PL235210B1 - Sposób detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej oraz urządzenie do jego realizacji - Google Patents

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest sposób detekcji materiału genetycznego (w tym DNA i RNA) w próbce materiału biologicznego, w szczególności z zastosowaniem technologii LAMP (ang. Loopmediated Isothermal AMPlification) do amplifikacji materiału genetycznego oraz urządzenie do jego realizacji. Przedmiot wynalazku znajduje swoje zastosowanie w szybkiej i mobilnej detekcji patogenów bakteryjnych, wirusowych i grzybowych w pobranym materiale biologicznym.

Aktualnie istnieje zapotrzebowanie na szybkie, tanie oraz skuteczne metody diagnostyczne pozwalające na identyfikację patogenów bakteryjnych, wirusowych i grzybowych, które mogą stanowić zanieczyszczenie mikrobiologiczne, np. produktów żywnościowych.

W opisie amerykańskiego zgłoszenia patentowego US2009061450A1 ujawniono urządzenie do diagnozowania oraz przeprowadzania testów patogenów układu oddechowego, zawierające urządzenie do pobierania próbek z nosa, pojedyncze wejście, jednorazowy wkład mikrofluidyczny do amplifikacji docelowego kwasu nukleotydowego oraz narzędzie z wbudowaną platformą do testowania oraz z elementami do detekcji celu. Urządzenie do pobierania próbek stanowi nośnik próbek, który umieszczany jest w odpowiednim gnieździe we wkładzie mikrofluidycznym tak, że są one ze sobą połączone płynowo i uszczelnione. We wkładzie mikrofluidycznym można wyróżnić szereg komór, w których przeprowadzane są kolejne etapy sposobu testowania patogenów, przy czym w pierwszym etapie następuje izolacja z próbki badanego materiału genetycznego, następnie wyizolowany materiał jest amplifikowany i podlega detekcji. W jednym przykładzie wykonania cytowanego rozwiązania amplifikacja materiału genetycznego realizowana jest przy wykorzystaniu metody LAMP. W komorze reakc yjnej, w której odbywa się amplifikacja, konieczne jest zapewnienie zadanej i stabilnej temperatury, co w przedstawionym rozwiązaniu uzyskano dzięki elementowi grzewczemu ITO nadrukowanemu na urządzenie mikrofluidyczne. Po przeprowadzeniu amplifikacji materiału genetycznego dodawany jest znacznik fluorescencyjny interkalujący z materiałem genetycznym, co umożliwia optyczną detekcję w czasie rzeczywistym.

Z kolei z opisu amerykańskiego zgłoszenia patentowego US2012264132A1 znane jest urządzenie oraz sposób przetwarzania próbek, obejmujący zasadniczo izotermiczną amplifikację kwasów nukleinowych. Urządzenie według cytowanego wynalazku zawiera pierwsze podłoże obejmujące obszary pierwszej populacji, przy czym co najmniej jeden obszar pierwszej populacji posiada co najmniej jeden obszar satelitarny umieszczony w pobliżu co najmniej jednego obszaru, a co najmniej jeden obszar satelitarny jest przystosowany do przechowywania materiału z pierwszego obszaru. Urządzenie zawiera dodatkowo drugie podłoże, na którym uformowany jest obszar drogiej populacji, a pierwsze i drugie podłoże są sprzęgane ze sobą w taki sposób, że względne przemieszczenie pierwszego i drugiego podłoża powoduje umieszczenie co najmniej części obszarów pierwszej populacji w wyrównaniu z co najmniej częścią obszarów drugiej populacji w taki sposób, że są one połączone płynowo. Przeprowadzenie amplifikacji materiału genetycznego z wykorzystaniem wspomnianego urządzenia polega na kontaktowaniu materiału próbki umieszczonego w szeregu pierwszych obszarów, gdzie materiał próbki zawiera docelowy kwas nukleinowy i co najmniej jeden z pierwszych obszarów zawiera co najmniej jedną cząsteczkę docelowego kwasu nukleinowego, z materiałem reagenta umieszczonym w szeregu drugich obszarów, przy czym kontaktowanie realizowane jest poprzez umieszczanie parami co najmniej części pierwszych obszarów i co najmniej części drugich obszarów w bezpośrednim połączeniu płynowym. W wyniku wspomnianego kontaktowania materiałów zachodzi amplifikacja cząsteczki docelowego kwasu nukleinowego.

Z opisu amerykańskiego zgłoszenia patentowego US20140335527A1 znany jest układ oraz sposób mobilnej analizy kwasów nukleinowych oraz białek. Przenośny układ do analizy przyjmuje postać niewielkiego urządzenia bezprzewodowego, z którym użytkownik komunikuje się za pośrednictwem wyświetlacza oraz klawiatury. Przenośny układ do analizy wykorzystuje połączone moduły do ekstrakcji, amplifikacji oraz detekcji kwasów nukleinowych z próbki. Cały proces, łącznie z przetwarzaniem danych, zabiera zazwyczaj nie więcej niż 20 minut. W pierwszym etapie sposobu analizy materiału genetycznego pobraną próbkę biologiczną ładuje się na zintegrowany chip. Można to zrealizować ręcznie przez port wejściowy dla próbki lub za pomocą układu zautomatyzowanego pobieraniu próbki. W zintegrowanym chipie próbka przemieszczana jest do modułu ekstrakcji, w której realizowany jest proces ekstrakcji materiału genetycznego z próbki biologicznej. Następnie wyizolowane kwasy nukleinowe transportowane są do modułu amplifikacji, w której w jednym przykładzie wykonania realizowana jest amplifikacja z zastosowaniem metody LAMP. Moduły ekstrakcji oraz amplifikacji zawierają wszelkie reagenty nie

PL 235 210 B1 zbędne do ich przeprowadzenia. Przeprowadzenie amplifikacji wymaga utrzymania zadanej podwyższonej temperatury, co realizowane może być za pośrednictwem podczerwonych elementów grzewczych. Namnożony materiał genetyczny trafia do modułu detekcji, w którym odbywa się jego wykrywanie, na przykład za pośrednictwem sygnału fluorescencyjnego pochodzącego z odpowiednich znaczników przyłączonych do wykrywanego DNA. W tym celu, jedna z komór do amplifikacji materiału genetycznego może być wstępnie załadowana np. wyznakowanym fluorescencyjnie master mixem reakcji LAMP. Cały zintegrowany chip jest przezroczysty, co umożliwia transmisję wiązek światła do podgrzewania odpowiednich modułów oraz do detekcji sygnału fluorescencyjnego.

Problemem technicznym pozostającym do rozwiązania jest zaproponowanie takiego sposobu detekcji materiału genetycznego (w szczególności DNA i/lub RNA) w próbce materiału biologicznego oraz urządzenia do jego realizacji, które umożliwi szybką detekcję pożądanych patogenów, a przy tym urządzenie będzie proste w budowie, kompletne, mobilne, względnie tanie w wytwarzaniu oraz będzie pozwalało na przechowywanie wkładów reakcyjnych przez dłuższy czas i nie będzie wiązało się z zapewnieniem specyficznych warunków przechowywania, takich jak bardzo niska temperatura. Pożądane jest również by wkłady reakcyjne, stanowiące komponent urządzenia do detekcji patogenu w próbce materiału biologicznego, nadawały się do utylizacji, natomiast samo urządzenie wykazywało ograniczoną energochłonność. Co więcej pożądane jest by opracowany sposób detekcji patogenu ograniczał liczbę niezbędnych etapów, przez co był prostszy i szybszy w realizacji oraz żeby konstrukcja urządzenia do jego realizacji zapewniała zmniejszone ryzyko kontaminacji próbki materiału biologicznego. Nieoczekiwanie wspomniane problemy rozwiązał prezentowany wynalazek.

Pierwszym przedmiotem wynalazku jest sposób detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej obejmujący następujące etapy:

a) próbkę biologiczną wprowadza się do wkładu reakcyjnego, a następnie lub przed tym umieszcza się wkład reakcyjny w urządzeniu pomiarowym,

b) wprowadza się pobraną próbkę biologiczną do komory izolacji,

c) przeprowadza się izolację materiału genetycznego z próbki biologicznej poprzez ogrzewanie komory izolacji,

d) przemieszcza się wyizolowany materiał genetyczny do szeregu komór reakcyjnych,

e) przeprowadza się amplifikację materiału genetycznego poprzez ogrzewanie komór reak- cyjnych.

charakteryzujący się tym, że w komorach reakcyjnych znajdują się zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego wraz z zliofilizowanym znacznikiem fluorescencyjnym interkalującym z wykrywanym materiałem genetycznym, a jednocześnie z etapem amplifikacji materiału genetycznego prowadzi się detekcję sygnału ze znaczników fluorescencyjnych, przy czym komory reakcyjne obejmują komorę testową, obejmującą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią, która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną, która zawiera komponenty reakcji bez starterów, przy czym amplifikacja materiału genetycznego w etapie e) jest prowadzona z jednoczesną kontrolą pozytywną i negatywną, i w etapie c) wiąże się inhibitory reakcji amplifikacji materiału genetycznego na żywicy jonowymiennej, przy czym ogrzewanie komory izolacji i/lub komór reakcyjnych realizowane jest za pośrednictwem szeregu zespołów grzejnych na diodach LED z detektorami temperatury, korzystnie emitujących promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali z zakresu od 350 nm do 530 nm.

W korzystnej realizacji wynalazku próbkę biologiczną pobiera się do układu pobierania próbki, a etap a) realizuje się poprzez wprowadzenie układu pobierania próbki do wkładu reakcyjnego (6).

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku zespół grzejny na diodach LED z detektorami temperatury zawiera optyczny detektor temperatury wykrywający promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie długości fal od 4 μm do 12 μm.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku próbkę biologiczną pobiera się z wykorzystaniem sił kapilarnych do kapilary w układzie pobierania próbki.

Korzystnie zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego obejmują deoksynukleotydy, specyficzne sekwencje starterów, bufor reakcyjny, jony magnezu Mg²⁺, korzystnie w postaci MgSO4, polimerazę zdolną do przeprowadzenia reakcji amplifikacji, korzystnie polimerazę Bst 3.0.

Równie korzystnie zliofilizowany znacznik fluorescencyjny interkalujący z wykrywanym materiałem genetycznym stanowi SYBR Green.

PL 235 210 B1

Jeszcze korzystniej wkład reakcyjny zawiera trzy komory reakcyjne, w tym komorę testową, obejmującą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią, która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną, która zawiera komponenty reakcji bez starterów.

W korzystnej realizacji wynalazku komory reakcyjne stanowią w widoku z góry wycinki koła, uzupełniające się i połączone na środku zastawką lub membraną.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku w etapie c) komorę izolacji ogrzewa się do temperatury 95°C w czasie od 5 min do 10 min.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku w etapie e) komory reakcyjne ogrzewa się do temperatury 65°C przez okres 15-60 min.

Korzystnie etap b) realizowany jest za pośrednictwem pierwszej pompy, korzystnie w postaci zamkniętego membraną zasobnika wody połączonego z komorą wytwarzającą ciśnienie lub tłokiem i mieszkiem.

Równie korzystnie etap d) realizowany jest za pośrednictwem drugiej pompy, korzystnie w postaci pustej komory zamkniętej membraną połączoną z komorą wytwarzającą ciśnienie.

Jeszcze korzystniej sposób obejmuje dodatkowo etap ogrzewania wkładu reakcyjnego do temperatury powyżej 100°C, korzystnie za pośrednictwem szeregu zespołów grzejnych na diodach LED z detektorami temperatury.

Drugim przedmiotem wynalazku jest urządzenie do detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej zawierające wkład reakcyjny oraz urządzenie pomiarowe, przy czym urządzenie pomiarowe zawiera komorę pomiarową posiadającą gniazdo mieszczące wkład reakcyjny, przy czym wkład reakcyjny zawiera komorę izolacji do izolacji materiału genetycznego, która za pośrednictwem kanałów połączona jest z komorami reakcyjnymi do amplifikacji wyizolowanego materiału genetycznego, charakteryzujące się tym, że w komorach reakcyjnych znajdują się zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego wraz z zliofilizowanym znacznikiem fluorescencyjnym interkalującym z wykrywanym materiałem genetycznym, a jednocześnie z etapem amplifikacji materiału genetycznego prowadzi się detekcję sygnału ze znaczników fluorescencyjnych, przy czym trzy komory reakcyjne, obejmują komorę testową, obejmującą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią, która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną, która zawiera komponenty reakcji bez starterów, i komora izolacji zawiera żywicę jonowymienną, przy czym urządzenie pomiarowe zawiera szereg zespołów grzejnych na diodach LED z detektorami temperatury, korzystnie emitujący promieniowanie elektromagnetyczne o długości fal z zakresu od 350 nm do 530 nm, rozmieszczony zasadniczo naprzeciw komory izolacji oraz komór reakcyjnych tak, że strumienie wiązek świetlnych emitowanych przez wspomniany szereg diod LED oświetlają wspomnianą komorę izolacji oraz komory reakcyjne.

W korzystnej realizacji wynalazku urządzenie zawiera rozłączny układ pobierania próbki, przy czym układ pobierania próbki zawiera wtyk, a wkład reakcyjny zawiera gniazdo dopasowane do wspomnianego wtyku i zapewniające stabilne i szczelne połączenie płynowe pomiędzy układem pobierania próbki i wkładem reakcyjnym.

Korzystnie komory reakcyjne stanowią w widoku z góry wycinki koła, uzupełniające się i połączone na środku zastawką lub membraną.

Równie korzystnie układ pobierania próbki zawiera kapilarę, do której pobierana jest próbka biologiczna, połączoną z pierwszą pompą, korzystnie w postaci zamkniętego membraną zasobnika wody połączonego z komorą wytwarzającą ciśnienie lub tłokiem i mieszkiem.

Jeszcze korzystniej zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego obejmują deoksynukleotydy, specyficzne sekwencje starterów, bufor reakcyjny, jony magnezu Mg²⁺, korzystnie w postaci MgSO4, polimerazę zdolną do przeprowadzenia reakcji amplifikacji, korzystnie polimerazę Bst 3.0.

W korzystnej realizacji wynalazku zliofilizowany znacznik fluorescencyjny interkalujący z wykrywanym materiałem genetycznym stanowi SYBR Green.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku wkład reakcyjny zawiera trzy komory reakcyjne, w tym komorę testową, obejmującą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią, która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego

PL 235 210 B1 organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną, która zawiera komponenty reakcji bez starterów.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku wkład reakcyjny zawiera drugą pompę, korzystnie w postaci pustej komory zamkniętej membraną połączoną z komorą wytwarzającą ciśnienie, połączoną z komorą izolacji i wytwarzającą ciśnienie powodujące przemieszczenie wyizolowanego materiału genetycznego z komory izolacji do komór reakcyjnych.

Korzystnie wkład reakcyjny i/lub układ pobierania próbki jest wykonany z polimeru hydrofobowego i stanowi układ w pełni pasywny.

Równie korzystnie komora izolacji oraz komory reakcyjne, jak również druga pompa we wkładzie reakcyjnym, zawierają na kanałach doprowadzających i odprowadzających odpowiednio zawory, korzystnie optyczne.

Jeszcze korzystniej w kanale łączącym komorę izolacji z drugą pompą znajduje się detektor cieczy, korzystnie odbiciowy podczerwieni.

W korzystnej realizacji wynalazku w kanałach odprowadzających z komór reakcyjnych znajdują detektory cieczy, korzystnie odbiciowe podczerwieni.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku komora pomiarowa posiada kontrolowaną izotermiczną temperaturę w zakresie od 4°C do 40°C, realizowaną za pośrednictwem układu grzejnego, korzystnie w postaci modułu Peltiera.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku układ grzejny zawiera przyłączony wentylator oraz radiator, a w komorze pomiarowej umieszczono kierownicę mieszającą powietrze.

Korzystnie komora pomiarowa pokryta jest izolacją termiczną.

Równie korzystnie urządzenie zawiera mechanizm pozycjonowania wkładu reakcyjnego.

Jeszcze korzystniej urządzenie zawiera mechanizm zadawania ciśnienia wywierający ciśnienie na pompie we wkładzie reakcyjnym oraz przeciwlegle ustawiony czujnik ciśnienia.

W korzystnej realizacji wynalazku urządzenie zawiera dodatkowe diody LED UV oświetlające obszar detekcyjny.

W kolejnej korzystnej realizacji wynalazku urządzenie zawiera dodatkowe diody LED do obsługi detektorów cieczy oraz zaworów.

W następnej korzystnej realizacji wynalazku na dnie komory izolacji i/lub komory reakcji umieszczona jest warstwa absorpcyjna całkowicie pochłaniająca energię fotonów, korzystnie wykonana z Cu lub Al pokrytych tlenkami, korzystnie barwionym na czarno AbO3.

Sposób detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej według niniejszego wynalazku pozwala na uniknięcie konieczności modyfikacji próbki materiału biologicznego przed umieszczeniem jej w urządzeniu, co redukuje prawdopodobieństwo kontaminacji, a także umożliwia wykonanie testu wyłącznie przez użytkownika końcowego. Ponadto do przeprowadzenia pełnego testu nie są konieczne dodatkowe urządzenia laboratoryjne ani sterylne warunki przygotowania reakcji. Co więcej, liofilizacja w procesie produkcyjnym składowych reakcji zapewnia znaczne wydłużenie przydatności do użycia wkładu reakcyjnego (nawet ponad rok od daty produkcji), a ponadto nie jest konieczne przechowywanie wkładu reakcyjnego w warunkach chłodniczych. Umieszczenie we wnętrzu komory reakcyjnej specyficznych dla namnażanego fragmentu kwasu nukleinowego starterów dodatkowo zmniejsza podatność procedury na kontaminację, a ponadto ułatwia przeprowadzenie badania użytkownikowi końcowemu. Dodatkowo umieszczenie barwnika w komorze reakcyjnej umożliwia natychmiastową detekcję powstałego produktu reakcji bez podejmowania działania przez użytkownika końcowego i znacząco upraszcza cały proces detekcyjny poprzez zmniejszenie liczby koniecznych do przeprowadzenia etapów. Wkład reakcyjny, jak również układ do pobierania próbki, wykonane są, jako elementy w pełni pasywne, z jednego materiału polimerowego, co pozwala na ich bezpieczną utylizację, wpływając korzystnie na środowisko. Ponadto zastosowane w urządzeniu sterującym diody LED do ogrzewania komory izolacji oraz komór reakcyjnych pozwala zmniejszyć energochłonność całego procesu.

Przykładowe realizacje wynalazku zaprezentowano na figurach rysunku, na którym fig. 1 przedstawia schematyczną reprezentację układu do pobierania próbek oraz wkładu reakcyjnego według jednego przykładu realizacji niniejszego wynalazku, fig. 2 przedstawia wkład reakcyjny według innego przykładu realizacji niniejszego wynalazku, fig. 3 przedstawia wkład reakcyjny według kolejnego przykładu realizacji niniejszego wynalazku, fig. 4 przedstawia różne przykłady realizacji zastawek wykorzystywanych w różnych przykładach realizacji wkładu reakcyjnego, natomiast fig. 5 przedstawia schemat blokowy urządzenia pomiarowego według jednego przykładu realizacji niniejszego wynalazku.

PL 235 210 B1

P r z y k ł a d 1

Urządzenie do detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej według jednej realizacji niniejszego wynalazku zostało częściowo przedstawione schematycznie (bez urządzenia pomiarowego) na figurze 1. Próbka materiału biologicznego (np. krew włośniczkowa, krew pełna, ślina, płyn z jam ciała), pobrana za pomocą układu pobierania próbki 1, zostaje wprowadzona do wkładu reakcyjnego 6, wykonanego z polimeru hydrofilowego pokrytego warstwą antykoagulantu np. cytrynian sodowy, EDTA, za pomocą sił kapilarnych w objętości nieprzekraczającej 1 ml (w przykładzie realizacji przedstawionym na fig. 1 objętość wynosi 10 μΙ). Po wypełnieniu kapilary 2, sygnalizowanym użytkownikowi końcowemu za pomocą znacznika na końcu kanału (nie pokazano), przykładowo poprzez obserwację napełnienia kanału do okienka kontrolnego lub za pomocą sygnału świetlnego i/lub dźwiękowego, materiał biologiczny zostaje przemieszczony za pomocą ciśnienia płynu wypływającego z komory zawierającej wodę przeznaczoną dla diagnostyki molekularnej.

Mieszanina materiału biologicznego oraz wody przedostaje się z kapilary 2 do komory izolacji 7 umieszczonej na jej końcu. W komorze izolacji 7 znajduje się immobilizowana żywica jonowymienna typu Chelex 100 lub inny materiał zdolny do wiązania inhibitorów reakcji amplifikacji materiału genetycznego. Po przedostaniu się mieszaniny dochodzi do podgrzania zawartości komory izolacji 7 do temperatury wyższej bądź równej 70°C przez okres ponad 5 minut. W tym czasie dochodzi do termicznej lizy komórek oraz, w niektórych przypadkach, także nukleokapsydów wirusowych zawartych w materiale biologicznym, doprowadzając tym samym do uwolnienia materiału genetycznego z ich wnętrza. W zależności od rodzaju patogenu, temperatura może zostać podwyższona do wartości 98°C.

Po zakończeniu procesu ogrzewania mieszanina zostaje schłodzona (pasywnie lub aktywnie, np. strumieniem opływającego powietrza za pomocą wentylatora) i przemieszczona do co najmniej jednej komory reakcyjnej 8.1, 8.2, 8.3 o objętości co najmniej 0,1 μl (w przykładzie realizacji przedstawionym na fig. 1 komory reakcyjne 8.1, 8.2, 8.3 posiadają objętość wynoszącą 20 μθ, w której znajduje się umieszczony w procesie produkcyjnym komory liofilizat zawierający odpowiednie ilości substancji niezbędnych do przeprowadzenia specyficznej reakcji izotermalnej amplifikacji i detekcji wybranego, namnożonego w czasie reakcji fragmentu materiału genetycznego. Liofilizacja w procesie produkcyjnym składowych reakcji umożliwia znaczne wydłużenie przydatności do użycia wkładu reakcyjnego (nawet ponad rok od daty produkcji), nie jest także konieczne przechowywanie wkładu reakcyjnego w warunkach chłodniczych. W komorze reakcyjnej 8.1,8.2, 8.3 umieszczony jest również zliofilizowany barwnik interkalujący z DNA. Umieszczenie barwnika w komorze reakcyjnej umożliwia natychmiastową detekcję powstałego produktu reakcji bez podejmowania działania przez użytkownika końcowego. W zależności od użytego barwnika fluorescencyjnego długość światła wzbudzającego barwnik interkalujący jest inna. Barwniki użyte do znakowania dają świecenie widzialne. Barwnik fluorescencyjny interkalujący z DNA (na przykład SYBR Green, EvaGreen, PikoGreen, Bromek Etydyny, Calcein, Oranż akrydyny, Proflawina, Akryflawina oraz inne) służy do detekcji produktu reakcji amplifikacji.

W celu namnożenia specyficznego produktu reakcji mogą zostać użyte poniższe technologie amplifikacji izotermalnej: Loop-mediated isothermal amplification (LAMP); Strand displacement amplification (SDA); Helicase-dependent amplification (HDA); Nicking enzyme amplification reaction (NEAR). W składzie liofilizatu znajdują się dobrane eksperymentalnie ilości deoksynukleotydów (dNTPs); specyficznych sekwencji starterów; składniki buforu reakcyjnego; jony magnezu Mg²⁺; polimeraza zdolna do przeprowadzenia reakcji amplifikacji; w niektórych przypadkach odwrotna transkryptaza oraz inne składniki niezbędne do namnożenia wybranej sekwencji materiału genetycznego. Zestaw starterów (przynajmniej para starterów) o unikalnej sekwencji specyficznej dla genomu danego patogenu wyznacza specyficzność reakcji. Do komory reakcyjnej 8.1,8.2, 8.3 wprowadzana jest woda pochodząca z komory izolacji 7 wraz z rozpuszczonym w niej materiałem genetycznym.

Proces namnażania wybranego fragmentu kwasu nukleinowego zachodzi w komorze reakcyjnej 8.1,8.2, 8.3, w stałej temperaturze wynoszącej co najmniej 40°C przez minimum 5 minut. Specyficzne sekwencje starterów przyłączają się do matrycowego DNA (wyizolowanego we wstępnej komorze izolacji 7), pochodzącego od różnego rodzaju patogenów obecnych w materiale biologicznym. Jeżeli materiałem biologicznym jest RNA, proces namnażania poprzedzony jest odwrotną transkrypcją z wykorzystaniem tzw. random primers, w wyniku czego powstaje cDNA. Po wyznaczeniu specyficzności przez startery polimeraza DNA syntetyzuje komplementarną nić. Podczas procesu LAMP otrzymuje się około 30 μg/μl DNA. Tak duża ilość powstałego dwuniciowego DNA uwidoczniona jest za pomocą barwników interkalujących z materiałem genetycznym. Dzięki dodaniu barwnika fluorescencyjnego do liofilizatu łą

PL 235 210 B1 czenie barwnika z DNA zachodzi jednocześnie z jego namnażaniem, w trakcie trwania reakcji. Po skończonej reakcji mieszanina reakcyjna oświetlana jest światłem o ściśle określonej długości fali, który wzbudza barwnik interkalujący z DNA na zasadzie fluorescencji. Detekcja produktu reakcji odbywa się przez rejestrację za pomocą elementu światłoczułego specyficznej dla użytego barwnika długości fali emitowanej przez kompleks barwnik - dwuniciowe DNA. Konstrukcja wkładu reakcyjnego 6 oraz materiał, z którego został wykonany (tj. przezroczysty polimer), umożliwia transmisję światła zarówno wzbudzającego kompleks barwnik - DNA, jak i światła emitowanego przez ten kompleks. Wynik interpretowany jest na zasadzie obecności świecenia lub jego braku (pozytywny wynik - obecne świecenie, negatywny - brak świecenia).

P r z y k ł a d 2

W niniejszym przykładzie realizacji urządzenie do detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej zawiera w ogólności trzy główne elementy, tj. urządzenie pomiarowe (przedstawione w postaci schematu blokowego na fig. 5), wkład reakcyjny 6 oraz układ pobierania próbki 1. Na figurze 1 przedstawiono schematycznie konstrukcję jednego, nieograniczającego przykładu realizacji wkładu reakcyjnego 6 oraz układu pobierania próbki 1. Połączony układ pobierania próbki 1 oraz wkład reakcyjny 6 umieszcza są w urządzeniu pomiarowym, które ma za zadanie sterować i kontrolować cały proces analizy materiału genetycznego. Urządzenie pomiarowe przyjmuje postać niewielkiego mobilnego urządzenia na wzór telefonu komórkowego, które zawiera gniazdo mieszczące wkład reakcyjny 6.

Układ pobierania próbki 1 zawiera kapilarę 2 służącą do pobierania krwi, która połączona jest z komorą wody, stanowiącą zamknięty membraną zasobnik wody połączoną z komorą wytwarzającą ciśnienie. Taki układ realizuje zadanie pierwszej pompy P1 wytwarzającej ciśnienie wypychające wodę z komory wody przez kapilarę 2 z pobraną próbką materiału biologicznego. Prawidłowe działanie układu pobierania próbki 1 zapewnia odpowietrzenie 3, stanowiące rozgałęzienie kapilary 2 oraz sterowane wspólnie zawory Z1 i Z2. W trakcie użycia układ pobierania próbki 1 kontaktuje się z płynnym materiałem biologicznym (np. krwią), gdzie pod wpływem działania sił kapilarnych napełniana jest kapilara 2. W trakcie napełniania kapilary 2 materiałem biologicznym zawór Z1 jest otwarty, natomiast zawór Z2 jest zamknięty, co zapewnia prawidłowe działanie układu. Po napełnieniu kapilary 2 materiałem biologicznym umieszcza się układ pobierania próbki 1 we wkładzie reakcyjnym 6.

Szczelne i stabilne połączenie tych elementów zapewniają dopasowane do siebie wtyk 4 w układzie pobierania próbki 1 oraz gniazdo 5 we wkładzie reakcyjnym 6. Połączenie tego wtyku 4 z gniazdem 5 zapewnia stabilne i uszczelnione połączenie płynowe pomiędzy układem pobierania próbki 1 oraz wkładem reakcyjnym 6. Po umieszczeniu układu pobierania próbki 1 we wkładzie reakcyjnym 6 następuje zamknięcie zaworu Z1, otwarcie zaworu Z2 oraz aktywacja pierwszej pompy P1 (tj. zamkniętego membraną zasobnika wody połączonego z komorą wytwarzającą ciśnienie). Aktywacja pierwszej pompy P1 następuje poprzez mechaniczne ściskanie komory. Sposób aktywacji pierwszej pompy P1 nie stanowi w tym przypadku ograniczenia i do transportu cieczy można zastosować dowolny sposób znany w stanie techniki, np. poprzez podgrzewanie diodami LED substancji o dużym współczynniku rozszerzalności termicznej. Operacja ta powoduje wypłukanie pobranego materiału biologicznego z kapilary 2 wraz z wodą z komory wody. Mieszanina wody oraz materiału biologicznego transportowana jest odpowiednim kanałem do komory izolacji 7. W komorze izolacji 7 znajduje się materiał zdolny do wiązania inhibitorów reakcji amplifikacji materiału genetycznego, a komora izolacji 7 ma dostęp do komory wody. Do tej komory izolacji 7 dostarczany jest pobrany materiał biologiczny. Pojemność tej komory izolacji wynosi około 100 pl. Z komory izolacji 7 rozciąga się kanał łączący z pustą komorą zamkniętą membraną połączoną z komorą wytwarzającą ciśnienie, stanowiące drugą pompę P2 wytwarzającą ciśnienie. Połączenie komory izolacji 7 z drugą pompą P2 odbywa się poprzez podczerwony odbiciowy detektor cieczy D1 oraz normalnie otwarty zawór Z3. Druga pompa P2 z kolei połączona jest poprzez normalnie otwarty zawór Z4 z odpowietrzeniem 9 zlokalizowanym na końcu wkładu reakcyjnego 6, przeciwległym do gniazda wtykowego 5. Taka konfiguracja zaworów Z3 i Z4 umożliwia wprowadzanie mieszaniny materiału biologicznego i wody przez komorę izolacji 7 dalej w kierunku drugiej pompy P2. Po osiągnięciu przez badaną mieszaninę detektora cieczy D1 sygnalizowane jest napełnienie komory izolacji 7 i następuje zamknięcie zaworu Z11 oraz Z3. Następnie w komorze izo lacji 7 materiał biologiczny ogrzewany jest do odpowiedniej temperatury przez określony cykl czasowy, co powoduje uwolnienie materiału genetycznego zamkniętego w komórkach/otoczce białkowej.

Po skończonym etapie izolacji materiału genetycznego z pobranej próbki następuje otwarcie zaworów Z3, Z5, Z6 i Z7 oraz aktywacja drugiej pompy P2. Zawory Z5, Z6 oraz Z7 rozmieszczone są na osobnych kanałach łączących komorę izolacji 7 z odpowiednimi komorami reakcyjnymi 8.1, 8.2, 8.3.

PL 235 210 B1

Każda komora reakcyjna 8.1,8.2, 8.3 połączona z kolei jest z odpowiednim odpowietrzeniem 9 zlokalizowanym na brzegu wkładu reakcyjnego 6, poprzez detektory obecności cieczy odpowiednio D1, D2, D3 (odbiciowe podczerwieni) oraz normalnie otwarte zawory odpowiednio Z8, Z9, Z10. Uruchomienie drugiej pompy P2, wraz z konfiguracją zaworów Z5, Z6, Z7 oraz Z8, Z9, Z10 umożliwia przemieszczenie wyizolowanego materiału genetycznego do komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3. Po otrzymaniu sygnału z detektorów obecności cieczy D1, D2, D3 następuje zamknięcie zaworów odpowiednio Z8, Z9, Z10. W następnej kolejności zamykane są zawory Z5, Z6 oraz Z7. W ten sposób komory reakcyjne 8.1,8.2, 8.3 zostają napełnione wyizolowanym materiałem genetycznym. Komory reakcyjne 8.1,8.2, 8.3 zawierają w swojej objętości zliofilizowane odczynniki, zawierające wszelkie niezbędne składniki do przeprowadzenia amplifikacji materiału genetycznego. Znajdujący się w komorach reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 master mix zawiera również zliofilizowany barwnik fluorescencyjny interkalujący z materiałem genetycznym. Pojemność komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 zawiera się w przedziale od 20 μl do 25 gl. W niniejszym przykładzie realizacji przewidziano trzy komory reakcyjne 8.1,8.2, 8.3, w których można wyróżnić komorę testową 8.1, zawierającą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią 8.2, która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną 8.3, która nie zawiera starterów, lecz pozostałe komponenty reakcji. Komora z kontrolą dodatnią 8.2 ma pozwalać na kontrolę polimerazy, warunków temperaturowych oraz procesu izolacji materiału genetycznego. Komora z kontrolą negatywną 8.3 pozwala na kontrolę procesu liofilizacji (np. sterylność) oraz kontrolę poprawności zachowania zaworów, co mogłoby powodować zmieszanie się zawartości tych komór reakcyjnych. Oczywiście liczba zastosowanych komór nie stanowi ograniczenia niniejszego wynalazku, a specjalista w dziedzinie chcąc uzyskać przykładowo jednoczesną analizę w kierunku różnych patogenów zastosuje rutynowo zwiększoną liczbę komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3.

W celu przeprowadzenia amplifikacji materiału genetycznego komory reakcyjne 8.1,8.2, 8.3 zostają następnie wygrzane do odpowiednich temperatur, co powoduje namnożenie materiału genetycznego. Jednocześnie z amplifikacją (albo następująco) prowadzona jest detekcja sygnału fluorescencyjnego pochodzącego z zastosowanego znacznika fluorescencyjnego przyłączonego do amplifikowanego materiału genetycznego. Przyrost produktu równy jest przyrostowi intensywności światła generowanego przez zastosowany znacznik fluorescencyjny.

Po całym procesie i odczycie wyniku przez układ optyczny z kamerą 28, obszary zawierające materiał biologiczny podgrzewane są diodami LED UV 29 emitującymi promieniowanie o długości fali z zakresu od 350 nm do 450 nm (lub laserem) do temperatury 150°C przez od 2 do 3 sekund celem neutralizacji zagrożenia biologicznego. Przy mniejszej mocy strumienia UV wspomniane diody LED UV 29 służą jednocześnie do wzbudzenia fluorescencji (oświetlenia wkładu reakcyjnego 6). Naświetlenie UV powoduje zniszczenie materiału biologicznego oraz depolimeryzację materiału wkładu reakcyjnego 6 co redukuje zagrożenie biologiczne i powoduje rozpad polimeru, wpływając korzystnie na ochronę środowiska oraz zapewniając właściwą utylizację.

W całym procesie analizy materiału biologicznego obróbka termiczna ciekłego materiału biologicznego prowadzona jest w komorze izolacji 7 oraz w komorach reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3. Energia konieczna do ogrzania komory izolacji 7 oraz komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 przekazywana jest bezkontaktowo. Źródłem energii są diody elektroluminescencyjne LED, emitujące promieniowanie świetlne z zakresu UV-VIS. Przykładowo długość fali emitowana przez diody LED może być wybrana z zakresu od 350 nm do 500 nm. Diody elektroluminescencyjne umieszczone są wewnątrz urządzenia pomiarowego i są tak rozmieszczone, że oświetlają obszar komory izolacji 7 oraz komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3. Dzięki zastosowaniu przezroczystego materiału na budowę wkładu reakcyjnego 6, który charakteryzuje się wysoką transmisją światła, możliwe jest zastosowanie energooszczędnego sposobu ogrzewania odpowiednich komór. Temperatura komory reakcyjnej 8.1, 8.2, 8.3 oraz izolacji 7 kontrolowana jest bezkontaktowo za pomocą pirometru z cyfrowym blokiem przetwarzania. Całość systemu kontrolowana jest za pomocą sterownika mikroprocesorowego z oprogramowaniem wbudowanym. Co więcej, w urządzeniu pomiarowym przewidziano również diodę LED UV małej mocy, która służy do oświetlania wnętrza reaktora, koniecznego do rejestracji obrazu przez matrycę CCD. Detekcja produktu reakcji biochemicznej oparta jest na określaniu skwantowanych poziomów sygnałów z kanałów RGB detektora CCD. Konstrukcja urządzenia pozwala na ciągłą rejestrację sygnałów barwnych. Wykorzystanie diody oświetlającej pozwala na ciągłą rejestrację obrazu przez detektor urządzenia, gdyż nie jest konieczne ciągłe oświetlanie próbki zewnętrznym źródłem światła.

PL 235 210 B1

Konstrukcja urządzenia pomiarowego według jednej realizacji niniejszego wynalazku została przedstawiona w postaci schematu blokowego na fig. 5. W ogólności, w urządzeniu pomiarowym można wyróżnić komorę pomiarową 10, która jest tak skonstruowana, że przyjmuje wkład reakcyjny 6. W celu odpowiedniego umiejscowienia wkładu reakcyjnego 6 w komorze pomiarowej 10 przewidziano mechanizm pozycjonowania 11 wkładu reakcyjnego 6. Komora pomiarowa 10 stanowi konstrukcję zamkniętą, która pokryta jest z zewnątrz izolacją termiczną 12, ułatwiającą utrzymywanie zadanej temperatury wewnątrz. Utrzymywanie kontrolowanej izotermicznie temperatury wewnątrz komory pomiarowej 10 (np. w zakresie od 4°C do 40°C) zapewnia układ grzewczy 13 (np. w postaci modułu Peltiera). W celu odpowiedniego rozprowadzenia ogrzanego powietrza wewnątrz komory pomiarowej 11 zastosowano wentylator 14 oraz kierownicę mieszającą powietrze 22. Efektywność układu grzewczego 13 zapewnia również umiejscowiony na zewnątrz komory pomiarowej 10 radiator 15. Urządzenie pomiarowe zawiera dodatkowo kolejne bloki, niezbędne do prawidłowego funkcjonowania urządzenia, takie jak moduł pomiarowy sterowania i analizy obrazu 16, moduł komunikacji 17, moduł zasilacza 18 oraz wyświetlacz 19. Funkcjonalność wymienionych powyżej bloków, a zarazem ich konstrukcja, są znane specjalistom w dziedzinie, dlatego ich dokładny opis pominięto w celu uproszczenia czynionych rozważań. W komorze pomiarowej 10 urządzenia pomiarowego przewidziano również mechanizm zadawania ciśnienia 20, który ma za zadanie uruchomić pompę P1 we wkładzie reakcyjnym 6. Do kontroli zadawanego ciśnienia na pompie P1 umieszczono przeciwległe czujnik ciśnienia 21. Aby zapewnić odpowiednią temperaturę w komorze izolacji 7 oraz komorach reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 zapewniono w komorze pomiarowej 10 szereg zespołów grzejnych 23, które są tak umiejscowione względem wkładu reakcyjnego 6, że emitowane strumienie świetlne oświetlają odpowiednio komorę izolacji 7 oraz komory reakcyjne 8.1,8.2, 8.3. Bardziej szczegółowo każdy zespół grzejny 23 składa się z diod LED z radiatorami 24, detektora temperatury 25 oraz stabilizatora detektora temperatury 26. Ogrzewanie komory izolacji 7 oraz komory reakcyjnej 8.1, 8.2, 8.3 odbywa się diodami LED o regulowanym ciągłym strumieniu energii fotonów w zakresie od 400 nm do 500 nm, co jest korzystne ze względu na wysoką sprawność emisji fotonów i przekłada się na dużą moc docierającą do warstwy absorpcyjnej na dnie komór izolacji 7 i reakcyjnej 8.1,8.2, 8.3. W celu wyrównania temperatury dna komory 7, 8.1,8.2, 8.3 i absorpcji energii, niedopuszczenia do degradacji zliofilizowanego materiału biologicznego w komorach 8.1, 8.2, 8.3, zastosowano warstwę absorpcyjną pochłaniającą całkowicie energię fotonów. Warstwa jest wykonana z materiałów np. Cu, Al pokrytych tlenkami (w niniejszym przykładzie ALO3 barwionego na czarno) lub innych materiałów o dobrych właściwościach absorpcyjnych i dobrej przewodności cieplnej (w tym modyfikowane polimery np. węglem lub grafenem).

Szybkość narostu temperatury w czasie w komorach 7, 8.1,8.2, 8.3 jest realizowana przez zwiększenie mocy strumienia światła, a opadania przez izotermiczną komorę pomiarową 10 o temperaturze od 4°C do 40°C. Przy stałej rezystancji termicznej komory izolacji 7 lub reakcyjnej 8.1, 8.2, 8.3 do otoczenia zmieniając temperaturę otoczenia wkładu reakcyjnego 6 można regulować szybkość opadania temperatury. W zależności od potrzebnej szybkości opadania temperatury ustalana jest temperatura wewnątrz urządzenia (tj. w komorze pomiarowej 10) i dostarczana jest odpowiednia moc do warstwy absorpcyjnej komór 7, 8.1, 8.2, 8.3. W ten sposób można uzyskać dowolny profil temperaturowy w zakresie od 25°C do 100°C z dużymi szybkościami narostu i opadania temperatury. Warstwa absorpcyjna komór posiada dużą przewodność cieplną co niweluje ewentualne niejednorodności strumienia światła z diod LED, jak i zapewnia brak gradientów temperatury w obszarze komór roboczych.

Dzięki temu, że pomiar temperatury wykonywany jest detektorem temperatury 25 np. w postaci pirometru z wbudowanym filtrem przepuszczającym promieniowanie w zakresie od 8 μm do 12 μm, możliwe jest jednoczesne mierzenie temperatury i dostarczanie energii do komór izolacji 7 i reakcyjnej 8.1, 8.2, 8.3. W tym przypadku nie występują okresy braku kontroli nad sterowaniem temperaturą w komorach izolacji 7 i reakcyjnych 8.1,8.2, 8.3. Ponadto nie obserwuje się pików temperatury związanych z pracą regulatora PID oraz nie ma potrzeby sterowania mocą za pomocą modulacji impulsowej PWM, co wpływa korzystnie na powstawanie mniejszego szumu termicznego.

Dodatkowo do obsługi zaworów Z1-Z11 oraz detektorów cieczy D1-D4 przewidziano szereg diod LED 27, analogicznie tak ustawionych, że strumień generowanego światła oświetla dane urządzenie. W komorze pomiarowej 10 zastosowano również układ optyczny z kamerą 28, który może przyjąć postać detektora CCD i ma za zadanie dokonać detekcji powstałego w wyniku reakcji w komorze reakcji 8.1,8.2, 8.3 sygnału świetlnego pochodzącego z barwników fluorescencyjnych. Aby to umożliwić przewidziano również diody LED UV 29, które oświetlają obszar detekcji.

PL 235 210 B1

P r z y k ł a d 2

Na fig. 2 przedstawiono schematycznie inny przykład realizacji wkładu reakcyjnego 6 stosowanego w urządzeniu do detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej według niniejszego wynalazku. Ogólna budowa i zasada działania wkładu reakcyjnego 6 przedstawionego w niniejszym przykładzie realizacji jest zbieżna z budową i zasadą działania wkładu reakcyjnego 6 przedstawionego w przykładzie 1. Zasadniczą różnicą pomiędzy porównywanymi wkładami reakcyjnymi 6 jest to, że we wkładzie reakcyjnym 6 z przykładu 2 zastosowano integralny układ pobierania próbki 1 (nie stanowi on osobnego urządzenia, jak to miało miejsce w pierwszym przykładzie realizacji niniejszego wynalazku). Wkład reakcyjny 6 stanowi, zatem zwartą konstrukcję, pozbawioną odłączalnych elementów. W tym przypadku pobrany materiał biologiczny jest wprowadzany do układu pobierania próbki 1, który stanowi integralną część wkładu reakcyjnego 6. Również w tym przykładzie można wyróżnić kapilarę 2, która dzięki siłom kapilarnym pobiera materiał biologiczny. Na drugim końcu kapilary 2 przewidziano okno kontrolne 30, sygnalizujące o napełnieniu kapilary 2 materiałem biologicznym. W niniejszym przykładzie realizacji pierwsza pompa P1 realizowana jest za pośrednictwem elementów mechanicznych, takich jak tłok i mieszek. Należy w tej realizacji podkreślić, że woda do karty reakcyjnej 6 dostarczana jest w postaci kapsułek, co umożliwia ich łatwą sterylizację oraz możliwość rozdzielenia mokrego procesu przy produkcji kart reakcyjnych 6. Uwolnienie wody następuje tuż przed testem i odbywa się przez wkłucie igły 31 w momencie, kiedy zaczyna działać pompa P1. Transport próbki materiału biologicznego oraz produktów z komory izolacji 7 do komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 zapewnia pompa P1 przez tłoczenie wody z kapsułki. Upraszcza to sterowanie procesami w urządzeniu. Odpowiednie ciśnienie podczas ogrzewania zapewnione jest przez czujnik ciśnienia 21 w urządzeniu pomiarowym oraz odpowiednie sterowanie zaworami Z5, Z8, Z9, Z10. W tym przykładzie realizacji na uwagę zasługuje również konstrukcja komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3. Każda z komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 tworzy w widoku z góry uzupełniający się wycinek koła. Komory reakcyjne 8.1, 8.2, 8.3 uzupełniają się tworząc obszar kołowy obejmujący wszystkie komory reakcyjne 8.1,8.2, 8.3, połączone w środku za pomocą zastawki lub membrany 33. W tym przykładzie realizacji można zastosować rozmaite konstrukcje zastawek 33, które nie wpływają na ogólność przedstawionego rozwiązania. Przykładowe zastawki 33, możliwe do zastosowania w wkładach reakcyjnych 6, przedstawiono na fig. 4 A-D, odpowiednio zastawkę okrągłą hydrofobową, zastawkę okrągłą hydrofobowo-mechaniczną, zastawkę eliptyczną hydrofobowo-mechaniczną, zastawkę prostokątną hydrofobowo-mechaniczną. Przedstawione zastawki mechaniczne działają na zasadzie odkształcenia elastycznego materiału, z którego została wykonana zastawka. Potrzebna jest do tego określona siła, która jednocześnie definiuje ciśnienie, po przekroczeniu, którego następuje przepływ cieczy w danym kierunku. Kształt zastawki jest taki, że w drugim kierunku odkształcenie elastyczne jest zablokowane co powoduje zablokowanie przepływu cieczy dla tego kierunku. Zastawki hydrofobowe działają na takiej zasadzie, że ciecz musi pokonać siły napięcia powierzchniowego w zetknięciu z hydrofobowym materiałem zastawki (natomiast powietrze przepływa swobodnie). Dzięki temu można blokować przepływ cieczy w kanale do określonego ciśnienia zależnego od średnicy otworu w zastawce i hydrofobowości materiału, z którego wykonana jest zastawka. W przypadku konieczności jednoczesnego wypełnienia trzech kanałów cieczą po umieszczeniu na końcach kanałów zastawek hydrofobowych nastąpi automatyczne ich wypełnienie. Powietrze wypłynie bez przeszkód, a ciecz zatrzyma się kolejno na tych zastawkach, ponieważ do przepłynięcia cieczy przez zastawki potrzebne będzie większe ciśnienie. Kombinacja tych dwóch rodzajów zastawek umożliwia uproszczenie w sterowaniu procesami przepływu cieczy we wkładzie reakcyjnym 6.

Ponadto w niniejszym przykładzie realizacji nie zastosowano dodatkowej pompy P2 oraz zasadniczo zmniejszono liczbę wykorzystywanych zaworów (w porównaniu do wkładu reakcyjnego 6 według pierwszego przykładu realizacji). Dodatkowo dzięki konstrukcji komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 kanały odprowadzające wyprowadzone w kierunku trzech różnych krawędzi wkładu reakcyjnego 6, a przed odpowietrzeniami 9 zastosowano komory kompensacyjne 33, w celu niedopuszczenia do wypłynięcia cieczy na zewnątrz wkładu reakcyjnego 6 do urządzenia pomiarowego.

Pozostałe elementy konstrukcyjne oraz zasada działania wkładu reakcyjnego 6 są zbieżne z tym, co ujawniono na pierwszego przykładu realizacji wkładu reakcyjnego 6.

P r z y k ł a d 3

Wkład reakcyjny 6 przedstawiony na fig. 3, stanowiący kolejny przykład realizacji niniejszego wynalazku, różni się od wkładu reakcyjnego 6 przedstawionego na fig. 2 jedynie tym, że w każdej komorze reakcyjnej 8.1,8.2, 8.3 zastosowano po dwie zastawki 33 (na wejściu i wyjściu komory reakcyjnej 8.1, 8.2, 8.3) oraz kanał łączący 34, który ma na celu zapewnić stabilny i kontrolowany przepływ cieczy

PL 235 210 B1 w jednym kierunku przy zmianach ciśnienia spowodowanych podgrzewaniem komór reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3. W przedstawionym w niniejszym przykładzie realizacji rozwiązaniu, w przeciwieństwie do rozwiązania przedstawionego w drugim przykładzie realizacji, nie występują zawory Z8 oraz Z10 co znacząco upraszcza konstrukcję wkładu reakcyjnego 6 oraz jego obsługę. Kanał łączący 34 służy do odpowietrzenia komór reakcyjnych 8.1,8.2, 8.3. Dzięki temu, że zastawki zapobiegają cofaniu się cieczy, nie dochodzi do niekontrolowanego mieszania się cieczy w komorach reakcyjnych 8.1,8.2, 8.3. Umieszczenie po dwie zastawki w komorach reakcyjnych 8.1,8.2, 8.3 pozwala na zastosowanie tylko jednego zaworu normalnie otwartego na wyjściu w celu zapewnienia prawidłowej pracy układu.

P r z y k ł a d 4

Detekcja wirusa HIV we krwi z wykorzystaniem sposobu według niniejszego wynalazku oraz urządzenia według niniejszego wynalazku.

Do analizy obecności wirusa HIV w próbce pobranej od pacjenta zastosowano sposób i urządzenie do detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej według niniejszego wynalazku, opisane szczegółowo w przykładach 1 oraz 2. W komorze izolacji 7 zastosowano Chelex 100. Izolacja DNA polega na termicznej degradacji błony komórkowej komórek lub otoczki białkowej wirusów i uwolnieniu materiału genetycznego, który jest zamknięty w komórkach/otoczce białkowej wirusa. Chelex 100 jest niezbędny do wyłapywania inhibitorów, które mogą blokować polimerazę i dawać wyniki fałszywie ujemne. Chelex 100 sporządzany jest jako mieszanina 5% w wodzie dejonizowanej, wolnej od nukleaz, może on także być immobilizowany na dnie komory izolacyjnej w postaci, porowatej warstwy. W celu przeprowadzenia izolacji w komorze izolacji krew ogrzewana jest w temperaturze 95°C przez 5-10 min.

W komorach reakcyjnych znajdują się zliofilizowane odczynniki, obejmujące: bufor, dNTPs, MgSO4, Mix starterów, Polimeraza Bst 3.0, SYBR Green. Amplifikacja materiału genetycznego realizowana jest w komorach reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 poprzez ogrzewanie w temperaturze 65°C przez 30 min. W komorze testowej 8.1 znajdują się specyficzne startery dla HIV. W komorze z kontrolą dodatnią 8.2 endogenną znajdują się specyficzne startery dla ludzkiego genu. W komorze z kontrolą negatywną 8.3 nie ma dodatku starterów, lecz zawiera ona pozostałe komponenty reakcji. Reakcja LAMP oraz detekcja - przebiega w komorach reakcyjnych 8.1, 8.2, 8.3 i polega na amplifikacji materiału genetycznego danego patogenu (oraz materiału genetycznego ludzkiego dla kontroli endogennej) za pomocą enzymu polimerazy Bst 3.0. Specyficzne startery dodawane do reakcji przyłączają się do wybranych fragmentów badanego genomu i wyznaczają fragment powielany w reakcji. Po zakończeniu reakcji powstaje około 10-50 pg/pl amplifikowanego fragmentu DNA. Obecny w mieszaninie reakcyjnej SYBR Green łączy się z produktem reakcji i w momencie połączenia z dwuniciowym DNA nabiera właściwości fluorescencyjnych (świeci po wzbudzeniu światłem odpowiedniej długości). Przyrost produktu równy jest przyrostowi świecenia pochodzącego od barwinka. Po zakończeniu reakcji w przypadku wyniku dodatniego i namnożenia badanego fragmentu obserwowalne jest świecenie, w przypadku wyniku ujemnego nie występuje świecenie. Pozostałe komponenty reakcji (bufor, MgSO4, dNTPs) dodawane są w celu zapewniania odpowiednich warunków pracy dla polimerazy Bst 3.0.

W procesie izolacji materiału DNA/RNA w komorze reakcyjnej następuje już neutralizacja patogenu. Jedynym zagrożeniem mogą być pozostałości materiału genetycznego w kapilarze 2 lub kanałach we wkładzie reakcyjnym 6. Przez to po przeprowadzeniu detekcji następuje utylizacja pozostałości materiału genetycznego, która jest realizowana naświetlanie wkładu reakcyjnego 6 (w szczególności komory izolacji 7 oraz komór reakcyjnych 8.1,8.2, 8.3) promieniowaniem UV w celu podgrzania poszczególnych elementów do temperatury powyżej 100°C i przez to utylizację materiału genetycznego. Takie postępowanie pozwala na bezpieczne wyrzucenie zużytego wkładu reakcyjnego 6, bez konieczności przeprowadzania skomplikowanych procedur utylizacyjnych.

Claims (33)

1. Sposób detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej obejmujący następujące etapy:

a) próbkę biologiczną wprowadza się do wkładu reakcyjnego (6), a następnie lub przed tym umieszcza się wkład reakcyjny (6) w urządzeniu pomiarowym,

b) wprowadza się pobraną próbkę biologiczną do komory izolacji (7),

c) przeprowadza się izolację materiału genetycznego z próbki biologicznej poprzez ogrzewanie komory izolacji (7),

PL 235 210 B1

d) przemieszcza się wyizolowany materiał genetyczny do szeregu komór reakcyjnych (8,1, 8.2, 8.3),

e) przeprowadza się amplifikację materiału genetycznego poprzez ogrzewanie komór reakcyjnych (8.1,8.2. 8.3).

znamienny tym, że w komorach reakcyjnych (8.1, 8.2, 8.3) znajdują się zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego wraz z zliofilizowanym znacznikiem fluorescencyjnym interkalującym z wykrywanym materiałem genetycznym, a jednocześnie z etapem amplifikacji materiału genetycznego prowadzi się detekcję sygnału ze znaczników fluorescencyjnych, przy czym komory reakcyjne (8.1,8.2, 8.3) obejmują komorę testową (8.1), obejmującą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią (8.2), która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną (8.3), która zawiera komponenty reakcji bez starterów, przy czym amplifikacja materiału genetycznego w etapie e) jest prowadzona z jednoczesną kontrolą pozytywną i negatywną, i w etapie c) wiąże się inhibitory reakcji amplifikacji materiału genetycznego na żywicy jonowymiennej, przy czym ogrzewanie komory izolacji (7) i/lub komór reakcyjnych (8.1,8.2, 8.3) realizowane jest za pośrednictwem szeregu zespołów grzejnych na diodach LED z detektorami temperatury (23), korzystnie emitujących promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali z zakresu od 350 nm do 530 nm.

2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że próbkę biologiczną pobiera się do układu pobierania próbki (1), a etap a) realizuje się poprzez wprowadzenie układu pobierania próbki (1) do wkładu reakcyjnego (6).

3. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że zespół grzejny na diodach LED z detektorami temperatury (23) zawiera optyczny detektor temperatury (25) wykrywający promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie długości fal od 4 μm do 12 μm.

4. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 3, znamienny tym, że próbkę biologiczną pobiera się z wykorzystaniem sił kapilarnych do kapilary (2) w układzie pobierania próbki (1).

5. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 4, znamienny tym, że liofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego obejmują deoksynukleotydy, specyficzne sekwencje starterów, bufor reakcyjny, jony magnezu Mg²⁺, korzystnie w postaci MgSO4, polimerazę zdolną do przeprowadzenia reakcji amplifikacji, korzystnie polimerazę Bst 3,0.

6. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 5, znamienny tym, że zliofilizowany znacznik fluorescencyjny interkalujący z wykrywanym materiałem genetycznym stanowi SYBK Green.

7. Sposób według zastrz. 6, znamienny tym, że komory reakcyjne (8.1, 8.2, 8.3) stanowią w widoku z góry wycinki koła, uzupełniające się i połączone na środku zastawką lub membraną (33).

8. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 7, znamienny tym, że w etapie c) komorę izolacji (7) ogrzewa się do temperatury 95°C w czasie od 5 min do 10 min.

9. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 8, znamienny tym, że w etapie e) komory reakcyjne (8.1,8.2, 8.3) ogrzewa się do temperatury 65°C przez okres od 15 min do 60 min.

10. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 9, znamienny tym, że etap b) realizowany jest za pośrednictwem pierwszej pompy (P1), korzystnie w postaci zamkniętego membraną zasobnika wody połączonego z komorą wytwarzającą ciśnienie lub tłokiem i mieszkiem.

11. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 10, znamienny tym, że etap d) realizowany jest za pośrednictwem drugiej pompy (P2), korzystnie w postaci pustej komory zamkniętej membraną połączoną z komorą wytwarzającą ciśnienie.

12. Sposób według któregokolwiek z zastrz. od 1 do 11, znamienny tym, że obejmuje dodatkowo etap ogrzewania wkładu reakcyjnego (6) do temperatury powyżej 100°C, korzystnie za pośrednictwem szeregu zespołów grzejnych na diodach LED z detektorami temperatury (23).

13. Urządzenie do detekcji materiału genetycznego w próbce biologicznej zawierające wkład reakcyjny (6) oraz urządzenie pomiarowe, przy czym urządzenie pomiarowe zawiera komorę pomiarową (10) posiadającą gniazdo mieszczące wkład reakcyjny (6), przy czym wkład reakcyjny (6) zawiera komorę izolacji (7) do izolacji materiału genetycznego, która za pośrednictwem kanałów połączona jest z komorami reakcyjnymi (8.1, 8.2, 8.3) do amplifikacji wyizolowanego materiału genetycznego, znamienne tym, że w komorach reakcyjnych (8.1,8.2, 8.3)

PL 235 210 B1 znajdują się zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego wraz z zliofilizowanym znacznikiem fluorescencyjnym interkalującym z wykrywanym materiałem genetycznym, a jednocześnie z etapem amplifikacji materiału genetycznego prowadzi się detekcję sygnału ze znaczników fluorescencyjnych, przy czym trzy komory reakcyjne (8.1,8.2, 8.3), obejmują komorę testową (8.1), obejmującą specyficzne startery dla badanego materiału genetycznego, komorę z kontrolą dodatnią (8.2), która zawiera startery specyficzne dla określonego fragmentu materiału genetycznego organizmu, z którego pochodzi próbka materiału biologicznego oraz komorę z kontrolą negatywną (8.3), która zawiera komponenty reakcji bez starterów, i komora izolacji (7) zawiera żywicę jonowymienną, przy czym urządzenie pomiarowe zawiera szereg zespołów grzejnych na diodach LED z detektorami temperatury (23), korzystnie emitujący promieniowanie elektromagnetyczne o długości fali z zakresu od 350 nm do 530 nm, rozmieszczony zasadniczo naprzeciw komory izolacji (7) oraz komór reakcyjnych (8.1, 8.2, 8.3) tak, że strumienie wiązek świetlnych emitowanych przez wspomniany szereg diod LED oświetlają wspomnianą komorę izolacji (7) oraz komory reakcyjne (8.1,8.2, 8.3).

14. Urządzenie według zastrz. 13, znamienne tym, że urządzenie zawiera rozłączny układ pobierania próbki (1), przy czym układ pobierania próbki (1) zawiera wtyk (4), a wkład reakcyjny (6) zawiera gniazdo (5) dopasowane do wspomnianego wtyku (4) i zapewniające stabilne i szczelne połączenie płynowe pomiędzy układem pobierania próbki (1) i wkładem reakcyjnym (6).

15. Urządzenie według zastrz. 13 albo 14, znamienne tym, że zawiera dodatkowo moduł pomiarowy sterowania i analizy obrazu (16), moduł komunikacji (17), moduł zasilacza (18) oraz moduł wyświetlacza (19).

16. Urządzenie według zastrz. 15, znamienne tym, że zespół grzejny na diodach LED z detektorami temperatury (23) zawiera optyczny detektor temperatury (25) wykrywający promieniowanie elektromagnetyczne w zakresie długości fal od 4 μm do 12 μm.

17. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 16, znamienne tym, że komory reakcyjne (8.1, 8.2, 8.3) stanowią w widoku z góry wycinki koła, uzupełniające się i połączone na środku zastawką lub membraną (33).

18. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 17, znamienne tym, że układ pobierania próbki (1) zawiera kapilarę (2), do której pobierana jest próbka biologiczna, połączoną z pierwszą pompą (P1), korzystnie w postaci zamkniętego membraną zasobnika wody połączonego z komorą wytwarzającą ciśnienie lub tłokiem i mieszkiem.

19. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 18, znamienne tym, że zliofilizowane odczynniki do amplifikacji materiału genetycznego obejmują deoksynukleotydy, specyficzne sekwencje starterów, bufor reakcyjny, jony magnezu Mg²⁺, korzystnie w postaci MgSO4, polimerazę zdolną do przeprowadzenia reakcji amplifikacji, korzystnie polimerazę Bst 3.0.

20. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 19, znamienne tym, że zliofiliowany znacznik fluorescencyjny interkalujący z wykrywanym materiałem genetycznym stanowi SYBR Green.

21. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 20, znamienne tym, że wkład reakcyjny (6) zawiera drugą pompę (P2), korzystnie w postaci pustej komory zamkniętej membraną połączoną z komorą wytwarzającą ciśnienie, połączoną z komorą izolacji (7) i wytwarzającą ciśnienie powodujące przemieszczenie wyizolowanego materiału genetycznego z komory izolacji (7) do komór reakcyjnych (8.1,8.2, 8.3).

22. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 21, znamienne tym, że wkład reakcyjny (6) i/lub układ pobierania próbki (1) jest wykonany z polimeru hydrofobowego i stanowi układ w pełni pasywny.

23. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 22, znamienne tym, że komora izolacji (7) oraz komory reakcyjne (8.1,8.2, 8.3), jak również druga pompa (P2) we wkładzie reakcyjnym (6), zawierają na kanałach doprowadzających i odprowadzających odpowiednio zawory (Z11), (Z5, Z6, Z7), (Z8, Z9, Z10), (Z3), (Z4), korzystnie optyczne.

24. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 23, znamienne tym, że w kanale łączącym komorę izolacji (7) z drugą pompą (P2) znajduje się detektor cieczy (D1), korzystnie odbiciowy podczerwieni.

25. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 24, znamienne tym, że w kanałach odprowadzających z komór reakcyjnych (8.1.8.2, 8.3) znajdują detektory cieczy (D2, D3, D4), korzystnie odbiciowe podczerwieni.

PL 235 210 B1

26. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 25, znamienne tym, że komora pomiarowa (10) posiada kontrolowaną izotermiczną temperaturę w zakresie od 4°C do 40°C, realizowaną za pośrednictwem układu grzejnego (13), korzystnie w postaci modułu Peltiera.

27. Urządzenie według zastrz. 26, znamienne tym, że układ grzejny (13) zawiera przyłączony wentylator (14) oraz radiator (15), a w komorze pomiarowej (10) umieszczono kierownicę mieszającą powietrze (22).

28. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 27, znamienne tym, że komora pomiarowa (10) pokryta jest izolacją termiczną (12).

29. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 28, znamienne tym, że zawiera mechanizm pozycjonowania (11) wkładu reakcyjnego (6).

30. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 29, znamienne tym, że zawiera mechanizm zadawania ciśnienia (20) wywierający ciśnienie na pompie (P1) we wkładzie reakcyjnym (6) oraz przeciwlegle ustawiony czujnik ciśnienia (21).

31. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 30, znamienne tym, że zawiera dodatkowe diody LED UV (29) oświetlające obszar detekcyjny.

32. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 31, znamienne tym, że zawiera dodatkowe diody LED (27) do obsługi detektorów cieczy (D1-D4) oraz zaworów (Z1-Z11).

33. Urządzenie według któregokolwiek z zastrz. od 13 do 32, znamienne tym, że na dnie komory izolacji (7) i/lub komory reakcji (8.1,8.2, 8.3) umieszczona jest warstwa absorpcyjna całkowicie pochłaniająca energię fotonów, korzystnie wykonana z Cu lub Al pokrytych tlenkami, korzystnie barwionym na czarno AbOs.