że zawiera sekwencję PTG posiadającą sekwencję nukleotydową przedstawioną, jako sekw. nr 8.
8. 8. Zestaw do wytwarzania systemu Cas9/sgRNA do edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia, znamienny tym, że zawiera syntetyczny gen endonukleazy Cas9 określony w zastrz. 1 oraz pustą kasetę kierującą sgRNA określoną w zastrz. 2-3.
9. 9. System Cas9/sgRNA do edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia, znamienny tym, że zawiera syntetyczny gen endonukleazy Cas9 określony w zastrz. 1 oraz wypełnioną kasetę kierującą sgRNA określoną w zastrz. 4-7.
10. 10. Zestaw według zastrz. 8 albo system według zastrz. 9, znamienny tym, że ma postać wektora plazmidowego.
11. 11. Sposób edytowania genomu rośliny jednoliściennej, zwłaszcza jęczmienia, znamienny tym, że do komórki roślinnej wprowadza się system Cas9/sgRNA określony w zastrz. 10, następnie izoluje się komórki, które uległy transformacji i odtwarza z nich rośliny transgeniczne.
12. 12. Sposób według zastrz. 11, znamienny tym, że system Cas9/sgRNA wprowadza się do komórek niedojrzałych zarodków jęczmienia za pomocą Agrobacterium tumefaciens.