PL235912B1 - Kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny - Google Patents
Kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny Download PDFInfo
- Publication number
- PL235912B1 PL235912B1 PL406052A PL40605213A PL235912B1 PL 235912 B1 PL235912 B1 PL 235912B1 PL 406052 A PL406052 A PL 406052A PL 40605213 A PL40605213 A PL 40605213A PL 235912 B1 PL235912 B1 PL 235912B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- strains
- probiotic
- lactobacillus rhamnosus
- mixture
- bacteria
- Prior art date
Links
- 239000006041 probiotic Substances 0.000 title claims description 89
- 235000018291 probiotics Nutrition 0.000 title claims description 89
- 230000000529 probiotic effect Effects 0.000 title claims description 86
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims description 80
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 title claims description 9
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 title claims description 8
- 241000218588 Lactobacillus rhamnosus Species 0.000 claims description 63
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 52
- 241000186012 Bifidobacterium breve Species 0.000 claims description 50
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 claims description 17
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 14
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims description 8
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 6
- 229920002774 Maltodextrin Polymers 0.000 claims description 5
- 239000005913 Maltodextrin Substances 0.000 claims description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 5
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 5
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 5
- 229940035034 maltodextrin Drugs 0.000 claims description 5
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims description 4
- 230000002906 microbiologic effect Effects 0.000 claims description 3
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 35
- 241000186660 Lactobacillus Species 0.000 description 30
- 229940039696 lactobacillus Drugs 0.000 description 29
- 230000035882 stress Effects 0.000 description 29
- 241000917009 Lactobacillus rhamnosus GG Species 0.000 description 25
- 238000000034 method Methods 0.000 description 25
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 25
- 241000186000 Bifidobacterium Species 0.000 description 24
- 210000001035 gastrointestinal tract Anatomy 0.000 description 24
- 229940059406 lactobacillus rhamnosus gg Drugs 0.000 description 24
- 102000000591 Tight Junction Proteins Human genes 0.000 description 21
- 108010002321 Tight Junction Proteins Proteins 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 21
- 102100025255 Haptoglobin Human genes 0.000 description 19
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 19
- 108010027843 zonulin Proteins 0.000 description 19
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 18
- 102000003940 Occludin Human genes 0.000 description 16
- 108090000304 Occludin Proteins 0.000 description 16
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 15
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 15
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 14
- 230000003042 antagnostic effect Effects 0.000 description 14
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 14
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 241000191963 Staphylococcus epidermidis Species 0.000 description 10
- 241000193985 Streptococcus agalactiae Species 0.000 description 10
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 10
- 241000194032 Enterococcus faecalis Species 0.000 description 9
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 8
- 238000000540 analysis of variance Methods 0.000 description 7
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 7
- 239000000463 material Substances 0.000 description 7
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 7
- 238000011160 research Methods 0.000 description 7
- 238000012313 Kruskal-Wallis test Methods 0.000 description 6
- 235000020299 breve Nutrition 0.000 description 6
- 210000003608 fece Anatomy 0.000 description 6
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 6
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 6
- 210000002490 intestinal epithelial cell Anatomy 0.000 description 6
- 210000002429 large intestine Anatomy 0.000 description 6
- 208000018773 low birth weight Diseases 0.000 description 6
- 231100000533 low birth weight Toxicity 0.000 description 6
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 6
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 6
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 6
- 241000741973 Bifidobacterium breve DSM 20213 = JCM 1192 Species 0.000 description 5
- 241000193163 Clostridioides difficile Species 0.000 description 5
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 5
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 5
- 239000003833 bile salt Substances 0.000 description 5
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 5
- 230000000369 enteropathogenic effect Effects 0.000 description 5
- 238000007901 in situ hybridization Methods 0.000 description 5
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 241000736262 Microbiota Species 0.000 description 4
- 210000004534 cecum Anatomy 0.000 description 4
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 4
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 4
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 4
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 4
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 4
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 description 4
- 230000005945 translocation Effects 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 3
- 206010036590 Premature baby Diseases 0.000 description 3
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 3
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 3
- 238000002509 fluorescent in situ hybridization Methods 0.000 description 3
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 3
- 210000003736 gastrointestinal content Anatomy 0.000 description 3
- 238000007489 histopathology method Methods 0.000 description 3
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 3
- 230000007358 intestinal barrier function Effects 0.000 description 3
- 238000012543 microbiological analysis Methods 0.000 description 3
- 208000037931 necrotizing enteritis Diseases 0.000 description 3
- 208000004995 necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 3
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 3
- 238000010149 post-hoc-test Methods 0.000 description 3
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 3
- 238000007789 sealing Methods 0.000 description 3
- PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 1-(3,7-dihydroxyphenoxazin-10-yl)ethanone Chemical compound OC1=CC=C2N(C(=O)C)C3=CC=C(O)C=C3OC2=C1 PKYCWFICOKSIHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001608472 Bifidobacterium longum Species 0.000 description 2
- 241000186015 Bifidobacterium longum subsp. infantis Species 0.000 description 2
- 206010051606 Necrotising colitis Diseases 0.000 description 2
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 2
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 2
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 2
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 2
- 229940009291 bifidobacterium longum Drugs 0.000 description 2
- 229940093761 bile salts Drugs 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N cephalexin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@@H]3N(C2=O)C(=C(CS3)C)C(O)=O)=CC=CC=C1 ZAIPMKNFIOOWCQ-UEKVPHQBSA-N 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 239000012297 crystallization seed Substances 0.000 description 2
- 238000002795 fluorescence method Methods 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- 210000003405 ileum Anatomy 0.000 description 2
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 2
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- 210000004347 intestinal mucosa Anatomy 0.000 description 2
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 2
- 238000012009 microbiological test Methods 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 2
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 201000006195 perinatal necrotizing enterocolitis Diseases 0.000 description 2
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 2
- 230000001681 protective effect Effects 0.000 description 2
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 2
- 210000003705 ribosome Anatomy 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000009469 supplementation Effects 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 1
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 1
- 208000004926 Bacterial Vaginosis Diseases 0.000 description 1
- 206010070545 Bacterial translocation Diseases 0.000 description 1
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 1
- 238000008998 Catalase assay kit Methods 0.000 description 1
- 241000273265 Clostridioides difficile ATCC 9689 = DSM 1296 Species 0.000 description 1
- 208000004232 Enteritis Diseases 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 208000006893 Fetal Hypoxia Diseases 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 240000006024 Lactobacillus plantarum Species 0.000 description 1
- 235000013965 Lactobacillus plantarum Nutrition 0.000 description 1
- 241000186869 Lactobacillus salivarius Species 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 241000700157 Rattus norvegicus Species 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 208000037009 Vaginitis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 241001148470 aerobic bacillus Species 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000005557 antagonist Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000003110 anti-inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007375 bacterial translocation Effects 0.000 description 1
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 229940004120 bifidobacterium infantis Drugs 0.000 description 1
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 1
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004737 colorimetric analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000037213 diet Effects 0.000 description 1
- 235000005911 diet Nutrition 0.000 description 1
- 230000001079 digestive effect Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 229940032049 enterococcus faecalis Drugs 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 210000002175 goblet cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000144993 groups of animals Species 0.000 description 1
- 244000005709 gut microbiome Species 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 210000004251 human milk Anatomy 0.000 description 1
- 235000020256 human milk Nutrition 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 230000002055 immunohistochemical effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000027866 inflammatory disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002757 inflammatory effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 210000005027 intestinal barrier Anatomy 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 1
- 229940072205 lactobacillus plantarum Drugs 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 1
- 230000008774 maternal effect Effects 0.000 description 1
- 239000002207 metabolite Substances 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 210000004877 mucosa Anatomy 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 230000035515 penetration Effects 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 230000009984 peri-natal effect Effects 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000011321 prophylaxis Methods 0.000 description 1
- 230000002226 simultaneous effect Effects 0.000 description 1
- 210000000813 small intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000007619 statistical method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 238000011477 surgical intervention Methods 0.000 description 1
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001578 tight junction Anatomy 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 241001148471 unidentified anaerobic bacterium Species 0.000 description 1
- 210000001215 vagina Anatomy 0.000 description 1
- 210000001835 viscera Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny mające zastosowanie w leczeniu i profilaktyce uszkodzeń przewodu pokarmowego, martwiczego zapalenia jelit i posocznicy u noworodków.
Prawidłowy rozwój układu pokarmowego, odpornościowego i mózgu noworodka zależy od szybkiej kolonizacji jego przewodu pokarmowego takimi składnikami mikrobioty, które stanowią organizmy pionierskie, umożliwiające dalsze stopniowe rozszerzanie się składu tej mikrobioty proporcjonalnie do rozszerzania się diety. W normalnych warunkach takie składniki zdrowy noworodek nabywa podczas porodu przechodząc przez kanał rodny, czyli pochwę matki, a zatem są to przede wszystkim bakterie z rodzajów Lactobacillus i Bifidobacterium. Natomiast nabywanie nieprawidłowych, patogennych składników jest związane zarówno z zaburzeniami rozwoju wspomnianych narządów, a w skrajnych przypadkach z groźnymi dla życia zakażeniami; to jest martwiczym zapaleniem jelit (zwanym w skrócie NEC) i zakażeniami układu krwionośnego. Nieprawidłowa kolonizacja dotyczy przede wszystkim noworodków z niską wagą urodzeniową. O wiele większą grupę stanowią noworodki z prawidłową wagą, ale urodzone przez cesarskie cięcie oraz noworodki, których matki otrzymywały w okresie okołoporodowym antybiotyki z powodu zapobiegania nosicielstwa GBS, lub przed cesarskim cięciem (albo z obu powodów). W takich sytuacjach prawidłowa mikrobiota pochwy matki ulega zniszczeniu i noworodki nie mają możliwości nabycia prawidłowych składników mikrobioty przewodu pokarmowego.
Martwicze zapalenie jelit jest najgroźniejszą, zapalną chorobą przewodu pokarmowego noworodków, powodującą znaczne uszkodzenie śluzówki jelita, wymagającą intensywnego leczenia, a nawet niekiedy interwencji chirurgicznej. Choroba ta występuje przede wszystkim u wcześniaków. Jako przyczynę uważa się niedotlenienie płodu, niedokrwienie lub czynniki zakaźne.
W publikacji wynalazku WO 01/83700 ujawniona jest kompozycja i metoda leczenia oraz zapobiegania uszkodzeniom układu pokarmowego. Kompozycja obejmuje kombinację bakterii Gram (+), w szczególności Lactobacillus i/lub Bifidobacterium i glutaminę. Metoda obejmuje doustne lub donosowe podawanie kompozycji. Kompozycja według wynalazku blokuje translokację czynników bakteryjnych, takich jak bakterie Gram (-) i innych czynników zakaźnych. Kompozycja przeznaczona jest do leczenia stanów zapalnych przewodu pokarmowo-jelitowego, martwiczego zapalenia jelit u noworodków i sepsy.
Znane są z amerykańskiego opisu patentowego US 6 132 710 szczepy Lactobacillus salivarius ATCC 202196 i Lactobacillus plantarum ATCC 202195 normalizujące środowisko bakteryjne w przewodzie pokarmowo-jelitowym. Szczepy Lactobacillus zapobiegają uszkodzeniom tkanek powstałym w trakcie martwiczego zapalenia jelit u wcześniaków.
Znane są z polskiego opisu patentowego PL 212096 nowe szczepy z gatunku Bifidobacterium infantis zdolne do przeżycia w przewodzie jelitowym i wytwarzające in vivo glutaminę i argininę. Przedmiotem wynalazku jest również środek farmaceutyczny zawierający nowe szczepy Bifidobacterium infantis i nośnik.
Znany jest z polskiego opisu patentowego PL 208422 nowy szczep Lactobacillus rhamnosus KL 53A spełniający wszystkie wymagania stawiane szczepom probiotycznym przeznaczony do uzupełniania składu fizjologicznej flory przewodu pokarmowego. Szczep ten nie może być samodzielnie stosowany do kolonizacji przewodu pokarmowego noworodków pozbawionego innych bakterii.
Znana jest z polskiego opisu patentowego PL 209430 kompozycja probiotyczna zawierająca szczep Lactobacillus rhamnosus KL 53A i jej zastosowanie do wytwarzania preparatu użytecznego w profilaktyce i leczeniu patologicznych stanów przewodu pokarmowego. Skuteczna dawka preparatu zawiera 1x1010 bakterii. Tak duża dawka nie jest odpowiednia do stosowana w terapii noworodków.
Celem wynalazku jest opracowanie kompozycji probiotycznej zawierającej szczepy o właściwościach antyoksydacyjnych, uszczelniających ścianę jelita, antagonistycznych wobec bakteryjnych czynników patogennych powodujących zapalenie jelita, adherujących do komórek nabłonka jelitowego, które dobrze przeżywają przejście przez przewód pokarmowy. Kompozycja probiotyczna powinna zawierać szczepy odpowiadające naturalnej florze bakteryjnej matki a więc zawierać bakterie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium a jej dawka powinna być bezpieczna dla noworodków. Celem wynalazku jest również zastosowanie produktu i opracowanie skutecznego sposobu kolonizacji przewodu pokarmowego noworodków.
Istotą wynalazku jest kompozycja probiotyczna zawierająca mieszaninę, zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów we Wrocławiu, szczepów Bifidobacterium breve PB 04, nr depozytu
PL 235 912 B1
B/00028 i Lactobacillus rhamnosus KL 53A, nr depozytu B/00011, w proporcji od 1:1 do 1:2 w ilości mieszczącej się w zakresie od 1x105 do 1x108 CFU.
Istotą wynalazku jest również zastosowanie kompozycji probiotycznej zawierającej mieszaninę szczepów Bifidobacterium breve PB 04 i Lactobacillus rhamnosus KL 53A w proporcji od 1:1 do 1:2, w ilości mieszczącej się w zakresie od 1x105 do 1x108 CFU, do wytwarzania produktu farmaceutycznego do leczenia stanów chorobowych związanych z zaburzeniami flory bakteryjnej jelit.
Istotą wynalazku jest również produkt farmaceutyczny, którego dawka zawiera mieszaninę szczepów Bifidobacterium breve PB 04 i Lactobacillus rhamnosus KL 53A w proporcji od 1:1 do 1:2 w ilości od 1x105 do 1x108 CFU oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawierający maltodekstrynę i kwas askorbinowy.
Istota wynalazku zasadza się na doborze dwóch unikalnych szczepów bakterii o wybitnych cechach probiotycznych, które działając synergistycznie wykazują unikalny zestaw cech szczególnie korzystnych w zakresie wygaszania stanów zapalnych jelita i hamowania rozwoju bakteryjnych czynników patogennych, mających udział w patologiach przewodu pokarmowego występujących w okresie noworodkowym, szczególnie istotnych u noworodków z niską masą urodzeniową (tzw. wcześniaków), takich jak martwicze zapalenie jelita przez podanie od jednej do dwóch dawek dziennie produktu farmaceutycznego bezpośrednio po porodzie ale nie później niż w ciągu 48 godzin, a następnie w okresie przebywania w szpitalu i po jego opuszczeniu przez okres od 2 do 6 tygodni.
Kompozycja wykazuje zdolność do adherencji do komórek nabłonka jelitowego, do przeżycia w przewodzie pokarmowym, do pobudzania wytwarzania okludyny i zonuliny prowadzącego do uszczelniania ścian jelita, a ponadto posiada właściwości antyoksydacyjne oraz właściwości antagonistyczne wobec bakteryjnych czynników patogennych zapaleń jelita.
Niniejszy wynalazek oparty jest na dwóch szczepach: Bifidobacterium breve PB 04 i Lactobacillus rhamnosus KL 53 A.
Szczep Bifidobacterium breve PB 04 został zdeponowany zgodnie z traktatem budapeszteńskim o międzynarodowym uznawaniu depozytu drobnoustrojów dla celów postępowania patentowego w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów (PCM) w Instytucie Immunologii i Terapii Doświadczalnej Polskiej Akademii Nauk we Wrocławiu (53-114 Wrocław, ul. Rudolfa Weigla 12). Nowy szczep Bifidobacterium breve PB04 został zdeponowany w dniu 4.06.2009 r. i otrzymał numer B/00028. W dacie 1.03.2013 roku organ depozytowy Polska Kolekcja Mikroorganizmów wydał dokument z przeprowadzonej atestacji dotyczącej komunikatu o późniejszym wskazaniu lub zmianie opisu naukowego i/lub proponowanego oznaczenia taksonomicznego. Przeprowadzona atestacja potwierdza dane zawarte w dokumencie depozytowym szczepu Bifidobacterium breve PB 04. Unikalne właściwości tego szczepu zostały ujawnione w opisie patentowym pt. „Nowy szczep Bifidobacterium breve PB 04” P.....229020
Właściwości szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53A zostały ujawnione w polskim opisie patentowym pt. „Nowy szczep Lactobacillus rhamnosus”, pat. 208422.
I. Badanie zdolności produkcji enzymów antyoksydacyjnych o charakterze przeciwzapal- nym.
Reaktywne formy tlenu do których należy między innymi nadtlenek wodoru są odpowiedzialne za zjawiska starzenia i procesy chorobowe. Większość bakterii kwasu mlekowego wchodzących w skład naturalnej flory przewodu pokarmowego jest w stanie zmniejszyć zagrożenie ze strony reaktywnych form tlenu, poprzez ich inaktywację. Jednak w organizmie w którym toczy się proces zapalny, może dochodzić do powstania nadwyżki reaktywnych form tlenu, w szczególności nadtlenku wodoru, który produkowany jest nie tylko przez komórki układu immunologicznego, ale również przez wybrane bakterie z rodzaju Lactobacillus, Streptococus, co może pogarszać przebieg procesu zapalnego. Z drugiej strony niektóre szczepy Lactobacillus posiadają właściwości antyoksydacyjne dzięki zdolności do rozkładu nadtlenku wodoru. Ważnym jest zatem zbadanie wybranych szczepów pod kątem produkcji i inaktywacji reaktywnych form tlenu.
1. Pomiar produkcji nadtlenku wodoru przez mieszaninę szczepów probiotycznych.
W celu dokonania pomiaru produkcji nadtlenku wodoru przez badane szczepy probiotyczne oraz ich mieszaninę wykorzystano testy paskowe firmy Merck, które zmieniały intensywność zabarwienia,
PL235 912B1 w zależności od ilości nadtlenku wodoru uwalnianego do płynnych hodowli tych bakterii. Barwę porównywano z odpowiednią skalą kolorymetryczną pozwalającą jednocześnie na wyliczenie przybliżonej wartości wyprodukowanego nadtlenku wodoru.
Tabela nr 1. Produkcja nadtlenku wodoru (mg/l) przez szczepy probiotyczne z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium.
| Badane szczepy | 4 godzinach | 24 godzinach |
| Lactobacillus rhamnosus KL53 A | 0 | 0 |
| Bifidobacterium breve PB04 | 0 | 0 |
| mieszanina Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 | 0 | 0 |
| kontrola negatywna bulion TSB | 0 | 0 |
W oparciu o powyższe wyniki można stwierdzić, iż zarówno pojedyncze szczepy jak i badana mieszanina szczepów probiotycznych nie odznaczała się pozakomórkową produkcją nadtlenku wodoru.
2. Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru.
Pomiar kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru został przeprowadzony za pomocą dwóch metod tj. w oparciu o test paskowy firmy Merck (test kolorymetryczny zmieniający intensywność zabarwienia w zależności od ilości H2O2) oraz z wykorzystaniem testu Amplex® Red (10- acetyl-3,7-dihydroxyphenoxazine), który w obecności nadtlenku wodoru przechodzi w formę utlenioną. Forma utleniona barwnika pod wpływem światła fluorescencyjnego o długości 590 nm. uwalnia światło, którego intensywność jest mierzona za pomocą odpowiedniego czytnika fluorescencyjnego.
Tabela nr 2. Oznaczenie kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru przez badane szczepy probiotyczne oraz ich mieszaninę w oparciu o metodę paskową.
| Badane szczepy | 0 min. | 30 min. | 60 min. | 90 min. | 120 min. | 150 min. | 180 min. | 210 min, | 24 godz. |
| Ilość nadtlenku wodoru (mg/l) | |||||||||
| Lactobacillus rhamnosus KL53A | 30 | 10 | 10 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 |
| Bifidobacterum breve PB04 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 10 | 0 |
| mieszanina Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 | 30 | 30 | 30 | 30 | 10 | 10 | 10 | 0 | 0 |
| Kontrola MRS | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 |
| Kontrola BL | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 10 | 0 |
PL 235 912 Β1
Tabela nr 3. Pomiar kinetyki rozkładu H2O2 przez badane szczepy probiotyczne oraz ich mieszaninę z wykorzystaniem testu Amplex Red.
| Badane szczepy wyniki pomiaru fluorescencji | Kinetyka rozkładu H2O2 (intensywność fluorescencji przy długości fali 590nm) | ||
| 1 godz. | 4 godz. | 20 godz. | |
| mieszanina Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 | 41254 | 45 223 | 39 909 |
| Lactobacillus rhmnosus K153A | 24 233 | 48 213 | 34132 |
| Bifidobacterium breve PB04 | 25 171 | 44 688 | 39 126 |
Na podstawie pomiarów kinetyki rozkładu nadtlenku wodoru w oparciu o test paskowy oraz z wykorzystaniem zestawu Amplex® Red Catalase Assay Kit firmy Molecular Probes, można stwierdzić, iż zdolność rozkładu H2O2 przez badaną mieszaninę szczepów probiotycznych jest porównywalna do poziomu rozkładu H2O2 przez pojedyncze szczepy.
II. Badania wpływu na poprawę funkcji bariery jelitowej poprzez stymulację produkcji białek połączeń ścisłych (tight junctions) w szczególności okludyny oraz zonuliny (ZO-1).
Białka połączeń ścisłych pełnią funkcję kontrolną w stosunku do procesu przenikania przez barierę śluzówki. Zwiększenie ilości białek połączeń ścisłych w szczególności zonuliny i okludyny powoduje uszczelnianie nabłonka.
Materiały i metody.
Do badań wybrano pojedyncze szczepy probiotyczne oraz ich mieszaninę. Jako kontrolę zastosowano Lactobacillus rhamnosus GG oraz enteropatogenny szczep Escherichia coli (dzięki uprzejmości Narodowego Instytutu Zdrowia - Państwowego Zakładu Higieny w Warszawie). W oparciu o dane literaturowe, szczególnie enteropatogenne szczepy Escherichia coli (EPEC) wykazują bardzo silne działanie uniemożliwiające tworzenie białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami, dlatego do niniejszego badania zastosowano jako kontrolę negatywną szczep EPEC.
Tworząc mieszaniny szczepów probiotycznych łączono bakterie z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w stosunku objętościowym 1:1, przy zachowaniu proporcji odpowiednio 10:1, czyli średnio na 108 j.t.k. Lactobacillus przypada 107j.t.k. Bifidobacterium.
Intensywność świecenia była obserwowana w mikroskopie fluorescencyjnym przy długości fali: wzb. 494nm - emi. 520 nm., pod powiększeniem 400x, a intensywność świecenia oceniano w skali półil ości owej. Wyniki badań umieszczono w tabeli nr 4 i 5.
Tabela 4. Zestawienie wyników oddziaływania szczepów Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 na stymulację produkcji białek połączeń ścisłych okludyny i zonuliny (ZO-1) wytwarzanych pomiędzy komórkami linii tkankowych Caco-2 i HT-29.
| Badane szczepy | Tkanka Caco-2 | Tkanka HT-29 | ||
| Okludyna | Zonulina ZO-1 | Okludyna | Zonulina ZO-1 | |
| L. rhamnosus KL53A | +++ | ++/+++ | +++ | + |
| B. breve PB04 | +++ | ++ | ++ | - |
| Kontrola Enteropatogenny szczep E. coli (EPEC) | ||||
| L. rhamnosus GG | +++ | +/++ | ++ | - |
PL235 912B1
Tabela 5. Zestawienie wyników oddziaływania mieszaniny probiotycznej o gęstości 105 j.t.k. na stymulację produkcji białek połączeń ścisłych okludyny i zonuliny (ZO-1) wytwarzanych pomiędzy komórkami linii tkankowych Caco-2.
| Badane szczepy | Gęstość szczepów | Tkanka Caco-2 | |
| Okludyna | ZonulinaZO-1 | ||
| mieszanina Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacteńum breve PB04 | 2,lxl05 | +++ | ++ |
| Kontrola: enteropatogenny szczep Escherichia coli (EPEC) | 2,8x105 | - | |
| Kontrola Lactobacillus rhamnosus GG | 3,2x105 | +++ | ++ |
Tabela 6. Zestawienie wyników oddziaływania mieszaniny probiotycznych o gęstości rzędu 108 j.t.k. na stymulację produkcji białek połączeń ścisłych okludyny i zonuliny (ZO-1) wytwarzanych pomiędzy komórkami linii tkankowych Caco-2.
| Badane szczepy | Gęstość szczepów | Tkanka Caco-2 | |
| Okludyna | ZonulinaZO-1 | ||
| mieszanina Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 | 3,1x10“ | - | - |
- brak świecenia (brak tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami) + słabe świecenie (niski poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) ++ silne świecenie (wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) +++ bardzo silne świecenie (bardzo wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych)
Wnioski • Zarówno szczepy Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacteńum breve PB04, jak i ich mieszanina posiadają szczególną zdolność do stymulacji komórek tkanek Caco-2 jak i HT-29 do produkcji okludyny.
• W przypadku białek połączeń ścisłych z grupy zonuliny (ZO-1) na komórkach linii Caco-2 zaobserwowano znaczne pobudzenie aktywności tworzenia tych białek po zastosowaniu Lactobacillus rhamnosus KL 53A.
• W przypadku zastosowania enteropatogennego szczepu Escherichia coli (EPEC) zaobserwowano bardzo silne działanie uniemożliwiające tworzenie białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami zarówno linii Caco-2 jak i HT-29.
• Badana mieszanina szczepów Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacteńum breve PB 04 bardzo silnie stymulowała komórki Caco-2 do produkcji okludyny i zonuliny ZO-1 przy liczebności populacji wynoszącej około 105 j.t.k./ml.
• Badając mieszaniny Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacteńum breve PB 04 (stosunek wagowy 1:1) zaobserwowano, iż zwiększenie sumarycznej liczebności populacji bakterii probiotycznych z 105 do 108 j.t.k./ml w istotny sposób zmniejszało zdolność komórek linii tkankowej nabłonka jelitowego do produkcji białek połączeń ścisłych tj. okludyny i zonuliny ZO-1.
PL 235 912 Β1
III. Badania adherencji do ludzkich linii tkankowych HT-29 ΜΤΧ i Caco-2.
Badanie wykonano według metodyki podanej w pracy: Właściwości powierzchniowe szczepów Lactobacillus. II. Adherencja do powierzchni komórek hodowli tkankowych. Struś M., Kukla G., Rurańska-Smutnicka D., Przondo-Mordarska A., Heczko P. Med. Dośw. Mikrobiol. 2001;53(3):253-8.
Do badań wybrano pojedyncze szczepy probiotyczne Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04 oraz ich mieszaninę w stosunku wagowym 1:1. Jako kontrolę zastosowano szczepy: Lactobacillus rhamnosus GG i Bifidobacterium breve DSM 20213.
Preparat był oceniany w mikroskopie świetlnym pod powiększeniem 1000x. Komórki badanych bakterii rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium, które zaadherowały do linii tkankowej były zliczane w 20 polach widzenia preparatu. Wyliczano wynik średni, któremu przyporządkowano odpowiedni stopień adherencji zgodnie z podanym poniżej zakresem.
| Stopień adherencji | Średnia liczba komórek bakteryjnych w polu widzenia |
| +++ | Powyżej 80 |
| ++ | Zakres 60-80 |
| + | Zakres 40-60 |
| - | Poniżej 40 |
Tabela 7. Adherencja mieszaniny bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium do tkanki CaCo-2.
| Badana mieszanina szczepów probiotycznych | I doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | II doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | WYNIK uśredniony |
| mieszanina szczepów Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB 04 | 110(+++) | 70(++) | 90 (+++) |
| Kontrola 1 Lactobacillus rhamnosus GG | 100(+++) | 100(+++) | 100(+++) |
| Kontrola 2 Bifidobacterium breve DSM 20213 | 58 (+) | 54(+) | 56(+) |
PL235 912B1
Tabela 8. Adherencja szczepów Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04 do tkanki CaCo-2.
| Badany szczep probiotyczny | I doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | II doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | WYNIK uśredniony |
| Lactobacillus rhamnosus KL53A | 100 (+++) | 100(+++) | 100(+++) |
| Bifidobacterium breve PB 04 | 54 (+) | 38(-) | 46 (+) |
| Kontrola 1 Lactobacillus rhamnosus GG | 95(+++) | 100(+++) | 97(+++) |
| Kontrola 2 Bifidobacterium longum | 68 (++) | 75(++) | 71(++) |
| DSM 20219 | |||
| Kontrola 3 Bifidobacterium breve DSM 20213 | 65 (++) | 38(-) | 51 (+) |
Tabela 9. Adherencja mieszanin bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium do tkanki ΗΤ-29ΜΤΧ.
| Badana mieszanina szczepów probiotycznych | I doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | II doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | WYNIK uśredniony |
| mieszanina szczepów Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB 04 | 90 (+++) | 80 (++) | 85 (+++) |
| Kontrola 1 Lactobacillus rhamnosus GG | 100(+++) | 100 (+++) | 100(+++) |
| Kontrola 2 Bifidobacterium breve DSM 20213 | 49(+) | 51 (+) | 50(+) |
PL 235 912 Β1
Tabela 10. Adherencja szczepów Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04 do tkanki ΗΤ-29ΜΤΧ.
| Badany szczep probiotyczny | I doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | II doświadczenie (wyniki z 20 pól widzenia preparatu) | WYNIK uśredniony |
| Lactobacillus rhamnosus KL53 A | 100(+++) | 100(+++) | 100 (+++) |
| Bifidobacterium breve PB 04 | 40 (+) | 50(+) | 45 (+) |
| Kontrolal Lactobacillus rhamnosus GG | 100(+++) | 100(+++) | 100(+++) |
| Kontrola 2 Bifidobacterium longum DSM 20219 | 78 (++) | 72 (++) | 75(++) |
| Kontrola 3 Bifidobacterium breve DSM 20213 | 45(+) | 51 (+) | 48(+) |
Wnioski • Mieszanina szczepów probiotycznych Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04 wykazuje silne właściwości adherencyjne zarówno do tkanki CaCo-2 jak i ΗΤ-29ΜΤΧ.
• Mieszanina szczepów probiotycznych nie straciła swoich właściwości adherencyjnych w stosunku do adherencji pojedynczych szczepów probiotycznych.
IV. Badania właściwości antagonistycznych wobec najczęściej występujących patogenów przewodu pokarmowego za pomocą metody ilościowej.
Materiały i metody.
Badanie wykonano zgodnie z metodyką podaną w pracy: Zakres antagonistycznego działania szczepów Lactobacillus na czynniki etiologiczne bakteryjnej waginozy.
Struś M., Malinowska M. Med. Dośw. Mikrobiol. 1999; 51 (1-2):47-57
Do badań wybrano pojedyncze szczepy probiotyczne Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04 oraz ich mieszaninę w stosunku wagowy 1:1; (w skrócie: mieszanina KL53A+PB04). Jako kontrolę zastosowano szczep Lactobacillus rhamnosus GG. W badaniu zastosowano następujące bakteryjne czynniki etiologiczne (szczepy wskaźnikowe):
• Escherichia coli 25922B/1 (w skrócie: E. coli), • Streptococcus agalactiae B/3 (w skrócie: S. agalactiae), • Staphylococcus epidermidis B/2 (w skrócie: S. epidermidis), • Staphylococcus aureus B/5 (w skrócie: S. aureus), • Enterococcus faecalis (w skrócie: E. faecalis), • Clostridium difficile ATCC 9689 (w skrócie: C. difficile).
Wyniki badania przedstawiono w poniższych tabelach.
PL235 912B1
Tabela 11. Antagonistyczne działanie mieszaniny Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04 (stosunek wagowy 1:1) wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej.
| Mieszanina probiotyczna/szczep wskaźnikowy | 0 godz. | po 8 godz. | po 24 godz. |
| mieszanina KL53A+PB04 | 4.5 xl08 | 2.0xl08 | 2.0xl08 |
| E.coli | Ι.ΟχΙΟ8 | 0 | 0 |
| mieszanina KL53A+ PB04 | 5.2xl08 | 4.5xl08 | Ι.ΟχΙΟ8 |
| S.agalactiae | 2.0xl07 | 0 | 0 |
| mieszanina KL53A+ PB04 | 4.4xl08 | 2.5Χ108 | Ι.ΟχΙΟ8 |
| S.epidermidis | Ι.ΟχΙΟ8 | 0 | 0 |
| mieszanina KL53A+ PB04 | 2.0x10® | 2.0Χ108 | Ι.ΟχΙΟ8 |
| S.aureus | Ι.ΟχΙΟ8 | 0 | 0 |
| mieszanina KL53 A+ PB04 | 2.2xl08 | Ι.ΟχΙΟ8 | Ι.ΟχΙΟ8 |
| E.faecalis | 2.5xl08 | 7.0xl06 | Ι.ΟχΙΟ2 |
| mieszanina KL53 A+ PB04 | 3.5xl08 | 4.0xl08 | Ι.ΟχΙΟ8 |
| C.difficile | 2.0xl05 | 0 | 0 |
| Kontrola | |||
| Kontrola mieszanina KL53A+ PB04 | 6.2xl08 | 3.5xl08 | 1.2χ108 |
| Kontrola E.coli | 6.0x10* | 2.0x10* | 1.2x10* |
| Kontrola S.agalactiae | 3.0x10* | 3,2x10* | 2.0x10* |
| Kontrola S.epidermidis | 5.0x10* | 5.2x10* | 4.0x10* |
| Kontrola S.aureus | 8.0x10* | 1.1x10* | 2.0x10* |
| Kontrola E.faecalis | 3.3x10* | 5.0x10* | 1.0x10* |
| Kontrola C.difficile | 1.2x10* | 1x10* | 5x10* |
PL 235 912 Β1
Tabela 12. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus rhamnosus GG wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej.
| Szczep probiotyczny/szczep wskaźnikowy | 0 godz. | ρο 8 godz. | ρο 24 godz. |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 2.5xl08 | Ι.ΟχΙΟ8 | 1.2χ108 |
| E.coli | Ι.ΟχΙΟ8 | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 2.5xl08 | 3.5χ108 | 1.5χ108 |
| S.agalactiae | 1χ108 | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 2.5xlO8 | 3.5χ108 | 3.0x10* |
| S.epidermidis | 4.1Χ108 | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 5.0χ108 | 3.5χ108 | 2.8χ108 |
| S.aureus | ό.ΟχΙΟ8 | 2.0x1ο1 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 2.ΟΧ1Ο8 | 2.5χ108 | 1.5χ108 |
| E.faecalis | 4.2χ108 | 8.0Χ104 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 5.0χ108 | 4.0χ108 | 2.5χ108 |
| C.difficile | 3.0χ105 | 0 | 0 |
| Kontrola | |||
| Kontrola Lactobacillus rhamnosus GG | 8.5.Χ1Ο8 | Ι.ΟχΙΟ9 | Ι.ΟχΙΟ9 |
| Kontrola E.coli | 6.0x10* | 2.0x10* | 1.2x10* |
| Kontrola S.agalactiae | 3.0x10* | 3,2x10* | 2.0x10* |
| Kontrola S.epidermidis | 5.0x10* | 5.2x10* | 4.0x10* |
| Kontrola S.aureus | 8.Οχ 10κ | 1.1x10* | 2.0x10* |
| Kontrola E.faecalis | 3.3x10* | 5.0x10* | Ι.ΟχΙΟ8 |
| Kontrola C.difficile | 1.2χ105 | 1x105 | 5χ105 |
PL235 912B1
Tabela 13. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus rhamnosus KL53A wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej.
| Szczep probiotyczny /szczep wskaźnikowy | 0 godz. CFU/ml | po 8 godz. CFU/ml | po 24 godz, CFU/ml |
| L. rhamnosus KL53A | 2,5xlOy | l,2xlOy | l,3xl0y |
| E.coli | 1,1x10* | 0 | 0 |
| L.rhamnosus KL53A | 3,4xlOy | l,3xl0y | 1,5x109 |
| S.agalactiae | 8,lxl0b | 0 | 0 |
| L. rhamnosus KL53A | 2,5xlOy | 9,6xl08 | l,3xl0y |
| S.epidermidis | 2,0x10' | 0 | 0 |
| L. rhamnosus KL53A | 3xlO8 | 2.5xl08 | 1.8xl08 |
| S.aureus | Ι,ΙχΙΟ8 | 2xl04 | 0 |
| L. rhamnosus KL53A | ΙχΙΟ9 | l,5xl0y | Ι,ΙχΙΟ9 /lxl0y |
| E.faecalis | 1x10' | 3x10* | 0/0* |
| L. rhamnosus KL53A | 2,9x109 | l,2xl09 | l,2xlOy |
| CLdifficile | Ι,ΟχΙΟ4 | 0 | 0 |
| Kontrola | |||
| Kontrola L.rhamnosus KL53A | l,8xl09 | 5,0xl08 | Ι,ΙχΙΟ9 |
| Kontrola E.coli | 4,0x10' | 4,0x10' | 3,0x10* |
| Kontrola S.agalactiae | 4,0x10' | 3,2xl08 | 1,6x108 |
| Kontrola S.epidermidis | 5,0x10' | l,7xl08 | 4,0xl08 |
| Kontrola S.aureus | 3,0xl08 | 1.1Χ108 | 2.0x108 |
| Kontrola Ent.faecalis | 3,0x10* | 4x10* | 6xl07 |
| Kontrola CLdifficile | 4,0xl05 | lxl0b | 5x10° |
LEGENDA:
* dodatkowy czas inkubacji 72 godziny
PL 235 912 Β1
Tabela 14. Antagonistyczne działanie szczepu Lactobacillus rhamnosus GG wobec wybranych bakterii wskaźnikowych, przy zastosowaniu metody ilościowej.
| Szczep probiotyczny /szczep wskaźnikowy | 0 godz. CFU/ml | po 8 godz. CFU/ml | po 24 godz. CFU/ml |
| Lactobacillus rhamnosus GG | l,4xl08 | 8,6xl09 | 7,4x10* |
| E.coli | 1x10* | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | l,2xl0y | 9,3x10* | 7x10* |
| S.agalactiae | 1x10' | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 5,2x10* | l,4xl0y | 7x10* |
| S.epidermidis | 1x10' | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 5.OxlO8 | 3.5xlO8 | 2.8xlOs |
| S.aureus | 6.0xl08 | 0 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | 7x10* | lxlOy | 8xlO8 |
| E.faecalis | 2x10' | 2xl03 | 0 |
| Lactobacillus rhamnosus GG | l,2xl08 | 3,5xl08 | 5x10* |
| Cl.difficile | ΙχΙΟ3 | 0 | 0 |
| Kontrola | |||
| Kontrola Lactobacillus rhamnosus GG | Ι,όχΙΟ9 | 2,4xl09 | lxl09 |
| Kontrola E.coli | 2x10* | 1x10* | 1x10* |
| Kontrola S.agalactiae | 2,1x10' | 5,7x10* | 1,2x10* |
| Kontrola S.epidermidis | 1x10* | 3x10* | 1,7x108 |
| Kontrola S.aureus | 8.0xl08 | 1.1x109 | 2.0xl09 |
| Kontrola E.faecalis | 3x10* | 4x10* | 6x10' |
| Kontrola Cl.difficile | 4x10' | lx 106 | 5xl0b |
Wnioski • Badając antagonistyczne działanie mieszaniny Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 (stosunek wagowy 1:1) wykazano jej aktywność w wobec wytypowanych bakterii wskaźnikowych.
PL 235 912 B1 • Analizując wyniki działania antagonistycznego poszczególnych szczepów probiotycznych można przypuszczać, iż redukcja populacji bakterii wskaźnikowych była spowodowana przede wszystkim działaniem metabolitów Lactobacillus rhamnosus KL53A, a w nieco mniejszym stopniu Bifidobacterium breve PB04.
V. Ocena aktywności antagonistycznej wobec bakterii tego samego rodzaju.
Antagonistyczne działanie szczepów Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 i ich mieszaniny wobec bakterii tego samego rodzaju (Lactobacillus i Bifidobacterium) określono za pomocą półilościowej metody słupkowej (Strus M., Pakosz K., Przondo-Mordarska A., Rożynek E., Pituch H., Meisel-Mikołajczyk F., Heczko P.B. 2001. Med. Dośw. Mikrobiol. 53: 133-142).
Wnioski
W badaniu wykazano, iż:
• Szczep Bifidobacterium breve PB04 nie wykazuje antagonistycznego działania wobec żadnego z badanych szczepów wskaźnikowych z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium.
• Szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A wykazuje słabe antagonistyczne działanie wobec szczepów z rodzaju Bifidobacterium, zaś w stosunku do szczepów z gatunku Lactobacillus rhamnosus brak jest takiego działania.
• W oparciu o powyższe wyniki można wnioskować, iż preparaty probiotyczne oparte na mieszaninie badanych szczepów (Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04) nie wywierają wzajemnego, antagonistycznego oddziaływania prowadzącego do redukcji populacji tych bakterii.
VI. Badanie oporności na sztuczny sok żołądkowy i sole żółci.
W celu oznaczenie stopnia oporności bakterii Lactobacillus rhamnosus K153A i Bifidobacterium breve PB04 na pH soku żołądkowego posłużono się zmodyfikowaną metodą Clarka (Clark P.A., Cotton L.N. , Martin J.H. 1993. Manuscript J-8381 of the Mississippi Agriculture and Forestry Experiment Station.; 11-14).
Badane szczepy Lactobacillus rhamnosus K153A oraz Bifidobacterium breve PB04, a także mieszanina tych dwóch szczepów wykazały dużą oporność na niskie pH i działanie pepsyny sztucznego soku żołądkowego. Szczepy te po upływie 20 min redukowały swoją populację tylko o 1-2 log, co może świadczyć o ich doskonałym przystosowaniu do niesprzyjających warunków panującym w ludzkim przewodzie pokarmowym.
Całkowity rozkład soli żółci w stężeniu 1,2, 5, 10, 20 g/l wykazał szczep Lactobacillus rhamnosus KL53A oraz mieszanina Lactobacillus rhamnosus K153A i Bifidobacterium breve PB04. W przypadku szczepu Bifidobacterium breve PB04 rozkład soli żółci był typowy dla rodzaju Bifidobacterium oraz gatunku Bifidobacterium breve tzn. szczep wykazał całkowity rozkład soli żółci dla stężenia równego 1 g/l (+++), zaś dla pozostałych stężeń, tj. 2, 5, 10, 20 g/l, zaobserwowano słaby rozkład soli żółci w metodzie półilościowej określony na (+).
VII. Wynalazek zostanie opisany w przykładzie dotyczącym badania wpływu podanej doustnie mieszaniny szczepów probiotycznych na skład mikroflory jelita i na funkcje jelita myszy gnotobiotycznych (germ-free).
Model doświadczalny polegający na doustnym podawaniu badanych bakterii myszom gnotobiotycznym został wybrany dlatego, gdyż uważany jest za najbliższy sytuacji zachodzącej u noworodka z niską masą urodzeniową i niewykształconym układem odpornościowym i/lub urodzonemu drogą cesarskiego cięcia, którego przewód pokarmowy nie jest skolonizowany bakteriami od matki.
Prace badawcze objęły m.in. badanie translokacji tj. oznaczenie obecności bakterii kwasu mlekowego w krezkowych węzłach chłonnych, krwi i wybranych narządach wewnętrznych (wątrobie, śledzionie), a także ocenę kolonizacji przewodu pokarmowego przez szczepy probiotyczne za pomocą metody hodowlanej i metody fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ. Myszy germ-free są najlepszym modelem do weryfikacji bezpieczeństwa bakterii probiotycznych.
PL 235 912 B1
W badaniu na myszach germ-free udowodniono bezpieczeństwo stosowania mieszaniny szczepów probiotycznych Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04. W eksperymentalnej ocenie jakościowej i ilościowej udowodniono, iż badane szczepy probiotyczne nie mają zdolności do przekroczenia/osłabienia bariery jelitowej i wnikania do organów gospodarza. W żadnym z badanych organów nie wykryto obecności Bifidobacterium breve PB04.
W badaniu na myszach germ-free udowodniono również skuteczność kolonizacji. Wykrycie obecności szczepów Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 w kale myszy, wykazało zdolność tych bakterii do efektywnej kolonizacji przewodu pokarmowego. W pierwszym dniu po kolonizacji Lactobacillus rhamnosus KL53A był dominującym szczepem w jelitach i jego koncentracja osiągała wartość do 2,7x109 CFU/g kału. W następnym dniu eksperymentu liczba ilość pałeczek kwasu mlekowego w kale nieznacznie spadła, podczas gdy stężenie Bifidobacterium breve PB04 osiągnęło poziom 1,27x1010 CFU/g kału i szczep ten pozostał dominującym w jelicie skolonizowanych myszy. Oceniono również stopień kolonizacji bakteriami probiotycznymi różnych części jelita (jelito kręte, jelito ślepe i okrężnica). Otrzymane wyniki przedstawiono na Fig 1.
Fig. 1. przedstawia stopień kolonizacji bakteriami probiotycznymi różnych części jelita (jelito kręte, jelito ślepe i okrężnica).
Sekcja zwierząt wykazała znaczne różnice w budowie jelita myszy germ-free i myszy skolonizowanych bakteriami probiotycznymi jak przestawiono na Fig. 2, gdzie (A) przedstawia jelita myszy germfree z ogromnie rozdętym jelitem ślepym, natomiast (B) przedstawia jelita myszy skolonizowanej Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 ze zmniejszonym jelitem ślepym.
Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) polegała na hybrydyzacji krótkołańcuchowych sond nukleotydowych do komplementarnego fragmentu rybosomalnego 16S rRNA. Sondy te są projektowane do takiego fragmentu 16S rRNA, który jest typowy dla odpowiedniego rodzaju bakterii. Na końcu 5‘, sondy te znakowane są odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym. Metoda FISH umożliwia wykrywanie poszczególnych rodzajów, a nawet gatunków bakterii bezpośrednio w zmiażdżonym materiale. Preparaty były oglądane w mikroskopie fluorescencyjnym pod powiększeniem 1000x.
W oparciu o zastosowaną metodę fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ potwierdzono obecność bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w treści jelitowej u wszystkich myszy gnotobiotycznych (germ-free) skolonizowanych bakteriami probiotycznymi oraz potwierdzono obecność bakterii probiotycznych w ścianie jelita u czterech z pięciu myszy otrzymujących probiotyki. Liczebność bakterii probiotycznych w przeliczeniu na 1 gram tkanki lub kału wynosiła około od 1x107 CFU do 1x108 CFU. W grupie kontrolnej (myszy germ-free, którym nie podano bakterii probiotycznych) wszystkie materiały pobrane do analizy mikrobiologicznej dały wyniki ujemne.
Uzyskane wyniki potwierdzają skuteczność kolonizacji jelita myszy gnotobiotycznych (germ-free) po doustnym podaniu mieszaniny bakterii Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04.
Sprawdzono również wpływ kolonizacji Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacterium breve PB04 na ekspresję białek połączeń ścisłych w jelicie. Ekspresja okludyny i zonuliny (ZO-1) była lekko podwyższona w grupie otrzymującej probiotyki w stosunku do grupy myszy germ-free (ale różnice nie były znamiennie statystyczne).
Podsumowując wyniki badania na myszach germ-free należy stwierdzić, iż szczepy wchodzące w skład produktu badanego są bezpieczne i nie wykazują ryzyka translokacji. Otrzymane wyniki badań mikrobiologicznych wskazują również na skuteczność kolonizacji, a tym samym na potencjalne korzyści w zastosowaniu produktu w grupie noworodków z niską masą urodzeniową.
VIII. Badania wpływu podawanych doustnie bakterii probiotycznych na funkcje bariery jelitowej noworodków szczurzych poddanych stresowi.
Model doświadczalny polegający na doustnym podawaniu badanych bakterii noworodkom szczurzym został wybrany z uwagi na to, że jest uważany za najbliższy sytuacji zachodzącej u noworodka z niską masą urodzeniową i niewykształconym układem odpornościowym, którego przewód pokarmowy nie jest skolonizowany bakteriami matki, a który jest poddawany stresom, np. związanym z hospitalizacją na oddziale intensywnej terapii noworodkowej.
Badanie przeprowadzono na 30 noworodkach szczurzych rasy Wistar. Procedury badawcze rozpoczęto w drugim dniu życia młodych i przeprowadzono w trzech grupach badawczych:
• Grupa kontrolna H - Handled (Kontrola)
PL235 912B1
Noworodki szczurze karmione mlekiem matki. Nie podlegały suplementacji probiotykiem i nie były poddawane odstawieniu. Samica nie otrzymywała probiotyku.
• Grupa badawcza SH - Stres, Handled (Stres)
Noworodki szczurze poddawane stresowi odstawienia od matki przez 180 minut dziennie, przez 13 dni. W tym czasie umieszczano je w cieplarce z płaszczem wodnym w temp. 32°C (+/- 0,5°C). Poza naturalnym pokarmem samicy, noworodki otrzymywały jałową wodę podawaną 1 x dziennie w ilości 100 μΙ. Samica nie otrzymywała probiotyku.
• Grupa badawcza SP - Stres, Probiotyk (Probiotyk)
Noworodki szczurze poddawane stresowi odstawienia od matki przez 180 minut dziennie, przez 13 dni. W tym czasie umieszczano je w cieplarce z płaszczem wodnym w temp. 32°C (+/- 0,5°C). Poza naturalnym pokarmem samicy, noworodki podlegały suplementacji probiotykiem doustnym, podawanym 1 x dziennie, rozpuszczonym w 100 μΙ wody. Samica również otrzymywała probiotyk.
W 15 dniu życia noworodki z każdej z grup zostały uśmiercone przez dekapitację po uśpieniu. Następnie w warunkach jałowych wypreparowano jelita, wątrobę i śledzionę, a pobrane materiały poddano analizie mikrobiologicznej, immunohistochemicznej oraz histopatologicznej.
1. Badania mikrobiologiczne ściany i treści jelita.
Badania te przeprowadzono metodą hodowlaną. Ze wszystkich próbek biologicznych wykonano jakościową oraz ilościową analizę mikrobiologiczną bakterii tlenowych i beztlenowych ze szczególnym uwzględnieniem bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium.
Uzyskano następujące wyniki:
• Badania mikrobiologiczne materiałów pobranych z fragmentów wątroby i śledziony zwierząt laboratoryjnych dały wyniki ujemne w grupie SP (stres + probiotyk) oraz w grupie SH (stres). Wskazuje to na fakt, iż nie doszło do zjawiska translokacji tych bakterii ze światła jelita przy dużej ich suplementacji drogą doustną, nawet przy równoległym działaniu silnego czynnika stresującego.
• Analizując średnie liczebności populacji bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium występujące w 1 gramie treści jelita zaobserwowano brak różnic pomiędzy grupami. Wyniosły one około 109 CFU/gram kału dla wszystkich badanych grup.
• Natomiast średnia liczebność bakterii probiotycznych w przeliczeniu na 1 gram tkanki jelita grubego w grupie SP (stres + probiotyk) uległa podwyższeniu aż o 3 logarytmy w stosunku do dwóch pozostałych grup szczurów. Tak duże zwiększenie średniej liczebności populacji bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w grupie SP w przeliczeniu na 1 gram tkanki jelita grubego może świadczyć o dużej adherencji zastosowanych szczepów probiotycznych do powierzchni nabłonka jelita grubego.
Tabela 15. Średnia liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w poszczególnych grupach zwierząt (j.t.k/gram; CFU/gram) obliczona w oparciu o metodę hodowlaną.
| Badane grupy szczurów | Średnia liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w poszczególnych grupach [CFU/gram] | |
| lC3ł | Jelito grube | |
| H- bez stresu (kontrola) | 1.2x109 | 1.5xl05 |
| SH- stres | 2.9x10’ | 1.6x106 |
| SP - stres + probiotyk | 4.0x10’ | 8.2x108 |
2. Badania z wykorzystaniem fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).
Metoda fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) polegała na hybrydyzacji krótkołańcuchowych sond nukleotydowych do komplementarnego fragmentu rybosomalnego 16S rRNA. Sondy te są projektowane do takiego fragmentu 16S rRNA, który jest typowy dla odpowiedniego rodzaju bakterii. Na
PL 235 912 Β1 końcu 5‘, sondy te znakowane są odpowiednim barwnikiem fluorescencyjnym. Metoda FISH umożliwia wykrywanie poszczególnych rodzajów, a nawet gatunków bakterii bezpośrednio w zmiażdżonym materiale. Preparaty były oglądane w mikroskopie fluorescencyjnym pod powiększeniem 1000x.
Wnioski • Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ (technika FISH) zastosowana do ilościowej oceny flory bakteryjnej z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium zawartej w treści jelitowej potwierdziła podobne populacje tych bakterii we wszystkich trzech grupach badanych noworodków szczurzych.
• W przypadku tkanek jelita grubego zaobserwowano podobną tendencję jak w metodzie hodowlanej, tzn. największą średnią wartość populacji Lactobacillus i Bifidobacterium zaobserwowano w grupie SP (stres + probiotyk), a najmniejszą średnia wartość populacji Lactobacillus i Bifidobacterium w grupie kontrolnej H.
Tabela 16. Całkowita liczba bakterii oraz całkowita liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium w poszczególnych grupach badanych obliczona przy pomocy fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH).
| Badana grupa szczurów/numer kolejnego szczura | Całkowita liczba bakterii [CFU] | Całkowita liczba bakterii z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacterium [CFU] |
| Wynik średni dla Grupy H | Treść jelita -lxl07 | Treść jelita- 1χ10ϋ |
| Ściana j elita-1 χ 104 | Ściana jelita- lxlOL | |
| Wynik średni dla Grupy SP | Treść jelita -lxlOz | Treść jelita- ΙχΙΟ6 |
| Ściana jelita-lxlO4 | f ' J Ściana jelita- 1x10 | |
| Wynik średni dla Grupy SH | Treść jelita -lxlOB | Treść jelita- lxlO6 |
| Ściana jelita-lxlO4 | Ściana jelita- 1x10 |
3. Badanie integralności jelita grubego.
W celu zbadania integralności jelita grubego wykrywano metodą fluorescencyjną obecność białek połączeń ścisłych (okludyny i zonuliny ZO-1). Analizę przeprowadzono na skrawkach parafinowych wykonanych z pociętych fragmentów jelita grubego. Obserwowano intensywność świecenia połączeń w mikroskopie fluorescencyjnym OLYMPUS (ΒΧ51) przy długości fali: wzb. 494 nm - emi.520 nm, pod powiększeniem 400x, a intensywność świecenia oceniano w skali półil ości owej.
Intensywność świecenia według skali półil ości owej:
- brak świecenia (brak tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami) + słabe świecenie (niski poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) ++ silne świecenie (wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych) +++ bardzo silne świecenie (bardzo wysoki poziom tworzenia białek połączeń ścisłych)
Stwierdzono, iż:
• Najsilniejszy sygnał (świadczący o obecności białek połączeń ścisłych) zaobserwowano na skrawkach pobranych od noworodków szczurzych z grupy kontrolnej H. W grupie SP (stres + probiotyk) intensywność świecenia była nieco słabsza.
• W przypadku grupy SH (stres) we fragmentach tkanek pobranych z nabłonka jelita grubego nie zaobserwowano żadnego sygnału świadczącego o obecności okludyny i zonuliny ZO-1. Brak sygnału w tej grupie może świadczyć o silnym wpływie zastosowanego czynnika stresowego na ograniczenie tworzenia białek połączeń ścisłych pomiędzy komórkami nabłonka jelitowego.
• Porównując grupy SP (stres + probiotyk) i SH (stres) stwierdzono, iż intensywność tworzenia białek połączeń ścisłych może być w pewnym stopniu modyfikowana suplementacją bakteriami
PL235 912B1 probiotycznymi, gdyż w grupie której podawano probiotyki, znacznie więcej noworodków szczurzych wykazywało się obecnością okludyny i zonuliny ZO-1 w pobranych skrawkach jelita grubego.
Uzyskane wyniki potwierdzają skuteczność kolonizacji jelit noworodków szczurzych po doustnym podaniu mieszaniny bakterii probiotycznych z rodzaju Lactobacillus i Bifidobacteńum tj. Lactobacillus rhamnosus KL53A i Bifidobacteńum breve PB04.
4. Analiza histopatologiczna.
Wykonano pomiary:
• długości kosmków jelitowych, • wysokości komórek nabłonka jelitowego, • wysokości kropel śluzu w komórkach kubkowych.
Analizę statystyczną przeprowadzono za pomocą programu Statistica 10 (StatSoft corp., USA). Do porównania różnic między grupami posłużono się testem Kruskal-Willis ANOVA wraz z testami dla porównań wielokrotnych. Przyjęto poziom istotności 0.05.
a) Wysokość kropli śluzu
Tab. 17 Wysokość kropli śluzu - test ANOVA
| ANOVA rang Kruskala-Wallisa; wysokość kropli śluzu Zmienna niezależna (grupująca): grupa Test Kruskala-Wallisa: H (2, N= 363) =36,57480 p =,0000 | ||||
| Kod | N - ważnych | Suma - Rang | Średnia - Ranga | |
| kontrola | 1 | 108 | 25080,50 | 232,2269 |
| stres | 2 | 75 | 12942,00 | 172,5600 |
| probiotyk | 3 | 180 | 28043,50 | 155,7972 |
Tab. 18 Wysokość kropli śluzu - wartości p
| Wartość p dla porównań wielokrotnych (dwustronych); wysokość kropli śluzu Zmienna niezależna (grupująca): grupa Test Kruskala-Wallisa: H (2, N= 363) =36,57480 p =,0000 | |||
| kontrola - R:232,23 | stres-R: 172,56 | probiotyk - R: 155,80 | |
| kontrola | 0,000465 | 0,000000 | |
| stres | 0,000465 | 0,735304 | |
| probiotyk | 0,000000 | 0,735304 |
Rozmiar kropli śluzu jest największy w grupie niepoddanej stresowi. W wypadku grupy poddanej stresowi zwraca uwagę mniejsza zmienność wyników. Podanie probiotyku nie prowadzi do normalizacji średnich wartości, natomiast zwiększa rozrzut. Różnice pomiędzy grupami są istotne statystycznie (Tab. 1); w teście post-hoc (Tab. 2) okazuje się, że istotna statystycznie jest różnica pomiędzy grupą kontrolną a grupą poddaną stresowi i grupą u której stosowano probiotyk, natomiast różnica pomiędzy grupą „stres” a grupą „probiotyk” nie jest istotna statystycznie. Porównanie wyników ilustruje Fig. 3.
PL 235 912 Β1
b) Długość kosmka jelitowego
Tabela 19 Długość kosmka - test ANOVA
| ANOVA rang Kruskala-Wallisa; długość kosmka Zmienna niezależna (grupująca): grupa Test Kruskala-Wallisa: H (2, N= 331) =46,12594 p =,0000 | ||||
| Kod | N - ważnych | Suma - Rang | Średnia - Ranga | |
| kontrola | 1 | 114 | 14100,50 | 123,6886 |
| stres | 2 | 80 | 17427,00 | 217,8375 |
| probiotyk | 3 | 137 | 23418,50 | 170,9380 |
Tabela 20 Długość kosmka - wartości p
| Wartość p dla porównań wielokrotnych (dwustronych); długość kosmka Zmienna niezależna (grupująca): grupa Test Kruskala-Wallisa: H ( 2, N= 331) =46,12594 p =,0000 | |||
| kontrola-R: 123,69 | stres - R:217,84 | probiotyk - R: 170,94 | |
| kontrola | 0,000000 | 0,000295 | |
| stres | 0,000000 | 0,001488 | |
| probiotyk | 0,000295 | 0,001488 |
Długość kosmka w grupie poddanej stresowi rośnie; podanie probiotyku prowadzi do częściowej normalizacji tego parametru. Różnice pomiędzy grupami są istotne statystycznie (Tab. 3); w teście posthoc (Tab. 4) okazuje się, że różnice pomiędzy wszystkimi trzema grupami są statystycznie istotne. Wyniki przedstawiono na Fig. 4.
c) Wysokość komórek nabłonka
Tabela 21 Wysokość komórek nabłonka - test ANOVA
| ANOVA rang Kruskala-Wallisa; wysokość komórek nabłonka Zmienna niezależna (grupująca): grupa Test Kruskala-Wallisa: H ( 2, N= 390) =9,741693 p =,0077 | ||||
| Kod | N - ważnych | Suma - Rang | Średnia - Ranga | |
| kontrola | 1 | 119 | 20814,00 | 174,9076 |
| stres | 2 | 80 | 18062,00 | 225,7750 |
| probiotyk | 3 | 191 | 37369,00 | 195,6492 |
PL235 912B1
Tabela 22 Wysokość komórek nabłonka - wartości p
| Wartość p dla porównań wielokrotnych (dwustronnych); wysokość komórek nabłonka Zmienna niezależna (grupująca): grupa Test Kruskala-Wallisa: H ( 2, N= 390) =9,741693 p =,0077 | |||
| kontrola-R: 174,91 | stres - R: 225,78 | probiotyk -R: 195,65 | |
| kontrola | 0,005406 | 0,345413 | |
| stres | 0,005406 | 0,134341 | |
| probiotyk | 0,345413 | 0,134341 | |
Wysokość komórek nabłonka w grupie poddanej stresowi rośnie; podanie probiotyku prowadzi do częściowej normalizacji tego parametru. Różnice pomiędzy grupami są istotne statystycznie (Tab. 5); w teście post-hoc (Tab. 6) okazuje się, że jedynie różnica pomiędzy grupą kontrolną i grupą „stres” jest istotna statystycznie. Wyniki przedstawiono na Fig. 5.
5. Wnioski.
W podsumowaniu analizy histopatologicznej można stwierdzić, iż w wyniku stresu dochodzi do wzrostu rozmiaru komórek nabłonka jelitowego, wzrostu długości kosmków i zmniejszenia rozmiaru kropel śluzu. Podanie probiotyku prowadzi do normalizacji tych parametrów, przy czym normalizacja ta jest najwyraźniej widoczna w przypadku wielkości komórek nabłonka, natomiast jest niewielka w wypadku wielkości kropel śluzu.
W doświadczeniach wykazano, że żaden z wymienionych szczepów, którymi skarmiano myszy nie przemieszczał się do ich krwi, węzłów chłonnych, śledziony i wątroby. Natomiast podawane bakterie namnażały się w wysokich liczbach w jelicie cienkim i grubym (liczebności powyżej 109 j.t.k.[CFU]/gram dla szczepu Lactobacillus rhamnosus KL 53A i powyżej 1O10 j.t.k.[CFU]/gram dla szczepu Bifidobacterium breve PB 04), co wskazuje na skuteczną kolonizację przewodu pokarmowego. Ponadto mieszanina badanych szczepów stymulowała syntezę białek połączeń ścisłych w nabłonku jelita badanych zwierząt, co wskazuje na ich właściwości ochronne, polegające na uszczelnieniu jelita i zapobieganiu translokacji bakteryjnej prowadzącej do zakażenia uogólnionego.
Przeprowadzone badania wykazały brak inwazyjności in vivo, a zatem bezpieczeństwo badanej mieszaniny szczepów, a ponadto ich właściwości protekcyjne wyrażające się ich wpływem na szczelność ściany jelita. Badania nad zdolnością ocenianych szczepów bakterii do zasiedlania (kolonizacji) jelita myszy gnotobiotycznych wykonane klasycznymi metodami hodowlanymi a ponadto molekularną metodą fluorescencyjnej hybrydyzacji in situ (FISH) wykazały, że oba szczepy namnażały się na ścianie jelita w wysokich liczbach, zatem skutecznie kolonizowały przewód pokarmowy.
Wyniki przeprowadzonych badań in vitro dowodzą, że szczepy zawarte w kompozycji przeżywają przejście przez przewód pokarmowy i go kolonizują.
Badania przeprowadzone na odpowiednio dobranych modelach zwierzęcych szczurach dowodzą, że sposób zapobiegania chorobom polegający na podaniu kompozycji może być stosowany w stanach zapalnych przewodu pokarmowo-jelitowego, szczególnie u noworodków z niską masą urodzeniową.
Przykład wykonania produktu farmaceutycznego.
Szczepy Lactobacillus rhamnosus KL 53A i Bifidobacterium breve PB 04) przechowywane są w postaci zliofilizowanej w ampułkach próżniowych jako pula macierzysta (master seed lot). Z puli tej sporządzane są kolejne pule produkcyjne (working seed lot). System ten pozwala na zachowanie określonej liczby pasaży dla każdej serii produktu.
Proces produkcji oparty jest na namnażaniu i liofilizacji odpowiednio przygotowanych zawiesin bakteryjnych. Hodowla bakterii probiotycznych prowadzona jest metodą stacjonarną na podłożu płynnym (Lactobacillus rhamnosus KL 53A na podłożu octanowym, Bifidobacterium breve PB 04 na podłożu cysternowym. Podczas wirowania następuje separacja i płukanie biomasy. Uzyskany osad komórek bakteryjnych zawieszany jest w nośniku o składzie: maltodekstryna, kwas askorbinowy i poddawany procesowi liofilizacji. Cykl liofilizacji prowadzony jest w taki sposób aby zachować wszystkie funkcje
PL 235 912 B1 fizjologiczne bakterii charakterystyczne dla szczepów probiotycznych. Liofilizat jest rozdrabniany do określonej wielkości ziaren.
Liofilizaty zawiesin obu szczepów naważa się, a następnie łączy i miesza do uzyskania jednolitej mieszaniny. Wymagania dla mieszaniny to nie mniej niż 1 x 108 CFU w 100 mg. 1 porcja produktu zawiera: 1 mld bakterii kwasu mlekowego w następujących proporcjach: 50% Bifidobacterium breve PB 04, 50% Lactobacillus rhamnosus KL 53 A oraz substancje pomocnicze: maltodekstryna substancja wypełniająca, kwas askorbinowy - przeciwutleniacz.
Mieszanina liofilizatów i substancja pomocnicza - maltodekstryna wchodząca w skład produktu są naważane zgodnie z recepturą, łączone i mieszane w celu uzyskania jednorodnego proszku.
Następnie produkt dozowany jest do kapsułek/fiolek/saszetek.
Wymagania dla produktu to nie mniej niż 1,0 x 106 CFU/ dawkę.
Dawkowanie
Preparat farmaceutyczny podaje się w ilości 1 do 2 dawek dziennie przez cały okres pobytu w szpitalu i po jego opuszczeniu od 2 do 6 tygodni.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Kompozycja probiotyczna zawierająca bakterie kwasu mlekowego, znamienna tym, że zawiera mieszaninę, zdeponowanych w Polskiej Kolekcji Mikroorganizmów we Wrocławiu, szczepów Bifidobacterium breve PB 04, nr depozytu B/00028, i Lactobacillus rhamnosus KL 53A, nr depozytu B/00011, w proporcji od 1:1 do 1:2 w ilości mieszczącej się w zakresie od 1x105 do 1x108 CFU.
- 2. Kompozycja probiotyczna zawierająca mieszaninę szczepów Bifidobacterium breve PB 04 i Lactobacillus rhamnosus KL 53A w proporcji od 1:1 do 1:2 w ilości mieszczącej się w zakresie od 1x105 do 1x108 CFU, do zastosowania wytwarzania produktu farmaceutycznego do leczenia stanów chorobowych związanych z zaburzeniami flory bakteryjnej jelit.
- 3. Produkt farmaceutyczny zawierający kompozycję bakterii kwasu mlekowego, znamienny tym, że dawka produktu farmaceutycznego zawiera mieszaninę szczepów Bifidobacterium breve PB 04 i Lactobacillus rhamnosus KL 53A w proporcji od 1:1 do 1:2 w ilości od 1x105 do 1x108 CFU oraz farmaceutycznie dopuszczalny nośnik zawierający maltodekstrynę i kwas askorbinowy.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406052A PL235912B1 (pl) | 2013-11-13 | 2013-11-13 | Kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL406052A PL235912B1 (pl) | 2013-11-13 | 2013-11-13 | Kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL406052A1 PL406052A1 (pl) | 2015-05-25 |
| PL235912B1 true PL235912B1 (pl) | 2020-11-16 |
Family
ID=53175997
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL406052A PL235912B1 (pl) | 2013-11-13 | 2013-11-13 | Kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL235912B1 (pl) |
-
2013
- 2013-11-13 PL PL406052A patent/PL235912B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL406052A1 (pl) | 2015-05-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| ES2324532T3 (es) | Bacteria probiotica: lactobacillus fermentum. | |
| EP2000530B1 (en) | Composition of lactobacillus strains and the application of the composition of lactobacillus strains | |
| US10155015B2 (en) | Probiotic compositions for use in the treatment of bowel diseases | |
| ES2311718T3 (es) | Cepas de lactobacillus. | |
| EP3412766B1 (en) | Lactobacillus salivarius strain, composition comprising the same, and uses thereof | |
| US11274275B2 (en) | Lactobacillus paracasei ET-22 and use thereof | |
| PT1824500E (pt) | Estirpes probióticas de lactobacillus para saúde vaginal melhorada | |
| ES2873075T3 (es) | Cepas probióticas de Lactobacillus plantarum para las infecciones del tracto urinario | |
| JP2001526690A (ja) | シュウ酸塩関連疾患を予防するためのシュウ酸塩分解微生物またはシュウ酸塩分解酵素 | |
| Gionchetti et al. | Probiotics for the treatment of postoperative complications following intestinal surgery | |
| CN116478874A (zh) | 一种改善慢性低度炎症的副干酪乳杆菌及其应用 | |
| PL212096B1 (pl) | Wyizolowane szczepy Bifidobacterium infantis i środek farmaceutyczny | |
| US20220305063A1 (en) | Probiotic compositions and methods of use | |
| CN115517367A (zh) | 副干酪乳杆菌smn-lbk在制备促进肠道健康产品中的应用 | |
| CN114196599A (zh) | 一种用于肠道菌群调和的微生物组合物及其制备方法 | |
| PL235912B1 (pl) | Kompozycja probiotyczna, zastosowanie kompozycji probiotycznej i produkt farmaceutyczny | |
| Pande et al. | Prospectus of probiotics in modern age diseases | |
| US6899872B1 (en) | Absorbable dietary composition for improving the biological balance of intestinal tract flora | |
| JP2021511822A (ja) | 新規ラクトバチルス・サリバリウス株を含む組成物、及び中耳炎と上気道感染症の予防法／治療法 | |
| US20240024376A1 (en) | Microorganisms synthesizing anti-inflammatory molecules | |
| WO2024055976A1 (zh) | 葵花籽蛋白组合物和其应用 | |
| WO2024026339A2 (en) | Probiotic blend supplement with micronutrients for infant and children's health | |
| CN121852271A (zh) | 益生大肠杆菌CP57 (Escherichia coli CP57)及其应用 | |
| WO2026087784A1 (en) | Uses of lactobacillus reuteri in therapy of premature infant subjects | |
| Triantafillidis et al. | The role of pre-and probiotics in the treatment of Inflammatory Bowel Disease |