PL235678B1 - Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz jej zastosowanie - Google Patents
Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz jej zastosowanie Download PDFInfo
- Publication number
- PL235678B1 PL235678B1 PL422747A PL42274717A PL235678B1 PL 235678 B1 PL235678 B1 PL 235678B1 PL 422747 A PL422747 A PL 422747A PL 42274717 A PL42274717 A PL 42274717A PL 235678 B1 PL235678 B1 PL 235678B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- medium
- optimized
- cortical
- glucose
- hydrochloride
- Prior art date
Links
- 210000002569 neuron Anatomy 0.000 title claims abstract description 142
- 230000000542 thalamic effect Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 230000001054 cortical effect Effects 0.000 title claims abstract description 65
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 title claims abstract description 24
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 142
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims abstract description 75
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims abstract description 61
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M Lactate Chemical compound CC(O)C([O-])=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 40
- 238000012136 culture method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 229940001447 lactate Drugs 0.000 claims description 42
- DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M sodium pyruvate Chemical compound [Na+].CC(=O)C([O-])=O DAEPDZWVDSPTHF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 34
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 28
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims description 26
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 22
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 21
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 21
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 21
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 21
- AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N L-threonine Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-GBXIJSLDSA-N 0.000 claims description 21
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 21
- KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N L-valine Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 21
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 19
- CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 4-(4-fluorophenyl)oxane-4-carboxylic acid Chemical compound C=1C=C(F)C=CC=1C1(C(=O)O)CCOCC1 CYDQOEWLBCCFJZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N L-tryptophane Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-VIFPVBQESA-N 0.000 claims description 18
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 18
- 239000001540 sodium lactate Substances 0.000 claims description 18
- 235000011088 sodium lactate Nutrition 0.000 claims description 18
- 229940005581 sodium lactate Drugs 0.000 claims description 18
- GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N α-tocopherol Chemical compound OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C GVJHHUAWPYXKBD-IEOSBIPESA-N 0.000 claims description 18
- 229940054269 sodium pyruvate Drugs 0.000 claims description 17
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 16
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 16
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 claims description 16
- RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N glutathione Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O RWSXRVCMGQZWBV-WDSKDSINSA-N 0.000 claims description 16
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 16
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 claims description 15
- 239000001763 2-hydroxyethyl(trimethyl)azanium Substances 0.000 claims description 14
- 235000019743 Choline chloride Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 14
- SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N Hexa-Ac-myo-Inositol Natural products CC(=O)OC1C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C(OC(C)=O)C1OC(C)=O SQUHHTBVTRBESD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N L-Proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N L-alanine Chemical compound C[C@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 14
- AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N L-isoleucine Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-WHFBIAKZSA-N 0.000 claims description 14
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 14
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N Nicotinamide Chemical compound NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N Phenolsulfonephthalein Chemical compound C1=CC(O)=CC=C1C1(C=2C=CC(O)=CC=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 BELBBZDIHDAJOR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 claims description 14
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 claims description 14
- 229960003767 alanine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 claims description 14
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 14
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims description 14
- 229960003178 choline chloride Drugs 0.000 claims description 14
- SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M choline chloride Chemical compound [Cl-].C[N+](C)(C)CCO SGMZJAMFUVOLNK-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 claims description 14
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 claims description 14
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 claims description 14
- 229960000367 inositol Drugs 0.000 claims description 14
- CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N inositol Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)[C@@H]1O CDAISMWEOUEBRE-GPIVLXJGSA-N 0.000 claims description 14
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960003136 leucine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 claims description 14
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 claims description 14
- 229960003531 phenolsulfonphthalein Drugs 0.000 claims description 14
- 229960005190 phenylalanine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960002429 proline Drugs 0.000 claims description 14
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N scyllo-inosotol Natural products OC1C(O)C(O)C(O)C(O)C1O CDAISMWEOUEBRE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 claims description 14
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 claims description 14
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 14
- 229960002898 threonine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960004441 tyrosine Drugs 0.000 claims description 14
- 229960004295 valine Drugs 0.000 claims description 14
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 claims description 14
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 claims description 14
- MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N (2S)-2-Amino-3-hydroxypropansäure Chemical compound OC[C@H](N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 13
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 13
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 13
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 13
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 13
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 claims description 13
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims description 13
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 claims description 13
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 12
- 229960004799 tryptophan Drugs 0.000 claims description 12
- 229960002989 glutamic acid Drugs 0.000 claims description 11
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 claims description 11
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 claims description 11
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 10
- 229940087168 alpha tocopherol Drugs 0.000 claims description 9
- 229960002743 glutamine Drugs 0.000 claims description 9
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 235000019799 monosodium phosphate Nutrition 0.000 claims description 9
- AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M sodium dihydrogen phosphate Chemical compound [Na+].OP(O)([O-])=O AJPJDKMHJJGVTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 claims description 9
- 229960000984 tocofersolan Drugs 0.000 claims description 9
- 239000002076 α-tocopherol Substances 0.000 claims description 9
- 235000004835 α-tocopherol Nutrition 0.000 claims description 9
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 claims description 8
- PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O (R)-carnitinium Chemical compound C[N+](C)(C)C[C@H](O)CC(O)=O PHIQHXFUZVPYII-ZCFIWIBFSA-O 0.000 claims description 8
- FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 13-cis retinol Natural products OCC=C(C)C=CC=C(C)C=CC1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 claims description 8
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 claims description 8
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 8
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 claims description 8
- OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N Corticosterone Natural products O=C1CCC2(C)C3C(O)CC(C)(C(CC4)C(=O)CO)C4C3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 108010024636 Glutathione Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 claims description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 claims description 8
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 claims description 8
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 claims description 8
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 claims description 8
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 claims description 8
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N Thyrolar Chemical compound IC1=CC(C[C@H](N)C(O)=O)=CC(I)=C1OC1=CC=C(O)C(I)=C1 AUYYCJSJGJYCDS-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims description 8
- FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N Vitamin A Natural products OC/C=C(/C)\C=C\C=C(\C)/C=C/C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-BOOMUCAASA-N 0.000 claims description 8
- 229940050528 albumin Drugs 0.000 claims description 8
- FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N all-trans-retinol Chemical compound OC\C=C(/C)\C=C\C=C(/C)\C=C\C1=C(C)CCCC1(C)C FPIPGXGPPPQFEQ-OVSJKPMPSA-N 0.000 claims description 8
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 claims description 8
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 8
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 claims description 8
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011616 biotin Substances 0.000 claims description 8
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 claims description 8
- 235000011148 calcium chloride Nutrition 0.000 claims description 8
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 229960004203 carnitine Drugs 0.000 claims description 8
- 229940105657 catalase Drugs 0.000 claims description 8
- OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N corticosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@H](CC4)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 OMFXVFTZEKFJBZ-HJTSIMOOSA-N 0.000 claims description 8
- 229940031098 ethanolamine Drugs 0.000 claims description 8
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 claims description 8
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 235000004554 glutamine Nutrition 0.000 claims description 8
- 229960003180 glutathione Drugs 0.000 claims description 8
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 claims description 8
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 8
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 claims description 8
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 claims description 8
- 229940035722 triiodothyronine Drugs 0.000 claims description 8
- 235000019155 vitamin A Nutrition 0.000 claims description 8
- 239000011719 vitamin A Substances 0.000 claims description 8
- 229940045997 vitamin a Drugs 0.000 claims description 8
- QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N (2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 QZNNVYOVQUKYSC-JEDNCBNOSA-N 0.000 claims description 7
- KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 2-amino-5-(diaminomethylideneamino)pentanoic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.OC(=O)C(N)CCCN=C(N)N KWTQSFXGGICVPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 claims description 7
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N D-alpha-Ala Natural products CC([NH3+])C([O-])=O QNAYBMKLOCPYGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N D-alpha-tocopherylacetate Chemical compound CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2O[C@@](CCC[C@H](C)CCC[C@H](C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-CEFNRUSXSA-N 0.000 claims description 7
- QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N L-Alanine Natural products C[C@@H](N)C(O)=O QNAYBMKLOCPYGJ-UWTATZPHSA-N 0.000 claims description 7
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 claims description 7
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 7
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- 229930182844 L-isoleucine Natural products 0.000 claims description 7
- 239000004395 L-leucine Substances 0.000 claims description 7
- 235000019454 L-leucine Nutrition 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 7
- BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N L-lysine hydrochloride Chemical compound Cl.NCCCC[C@H](N)C(O)=O BVHLGVCQOALMSV-JEDNCBNOSA-N 0.000 claims description 7
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 claims description 7
- 229930182821 L-proline Natural products 0.000 claims description 7
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 claims description 7
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N Serine Natural products OCC(N)C(O)=O MTCFGRXMJLQNBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 claims description 7
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 claims description 7
- KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N Valine Natural products CC(C)C(N)C(O)=O KZSNJWFQEVHDMF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000004279 alanine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960003121 arginine Drugs 0.000 claims description 7
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000009697 arginine Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 claims description 7
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 7
- 229960005261 aspartic acid Drugs 0.000 claims description 7
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L copper(II) sulfate Chemical compound [Cu+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] ARUVKPQLZAKDPS-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910000366 copper(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 7
- ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N d-alpha-Tocopheryl acetate Natural products CC(=O)OC1=C(C)C(C)=C2OC(CCCC(C)CCCC(C)CCCC(C)C)(C)CCC2=C1C ZAKOWWREFLAJOT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003082 galactose Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002449 glycine Drugs 0.000 claims description 7
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 claims description 7
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 235000014304 histidine Nutrition 0.000 claims description 7
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 7
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 7
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960003646 lysine Drugs 0.000 claims description 7
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 claims description 7
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 7
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 229960001153 serine Drugs 0.000 claims description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 7
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 claims description 7
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 claims description 7
- 229940042585 tocopherol acetate Drugs 0.000 claims description 7
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 claims description 7
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000004474 valine Substances 0.000 claims description 7
- 235000014393 valine Nutrition 0.000 claims description 7
- -1 KCI Chemical compound 0.000 claims description 6
- QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N Tryptophan Natural products C1=CC=C2C(CC(N)C(O)=O)=CNC2=C1 QIVBCDIJIAJPQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 claims description 6
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 claims description 6
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 6
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910003424 Na2SeO3 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 239000011781 sodium selenite Substances 0.000 claims description 5
- 235000015921 sodium selenite Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 claims description 2
- 239000011734 sodium Substances 0.000 claims description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims 1
- 229910018143 SeO3 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 229940022663 acetate Drugs 0.000 claims 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 29
- 230000001537 neural effect Effects 0.000 description 28
- 210000003618 cortical neuron Anatomy 0.000 description 21
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 13
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 9
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 9
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 9
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 9
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 8
- 230000004962 physiological condition Effects 0.000 description 8
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 8
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 7
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 7
- 230000002195 synergetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 6
- 210000001787 dendrite Anatomy 0.000 description 6
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 6
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 6
- 102000008763 Neurofilament Proteins Human genes 0.000 description 5
- 108010088373 Neurofilament Proteins Proteins 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 5
- 210000005044 neurofilament Anatomy 0.000 description 5
- 239000012583 B-27 Supplement Substances 0.000 description 4
- 102000003952 Caspase 3 Human genes 0.000 description 4
- 108090000397 Caspase 3 Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 4
- 210000001130 astrocyte Anatomy 0.000 description 4
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 description 4
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 4
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 4
- 230000011664 signaling Effects 0.000 description 4
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 4
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 4
- 101001124058 Drosophila melanogaster Vesicle-fusing ATPase 1 Proteins 0.000 description 3
- LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M Pyruvate Chemical compound CC(=O)C([O-])=O LCTONWCANYUPML-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 230000003376 axonal effect Effects 0.000 description 3
- 230000003492 excitotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 3
- 239000006481 glucose medium Substances 0.000 description 3
- 230000002145 glucotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 210000002243 primary neuron Anatomy 0.000 description 3
- 229940076788 pyruvate Drugs 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N D-lysine Chemical compound NCCCC[C@@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-RXMQYKEDSA-N 0.000 description 2
- 101100447432 Danio rerio gapdh-2 gene Proteins 0.000 description 2
- 101150112014 Gapdh gene Proteins 0.000 description 2
- 239000012981 Hank's balanced salt solution Substances 0.000 description 2
- 210000003050 axon Anatomy 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 238000003570 cell viability assay Methods 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 2
- 229940107161 cholesterol Drugs 0.000 description 2
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 2
- CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N creatine Chemical compound NC(=[NH2+])N(C)CC([O-])=O CVSVTCORWBXHQV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 2
- 102000006602 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 2
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N resorufin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3N=C21 HSSLDCABUXLXKM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 239000012090 serum-supplement Substances 0.000 description 2
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 2
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 2
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 2
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 2
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 2
- FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 4',6-Diamino-2-phenylindol Chemical compound C1=CC(C(=N)N)=CC=C1C1=CC2=CC=C(C(N)=N)C=C2N1 FWBHETKCLVMNFS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000009010 Bradford assay Methods 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 206010015548 Euthanasia Diseases 0.000 description 1
- 238000008458 Glucose Oxidase Reagent Methods 0.000 description 1
- 108010015776 Glucose oxidase Proteins 0.000 description 1
- 239000004366 Glucose oxidase Substances 0.000 description 1
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 102000005755 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010070716 Intercellular Signaling Peptides and Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000004108 Neurotransmitter Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108090000590 Neurotransmitter Receptors Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 208000037273 Pathologic Processes Diseases 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N Resazurin Chemical compound C1=CC(=O)C=C2OC3=CC(O)=CC=C3[N+]([O-])=C21 PLXBWHJQWKZRKG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930182558 Sterol Natural products 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003429 antifungal agent Substances 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003443 antiviral agent Substances 0.000 description 1
- 238000003782 apoptosis assay Methods 0.000 description 1
- 230000028600 axonogenesis Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000005754 cellular signaling Effects 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000010835 comparative analysis Methods 0.000 description 1
- 229960003624 creatine Drugs 0.000 description 1
- 239000006046 creatine Substances 0.000 description 1
- 238000012364 cultivation method Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 150000001982 diacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 description 1
- 229940011871 estrogen Drugs 0.000 description 1
- 239000000262 estrogen Substances 0.000 description 1
- 231100000318 excitotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000063 excitotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000003925 fat Substances 0.000 description 1
- 235000019197 fats Nutrition 0.000 description 1
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229960001031 glucose Drugs 0.000 description 1
- 230000010030 glucose lowering effect Effects 0.000 description 1
- 229940116332 glucose oxidase Drugs 0.000 description 1
- 235000019420 glucose oxidase Nutrition 0.000 description 1
- 108010046301 glucose peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 229940049906 glutamate Drugs 0.000 description 1
- 229930195712 glutamate Natural products 0.000 description 1
- 210000004295 hippocampal neuron Anatomy 0.000 description 1
- 210000001320 hippocampus Anatomy 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 150000003893 lactate salts Chemical group 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 235000021073 macronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002759 monoacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 239000012120 mounting media Substances 0.000 description 1
- 230000004031 neuronal differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000007514 neuronal growth Effects 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 238000001543 one-way ANOVA Methods 0.000 description 1
- 230000000065 osmolyte Effects 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000009054 pathological process Effects 0.000 description 1
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 230000005522 programmed cell death Effects 0.000 description 1
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 1
- 239000010421 standard material Substances 0.000 description 1
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 1
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 1
- 150000003432 sterols Chemical class 0.000 description 1
- 235000003702 sterols Nutrition 0.000 description 1
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 1
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 210000000225 synapse Anatomy 0.000 description 1
- 230000009044 synergistic interaction Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 210000001103 thalamus Anatomy 0.000 description 1
- 230000008719 thickening Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000816 toxic dose Toxicity 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000003026 viability measurement method Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001993 wax Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest zoptymalizowana pożywka do hodowli neuronów, korzystnie pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, która zawiera mleczan w stężeniu od około 125 uM do około 6 mM, a glukozę w stężeniu od około 3,0 do około 12,5 mM. Zgłoszenie obejmuje też zastosowanie pożywki do prowadzenia hodowli neuronów i sposób hodowli neuronów wykorzystujący zoptymalizowaną pożywkę do hodowli neuronów.
Description
Opis wynalazku
DZIEDZINA TECHNIKI
Wynalazek dotyczy zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, jej zastosowania do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz sposobu hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych wykorzystującego zoptymalizowaną pożywkę do hodowli neuronów według wynalazku.
STAN TECHNIKI
Znane są komercyjnie dostępne pożywki do hodowli neuronów. Dostępne pożywki przeznaczone są zarówno do hodowli komórek pre- jak i post-natalnych, w tym neuronów pochodzących z hipokampa czy kory, oraz innych rejonów mózgu w tym następujące wymienione z nazwy handlowej: Neurobasal® (Thermo Scientific), NbActiv4 (BrainBits), Primary Neuron Growth Medium (PNGM, Lonza), BrainPhys™ Neuronal Basal Medium (Stemcell) i NeuroCult™ Neuronal Basal Medium (Stemcell).
Neurobasal® [Brewer et al., 1993] jest to pożywka powstała na bazie pożywki DMEM przeznaczonej do szybko dzielących się komórek (w tym pochodzenia nowotworowego oraz linii komórkowych unieśmiertelnionych in vitro), nie dziwi więc, że medium to nie jest optymalne dla przeżycia i różnicowania neuronów. Obecnie znakomita większość naukowców na całym świecie prowadzi hodowle neuronów w pożywce Neurobasal (Thermo Scientific), która od wielu lat jest traktowana jako tzw. „złoty standard”. Jednak Neurobasal nie jest pożywką optymalną do prowadzenia hodowli neuronów, gdyż wykazano jej ekscytotoksyczne działanie na neurony w hodowlach pierwotnych [Hogins et al., 2011; Maggioni et al., 2015], które polega na patologicznym procesie, w którym neurony są uszkadzane i zabijane przez glutaminian i podobne związki chemiczne. Dodatkowo wysokie stężenie glukozy w pożywce wywołuje toksyczny efekt na neurony w hodowlach pierwotnych [Russell et al., 2002; Peng et al., 2016]. Zachodzi więc potrzeba stworzenia nowej pożywki o optymalnym składzie, pozwalającej na efektywne prowadzenie hodowli pierwotnej neuronów w warunkach fizjologicznych, nie wywołujących negatywnego efektu ekscytoksycznego i glukotoksycznego.
Znaną pożywką wykorzystywaną do hodowli neuronów jest NbActiv4 (BrainBits). Pożywka NbActiv4 (BrainBits) jest modyfikacją kompozycji medium Neurobasal (Thermo Scientific). Pożywka względem Neurobasal jest dodatkowo uzupełniona o cholesterol, kreatynę i estrogen. Modyfikacja ta zwiększa gęstość synaps neuronalnych i ilość receptorów neurotransmiterów w hodowanych neuronach, co zwiększa ilość rejestrowanych potencjałów iglicowych. Pożywka ta ma następujące wady: opiera się na formulacji pożywki Neurobasal i nadal zawiera m.in. niefizjologiczną ilość glukozy (patrz https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC239354).
Innymi znanymi pożywkami do hodowli neuronów są NeuroCult™ Neuronal Basal Medium (StemCell) oraz BrainPhys™ Neuronal Medium (StemCell) (patrz http://www.pnas.org/con- tent/112/20/E2725.long). Pożywka BrainPhys składem przypomina płyn mózgowo-rdzeniowy. Ma m.in. obniżoną zawartości glukozy do wartości 2,5 mM. Pożywki NeuroCult oraz BrainPhys mają następujące wady: najważniejszą z nich jest to, że hodowla pierwotna neuronów wymaga zastosowania dwóch rodzajów pożywek - jednej do założenia hodowli (NeuroCult, która jest pożywką z wysokim, toksycznym stężeniu glukozy) i drugiej BrainPhys do utrzymania hodowli przez okres dłuższy niż 5 dni.
UJAWNIENIE WYNALAZKU
W świetle opisanego stanu techniki celem niniejszego wynalazku jest przezwyciężenie wskazanych niedogodności i dostarczenie nowej zoptymalizowanej pożywki do hodowli neuronów, szczególnie pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz jej zastosowania do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz sposobu hodowli z jej wykorzystaniem.
Istota niniejszego wynalazku opiera się więc na nieoczekiwanym stwierdzeniu, że dodanie do pożywki odpowiedniej dla hodowli neuronów mleczanu w stężeniu od około 125 μM do około 6 mM, korzystnie około 125 μM, wraz z obniżeniem stężenia glukozy do stężeń w zakresie od około 3,0 do około 12,5 mM, korzystnie do około 3 mM, prowadzi do uzyskania zoptymalizowanej pożywki do hodowli neuronów, która zapewnia fizjologiczne warunki utrzymania hodowli neuronów, szczególnie neuronów pierwotnych korowych i wzgórzowych, oraz zwiększa ich żywotności w stosunku do dotychczasowych rozwiązań opierających się na wysokiej koncentracji glukozy.
Nieoczekiwanie okazało się, że dodając mleczan do pożywek odpowiednich do hodowli neuronów w stężeniu od około 125 μM do około 6 mM z jednoczesnym obniżeniem stężenia glukozy do stężenia od około 3,0 do około 12,5 mM, czyli w zakresach stężeń wskazanych dla zoptymalizowanej
PL 235 678 B1 pożywki według wynalazku obserwuje się efekt synergistyczny (patrz Fig. 9) współdziałania tych dwóch czynników, nieobserwowany dla działania po dodaniu samego mleczanu czy jedynie obniżenia stężenia glukozy. Taki synergistyczny efekt współdziałania mleczanu i glukozy w określonych zakresach ich stężeń nie był znany ani sugerowany w stanie techniki.
Jest oczywiste, że zoptymalizowana pożywka dla hodowli neuronów zawiera inne składniki pożywki w stężeniach umożliwiających wzrost i rozwój neuronów w tym białka, aminokwasy, lipidy, w szczególności tłuszcze, woski, sterole (w tym cholesterol), rozpuszczalne w tłuszczach witaminy (A, D, E, K), monoacyloglicerole, diacyloglicerole, fosfolipidy, cukry, witaminy, mikroelementy i makroelementy, ponadto może korzystnie zawierać środki stabilizujące, środki buforujące, środki przeciwbakteryjne, środki przeciwwirusowe, środki przeciwgrzybicze, barwniki, czynniki prożyciowe, aktywatory wzrostu, osmolity itd.
Inne składniki i środki zoptymalizowanej pożywki dla hodowli neuronów są korzystnie wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCb, Fe(NO3)3x9H2O, MgCb, KCI, NaHCO3, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, HEPES, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, suplementu B-27 (ThermoScientific), suplementu SM1 (StemCell), suplementu IGA1000+NSF-1 (Lonza), pożywki pohodowlanej z astrocytów, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin. Specjalista w dziedzinie jest w stanie ustalić odpowiednie składniki i stężenia tych składników, przykładowo bazując na stężeniach i składnikach występujących w znanych obecnie pożywkach dla hodowli neuronów NeuroCult™ Neuronal Basal Medium (StemCell), BrainPhys™ Neuronal Medium (StemCell), Neurobasal (ThermoScientific), PNGM (Lonza), zmieniając odpowiednio stężenie glukozy (w odpowiednim przypadku np. Neurobasal A (Thermo Scientific) lub BrainPhys (StemCell)) i dodając mleczan.
Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według wynalazku zawiera optymalną dla wzrostu neuronów ilość glukozy w stężeniu tożsamym jak w warunkach występujących naturalnie w mózgu oraz mleczan, który jest wykorzystywany przez komórki nerwowe jako alternatywne źródło energii lub cząsteczka sygnałowa, które działają ze sobą synergistycznie.
Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według wynalazku zwiększa przeżywalność neuronów w stosunku do dotychczasowych znanych rozwiązań przez co pozwala na efektywne prowadzenie hodowli neuronów. Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według wynalazku umożliwia prowadzenie hodowli pierwotnych i eksperymentów na neuronach w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Zapewnienie fizjologicznych warunków utrzymania hodowli neuronów pierwotnych oraz zwiększenia ich żywotności w stosunku do dotychczasowych rozwiązań opierających się na wysokiej koncentracji glukozy w pożywkach, zapobiega efektowi ubocznemu występującemu przy wykorzystaniu do hodowli znanych w stanie techniki pożywek, którym jest tzw. glukotoksyczność, czyli toksyczne działanie glukozy przy chronicznym narażeniu na wysokie jej stężenie. Dodatkowo, pożywka zawiera niestosowany dotąd w innych rozwiązaniach składnik - mleczan, będący alternatywnym w stosunku do glukozy i pirogronianu źródłem energii dla neuronów lub cząsteczką sygnałową. Znane pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, nie zawierają w swoim składzie mleczanu.
Wynalazek dotyczy więc zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zarówno w etapie zakładania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych jak i w etapie utrzymywania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych, która zawiera mleczan w stężeniu od 125 μΜ do 6 mM, glukozę w stężeniu od 3,0 do 12,5 mM.
W korzystnej zoptymalizowanej pożywce do hodowli neuronów mleczan jest w postaci mleczanu sodu a glukoza jest w postaci D-glukozy.
Korzystna zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zawiera mleczan sodu w stężeniu 125 μM, D-glukozę w stężeniu 3 mM.
Korzystna zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych ponadto zawiera składniki wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny,
PL 235 678 B1 izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCb, Fe(NO3)3x9H2O, MgCb, KCI, NaHCO3, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin.
Korzystna zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zawiera glicynę 0,4 mM; L-alaninę 0,02247191 mM; hydrochlorek L-argininy 0,39810428 mM; L-asparaginę 0,0055333334 mM; L-cysteinę 0,2603306 mM; hydrochlorek L-histydyny 0,2 mM; L-izoleucynę 0,8015267 mM; L-leucynę 0,8015267 mM; hydrochlorek L-lizyny 0,7978142 mM; L-metioninę 0,20134228 mM; L-fenyloalaninę 0,4 mM; L-prolinę 0,06747826 mM; L-serynę 0,4 mM; L-treoninę 0,7983193 mM; L-tryptofan 0,078431375 mM; L-tyrozynę 0,39779004 mM; L-walinę 0,8034188 mM; kwas glutaminowy 0,0125 mM; L-glutaminę 2,0 mM; chlorek choliny 0,028571429 mM; pantotenian wapnia 0,008385744 mM; kwas foliowy 0,009070295 mM; amid niacyny 0,032786883 mM; hydrochlorek pirydoksalu 0,019607844 mM; ryboflawinę 0,0010638298 mM; hydrochlorek tiaminy 0,011869436 mM; witamina B12 5,0184503E-6 mM; inozytol 0,04 mM; CaCI2 1,8018018 mM; Fe(NOs)sx9H2O 2,4752476E-4 mM; MgCb 0,8136842 mM; KCI 5,3333335 mM; NaHCOs 26,190475 mM; NaCI 51,724136 mM; NaH2PO4-H2O 0,9057971 mM; ZnSO4-7H2O 6.736111E-4 mM; D-glukozę 3,125 mM; HEPES 10,92437 mM; czerwień fenolową 0,021519661 mM; pirogronian sodu 0,22727273 mM; mleczan sodu 0,125 mM.
Zoptymalizowana pożywka jest korzystnie uzupełniona pożywką pohodowlaną z astrocytów lub suplementem niesurowiczym, przykładowo wybranym z suplementu B-27 (ThermoScientific), suplementu SM1 (StemCell), suplementu IGA-1000+NSF-1 (Lonza).
Wynalazek dotyczy również zastosowania zoptymalizowanej pożywki według wynalazku do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych, przy czym zoptymalizowana pożywka zawiera mleczan w stężeniu od 125 μM do 6 mM, glukozę w stężeniu od 3,0 do 12,5 mM, przy czym zoptymalizowaną pożywkę stosuje się zarówno do zakładania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych jak i utrzymywania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych.
W korzystnym zastosowaniu zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych zoptymalizowana pożywka zawiera mleczan sodu w stężeniu 125 μM, D-glukozę w stężeniu 3 mM.
W korzystnym zastosowaniu zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych zoptymalizowana pożywka ponadto zawiera składniki wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCI2, Fe(NO3)3x9H2O, MgCI2, KCI, NaHCO3, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin.
W korzystnym zastosowaniu zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych zoptymalizowana pożywka zawiera glicynę 0,4 mM; L-alaninę 0,02247191 mM; hydrochlorek L-argininy 0,39810428 mM; L-asparaginę 0,0055333334 mM; L-cysteinę 0,2603306 mM; hydrochlorek L-histydyny 0,2 mM; L-izoleucynę 0,8015267 mM; L-leucynę 0,8015267 mM; hydrochlorek L-lizyny 0,7978142 mM; L-metioninę 0,20134228 mM; L-fenyloalaninę 0,4 mM; L-prolinę 0,06747826 mM; L-serynę 0,4 mM; L-treoninę 0,7983193 mM; L-tryptofan 0,078431375 mM; L-tyrozynę 0,39779004 mM; L-walinę 0,8034188 mM; kwas glutaminowy 0,0125 mM; L-glutaminę 2,0 mM; chlorek choliny 0,028571429 mM; pantotenian wapnia 0,008385744 mM; kwas foliowy 0,009070295 mM; amid niacyny 0,032786883 mM; hydrochlorek pirydoksalu 0,019607844 mM; ryboflawinę 0,0010638298 mM; hydrochlorek tiaminy 0,011869436 mM; witamina B12 5,0184503E-6 mM; inozytol 0,04 mM; CaCl2 1,8018018 mM; Fe(NO3)3x9H2O 2,4752476E-4 mM; MgCb 0,8136842 mM; KCI 5,3333335 mM; NaHCO3 26,190475 mM; NaCI 51,724136 mM; NaH2PO4-H2O 0,9057971 mM; ZnSO4-7H2O 6,736111E-4 mM;
PL 235 678 B1
D-glukozę 3,125 mM; HEPES 10,92437 mM; czerwień fenolową 0,021519661 mM; pirogronian sodu 0,22727273 mM; mleczan sodu 0,125 mM.
W korzystnym zastosowaniu zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych w trakcie hodowli wymieniana jest część objętości pożywki, na której prowadzi się hodowlę na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w opisanym zastosowaniu. Korzystniej w zastosowaniu zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych wymiana części objętości zoptymalizowanej pożywki następuje po 34 dobach od dnia startu hodowli, korzystnie etap wymiany zoptymalizowanej pożywki jest wielokrotnie powtarzany co 3-4 doby.
Korzystniej w zastosowaniu zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych zoptymalizowana pożywka wymieniana jest w ilości od około 1/3 do około 2/3 części objętości pożywki z prowadzonej hodowli, korzystniej wymieniana jest połowa objętości pożywki, na której prowadzona jest hodowla na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w opisanym zastosowaniu.
Wynalazek dotyczy również sposobu hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, który obejmuje etapy, w których:
a) zakłada się hodowlę pierwotną neuronów korowych lub wzgórzowych na zoptymalizowanej pożywce zawierającej mleczan i glukozę,
b) utrzymuje się hodowlę pierwotną neuronów korowych lub wzgórzowych na zoptymalizowanej pożywce zawierającej mleczan i glukozę, przy czym zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i b) zawiera mleczan w stężeniu od 125 μΜ do 6 mM, glukozę w stężeniu od 3,0 do 12,5 mM.
W korzystnym sposobie hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i/lub b) zawiera mleczan sodu w stężeniu 125 μM, D-glukozę w stężeniu 3 mM.
W korzystnym sposobie hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i/lub b) ponadto zawiera składniki wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCI2, Fe(NO3)3x9H2O, MgCI2, KCI, NaHCO3, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin.
W korzystnym sposobie hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i/lub b) zawiera glicynę 0,4 mM; L-alaninę 0,02247191 mM; hydrochlorek L-argininy 0,39810428 mM; L-asparaginę 0,0055333334 mM; L-cysteinę 0,2603306 mM; hydrochlorek L-histydyny 0,2 mM; L-izoleucynę 0,8015267 mM; L-leucynę 0,8015267 mM; hydrochlorek L-lizyny 0,7978142 mM; L-metioninę 0,20134228 mM; L-fenyloalaninę 0,4 mM; L-prolinę 0,06747826 mM; L-serynę 0,4 mM; L-treoninę 0,7983193 mM; L-tryptofan 0,078431375 mM; L-tyrozynę 0,39779004 mM; L-walinę 0,8034188 mM; kwas glutaminowy 0,0125 mM; L-glutaminę 2,0 mM; chlorek choliny 0,028571429 mM; pantotenian wapnia 0,008385744 mM; kwas foliowy 0,009070295 mM; amid niacyny 0,032786883 mM; hydrochlorek pirydoksalu 0,019607844 mM; ryboflawinę 0,0010638298 mM; hydrochlorek tiaminy 0,011869436 mM; witamina B12 5,0184503E-6 mM; inozytol 0,04 mM; CaCI2 1,8018018 mM; Fe(NO3)3x9H2O 2,4752476E-4 mM; MgCI2 0,8136842 mM; KCI 5,3333335 mM; NaHCO3
26,190475 mM; NaCI 51,724136 mM; NaH2PO4-H2O 0,9057971 mM; ZnSO4-7H2O 6,736111E-4 mM; D-glukozę 3,125 mM; HEPES 10,92437 mM; czerwień fenolową 0,021519661 mM; pirogronian sodu 0,22727273 mM; mleczan sodu 0,125 mM.
W korzystnym sposobie hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych sposób ponadto zawiera co najmniej jeden etap wymiany części objętości pożywki na której prowadzi się hodowlę na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w sposobie hodowli opisanym powyżej.
Korzystniej w sposobie hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych wymiana części objętości zoptymalizowanej pożywki następuje po 3-4 dobach od dnia startu hodowli, korzystnie etap wymiany zoptymalizowanej pożywki jest wielokrotnie powtarzany co 3-4 doby.
PL 235 678 B1
Korzystniej w sposobie hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych wymienia się około 1/3 do około 2/3 części objętości pożywki z prowadzonej hodowli, korzystniej wymieniana jest połowa objętości pożywki na której prowadzona jest hodowla na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w sposobie hodowli określonym powyżej.
Twórcy opracowali nową formulację zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych. Nowo opracowana pożywka, zwana dalej pożywką według wynalazku, pozwala na efektywne prowadzenie hodowli neuronów. Umożliwia prowadzenie hodowli pierwotnych i eksperymentów na neuronach w warunkach zbliżonych do fizjologicznych co zmniejsza ryzyko otrzymania artefaktów badawczych, przykładowo spowodowanych stresem i warunkami niefizjologicznymi. Pożywka według wynalazku, przykładowo w odróżnieniu od stosowanych dotąd pożywek do hodowli neuronów przykładowo pożywki Neurobasal, nie wywołuje efektu ekscytotoksycznego i glukotoksycznego. Zastosowanie pożywki według wynalazku powoduje zmniejszenie śmiertelności neuronów w hodowli pierwotnej, co zostało udowodnione poprzez znaczący spadek zawartości aktywnej formy kaspazy 3, będącej markerem apoptozy - programowanej śmierci komórkowej (patrz Fig. 1).
Pożywka według wynalazku zwiększa przeżywalność i żywotność neuronów w hodowli w stosunku do obecnych standardów (patrz Fig. 2).
Efekt lepszej żywotności osiągnięto przez obniżenie stężenia glukozy poniżej 12,5 mM co zapobiega efektowi glukotoksycznemu (patrz Fig. 7). Większość obecnych na rynku pożywek zawiera stanowczo zbyt wysokie, toksyczne stężenie glukozy tj. 25 mM.
Jako dodatkowy niestosowany dotąd w tego typie pożywkach składnik zastosowano mleczan stanowiący dodatkowe źródło energii lub będący cząsteczką sygnałową dla komórek nerwowych. Dodatek mleczanu do pożywki hodowlanej wpływa pozytywnie na żywotność neuronów (patrz Fig. 8). Składnik ten nie występuje w dostępnych na rynku pożywkach zaś występuje fizjologicznie w mózgu. Dodanie mleczanu do dowolnej pożywki wysokoglukozowej występującej na rynku powoduje nieznaczne zwiększenie żywotności neuronów (patrz Fig. 6). Nieoczekiwanie okazało się, że jednoczesne obniżenie stężenia glukozy w pożywce i dodanie niestosowanego dotąd mleczanu daję formulację pożywki dla neuronów, która przez synergistyczne współdziałanie tych dwóch czynników (patrz Fig. 9), powoduje, że warunki hodowli są bardziej podobne do warunków fizjologicznych panujących w mózgu. Zbilansowany skład substratów energetycznych w pożywce według wynalazku umożliwia optymalne prowadzenie hodowli i badań neuronów.
Neurony hodowane w pożywce według wynalazku wykazują morfologię bardziej odpowiadającą stanowi fizjologicznemu, przykładowo prezentują gęstsze drzewo dendrytyczne w stosunku do hodowli na obecnie stosowanych standardowych pożywkach (patrz Fig. 3).
Ponadto neurony hodowane w pożywce według wynalazku wykazują wyższą zawartość neurofilamentu, markera aksonów, sugerującą lepszy wzrost aksonu w porównaniu ze standardowymi warunkami (patrz Fig. 4).
Zastosowanie pożywki według wynalazku do hodowli neuronów ma tę zaletę, że zapewnia ona bardziej fizjologiczne warunki hodowli neuronów oraz obserwowana jest większa żywotność neuronów w stosunku do dotychczasowych znanych rozwiązań. Dla zapewnienia optymalnych warunków hodowli i w celu zachowania stałego stężenia substancji odżywczych i substratów energetycznych, podobnie jak w przypadku znanych ze stanu techniki pożywek np. Neurobasal, zalecana zgodnie ze sposobem hodowli według wynalazku jest cykliczna wymiana części pożywki, korzystnie wymiana od około 1/3 do około 2/3, korzystniej wymiana około połowy objętości pożywki co 3-4 doby, ze względu na zużywanie się substratów energetycznych oraz substancji odżywczych (patrz Fig. 5).
KRÓTKI OPIS FIGUR RYSUNKU
Dla lepszego zrozumienia wynalazku, został on zilustrowany w przykładach wykonania oraz na załączonych figurach rysunku, na których:
Fig. 1. Przedstawia wyniki analizy western-blot aktywnej formy kaspazy 3 (markera apoptozy) w neuronach z 14-dniowej hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych. Gapdh - dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (białko kontrolne).
Fig. 2. Przedstawia wyniki żywotności neuronów w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych zmierzonej w dniu 14 hodowli przy użyciu testu Celltiter-Blue (Promega). *p<0,05 vs. Neurobasal.
PL 235 678 B1
Fig. 3. Przedstawia wyniki analizy morfologii neuronów z 10-dniowej hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych A. - Analiza liczby dendrytów B. - Analiza długości dendrytów C. - Analiza Sholla D. - zdjęcie mikroskopowe obrazujące morfologię neuronów (lub obraz morfologii neuronów).
Fig. 4. Przedstawia wyniki analizy western-blot zawartości neurofilamentu (markera aksonów) w neuronach z 14-dniowej hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych. NF-M - neurofilament 140-160 kDa; Gapdh - dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego (białko kontrolne).
Fig. 5. Przedstawia wyniki oznaczania stężenia glukozy w pożywce X - pożywce według wynalazku oraz pożywce Neurobasal w trakcie hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych. D0, D1, D4, D7, D10, D14 - dzień hodowli odpowiednio 0, 1,4, 7, 10, 14.
Fig. 6. Przedstawia wyniki żywotności neuronów w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych hodowanych w pożywkach wysokoglukozowych (25 mM) różnych dostawców: Neurobasal (ThermoScientific), NeuroCult (StemCell), PNGM (Lonza). Mleczan dodany w stężeniu 125 μΜ. Żywotność została zmierzona w dniu 14 hodowli przy użyciu testu Celltiter-Blue (Promega). *p<0,05 vs. PNGM.
Fig. 7. Przedstawia wyniki żywotności neuronów w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych hodowanych w pożywce zawierającej różne stężenia glukozy w zakresie od 1,56 mM do 25 mM. Żywotność mierzona w dniu 14 hodowli przy użyciu testu Celltiter-Blue (Promega). *p<0,05 vs. 25 mM glukozy (Neurobasal).
Fig. 8. Przedstawia wyniki żywotności neuronów w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych hodowanych w pożywkach zawierających stałe stężenie glukozy 3 mM oraz zmienne stężenie mleczanu w zakresie od 0 do 20 mM. Żywotność zmierzona w dniu 14 hodowli przy użyciu testu CelltiterBlue (Promega). *p<0,05 vs. 25 mM glukozy (Neurobasal).
Fig. 9. Przedstawia efekt synergistycznego działania dodatku mleczanu oraz obniżonego stężenia glukozy na żywotność neuronów w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych zmierzonej w dniu 14 hodowli przy użyciu testu Celltiter-Blue (Promega). *p<0,05 vs. 25 mM glukozy; #p<0,05 vs. 3 mM glukozy.
SPOSOBY WYKONANIA WYNALAZKU
Poniższe przykłady zostały umieszczone jedynie w celu zilustrowania wynalazku oraz wyjaśnienia poszczególnych jego aspektów, a nie w celu jego ograniczenia i nie powinny być utożsamiane z całym jego zakresem, który zdefiniowano w załączonych zastrzeżeniach.
W poniższych przykładach, jeśli nie wskazano inaczej stosowano standardowe materiały i metody znane specjalistom w dziedzinie techniki lub postępowano zgodnie z zaleceniami producentów dla określonych materiałów i metod.
Wszystkie referencje i cytowane publikacje są niniejszym włączone w całości jako odniesienie.
PRZYKŁADY
P r z y k ł a d 1. Wytworzenie zoptymalizowanej pożywki do hodowli neuronów
Pożywkę według wynalazku w postaci korzystnej Pożywki X otrzymano przez zmieszanie sypkich lub płynnych składników w celu otrzymania odpowiednich końcowych stężeń molarnych z wodą o molekularnej czystości i wyjałowienie przez filtrację (szerokość poru filtra 0,22 μM firmy VWR) w warunkach sterylnych (w komorze laminarnej).
Jako pożywki kontrolne stosowano Neurobasal oraz Neurobasal-A (Thermo Scientific), NeuroCult (StemCell), PNGM (Lonza) uzupełniane lub nie, w zależności od określonego eksperymentu L-glutaminą, kwasem L-glutaminowym, D-glukozą, mleczanem sodu, pirogronianem sodu oraz suplementami B27 (Thermo Scientific) lub SM1 (StemCell) lub GA-1000+NSF-1 (Lonza).
W celu uzyskania końcowej stosowanej w doświadczeniach Pożywki X pożywka o składzie wymienionym w Tabeli 1. była uzupełniana dodatkowo suplementem niesurowiczym B- 27 (ThermoScientific) zgodnie z instrukcjami producenta w stosunku 1:50 suplement/pożywka (obj./obj.), który to suplement zawiera: Na2SeOs, HEPES, biotynę, alfa-tokoferol, octan alfa-tokoferolu, witaminę A, albuminę, katalazę, insulinę, dysmutazę nadtlenkową, transferrynę, kortykosteron, galaktozę, etanolaminę, glutationu, karnitynę, kwas linolowy, kwasu linolenowy, progesteron, putrescynę, trijodotyroninę.
PL 235 678 Β1
Tabela 1 Skład pożywki według wynalazku do hodowli neuronów (Pożywka X bez suplementu niesurowiczego).
| stężenie [mM] | |
| Glicyna | 0,4 |
| L-Alanina | 0,02247191 |
| hydrochlorek L-Argininy | 0,39810428 |
| L-Asparagina | 0,0055333334 |
| L-Cysteina | 0,2603306 |
| hydrochlorek L-Histydny | 0,2 |
| L-Izoleucyna | 0,8015267 |
| L-Leucyna | 0,8015267 |
| hydrochlorek L-Lizyny | 0,7978142 |
| L-Metionina | 0,20134228 |
| L-Fenyloalanina | 0,4 |
| L-Prolina | 0,06747826 |
| L-Sery na | 0,4 |
| L-Treonina | 0,79831934 |
| L-T ryptofan | 0,078431375 |
| L-Tyrozyna | 0,39779004 |
| L-Walina | 0,8034188 |
| Kwas glutaminowy | 0,0125 |
| L-Glutamina | 2,0 |
| Chlorek choliny | 0,028571429 |
| Pantotenian wapnia | 0,008385744 |
| Kwas foliowy | 0,009070295 |
| Amid niacyny | 0,032786883 |
| Hydrochlorek pirydoksalu | 0,019607844 |
| Rybotlawina | 0,0010638298 |
| Hydrochlorek tiaminy | 0,011869436 |
| Witamina B12 | 5,0184503E-6 |
| inozytol | 0,04 |
| CaCI2 | 1,8018018 |
PL 235 678 Β1
| Fe(NO3)39H2O | 2,4752476E-4 |
| MgCI2 | 0,8136842 |
| KOI | 5,3333335 |
| NaHCO3 | 26,190475 |
| NaCI | 51,724136 |
| NaH2PO4-H2O | 0,9057971 |
| ZnSO4-7H2O | 6,736111E-4 |
| D-Glukoza | 3,125 |
| HEPES | 10,92437 |
| Czerwień fenolowa | 0,021519661 |
| Pirogronian sodu | 0,22727273 |
| Mleczan sodu | 0,125 |
Przykład 2. Sposób hodowli neuronów
Ciężarną samicę szczura stada Wistar poddano eutanazji gazowej oraz uśmierceniu poprzez dyslokację kręgów szyjnych. Wyekstrahowano płody w wieku embrionalnym E18.5 w celu izolacji fragmentów kory oraz wzgórza mózgu. Wyizolowane fragmenty kory oraz wzgórza płukano w zimnym buforze HBSS (Sigma-Aldrich) i poddano enzymatycznemu trawieniu przy użyciu 1,25% trypsyny (Thermo Scientific) w temperaturze 37°C przez okres 10 min. Następnie tkankę rozdysocjowano w roztworze HBSS (Sigma-Aldrich) mechanicznie za pomocą pipety. Liczbę uwolnionych komórek nerwowych w zawiesinie zliczano przy użyciu komory Burkera a następnie zawieszano w pożywce hodowlanej i wysiewano w objętości 500 μΙ w liczbie 200 tyś. kom./dołek 24-dołkowych hodowlanych płytek adherentnych pokrytych poli-D-lizyną (Corning). Hodowlę pierwotną neuronów korowych lub wzgórzowych prowadzono w inkubatorze w temperaturze 37°C oraz 5% CO2 przez okres 2 tygodni. Co 3-4 dni % pożywki hodowlanej wymieniano na świeżą. Hodowle prowadzono w pożywce według wynalazku o określonym w danym doświadczeniu składzie, i/lub w pożywkach znanych ze stanu techniki.
Przykład 3. Analiza western-blot markera apoptozy (kaspazy 3) w neuronach z hodowli pierwotnej oraz analiza western-blot zawartości markera wzrostu aksonów (neurofilamentu)
Neurony korowe lub wzgórzowe w hodowli pierwotnej prowadzonej na Pożywce X (wytworzonej zgodnie z Przykładem 1) i prowadzonej na pożywce Neurobasal przepłukiwano jednokrotnie buforem PBS a następnie zbierano przy użyciu skrobaczki i inkubowano na lodzie przez 30 minut w zimnym buforze lizującym. Następnie lizaty wirowano. Supernatant zawierający białka przenoszono do nowej probówki i oznaczano w nim zawartość białka metodą Bradforda.
Prowadzono elektroforetyczny rozdział białek (po 50 μg białka/próbę) w żelu poliakrylamidowym w warunkach denaturujących stosując 10% żel rozdzielający i 5% żel zagęszczający [stosowano marker wielkości białek PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific)].
Rozdzielone białka przenoszono na membranę nitrocelulozową (GE Healthcare) i inkubowano w obecności odpowiedniego l-rzędowego przeciwciała [1:1000 anty-casp3 (Celi Signaling), 1:500 antyNFMH (ProteinTech), 1:40000 anty-GAPDH (Sigma-Aldrich)] a następnie z ll-rzędowym przeciwciałem sprzężonym z peroksydazą chrzanową [1:10000 anty-mouse-HRP oraz anty-rabbit-HRP (Sigma-Aldrich)]. Detekcję białek prowadzono za pomocą odczynników do chemilinescencji. Sygnał z membrany wizualizowano przy użyciu aparatu Amersham lmager600 RGB (GE Healthcare).
Wyniki analizy western-blot aktywnej formy kaspazy 3 w neuronach z 14-dniowej hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych wykazały spadek zawartości tego markera apoptozy w neuronach hodowanych w pożywce według wynalazku (Fig. 1). Świadczy to o niższym poziomie śmiertelności
PL 235 678 B1 neuronów hodowanych w pożywce według wynalazku. Wyniki analizy western-blot zawartości neurofilamentu w neuronach z 14-dniowej hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych wykazała wzrost zawartości markera wzrostu aksonów w lizacie z neuronów hodowanych w Pożywce X (Fig. 4) co może świadczyć o lepszej kondycji aksonów neuronów hodowanych w Pożywce X.
P r z y k ł a d 4. Oznaczenie żywotności neuronów 4.1.
Przeżywalność neuronów korowych lub wzgórzowych w hodowli pierwotnej hodowanych w Pożywce X i pożywce Neurobasal określano przy użyciu odczynnika CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega). Wskaźnikiem żywotności komórek, w tym teście, jest zdolność aktywnych metabolicznie komórek do redukcji rezazuriny (barwa ciemnoniebieska) do rezorufiny (barwa różowa). Ilość powstającej rezorufiny jest proporcjonalna do liczby żywych komórek. W tym celu do komórek dodawano pełną pożywkę hodowlaną zawierającą odczynnik CellTiter-Blue. Po 3 godzinach inkubacji w 37°C mierzono absorbancję przy długości fali 620 nm przy długości fali referencyjnej 690 nm używając czytnika mikropłytek Bio-tek. Przeżywalność komórek przedstawiono jako różnice wartości względnej absorbancji zmierzonej przy długości fal 620 nm i 690 nm z uwzględnieniem wartości próby ślepej. W tym i kolejnych przykładach uzyskane i przedstawione wyniki zostały opracowane statystycznie na istotność testem „One-way Anova”.
Wynik pomiaru żywotności neuronów w hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych zmierzonej w dniu 14 hodowli przy użyciu testu Celltiter-Blue (Promega) wykazał zwiększoną przeżywalność neuronów hodowanych w Pożywce X (Fig. 2).
4.2.
Przeżywalność neuronów korowych w hodowli pierwotnej określano przy użyciu odczynnika CellTiter-Blue Cell Viability Assay (Promega) po okresie 14 dni hodowli prowadzonych w sposób opisany jak wyżej. Pożywki suplementowane były wg zaleceń producentów.
a) Różne pożywki z mleczanem
Do dostępnych komercyjnie pożywek wysokoglukozowych (25 mM glukozy), w tym Neurobasal (Thermo Scientific), NeuroCult (StemCell) oraz PNGM (Lonza) dodano 125 gM mleczanu sodu. W pożywkach tych zakładano i prowadzono hodowlę pierwotną neuronów korowych. W 14 dniu hodowli wykonano pomiar żywotności. Neurony hodowane w pożywkach wysokoglukozowych z dodatkiem mleczanu wykazywały nieznaczną tendencję wzrostu żywotności w porównaniu do neuronów hodowanych w tożsamych pożywkach bez dodatku mleczanu (Fig. 6).
b) Różne stężenia glukozy
Pożywkę pozbawionej glukozy Neurobasal-A (Thermo Scientific) uzupełniono pirogronianem sodu w stężeniu 0,277 mM oraz różnymi stężeniami glukozy w zakresie od 1,56 mM do 25 mM. W pożywkach tych zakładano i prowadzono hodowlę pierwotną neuronów korowych. W 14 dniu hodowli wykonano pomiar żywotności. Neurony hodowane w pożywkach ze zmniejszoną zawartością glukozy (tj. w zakresie 1,56-12,5 mM) wykazywały wzrost żywotności w porównaniu do neuronów hodowanych w standardowej pożywce wysokoglukozowej tj. o stężeniu glukozy równym 25 mM (Fig. 7).
c) Stałe stężenie glukozy i zmienne stężenie mleczanu
Pożywkę Neurobasal-A (Thermo Scientific) uzupełniono suplementem B27 (Thermo Scientific), pirogronianem sodu w stężeniu 0,277 mM, D-glukozą w stężeniu 25 i 3 mM oraz mleczanu sodu w stężeniu 125 gM w celu określenia wpływu glukozy i mleczanu na żywotność neuronów. W pożywkach tych zakładano i prowadzono hodowlę pierwotną neuronów korowych. W 14 dniu hodowli wykonano pomiar żywotności. Neurony hodowane w pożywkach z dodatkiem mleczanu w zakresie stężeń od 0,63 gM do 6 mM wykazywały wzrost żywotności w porównaniu do neuronów hodowanych w pożywce nie zawierającej dodatku mleczanu (Fig. 8).
Neurony hodowane jedynie z 3 mM mleczanem lub 6 mM mleczanem bez glukozy miały bardzo niską przeżywalność i wykazywały 10-20% żywotności (wyniki nie uwzględnione na wykresie).
P r z y k ł a d 5. Analiza porównawcza morfologii neuronów z hodowli pierwotnej neuronów korowych
Neurony korowe hodowane na szkiełkach pokrytych poli-D-lizyną oraz lamininą (Corning) w pożywce Neurobasal i Pożywce X transfekowano w 7-dniu hodowli plazmidem ekspresyjnym zawierającym białko zielonej fluorescencji GFP przy użyciu odczynnika Lipofectamine 2000 (Thermo Fisher). Po 3 dniach od transfekcji komórki przepłukiwano roztworem PBS i inkubowano w 4% paraformaldehydzie przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Następnie utrwalone komórki płukano roztworem PBS i wybarwiano jądra komórkowe z użyciem barwnika fluorescencyjnego DAPI (Thermo Fisher), a następnie
PL 235 678 B1 zabezpieczono roztworem zamykającym VectaShield Fluorescent Mounting Medium (Vector Laboratories). Zdjęcia mikroskopowe wykonano przy użyciu mikroskopu konfokalnego i oceniano ich morfologię w tym całkowitą długość dendrytów, liczbę dendrytów oraz morfologię drzewa dendrytycznego (tzw. analiza Scholl).
Wyniki analizy morfologii neuronów z 10-dniowej hodowli pierwotnej szczurzych neuronów korowych wykazała zwiększoną liczbę dendrytów (Fig. 3 A), długość dendrytów (Fig. 3 B) oraz bardziej rozbudowane drzewo dendrytyczne neuronów hodowanych w Pożywce X (Fig. 3 C, D).
P r z y k ł a d 6. Wyznaczenie stężenia glukozy w pożywce w trakcie hodowli pierwotnej neuronów korowych
W trakcie trwania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych pobierano część pożywki pohodowlanej. 10 ul pożywki mieszano z 1 ml odczynnika do pomiaru stężenia glukozy zawierającej oksydazę glukozy oraz peroksydazę (Biosystems). Reakcję enzymatyczną prowadzono w temperaturze pokojowej w czasie 10 minut, a następnie mierzono absorbancję powstającego barwnego produktu reakcji enzymatycznej tj. chinoimina przy długości fali 500 nm w spektrofotometrze kuwetowym (Eppendorf biophotometer D30). Stężenie glukozy określano na podstawie wartości absorbancji zmierzonej przy długości fal 500 nm z uwzględnieniem wartości próby ślepej oraz dostarczonego przez producenta zestawu standardu (Fig. 5).
P r z y k ł a d 7. Wykazanie efektu synergistycznego współdziałania mleczanu oraz obniżonego stężenia glukozy na żywotność neuronów
Pożywkę Neurobasal-A (Thermo Scientific) uzupełniono suplementem B27 (Thermo Scientific), pirogronianem sodu w stężeniu 0,277 mM, D-glukozą w stężeniu 3 mM oraz różnymi stężeniami mleczanu sodu w zakresie od 0 do 20 mM. W pożywkach tych zakładano i prowadzono hodowlę pierwotną neuronów korowych. W 14 dniu hodowli wykonano pomiar żywotności. Neurony hodowane w pożywce standardowej o stężeniu glukozy 25 mM z dodatkiem mleczanu oraz neurony hodowane w pożywce z niskim stężeniem glukozy wykazały wzrost żywotności w porównaniu do neuronów hodowanych w standardowej pożywce wysokoglukozowej tj. o stężeniu 25 mM (Fig. 9). Jednakże, nieoczekiwanie, połączenie niskiego stężenia glukozy (tj. w zakresie 3,0-12,5 mM) oraz dodatku mleczanu spowodowało synergistyczny efekt wzrostu żywotności neuronów, większy od pozostałych grup badawczych oraz większy niż mogłoby to wynikać z efektu addytywnego obniżenia stężenia glukozy oraz suplementacji mleczanu (Fig. 9).
Podsumowanie:
Zoptymalizowana pożywka hodowlana dla neuronów według wynalazku zawiera optymalną dla wzrostu neuronów ilość glukozy w stężeniu zbliżonym do warunków występujących naturalnie w mózgu. Dodatkowo pożywka zawiera niestosowany dotąd w innych rozwiązaniach składnik - mleczan, będący alternatywnym (w stosunku do glukozy i pirogronianu) źródłem energii dla neuronów lub działającym jako cząsteczka sygnałowa. Niespodziewanie okazało się, że dodając mleczan do pożywek odpowiednich do hodowli neuronów w stężeniu od 125 μM do 6 mM z jednoczesnym obniżeniem stężenia glukozy do stężenia 3,0-12,5 mM obserwuje się efekt synergistyczny współdziałania tych dwóch czynników dla wzrostu neuronów. Pożywka według wynalazku zapewnia fizjologiczne warunki utrzymania hodowli neuronów pierwotnych oraz zwiększenia ich żywotności w stosunku do dotychczasowych rozwiązań opierających się na wysokiej koncentracji glukozy w pożywkach (25 mM), których efektem ubocznym była tzw. glukotoksyczność, czyli toksyczne działanie glukozy przy narażeniu chronicznym na wysokie jej stężenie. Nie będąc związanym żadną teorią wg. hipotezy o wymianie mleczanu między astrocytami, a neuronami to właśnie mleczan jest podstawowym źródłem energii dla neuronów, dostarczanym w mózgu przez astrocyty do neuronów. Dodatek mleczanu do pożywki symuluje naturalnie występujący skład substancji odżywczych dostępnych dla neuronów w warunkach fizjologicznych mózgu. Dotychczasowe produkty (pożywki) dostępne na rynku nie zawierają w swoim składzie mleczanu. Dotychczas nie był znany synergistyczny efekt współdziałania mleczanu i glukozy w określonych zakresach ich stężeń oraz nie był znany ani sugerowany w stanie techniki.
Literatura:
Brewer GJ, Torricelli JR, Evege EK, Price PJ. Optimized survival of hippocampal neurons in B27supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 1993 Aug 1; 35(5):567-76. PubMed PMID: 8377226;
PL 235 678 B1
Hogins J, Crawford DC, Zorumski CF, Mennerick S. Excitotoxicity triggered by Neurobasal culture medium. PLoS One. 2011; 6(9):e25633. doi: 10.1371/joumal.pone.0025633. Epub 2011 Sep 28. PubMed PMID: 21980512; PubMed Central PMCID: PMC3182245;
Maggioni D, Monfrini M, Ravasi M, Tredici G, Scuteri A. Neurobasal medium toxicity on mature cortical neurons. Neuroreport. 2015 Apr 15; 26(6):320-4. doi: 10.1097/WNR.0000000000000343. PubMed PMID: 25756909;
Peng Y, Liu J, Shi L, Tang Y, Gao D, Long J, Liu J. Mitochondrial dysfunction precedes depression of AMPK/AKT signaling in insulin resistance induced by high glucose in primary cortical neurons. J Neurochem. 2016 Jun; 137(5):701-13. doi: 10.1111 /jnc. 13563. Epub 2016 Apr 18. PubMed PMID: 26926143.
Russell JW, Golovoy D, Vincent AM, Mahendru P, Olzmann JA, Mentzer A, Feldman EL. High glucose-induced oxidative stress and mitochondrial dysfunction in neurons. FASEB J. 2002 Nov; 16(13):1738-48. PubMed PMID: 12409316.
Claims (18)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, znamienny tym, że obejmuje etapy, w których:a) zakłada się hodowlę pierwotną neuronów korowych lub wzgórzowych na zoptymalizowanej pożywce zawierającej mleczan i glukozę,b) utrzymuje się hodowlę pierwotną neuronów korowych lub wzgórzowych na zoptymalizowanej pożywce zawierającej mleczan i glukozę, przy czym zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i b) zawiera mleczan w stężeniu od 125 μΙ^ do 6 mM, glukozę w stężeniu od 3,0 do 12,5 mM.
- 2. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 1, znamienny tym, że zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i/lub b) zawiera mleczan sodu w stężeniu 125 μM, D-glukozę w stężeniu 3 mM.
- 3. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 1-2, znamienny tym, że zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i/lub b) ponadto zawiera składniki wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCI2, Fe(NO3)3x9H2O, MgCI2, KCI, NaHCO3, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin.
- 4. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 1-3, znamienny tym, że zoptymalizowana pożywka stosowana w etapie a) i/lub b) zawiera glicynę 0,4 mM; L-alaninę 0,02247191 mM; hydrochlorek L-argininy 0,39810428 mM; L-asparaginę 0,0055333334 mM; L-cysteinę 0,2603306 mM; hydrochlorek L-histydyny 0,2 mM; L-izoleucynę 0,8015267 mM; L-leucynę 0,8015267 mM; hydrochlorek L-lizyny 0,7978142 mM; L-metioninę 0,20134228 mM; L-fenyloalaninę 0,4 mM; L-prolinę 0,06747826 mM; L-serynę 0,4 mM; L-treoninę 0,7983193 mM; L-tryptofan 0,078431375 mM; L-tyrozynę 0,39779004 mM; L-walinę 0,8034188 mM; kwas glutaminowy 0,0125 mM; L-glutaminę 2,0 mM; chlorek choliny 0,028571429 mM; pantotenian wapnia 0,008385744 mM; kwas foliowy 0,009070295 mM; amid niacyny 0,032786883 mM; hydrochlorek pirydoksalu 0,019607844 mM; ryboflawinę 0,0010638298 mM; hydrochlorek tiaminy 0,011869436 mM; witamina B12 5,0184503E-6 mM; inozytol 0,04 mM; CaCI2 1,8018018 mM; Fe(NO3)39H2O 2,4752476E-4 mM; MgCI20,8136842 mM; KCI 5,3333335 mM; NaHCO3 26,190475 mM; NaCI 51,724136 mM; NaH2PO4-H2O 0,9057971 mM; ZnSO4-7H2O 6,736111E-4 mM; D-glukozę 3,125 mM; HEPES 10,92437 mM; czerwień fenolową 0,021519661 mM; pirogronian sodu 0,22727273 mM; mleczan sodu 0,125 mM.PL 235 678 B1
- 5. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 1-4, znamienny tym, że ponadto zawiera co najmniej jeden etap wymiany części objętości pożywki na której prowadzi się hodowlę na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w sposobie hodowli określonym w zastrz. 1-4.
- 6. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 5, znamienny tym, że wymiana części objętości zoptymalizowanej pożywki następuje po 3-4 dobach od dnia startu hodowli, korzystnie etap wymiany zoptymalizowanej pożywki jest wielokrotnie powtarzany co 3-4 doby.
- 7. Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 5-6, znamienny tym, że wymienia się około 1/3 do około 2/3 części objętości pożywki z prowadzonej hodowli, korzystniej wymieniana jest połowa objętości pożywki na której prowadzona jest hodowla na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w sposobie hodowli określonym w zastrz 1-4.
- 8. Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych zarówno w etapie zakładania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych jak i w etapie utrzymywania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych, znamienna tym, że zawiera mleczan w stężeniu od 125 μΜ do 6 mM, glukozę w stężeniu od 3,0 do 12,5 mM.
- 9. Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 8, znamienna tym, że zawiera mleczan sodu w stężeniu 125 μM, D-glukozę w stężeniu 3 mM.
- 10. Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 8-9, znamienna tym, że ponadto zawiera składniki wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCI2, Fe(NO3)3x9H2O, MgCb, KCI, NaHCO3, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin.
- 11. Zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych według zastrz. 8-10, znamienna tym, że zawiera glicynę 0,4 mM; L-alaninę 0,02247191 mM; hydrochlorek L-argininy 0,39810428 mM; L-asparaginę 0,0055333334 mM; L-cysteinę 0,2603306 mM; hydrochlorek L-histydyny 0,2 mM; L-izoleucynę 0,8015267 mM; L-leucynę 0,8015267 mM; hydrochlorek L-lizyny 0,7978142 mM; L-metioninę 0,20134228 mM; L-fenyloalaninę 0,4 mM; L-prolinę 0,06747826 mM; L-serynę 0,4 mM; L-treoninę 0,7983193 mM; L-tryptofan 0,078431375 mM; L-tyrozynę 0,39779004 mM; L-walinę 0,8034188 mM; kwas glutaminowy 0,0125 mM; L-glutaminę 2,0 mM; chlorek choliny 0,028571429 mM; pantotenian wapnia 0,008385744 mM; kwas foliowy 0,009070295 mM; amid niacyny 0,032786883 mM; hydrochlorek pirydoksalu 0,019607844 mM; ryboflawinę 0,0010638298 mM; hydrochlorek tiaminy 0,011869436 mM; witamina B12 5,0184503E-6 mM; inozytol 0,04 mM; CaCI2 1,8018018 mM; Fe(NO3)3x9H2O 2,4752476E-4 mM; MgCb 0,8136842 mM; KCI 5,3333335 mM; NaHCO3 26,190475 mM; NaCI 51,724136 mM; NaH2PO4-H2O 0,9057971 mM; ZnSO4-7H2O6.736111E-4 mM; D-glukozę 3,125 mM; HEPES 10,92437 mM; czerwień fenolową 0,021519661 mM; pirogronian sodu 0,22727273 mM; mleczan sodu 0,125 mM.
- 12. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych, przy czym zoptymalizowana pożywka zawiera mleczan w stężeniu od 125 μM do 6 mM, glukozę w stężeniu od 3,0 do 12,5 mM, oraz przy czym zoptymalizowaną pożywkę stosuje się zarówno do zakładania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych jak i utrzymywania hodowli pierwotnej neuronów korowych lub wzgórzowych.
- 13. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych według zastrz. 12, znamienne tym, że zoptymalizowana pożywka zawiera mleczan sodu w stężeniu 125 μM, D-glukozę w stężeniu 3 mM.PL 235 678 B1
- 14. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych według zastrz. 12-13, znamienne tym, że zoptymalizowana pożywka ponadto zawiera składniki wybrane z glicyny, alaniny, argininy, asparaginy, cysteiny, histydyny, izoleucyny, leucyny, lizyny, metioniny, fenyloalaniny, proliny, seryny, treoniny, tryptofanu, tyrozyny, waliny, kwasu glutaminowego, glutaminy, chlorku choliny, pantotenianu wapnia, kwasu foliowego, amidu niacyny, hydrochlorku pirydoksalu, ryboflawiny, tiaminy, hydrochlorku tiaminy, kwasu asparaginowego, witaminy B12, inozytolu, NaCI, KCI, MgSO4, CuSO4, FeSO4, NaH2PO4, CaCI2, Fe(NO3)3x9H2O, MgCb, KCI, NaHCOs, NaCI, NaH2PO4-H2O, ZnSO4-7H2O, Na2SeO3, HEPES, biotyny, alfa-tokoferolu, octanu alfa-tokoferolu, witaminy A, albuminy, katalazy, insuliny, dysmutazy nadtlenkowej, transferryny, kortykosteronu, galaktozy, etanolaminy, glutationu, karnityny, kwasu linolowego, kwasu linolenowego, progesteronu, putrescyny, trijodotyroniny, czerwieni fenolowej, pirogronianu sodu lub ich mieszanin.
- 15. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych według zastrz. 12-14, znamienne tym, że zoptymalizowana pożywka zawiera glicynę 0,4 mM; L-alaninę 0,02247191 mM; hydrochlorek L-argininy 0,39810428 mM; L-asparaginę 0,0055333334 mM; L-cysteinę 0,2603306 mM; hydrochlorek L-histydyny 0,2 mM; L-izoleucynę 0,8015267 mM; L-leucynę 0,8015267 mM; hydrochlorek L-lizyny 0,7978142 mM; L-metioninę 0,20134228 mM; L-fenyloalaninę 0,4 mM; L-prolinę 0,06747826 mM; L-serynę 0,4 mM; L-treoninę 0,7983193 mM; L-tryptofan 0,078431375 mM; L-tyrozynę 0,39779004 mM; L-walinę 0,8034188 mM; kwas glutaminowy 0,0125 mM; L-glutaminę 2,0 mM; chlorek choliny 0,028571429 mM; pantotenian wapnia 0,008385744 mM; kwas foliowy 0,009070295 mM; amid niacyny 0,032786883 mM; hydrochlorek pirydoksalu 0,019607844 mM; ryboflawinę 0,0010638298 mM; hydrochlorek tiaminy 0,011869436 mM; witamina B12 5,0184503E-6 mM; inozytol 0,04 mM; CaCb 1,8018018 mM; Fe(NOs)sx9H2O 2,4752476E-4 mM; MgCb 0,8136842 mM; KCI 5,3333335 mM; NaHCOs 26,190475 mM; NaCI 51,724136 mM; NaH2PO4-H2O 0,9057971 mM; ZnSO4-7H2O 6,736111E-4 mM; D-glukozę 3,125 mM; HEPES 10,92437 mM; czerwień fenolową 0,021519661 mM; pirogronian sodu 0,22727273 mM; mleczan sodu 0,125 mM.
- 16. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych według zastrz. 12-15, znamienne tym, że w trakcie hodowli wymieniana jest część objętości pożywki, na której prowadzi się hodowlę na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w zastosowaniu określonym w zastrz. 12-15.
- 17. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych według zastrz. 16, znamienne tym, że wymiana części objętości zoptymalizowanej pożywki następuje po 3-4 dobach od dnia startu hodowli, korzystnie etap wymiany zoptymalizowanej pożywki jest wielokrotnie powtarzany co 3-4 doby.
- 18. Zastosowanie zoptymalizowanej pożywki do hodowli pierwotnych neuronów korowych lub wzgórzowych według zastrz. 16-17, znamienne tym, że zoptymalizowana pożywka wymieniana jest w ilości od około 1/3 do około 2/3 części objętości pożywki z prowadzonej hodowli, korzystniej wymieniana jest połowa objętości pożywki, na której prowadzona jest hodowla na zoptymalizowaną pożywkę jak stosowaną w zastosowaniu określonym w zastrz. 12-15.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422747A PL235678B1 (pl) | 2017-09-05 | 2017-09-05 | Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz jej zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422747A PL235678B1 (pl) | 2017-09-05 | 2017-09-05 | Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz jej zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL422747A1 PL422747A1 (pl) | 2019-03-11 |
| PL235678B1 true PL235678B1 (pl) | 2020-10-05 |
Family
ID=65629581
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL422747A PL235678B1 (pl) | 2017-09-05 | 2017-09-05 | Sposób hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych, zoptymalizowana pożywka do hodowli pierwotnych neuronów korowych i wzgórzowych oraz jej zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL235678B1 (pl) |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008102118A1 (en) * | 2007-02-19 | 2008-08-28 | Stem Cell Sciences (Uk) Ltd | Large scale production of stem cells |
| CN103484432A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-01 | 栾佐 | 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途 |
| WO2016210313A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Culture medium for generating microglia from pluripotent stem cells and related methods |
-
2017
- 2017-09-05 PL PL422747A patent/PL235678B1/pl unknown
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2008102118A1 (en) * | 2007-02-19 | 2008-08-28 | Stem Cell Sciences (Uk) Ltd | Large scale production of stem cells |
| CN103484432A (zh) * | 2013-09-30 | 2014-01-01 | 栾佐 | 一种诱导神经干/祖细胞分化为少突胶质前体细胞的诱导培养基及其诱导方法和用途 |
| WO2016210313A1 (en) * | 2015-06-24 | 2016-12-29 | Whitehead Institute For Biomedical Research | Culture medium for generating microglia from pluripotent stem cells and related methods |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| A-K. BOUZIER-SORE ET AL: "2003", LACTATE IS A PREFERENTIAL OXIDATIVE ENERGY SUBSTRATE OVER GLUCOSE FOR NEURONS IN CULTURE * |
| S. WOHNSLAND ET AL: "2010", NEURONS AND NEURONAL STEM CELLS SURVIVE IN GLUCOSE-FREE LACTATE AND IN HIGH GLUCOSE CELI CULTURE MEDIUM DURING NORMOXIA AND ANOXIA * |
| Z. ALVAREZ ET AL: "2016", NEURONAL PROGENITOR MAINTENANCE REQUIRES LACTATE METABOLISM AND PEPCK-M-DIRECTED CATAPLEROSIS * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL422747A1 (pl) | 2019-03-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6148429B2 (ja) | ヒト多能性幹細胞の培養方法 | |
| US6103529A (en) | Animal cell culture media comprising peptides derived from rice | |
| KR20100025569A (ko) | 배아 줄기 세포 배양을 위한 제형 및 방법 | |
| US20040171152A1 (en) | Animal cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients | |
| WO2011067465A1 (en) | Formulations and methods for culturing stem cells | |
| US20130084640A1 (en) | Animal cell culture media comprising non animal or plant derived nutrients | |
| CN103857789A (zh) | 制备间充质干细胞基础培养基和利用间充质干细胞基础培养基制备细胞治疗产品的方法及用该培养基得到的分化产品 | |
| JP6780638B2 (ja) | ヒト血清アルブミンを含む神経幹細胞増殖培地 | |
| US10968429B2 (en) | Chelated iron-containing culture medium for neural stem cells | |
| WO2016210313A1 (en) | Culture medium for generating microglia from pluripotent stem cells and related methods | |
| US20190024047A1 (en) | Medium for neural stem cells enhancing neural differentiation ability | |
| EP1210410A2 (en) | Metal binding compounds and their use in cell culture medium compositions | |
| JP2023531963A (ja) | 多能性細胞懸濁物を培養するための方法及び組成物 | |
| JP2016073323A (ja) | ヒト多能性幹細胞の培養方法 | |
| WO2018111908A1 (en) | Xenobiotic-free culture system to expand human limbal stem cells | |
| WO2026093217A1 (en) | Reduction of albumin in a cell culture medium | |
| WO2026093215A1 (en) | Reduction of albumin in a cell culture medium |