PL235848B1 - Nowe pochodne kumaryny, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie w sposobie wykrywania i/lub oznaczania aktywności katalitycznej i stereoselektywności reakcji hydrolaz - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku są pochodne kumaryny o wzorze ogólnym 5, gdzie R3 i R4 oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH; alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10; R5, R6, R7, R8, R9 oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl, a X oznacza atom tlenu, siarki lub azotu, sposób ich wytwarzania oraz ich zastosowanie jako substratów barwnych do fluorescencyjnych i spektrofotometrycznych, enzymatycznych oznaczeń aktywności hydrolaz, a także do oznaczania stereoselektywności katalizowanych reakcji dla oznaczeń biochemicznych, chemicznych, biotechnologicznych, enzymologicznych.

Description

Przedmiotem wynalazku są pochodne kumaryny, sposób ich wytwarzania oraz zastosowanie tych związków jako substratów barwnych do fluorescencyjnego i spektrofotometrycznego wykrywania aktywności katalitycznej oraz oznaczania stereoselektywności reakcji katalizowanych przez hydrolazy.

Enzymy jako katalizatory reakcji chemicznych i biochemicznych znalazły szerokie zastosowanie w procesach technologicznych i biotechnologicznych, szczególnie w syntezie związków nieracemicznych, o wysokiej wartości dodanej, takich jak aktywne składniki farmaceutyków (API; Active Pharmaceutical Ingredients). Zastosowania enzymów wymagają opracowania prostych i wiarygodnych metod oznaczania ich aktywności katalitycznej oraz określania stereoselektywności reakcji gdy substraty są związkami racemicznymi. Dlatego też, zastosowanie enzymów do syntezy związków enancjomerycznie wzbogaconych wymaga wykonania szeregu dodatkowych badań, w ramach których należy wyznaczyć, poza określeniem aktywności poszczególnych enzymów względem achiralnych substratów, także skład enancjomeryczny mieszanin reakcyjnych uzyskanych w wyniku procesów bioakatalitycznych dla substratów racemicznych. Umożliwia to określenie stereoselektywności reakcji katalizowanych przez enzymy co ma kluczowe znaczenie szczególnie dla ich zastosowań szczególnie przemysłowych. Metody oznaczania aktywności enzymatycznej oparte na oznaczeniach optycznych (fotometria, spektrofotometria, fluorescencja, luminescencja) zapewniają wysoki standard odpowiednich oznaczeń. Można je zastosować wtedy, gdy substrat do reakcji enzymatycznej lub uzyskiwany z niego w wyniku reakcji katalizowanej przez poszukiwany enzym produkt są substancjami barwnymi. Nie jest to jednak możliwe w przypadku, gdy oba związki nie różnią się właściwościami spektroskopowymi (J. P. Goddard, J. L. Reymond, Trends in Biotechnology 2004, 22, 363-370).

Powszechnie do oznaczania aktywności lipaz i esteraz stosuje się estry p-nitrofenolu i kwasów karboksylowych o wzorze 1 posiadające grupy R¹ będące łańcuchami alifatycznymi C1-C20. Krótkołańcuchowe estry, takie jak octan czy maślan, są rozpuszczalne w wodzie i zwykle wykorzystywane do oznaczania aktywności esteraz, natomiast estry długołańcuchowe, jak laurynian, palmitynian czy oleinian, nie są rozpuszczalne w środowisku wodnym oraz wymagają stosowania dodatku środków powierzchniowo czynnych i są wykorzystywane do oznaczania aktywności lipaz. Reakcje takie przebiegają zgodnie z mechanizmem przedstawionym na Schemacie I, powodując uwalnianie p-nitrofenolu, którego stężenie oznacza się spektofotometrycznie przy długości fali 410 nm.

Wzór 1

Schemat I

Metoda pomimo wielu zalet, jak prostota oznaczania i niski koszt substratów, posiada jednak również szereg wad (C. Huggins, J. Lapides, J. Biol. Chem. 1947, 170, 467-482). Jedną z ważniejszych jest jej ograniczenie tylko do oznaczania jednego achiralnego fenolu i to, że nie pozwala ona na oznaczenie aktywności reakcji dla estrów alkoholi racemicznych.

Aktywność enzymów hydrolitycznych może być oznaczana z dużą czułością i dokładnością za pomocą metod fluorymetrycznych z zastosowaniem substratów fluorogennych, które nie posiadają właściwości fluorescencyjnych a dopiero uwolniony w wyniku hydrolizy enzymatycznej związek wykazuje silną fluorescencję. Szeroko stosowane do tego celu są estry kumaryny o wzorze 2 posiadające jako grupę R² wodór, metyl lubtrifluorometyl oraz grupę R¹ będącą łańcuchem alifatycznymi C1-C20. Najczęściej stosowane są octan i maślan 7-hydroksy-4-metylokumaryny do oznaczania aktywności esteraz oraz palmitynian i laurynian do oznaczania aktywności lipaz (T. De Laborde de Monpezat, B. De Jeso, J.L. Butour, L. Chavant, M. Sancholle, Lipids 1990, 25, 661-664). Metody te jednak nie pozwalają na wyznaczenie stereoselektywności reakcji a także dotyczą tylko pochodnych kwasów karboksylowych.

Zaproponowano pośrednie metody oznaczania aktywności hydrolaz z zastosowaniem procedury składającej się z sekwencji trzech następujących po sobie reakcji (Patent US 2003/0199017 A1 : J.-L. Reymond, D. Wahler, F. Badalassi, H.-K. Nguyen). W pierwszym etapie, z fluorogennych substratów w wyniku hydrolizy enzymatycznej uwalniany był kwas karboksylowy i drugorzędowy alkohol połączony

PL 235 848 Β1 wiązaniem eterowym z 7-hydroksy-4-metylokumaryną. Następnie, w wyniku działania najdodanu sodu alkohol był utleniany do odpowiedniego ketonu, który pod działaniem albuminy z surowicy bydlęcej ulegał procesowi β-eliminacji, prowadząc do uwolnienia fluorescencyjnej 7-hydroksy-4-metylokumaryny. W kolejnych latach metoda ta została zaadaptowana do badań przesiewowych nad lipazami i esterazami (E. Nyfeler, J. Grognux, D. Wahler, J.L. Reymond, Helvetica Chimica Acta 2003, 86, 2919-2926), aldolazami (R. P. Carlón, N. Jourdain, J.-L. Reymond, Chem. Eur. J. 2000, 6, 4154-4162), amidazami (E. Henke, U. T. Bornscheuer, Anal. Chem. 2003, 75, 255-260), fosfatazami (E. M. Gonzalez-Garcia, J. Grognux, D. Wahler, J.-L. Reymond, Helvetica Chimica Acta 2003, 86, 2458-2467), hydrolazami epoksydowymi (P. D. Jones, N. M. Wolf, C. Morisseau, P. Wheatstone, B. Hock, B. D. Hammock, Anal. Blochem. 2005, 343, 66-75), monooksygenazami Bayera-Villigera (R. Sicard, L. S. Chen, A. J. Marsaioli, J.-L. Reymond, Adv. Synth. Catal. 2005, 347, 1041-1050). Zaproponowane substraty w wyniki reakcji z hydrolazami dają produkty uboczne takie jak aldehydy lub ketony, które są często inhibitorami badanych hydrolaz.

Przedstawione metody można zastosować, gdy produkty reakcji hydrolizy katalizowanej przez enzym posiadają silną fluorescencję w środowisku reakcji, natomiast substraty nie wykazują fluorescencji i można je użyć do jakościowego oraz ilościowego oznaczania nawet bardzo małych ilości enzymu. Tego typu oznaczenia znakomicie upraszczają procesy wydzielania enzymów. Takie substraty znajdują zastosowanie w technikach „high-throughput screening” (HTS). Niestety, można je zastosować tylko do wybranych grup substratów, w których funkcję grupy alkoksylowej pełni cząsteczka chromoforu lub fluoroforu. Oznaczenie aktywności dla nieracemicznych estrów alkoholi drugorzędowych, tioli czy amidów nieracemicznych amin nie jest bezpośrednio możliwe jak też oznaczenie stereoselektywności tych reakcji.

Nieoczekiwanie, stwierdzono, że pochodne kumaryny według wynalazku przedstawione poniższym wzorem 5, które są mieszanymi węglanami alkoholi, tioli, amin oraz pochodnych kumaryny są o wiele lepszymi substratami od znanych obecnie związków stosowanych do wykrywania obecności oraz oznaczania aktywności hydrolaz oraz wyznaczania stereoselektywności biokatalizowanych reakcji.

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne kumaryny przedstawione wzorem 5,

R7 R6

R9

Wzór 5 gdzie R³ i R⁴ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH; alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10; R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl, a X oznacza atom tlenu, siarki lub azotu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania nowych pochodnych kumaryny o wzorze 5. Synteza według wynalazku polega na reakcji odpowiedniego alkoholu, tiolu lub aminy o wzorze 3, gdzie R³ i R⁴ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH; alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10; z fosgenem co daje odpowiednią pochodną o wzorze 6, która następnie poddawana jest reakcji z kumaryną o wzorze 4 gdzie R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl, -Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl.

W sposobie według wynalazku substrat barwny o wzorze 5 otrzymuje się jak przedstawiono na Schemacie II (dane eksperymentalne patrz Przykład I) w reakcji pomiędzy podstawioną grupami R³ i R⁴ alkoholem, aminą lub tiolem z fosgenem co prowadzi do powstania nietrwałego związku o wzorze 6, który natychmiast i bez wydzielania podawany jest reakcji z podstawioną grupami R⁵, R⁶, R⁷i R⁸, R⁹ kumaryną o wzorze 4.

PL 235 848 Β1

R4

Wzór 3

COCI₂

Wzór 6

Schemat II

Korzystnie, reakcje prowadzi się w rozpuszczalnikach polarnych aprotycznych, np. tetrahydrofuranie, chlorku metylenu, chloroformie lub w węglowodorach aromatycznych, lub w ich mieszaninach, przez 1-24 godziny, w temperaturze od 0 do 100°C i w obecności zasady organicznej, korzystnie EtsN, pirydyny, lutydyny, dimetyloaminopirydyny lub zasady nieorganicznej, korzystnie węglan sodu lub węglan potasu.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób oznaczania aktywności hydrolaz, charakteryzujący tym, że testowaną próbkę kontaktuje się z substratem, a następnie bada się obecność produktu hydrolizy substratu, przy czym jako substrat stosuje się związek według wynalazku o wzorze 5 a jego hydrolizę bada się dokonując pomiaru spektrofotometrycznego lub pomiaru fluorescencji.

Korzystnie, aktywność hydrolaz oznacza się w surowych lub oczyszczonych preparatach organicznych i/lub preparatach biologicznych.

Korzystnie, sposobem według wynalazku oznacza się stereoselektywność reakcji katalizowanych przez hydrolazy, przy czym do oznaczeń stosuje się enancjomerycznie czyste lub wzbogacone pochodne kumaryny o wzorze 5.

Uzyskany substrat barwny o wzorze 5, według wynalazku jest stosowany do wykrywania, oznaczania aktywności enzymatycznej oraz wyznaczania stereoselektywności reakcji katalizowanych przez hydrolazy takie jak lipazy, esterazy, proteazy obecne w surowych i oczyszczonych preparatach organicznych i/lub preparatach biologicznych zawierających te enzymy natywne lub genetycznie modyfikowane, zgodnie ze Schematem III.

Schemat III

Uzyskiwane w tej reakcji produkty, którymi są pochodne kumaryny o wzorze 4 silnie pochłaniają światło w zakresie UV oraz silnie fluoryzują co umożliwia ich szybkie jakościowe i ilościowe oznaczenie, a także wyznaczenie prędkości poszczególnych reakcji jednostkowych z enzymami. Zastosowanie obu enancjomerów substratu barwnego do reakcji oddzielnie umożliwia bezpośrednie wyznaczenie prędkości reakcji obu enancjomerów a tym samym oznaczenie stereoselektywności procesu i określenia który z enancjomerów substratu reaguje szybciej w obecności danego enzymu.

Oznaczenia takie można prowadzić dla różnych preparatów biologicznych zawierających hydrolazy, niezależnie od ich pochodzenia w roztworach wodnych, w procesie oczyszczania enzymów, w procesie ich immobilizacji, w badaniu aktywności próbek otrzymywanych w procesie oczyszczania tego enzymu po rozdziale metodą średniociśnieniowej chromatografii cieczowej i wysokosprawnej chromatografii cieczowej, hodowlach inokulum, fermentacji w skali laboratoryjnej i przemysłowej. Ponadto, używając te związki jako substraty barwne można wykrywać obecność oraz określać stereoselektywność hydrolaz na żelach po procesie rozdziału próbek metodą elektroforezy. Identyfikacja taka polega na oświetleniu powierzchni żelu światłem UV o długości fali 360 nm i obserwacji fluoryzującego prążka produktu reakcji katalizowanej przez hydrolazę na jego powierzchni.

PL 235 848 B1

Przedmiot wynalazku w przykładach wykonania jest uwidoczniony na rysunku, na którym na fig. 1 przedstawiono widma absorpcji i fluorescencji 7-hydroksy-4-metylokumaryny, 7-hydroksy-4-trifluorometylokumaryny, związku 5a.

W podanych przykładach pokazano zastosowanie tych związków do fluorescencyjnego oznaczania aktywności enzymatycznej hydrolaz (przykład II, IV) do spektrofotometrycznego oznaczania aktywności enzymatycznej hydrolaz (przykład III).

P r z y k ł a d I

Wytwarzanie substratu barwnego o wzorze 5a (ogólnie Schemat II, szczegółowo)

Ogólna metoda syntezy związków o wzorze 5

Roztwór odpowiedniego alkoholu, aminy lub tiolu (1 mmol) w bezwodnym tetrahydrofuranie THF (2 ml) schłodzono do temperatury 0°C, w atmosferze argonu, i dodano roztwór fosgenu w toluenie (20%, 1.25 ml, 2.5 mmol). Następnie mieszaninę reakcyjną mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej. Przepuszczono przez 15 minut argon, aby usunąć nieprzereagowany fosgen. Ponownie schłodzono do 0°C i powoli dodano roztwór dimetyloaminopirydyny (25 mg, 0.2 mmol), trietyloaminy (0.42 ml, 3 mmol) i odpowiedniej kumaryny o wzorze 4 (1 mmol) w bezwodnym THF (2 ml). Następnie mieszano przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, dodano chlorek metylenu (10 ml) i ekstrahowano roztworem kwasu solnego (1 M, 5 ml). Fazy rozdzielono i fazę organiczną suszono za pomocą siarczanu magnezu. Po odparowaniu rozpuszczalnika pozostałość poddano chromatografii kolumnowej na żelu krzemionkowym stosując jako eluent mieszaninę chlorku metylenu i metanolu (99:1, obj./obj.).

Produkt 5a węglan etylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3= Et, R4, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (161.4 mg, wydajność 65%, tt = 98-99°C).

¹H NMR (COCI3, 400 MHz) δ 7.61-7.59 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.21-7.14 (m, 2H), 6.26 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.37-4.31 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.43-2.42 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.42-1.38 (t, 3H, J = 7.2 Hz); ¹³C NMR (COCI3, 100 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.2, 152.7, 151.8, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 65.3, 18.7, 14.1; UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.25), 270 (4.12), 310 (4.03); Analiza obliczona dla C13H12O5: C 62.90, H 4.87; znaleziona C 62.76, H 4.79.

Produkt 5b węglan izopropylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=i-Pr, R4, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (91.8 mg, wydajność 35%, tt = 94-95°C) ¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 7.64-7.59 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.23-7.14 (m, 2H), 6.28-6.27 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.08-4.95 (m, 1H, J = 6.2 Hz), 2.44-2.43 (d, 3H, J = 1.4 Hz), 1.42-1.39 (d, 6H, J = 6.2 Hz); ¹³C NMR (COCI3, 50 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.3, 152.7, 151.8, 125.4, 117.8, 117.4, 114.5, 109.9, 73.8, 21.7, 18.7; UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.20), 270 (4.04), 310 (3.96); Analiza obliczona dla C14H14O5: C 64.12, H 5.38; znaleziona: C 64.02, H 5.33.

Produkt 5c węglan tri(etylenowego glikolumonoetylowego)-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7- ylo) (X=O, R3= Et(OCH2CH2)3, R4, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci bezbarwnego oleju z wydajnością 35%.

¹H NMR (COCI3, 400 MHz) δ 7.63-7.61 (d, 1H, J = 8.8 Hz), 7.23-7.16 (m, 2H), 6.28 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.45-4.43 (m, 2H, J = 2.8 Hz), 3.83-3.81 (m, 2H, J = 2.8 Hz), 3.73-3.66 (m, 6H), 3.62-3.60 (m, 2H), 3.56-3.51 (q, 2H, J = 7.2 Hz), 2.44 (d, 3H, J = 1.6Hz), 1.23-1.20 (t, 3H, J = 7.2 Hz);

¹³C NMR (COCI3, 100 MHz) δ 160.4, 154.0, 153.2, 152.8, 151.8, 125.5, 117.9, 117.3, 114.6, 109.9, 70.7, 70.6, 70.5, 69.7, 68.6, 68.1,66.6, 18.7, 15.1; UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.19), 270 (4.04), 310 (3.98); Analiza obliczona dla C19H24O8: C 59.99, H 6.36; znaleziona: C 59.75, H 6.25

Produkt 5d węglan (R)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (115.8, 71%, t1 = 65-66°C).

¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 7.79-7.83 (d, 1 H, J = 8.6 Hz), 7.65-7.59 (m, 5H), 7.43-7.35 (td, 2H, Ji = 8.8 Hz, J2 = 6.4 Hz), 6.49 (s, 1 H), 6.09-6.06 (q, 1 H, J = 6.6 Hz), 2.65-2.64 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.94-1.91 (d, 3H, J = 6.6 Hz); ¹³C NMR (COCI3, 50 MHz) δ 160.4, 154.0, 153.2, 151.9, 151.8, 140.1, 128.7, 128.5, 126.2, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 78.1,22.1, 18.7 UV/Vis Xmax (MeCN, nm, loge): 215 (4.23), 270 (4.02), 310 (3.93); Analiza obliczona dla C19H16O5: C 70.36, H 4.97; znaleziona: C 70.51, H 4.99; [a]o = 124 (c 1.0,CHCh).

Produkt 5e węglan (S)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (113.5, 70%, t1 = 65-66°C).

¹H NMR (COCI3, 200 MHz) δ 7.84-7.79 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.67-7.59 (m, 4H), 7.43-7.35 (m, 2H), 6.49 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 6.09-6.06 (q, 1H, J = 6.6 Hz), 2.65-2.64 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.94-1.91 (d, 3H,

PL 235 848 B1

J = 6.6 Hz); ¹³C NMR (CDCI3, 50 MHz) δ 160.4, 154.1, 153.2, 151.8, 151.8, 140.1, 128.7, 128.5, 126.2, 125.4, 117.9, 117.4, 114.6, 109.9, 78.1,22.1, 18.7; UV/Vis 7max(MeCN, nm, logs): 215 (4.22), 270 (4.03), 310 (3.95); Analiza obliczona dla C19H16O5: C 70.36, H 4.97; znaleziona: C 70.49, H 4.86; [a]D = -122 (c1.0, CHCI3)

Produkt 5f węglan (R)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 =H, R6 = CF3) otrzymano w postaci bezbarwnego oleju (131.8 mg, 70%) ¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.66-7.64 (dd, 1H, Ji = 8.8 Hz, J₂ = 1.6 Hz), 7.36-7.12 (m, 7H), 6.70 (s, 1H), 5.81-5.76 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 1.64-1.63 (d, 3H, J = 6.4 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 158.4, 155.0, 154.2, 151.8, 139.9, 128.7, 128.7, 126.5, 126.3, 126.2, 119.6, 118.3, 115.4, 111.3, 110.4, 78.4, 22.1, UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.14), 280 (3.97), 315 (3.86), Analiza obliczona dla C19H13F3O5: C 60.32, H 3.46; znaleziona: C 60.89, H 3.85 [a]D = 109 (c 1.0, CHCI3)

Produkt 5g węglan (S)-1-fenyloetylo-(2-okso-4-trifluorometylo-2H-chromen-7-ylo) (X=O, R3=Me, R4=CH²Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = CF3) otrzymano w postaci bezbarwnego oleju (139.5 mg, 74%) ¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.66-7.63 (dt, 1H, Ji = 2.0 Hz, J₂ = 7.2 Hz), 7.37-7.10 (m, 7H), 6.69 (s, 1H), 5.80-5.75 (q, 1H, J = 6.4 Hz), 1.64-1.62 (d, 3H, J = 6.4 Hz), ¹³CNMR (CDCI3, 100 MHz) δ 158.4, 155.0, 154.1, 151.8, 139.9, 128.7, 128.6, 126.5, 126.3, 126.2, 120.0, 118.3, 115.4, 111.3, 110.4, 78.4, 22.1 UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.13), 280 (3.98), 315 (3.87). Analiza obliczona dla C19H13F3O5: C 60.32, H 3.46; znaleziona: C 61.27, H 3.72 [a]D = -112 (c 1.0, CHCI3).

Produkt 5h węglan (R)-1-fenyloetyloamino-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=N, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (107.1 mg, 66%, t1 = 128-130°C).

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.49-7.45 (d, 1H, J = 18.4 Hz), 7.32-7.28 (m, 4H), 7.25-7.20 (m, 1H), 7.05-7.03 (m, 2H), 6.15-6.14 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.43-5.42 (d, 1H, J = 6.8 Hz), 4.88-4.81 (q, 1 H, J = 7.2 Hz), 2.32 (d, 3H, J = 0.8 Hz), 1.52-1.50 (d, 3H, J = 6.8 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 160.6, 154.1, 153.6, 152.6, 152.0, 142.6, 128.8, 127.6, 126.0, 125.1, 117.9, 117.2, 114.1, 110.0, 51.1, 22.1, 18.6, UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.20), 270 (3.95), 310 (3.94), Analiza obliczona dla C19H13F3O5: C 70.58, H 5.30, N 4.33; znaleziona: C 70.09, H 5.29, N 4.16, [a]D = 81 (c 1.0, CHCI3)

Produkt 5i węglan (S)-1-fenyloetyloamino-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=N, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci białego proszku (107.1 mg, 66%, t1 = 128-130°C).

¹H NMR (CDCI3, 200 MHz) δ 7.79-7.75 (d, 1H, J = 18.4 Hz), 7.61-7.49 (m, 5H), 7.35-7.33 (m, 2H), 6.45 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 5.81-5.77 (d, 1H, J = 7.2 Hz), 5.22-5.11 (q, 1H, J = 7.0 Hz), 2.63 (d, 3H, J = 0.8 Hz), 1.83-1.79 (d, 3H, J = 6.8 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 50 MHz) δ 160.6, 154.1, 153.6, 152.6, 152.0, 142.6, 128.7, 127.6, 126.0, 125.1, 117.9, 117.2, 114.1, 110.0, 51.1,22.1, 18.6, UV/Vis 7max(MeCN, nm, loge): 215 (4.23), 270 (3.96), 310 (3.94)

Analiza obliczona dla: C19H13F3O5: C 70.58, H 5.30, N 4.33; znaleziona: C 70.52, H 5.52, N 4.25, [a]D = -74 (c 1.0, CHCI3).

Produkt 5j węglan 1-fenyloetylotio-(2-okso-4-metylo-2H-chromen-7-ylo) (X=S, R3=Me, R4=CH2Ph, R5, R7, R8, R9 = H, R6 = Me) otrzymano w postaci jasnożółtego proszku (78.3 mg, 23%, t1 = 87-88°C).

¹H NMR (CDCI3, 400 MHz) δ 7.53-7.49 (d, 1H, J = 8.6 Hz), 7.29-7.18 (m, 5H), 7.08-7.01 (m, 2H), 6.19-6.18 (d, 1H, J = 1.2 Hz), 4.64-4.58 (q, 1H, J = 7.2 Hz), 2.34 (d, 3H, J = 1.2 Hz), 1.71-1.69 (d, 3H, J = 7.2 Hz), ¹³C NMR (CDCI3, 100 MHz) δ 168.9, 160.3, 154.1, 153.2, 151.7, 141.6, 128.7, 127.8, 127.2, 125.4, 118.0, 117.6, 114.7, 110.2, 45.7, 22.2, 18.7, UV/Vis 7max (MeCN, nm, loge): 215 (4.30), 270 (4.02), 310 (3.95), Analiza obliczona dla: C19H13F3O5: C 67.04, H 4.74; znaleziona: C 67.12, H 4.9.9

P r z y k ł a d II

Fluorymetryczne oznaczenie aktywności hydrolaz

Wyznaczano prędkości początkowe hydrolizy 100 μM roztworów substratów 5a, 5b, 5c, 5d, 5e o stężeniu 5 milimoli w buforze fosforanowym o pH 7.4, w temperaturze 30°C, w obecności albuminy surowicy bydlęcej (BSA) o stężeniu 2 mg/ml i 100 μg enzymu. Stosowano długość fali wzbudzenia ex = 360 nm, a dane rejestrowano przy długości fali emisji em = 445 nm przez 2 godziny. Pomiary prowadzono za pomocą spektrofluorymetru SHIMAZU F7000. Do obliczenia prędkości początkowych zestawionych w Tabeli 1 wykorzystano zależność intensywności fluorescencji od stężenia 7-hydroksy-4-metylokumaryny.

PL 235 848 Β1

Tabela 1. Prędkości początkowe reakcji autohydrolizy związków 5a-5e w buforze fosforanowym w obecności BSA i w przypadku jego braku

Związek	bez BSA [nM s’1]	BSA [nM s1]	BSA/bez BSA
5a	0.4	3.0	8
5b	0.1	2.5	18
5c	0.9	2.1	3
5d	2.2	3.9	2
5e	2.9	5.1	2

Wartości prędkości netto (V_net) podane w Tabeli 2 obliczono ze wzoru V_net = Venz- VnoE, gdzie Venz to prędkości początkowe reakcji w obecności enzymu i BSA, a VnoE to prędkości początkowe reakcji w obecności BSA.

Tabela 2. Prędkości netto reakcji hydrolizy enzymatycznej związków 5a-5e

Enzym _	Vnet [nM s 1]
5a	5b	5c	5d	5e	5f	5g
Lipaza z Candida rugosa	145	129	24	8	27	15	43
Esteraza z wątroby końskiej	44	9	35	25	18
Lipaza z Candida antarctica	75	15	25	4	2
Lipaza z Candida cylindracea	15	10	1	13	20
Lipaza z Porcine pancreas	11	7	8	15	1	9	2
Lipaza z Hog pancreas	6	4	1	12	1
Lipaza z Candida lipolityca	15	3	0.3	9	1
Lipaza z Rhizopus arrhizus	14	1	2	10	1
Lipaza z Pseudomonas fluorescens	4	2	3	14	11
Lipaza z Pseudomonas cepacia	8	2	4	8	1
Esteraza z wątroby świńskiej	7	6	3	88	67
Esteraza z Pseudomonas fluorescens	4	2	0	6	6

V net—νθηζΎποΕ

Przykład III

Spektrofotometryczne oznaczenie aktywności hydrolaz

Substraty przygotowano w postaci 5 mM roztworów w acetonitrylu. Sporządzono krzywe zależności absorbancji w czasie dla reakcji hydrolizy pochodnych kumaryny dla serii lipaz i esteraz. Wyznaczono prędkości początkowe hydrolizy 100 μΜ roztworów substratów 5d, 5e, 5f, 5g w buforze fosforanowym o pH 7.4, w temperaturze 30°C w obecności 200 μg enzymu. Pomiary prowadzono za pomocą spektrofotometru Hitachi U-1900 przez 1 godzinę. Dane rejestrowano przy długości fali 360 nm dla związków 5d, 5e lub 410 nm dla związków 5f, 5g.

PL 235 848 Β1

Tabela 3. Prędkości początkowe hydrolizy enzymatycznej związków 4-5 wyznaczane metodą spektrometrii UV-Vis

Enzym _	V [nM/s]
5f	5g	5d	5e
Lipaza z Porcine pancreas.	23	14	83	6
Lipaza z Candida rugosa	30	113	18	89

Przykład IV

Fluorymetryczne oznaczenie aktywności hydrolaz

Stosując procedurę opisaną w przykładzie II przeprowadzono analizę fluorometryczną aktywności hydrolaz według poniższej tabeli.

Tabela 4. Prędkości początkowe hydrolizy enzymatycznej fluorogennych substratów 5h, 5i

Enzym —	V [nM/s]
5h	5i	5j
Autodroliza	5	5	0.2
Proteaza z Bovine Pancreas	18	15
Proteaza Bacillus Licheniformis	7	13
Lipaza z Candida cylindracea			0.9
Lipaza z Candida rugosa			2
Lipaza z Candida antardica			2
Esteraza z wątroby końskiej			4

Zastrzeżenia patentowe

Claims (6)

1. Nowa pochodna kumaryny o wzorze 5,

Wzór 5 gdzie R³ i R⁴ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH;

alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10;

R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl, Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl,

X oznacza atom tlenu, siarki lub azotu.

2. Sposób wytwarzania związku określonego w zastrz. 1, znamienny tym, że związek o wzorze 3

R4

Wzór 3

PL 235 848 Β1 gdzie R³ i R⁴ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C25, ewentualnie podstawiony w pozycji α, β, γ grupą: -OH, alkoksylową C1-C5, NH2, COOH; alken C2-C25, alkin C2-C25 lub aryl C6-C10; X oznacza atom tlenu, siarki lub azotu poddaje się reakcji z fosgenem i uzyskuje się związek o wzorze 6,

Wzór 6 gdzie R³, R⁴ i X mają znaczenie jak powyżej, który następnie poddaje się reakcji z kumaryną o wzorze 4

R7 R6

R9

Wzór 4 gdzie R⁵, R⁶, R⁷, R⁸, R⁹ oznaczają niezależnie od siebie wodór, alkil C1-C5, alkoksyl C1-C5, fenyl,

-Cl, -Br, -J, NO2, triflorometyl, trichlorometyl i uzyskuje się związek o wzorze 5:

R7 R6

R9

Wzór 5

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że reakcje prowadzi się w rozpuszczalnikach polarnych aprotycznych, korzystnie tetrahydrofuranie, chlorku metylenu, chloroformie lub w węglowodorach aromatycznych, lub w ich mieszaninach; przez 1-24 godziny; w temperaturze od 0 do 100°C; w obecności zasady organicznej, korzystnie EtsN, pirydyny, lutydyny, dimetyloaminopirydyny; lub zasady nieorganicznej, korzystnie węglan sodu lub węglan potasu.

4. Sposób oznaczania aktywności hydrolaz, znamienny tym, że testowaną próbkę kontaktuje się z substratem, a następnie bada się obecność produktu hydrolizy substratu, przy czym jako substrat stosuje się związek określony w zastrz. 1, a jego hydrolizę bada się dokonując pomiaru spektrofotometrycznego lub pomiaru fluorescencji.

5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że aktywność hydrolaz oznacza się w surowych lub oczyszczonych preparatach organicznych i/lub preparatach biologicznych.

6. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że oznacza się stereoselektywność reakcji katalizowanych przez hydrolazy, przy czym do oznaczeń stosuje się enancjomerycznie czyste lub wzbogacone pochodne kumaryn o wzorze 5.