PL236060B1 - Grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie - Google Patents
Grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie Download PDFInfo
- Publication number
- PL236060B1 PL236060B1 PL420046A PL42004616A PL236060B1 PL 236060 B1 PL236060 B1 PL 236060B1 PL 420046 A PL420046 A PL 420046A PL 42004616 A PL42004616 A PL 42004616A PL 236060 B1 PL236060 B1 PL 236060B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- peptide
- fmoc
- resin
- compounds
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 53
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title description 21
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title description 3
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 39
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims abstract description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 claims description 20
- 229920005989 resin Polymers 0.000 claims description 20
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 17
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N acetic acid Substances CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 10
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 claims description 9
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 238000012360 testing method Methods 0.000 claims description 8
- FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N (E)-dacarbazine Chemical compound CN(C)\N=N\c1[nH]cnc1C(N)=O FDKXTQMXEQVLRF-ZHACJKMWSA-N 0.000 claims description 7
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 claims description 7
- KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N [(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-acetyl-6-formyl-3-methoxy-10,13-dimethyl-1,2,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl] acetate Chemical compound C1C[C@@H]2[C@](CCC(OC)=C3)(C)C3=C(C=O)C[C@H]2[C@@H]2CC[C@](OC(C)=O)(C(C)=O)[C@]21C KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 claims description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims description 5
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 5
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 5
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 claims description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims description 5
- UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N tetrachloro-1,4-benzoquinone Chemical compound ClC1=C(Cl)C(=O)C(Cl)=C(Cl)C1=O UGNWTBMOAKPKBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 5
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 4
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000008021 deposition Effects 0.000 claims description 3
- 238000010511 deprotection reaction Methods 0.000 claims description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 claims description 3
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 3
- 230000008961 swelling Effects 0.000 claims description 3
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 3
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 claims description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 claims description 2
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 2
- 238000007710 freezing Methods 0.000 claims description 2
- 230000008014 freezing Effects 0.000 claims description 2
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 claims description 2
- 238000006902 nitrogenation reaction Methods 0.000 claims description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 229910001868 water Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 abstract description 20
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 abstract description 8
- 229940126601 medicinal product Drugs 0.000 abstract 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 42
- DRSHXJFUUPIBHX-UHFFFAOYSA-N COc1ccc(cc1)N1N=CC2C=NC(Nc3cc(OC)c(OC)c(OCCCN4CCN(C)CC4)c3)=NC12 Chemical compound COc1ccc(cc1)N1N=CC2C=NC(Nc3cc(OC)c(OC)c(OCCCN4CCN(C)CC4)c3)=NC12 DRSHXJFUUPIBHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 21
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 20
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 10
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 10
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 9
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 8
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 8
- 206010018910 Haemolysis Diseases 0.000 description 7
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 7
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-dimethylformamide Substances CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 230000008588 hemolysis Effects 0.000 description 7
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 7
- 210000003470 mitochondria Anatomy 0.000 description 7
- 108700042778 Antimicrobial Peptides Proteins 0.000 description 6
- 102000044503 Antimicrobial Peptides Human genes 0.000 description 6
- WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N Haematoxylin Chemical compound C12=CC(O)=C(O)C=C2CC2(O)C1C1=CC=C(O)C(O)=C1OC2 WZUVPPKBWHMQCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N dichloromethane Natural products ClCCl YMWUJEATGCHHMB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 101800003223 Cecropin-A Proteins 0.000 description 5
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 5
- HCQPHKMLKXOJSR-IRCPFGJUSA-N cecropin-a Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(N)=O)[C@@H](C)CC)C(C)C)[C@@H](C)CC)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN)C1=CC=CC=C1 HCQPHKMLKXOJSR-IRCPFGJUSA-N 0.000 description 5
- 210000004379 membrane Anatomy 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 5
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N trifluoroacetic acid Substances OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108700022013 Insecta cecropin B Proteins 0.000 description 4
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 4
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 4
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 4
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 4
- YDJXDYKQMRNUSA-UHFFFAOYSA-N tri(propan-2-yl)silane Chemical compound CC(C)[SiH](C(C)C)C(C)C YDJXDYKQMRNUSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 3
- 102100039510 Cancer/testis antigen 2 Human genes 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101000889345 Homo sapiens Cancer/testis antigen 2 Proteins 0.000 description 3
- 108010028921 Lipopeptides Proteins 0.000 description 3
- 238000011319 anticancer therapy Methods 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 230000006721 cell death pathway Effects 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 230000017074 necrotic cell death Effects 0.000 description 3
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 3
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 3
- 108700012813 7-aminoactinomycin D Proteins 0.000 description 2
- YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 7-aminoactinomycin D Chemical compound C[C@H]1OC(=O)[C@H](C(C)C)N(C)C(=O)CN(C)C(=O)[C@@H]2CCCN2C(=O)[C@@H](C(C)C)NC(=O)[C@H]1NC(=O)C1=C(N)C(=O)C(C)=C2OC(C(C)=C(N)C=C3C(=O)N[C@@H]4C(=O)N[C@@H](C(N5CCC[C@H]5C(=O)N(C)CC(=O)N(C)[C@@H](C(C)C)C(=O)O[C@@H]4C)=O)C(C)C)=C3N=C21 YXHLJMWYDTXDHS-IRFLANFNSA-N 0.000 description 2
- 108050004290 Cecropin Proteins 0.000 description 2
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 2
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 2
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 2
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 210000000601 blood cell Anatomy 0.000 description 2
- 150000001718 carbodiimides Chemical class 0.000 description 2
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 2
- 230000030833 cell death Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N eosin Chemical compound [Na+].OC(=O)C1=CC=CC=C1C1=C2C=C(Br)C(=O)C(Br)=C2OC2=C(Br)C(O)=C(Br)C=C21 YQGOJNYOYNNSMM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 150000004665 fatty acids Chemical group 0.000 description 2
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001788 irregular Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 2
- 238000001840 matrix-assisted laser desorption--ionisation time-of-flight mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N methyl cyanide Natural products CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M mitoTracker Red Chemical compound [Cl-].C1=CC(CCl)=CC=C1C(C1=CC=2CCCN3CCCC(C=23)=C1O1)=C2C1=C(CCC1)C3=[N+]1CCCC3=C2 IKEOZQLIVHGQLJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 2
- 238000010647 peptide synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M propidium iodide Chemical compound [I-].[I-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CCC[N+](C)(CC)CC)=C1C1=CC=CC=C1 XJMOSONTPMZWPB-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 2
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 2
- KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N (2S,3S,4S,5R,6R)-6-[(2S,3R,4R,5S,6R)-3-Acetamido-2-[(2S,3S,4R,5R,6R)-6-[(2R,3R,4R,5S,6R)-3-acetamido-2,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-2-carboxy-4,5-dihydroxyoxan-3-yl]oxy-5-hydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-4-yl]oxy-3,4,5-trihydroxyoxane-2-carboxylic acid Chemical compound CC(=O)N[C@H]1[C@H](O)O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O3)C(O)=O)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)NC(C)=O)[C@@H](C(O)=O)O1 KIUKXJAPPMFGSW-DNGZLQJQSA-N 0.000 description 1
- DYWUPCCKOVTCFZ-LBPRGKRZSA-N (2s)-2-amino-3-[1-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonyl]indol-3-yl]propanoic acid Chemical compound C1=CC=C2N(C(=O)OC(C)(C)C)C=C(C[C@H](N)C(O)=O)C2=C1 DYWUPCCKOVTCFZ-LBPRGKRZSA-N 0.000 description 1
- GVIXTVCDNCXXSH-AWEZNQCLSA-N (2s)-2-amino-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]pentanoic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C GVIXTVCDNCXXSH-AWEZNQCLSA-N 0.000 description 1
- VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N (2s)-2-amino-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound CC(C)(C)OC(=O)NCCCC[C@H](N)C(O)=O VVQIIIAZJXTLRE-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoserine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP(O)(=O)OC[C@H](N)C(O)=O)OC(=O)CCCCCCCCCCCCCCCCC TZCPCKNHXULUIY-RGULYWFUSA-N 0.000 description 1
- HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 3,3'-diaminobenzidine Chemical compound C1=C(N)C(N)=CC=C1C1=CC=C(N)C(N)=C1 HSTOKWSFWGCZMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000024893 Acute lymphoblastic leukemia Diseases 0.000 description 1
- 208000014697 Acute lymphocytic leukaemia Diseases 0.000 description 1
- 108090000672 Annexin A5 Proteins 0.000 description 1
- 102000004121 Annexin A5 Human genes 0.000 description 1
- 206010005003 Bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 102000011727 Caspases Human genes 0.000 description 1
- 108010076667 Caspases Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N Fluorouracil Chemical compound FC1=CNC(=O)NC1=O GHASVSINZRGABV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001517610 Funa Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N Glycerophosphorylserin Natural products OC(=O)C(N)COP(O)(=O)OCC(O)CO ZWZWYGMENQVNFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055207 HMGB1 Human genes 0.000 description 1
- 108700010013 HMGB1 Proteins 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 description 1
- 241000256023 Hyalophora cecropia Species 0.000 description 1
- 241001424413 Lucia Species 0.000 description 1
- 206010058467 Lung neoplasm malignant Diseases 0.000 description 1
- 108060003100 Magainin Proteins 0.000 description 1
- 108010036176 Melitten Proteins 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 235000021314 Palmitic acid Nutrition 0.000 description 1
- 229930040373 Paraformaldehyde Natural products 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 208000006664 Precursor Cell Lymphoblastic Leukemia-Lymphoma Diseases 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 239000004809 Teflon Substances 0.000 description 1
- 229920006362 Teflon® Polymers 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 208000007097 Urinary Bladder Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 description 1
- 150000003862 amino acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000002246 antineoplastic agent Substances 0.000 description 1
- 230000006907 apoptotic process Effects 0.000 description 1
- 210000002469 basement membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000003659 bee venom Substances 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 108010047197 cecropin A(1-7)melittin(2-9) Proteins 0.000 description 1
- 108010020085 cecropin A(1-8)melittin(1-18) Proteins 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 230000001461 cytolytic effect Effects 0.000 description 1
- 238000007822 cytometric assay Methods 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 229940127089 cytotoxic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000003527 eukaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N fluorescein-5-isothiocyanate Chemical compound O1C(=O)C2=CC(N=C=S)=CC=C2C21C1=CC=C(O)C=C1OC1=CC(O)=CC=C21 MHMNJMPURVTYEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001943 fluorescence-activated cell sorting Methods 0.000 description 1
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 1
- 229960002949 fluorouracil Drugs 0.000 description 1
- PTCGDEVVHUXTMP-UHFFFAOYSA-N flutolanil Chemical compound CC(C)OC1=CC=CC(NC(=O)C=2C(=CC=CC=2)C(F)(F)F)=C1 PTCGDEVVHUXTMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 1
- 230000002949 hemolytic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000086 high toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001744 histochemical effect Effects 0.000 description 1
- 229920002674 hyaluronan Polymers 0.000 description 1
- 229960003160 hyaluronic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000002991 immunohistochemical analysis Methods 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000000622 irritating effect Effects 0.000 description 1
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 description 1
- 210000002311 liver mitochondria Anatomy 0.000 description 1
- 230000007762 localization of cell Effects 0.000 description 1
- 201000005202 lung cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000020816 lung neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 1
- VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N melittin Chemical compound NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(N)=O)CC1=CNC2=CC=CC=C12 VDXZNPDIRNWWCW-JFTDCZMZSA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 210000001700 mitochondrial membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000008965 mitochondrial swelling Effects 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N n-Pentadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCC(O)=O WQEPLUUGTLDZJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C.CCN(C(C)C)C(C)C WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N n-hexadecanoic acid Natural products CCCCCCCCCCCCCCCC(O)=O IPCSVZSSVZVIGE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000001338 necrotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 1
- 239000012188 paraffin wax Substances 0.000 description 1
- 229920002866 paraformaldehyde Polymers 0.000 description 1
- 230000000149 penetrating effect Effects 0.000 description 1
- 125000001151 peptidyl group Chemical group 0.000 description 1
- 210000001236 prokaryotic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 1
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 238000010532 solid phase synthesis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000004611 spectroscopical analysis Methods 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N tfa trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F.OC(=O)C(F)(F)F WROMPOXWARCANT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 201000005112 urinary bladder cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002435 venom Substances 0.000 description 1
- 210000001048 venom Anatomy 0.000 description 1
- 231100000611 venom Toxicity 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia są nowe związki o wzorze ogólnym, przedstawionym na rysunku, gdzie "R" oznacza: IGAVLKVLTTGLPALIS-NH2, AVLKVLA-NH2, AVLKVLR-NH2, AVLKVLN-NH2, AVLKVLD-NH2, AVLKVLC-NH2, AVLKVLQ-NH2, AVLKVLE-NH2, AVLKVLG-NH2, AVLKVLH-NH2, AVLKVLI-NH2, AVLKVLL-NH2, AVLKVLK-NH2, AVLKVLM-NH2, AVLKVLF-NH2, AVLKVLP-NH2, AVLKVLS-NH2, AVLKVLT-NH2, AVLKVLW-NH2, AVLKVLY-NH2, AVLKVLV-NH2. Zgłoszenie obejmuje też sposób otrzymywania przedmiotowych związków, charakteryzujący się tym, że otrzymuje się je kilku etapach. Ponadto przedmiotem zgłoszenia jest też zastosowanie powyższych związków do wytwarzania środka leczniczego przeznaczonego dla pacjentów z chorobami nowotworowymi.
Description
Opis wynalazku
Przedmiotem wynalazku jest grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie.
Powszechnie wiadomo, że wiele z naturalnie występujących peptydów przeciwdrobnoustrojowych oraz ich syntetycznych analogów wykazuje jednocześnie działanie przeciwnowotworowe. Fakt ten wpływa na wciąż rosnące zainteresowanie tą grupą związków w opracowywaniu nowych sposobów terapii chorób nowotworowych. Peptydy przeciwbakteryjne, dzięki swemu wypadkowemu ładunkowi dodatniemu, wiążą się preferencyjnie do powierzchni komórek nowotworowych niszcząc je i prowadząc do ich śmierci. Natomiast peptydy syntezowane chemicznie projektowane są tak, by łączyły się z określonymi celami, co zapewnia im dużo większą swoistość. Rozpoznają one ściśle określone miejsca na/w komórkach nowotworowych.
Peptydy przeciwbakteryjne są izolowane z mikroorganizmów oraz niektórych komórek owadów, roślin, i zwierząt, z komórkami ludzkimi włącznie. Dotychczas wyizolowano i ustalono sekwencję tysięcy peptydów wykazujących aktywność przeciwdrobnoustrojową. Związki te ze względu na swój kationowy charakter wykazują wyższe powinowactwo względem błony komórek bakteryjnych niż powierzchni komórek ludzkich. Podobny mechanizm działania dotyczy peptydów, które wnikają do wnętrza komórki. Powszechna jest symbiotyczna teoria pochodzenia mitochondriów komórek eukariotycznych (np. nowotworowych). Organelle te powstały na drodze ewolucji z organizmów bakteryjnych, co powoduje, że ich błona komórkowa jest podobna do błony komórek prokariotycznych. Cecha ta powoduje, że peptydy przeciwbakteryjne po wniknięciu do wnętrza komórek eukariotycznych łączą się z powierzchnią mitochondriów niszcząc je i wywołując śmierć komórek. Powierzchnia komórek nowotworowych różni się pod względem niektórych cech od komó rek prawidłowych. Ich błona komórkowa, w przeciwieństwie do błony komórek prawidłowych jest bogata w kwas sialowy. Komórki prawidłowe mają na swojej powierzchni znacznie mniej cząsteczek ujemnie naładowanych, jak na przykład fosfatydyloseryna czy O-glikozylowana mucyna, niż komórki nowotworowe. Prawdopodobnie ujemnie naładowana błona komórek nowotworowych zmniejsza przyleganie komórek do błony podstawnej bogatej w kwas hialuronowy. Luźna struktura błony komórek nowotworowych ułatwia działanie peptydów przeciwbakteryjnych. Niektóre komórki nowotworowe, ze względu na dużą liczbę wypustek cytoplazmatycznych lub nieregularny kształt, mają większą powierzchnię. Pozwala to na wiązanie się z błoną większej liczby cząsteczek peptydów. Wypustki te mają różne formy i rozmiary, co pozwala na przyleganie komórek oraz komunikację między komórkami nowotworowymi a mikrośrodowiskiem. Mogą one także pełnić rolę w selektywnym przyleganiu peptydów kationowych do komórek nowotworowych. Różnice w budowie błon komórkowych, a także dość duża, nieregularna powierzchnia komórek nowotworowych mogą powodować, że komórki te będą spenetrowane z większą selektywnością przez peptydy przeciwbakteryjne niż komórki prawidłowe. Ze względu na łatwość otrzymywania i wysoką aktywność wykazywaną w testach in vitro, peptydy są potencjalną grupą związków możliwych do zastosowania w terapii przeciwnowotworowej. Naturalnie występujące peptydy przeciwbakteryjne często mają właściwości przeciwnowotworowe. Peptydy te preferencyjnie wiążą się z błonami komó rek nowotworowych. Natomiast syntezowane chemicznie są zdolne wiązać się swoiście z określonymi celami molekularnymi w komórce. Pod wpływem swoistych peptydów komórki nowotworowe mogą ginąć w wyniku niszczenia błony komórkowej lub mitochondrialnej. Działanie peptydów może powodować również zablokowanie aktywności wybranych białek niezbędnych do przeżycia, proliferacji, migracji oraz zdolności do tworzenia przerzutów. Do grupy peptydów przeciwbakteryjnych wykazujących właściwości przeciwnowotworowe zaliczamy m.in. cekropinę A i B. Cekropiny po raz pierwszy wyizolowano z organizmu ćmy - Hyalophora cecropia. Peptydy te wyizolowano także z komórek ssaków. Cekropinę A (KWKLFKKIEKVGQNIRDGIIIKAG-PAVAVVGQATQIAK) i cekropinę B (KWKVFKKIEKMGRNIRNGIVKAGPAIAVLG-EAKAL) cechuje obecność dwóch a-helis. Zarówno cekropina A jak i cekropina B wykazują właściwości cytolityczne w stosunku do kilku różnych linii komórek nowotworowych. Nie powodują one niszczenia prawidłowych komórek fibroblastów, limfocytów i erytrocytów w stężeniu toksycznym dla komórek nowotworowych. Istnieją dane wskazujące, że cekropiny A i B wykazują dużą toksyczność względem komórek raka pęcherza moczowego z niewielkim efektem toksycznym w stosunku do komórek prawidłowych fibroblastów. Skojarzenie cekropiny A z 5-fluorouracylem przynosi dodatkowy efekt cytotoksyczny przeciwko ko
PL 236 060 B1 mórkom ostrej białaczki limfatycznej. Kombinacja peptydów przeciwbakteryjnych i chemioterapeutyków może być zatem użyteczna w terapii nowotworów.
Jedną z propozycji mających na celu opracowanie związków o nowych właściwościach jest łączenie fragmentów peptydów wyizolowanych ze źródeł naturalnych. Efektem podejmowanych prób są peptydy będące chimerami. Przykładem takiego związku jest peptyd CAMEL - CA(1-7)M(2-9) (M-melityna; GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ). Melityna, której część sekwencji aminokwasowej wchodzi w skład owego związku, jest peptydem występującym w jadzie pszczelim. Odpowiada za drażniące i hemolizujące działanie jadu w miejscu użądlenia. Nie jest to jedyna jej aktywność, gdyż może także indukować apoptozę komórek nowotworowych.
Wiele uwagi poświęca się także projektowaniu nowych związków z grupy peptydów. Przykładem są lipopeptydy, czyli połączenia sekwencji aminokwasowej z resztą kwasu tłuszczowego. Udowodniona jest ich wysoka aktywność przeciwdrobnoustrojowa (efektywność działania nawet dla krótkich sekwencji, tzw. krótkich lipopeptydów). Ze względu na łatwość otrzymywania i niskie koszty syntezy są one obiecującą grupą związków, które mogą znaleźć zastosowanie w medycyni e. Potwierdzone jest także działanie przeciwnowotworowe lipopeptydów. Grupa związków zawierających w swojej sekwencji reszty kwasu tłuszczowego została przebadana na 56 linii ludzkich komórek nowotworowych. Obiecujące wyniki uzyskano m.in. wobec komórek raka płuc, białaczki i czerniaka.
Pomimo wielu odkryć w dziedzinie związków peptydowych trwają poszukiwania nowych struktur swoiście niszczących komórki nowotworowe oraz komórki mikrośrodowiska nowotworowego takie jak komórki śródbłonkowe naczyń nowotworowych, makrofagi czy fibroblasty związane z nowotworami.
Dotychczas wszystkie ujawnione wynalazki zastrzegają inne grupy związków niż te, które są przedmiotem niniejszego zgłoszenia.
Celem wynalazku jest opracowanie nowych syntetycznych peptydów wykazujących działanie przeciwnowotworowe oraz sposobu ich otrzymywania. Związki te mogą znaleźć zastosowanie jako nowe środki lecznicze w terapii przeciwnowotworowej.
W opisywanym wynalazku przedstawiono zastosowanie grupy peptydów przeciwbakteryjnych, które jednocześnie posiadają działanie przeciwnowotworowe. Związki otrzymano na drodze syntezy chemicznej metodą SPPS (synteza na fazie stałej, SPPS - ang. Solid-phase peptide synthesis) z zastosowaniem strategii Fmoc/tBu. Do syntezy zastosowano wyłącznie aminokwasy o konfiguracji L. Grupa α-aminowa wszystkich aminokwasów była chroniona osłoną Fmoc. Osłonięte były również łańcuchy boczne aminokwasów.
Wynalazek dotyczy grupy pochodnych peptydu CAMEL (KWKLFKKIGAVLKVL-NH2), sposobu ich otrzymywania i zastosowania w terapii przeciwnowotworowej.
PL 236 060 Β1
Przedmiotem wynalazku są nowe związki o wzorze ogólnym:
gdzie „R” oznacza:
-IGAVLKVLTTGLPALIS-NH2 (związek II)
-AVLKVLA-NH2
-AVLKVLR-NH2
-avlkvln-nh2
-avlkvld-nh2
-avlkvlc-nh2
-avlkvlq-nh2
-avlkvlenh2
-avlkvlg-nh2
-avlkvlh-nh2
-avlkvli-nh2
-avlkvll-nh2
-avlkvlk-nh2
-avlkvlm-nh2
-avlkvlf-nh2
-avlkvlp-nh2
PL 236 060 Β1
-AVLKVLS-NH2
-avlkvlt-nh2
-avlkvlw-nh2
-avlkvly-nh2
-avlkvlv-nh2
Sposób otrzymywania związków zdefiniowanych powyżej, które otrzymuje się w następujących etapach:
a) 60 minutowy proces pęcznienia żywicy amidowej Fmoc-Rink Amidę AM RAM w DCM;
b) deprotekcja osłony Fmoc, blokującej grupę α-aminową w 20% roztworze piperydyny w DMF;
c) przemywanie żywicy (DMF, DCM);
d) wykonanie testu chloranilowego;
e) reakcja acylowania poprzez przyłączenie Fmoc-chronionego aminokwasu; wspomaganie promieniowaniem mikrofalowym: czas - 15 min, temperatura - 65°C, moc - 40 W; przy użyciu równomolowej mieszaniny chronionego aminokwasu, DIC oraz Oxyma Pure (Fmoc-AA:DIC:Oxyma Pure, 1:1:1) i zastosowaniu dwukrotnego molowego nadmiaru w stosunku do stopnia osadzenia nośnika;
f) przemywanie żywicy (DMF, DCM);
g) wykonanie testu chloranilowego;
h) powtarzanie etapów od b) do g) aż do momentu uzyskania peptydu z zastrzeżenia 1;
i) odszczepienie peptydu od żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon znajdujących się na łańcuchach bocznych za pomocą mieszaniny TFA:H2C:TIS:fenol (95:2:2:1, v/v/v/w);
j) odsączenie, wytrącenie eterem schłodzonym w ciekłym azocie, rozpuszczenie osadu w wodzie destylowanej z 10% CH3COOH, następnie zamrożenie za pomocą ciekłego azotu i liofilizacja;
k) analiza i oczyszczanie za pomocą RP-HPLC;
I) spektrometria mas w celu potwierdzenia tożsamości.
Nowe związki określone powyżej do zastosowania jako lek do leczenia chorób nowotworowych.
Opis figur:
Fig. 1 -przedstawia cytotoksyczność peptydów dla mysich komórek nowotworowych.
Fig. 2 -przedstawia hemolizę erytrocytów w obecności związku II.
Fig. 3-przedstawia lokalizację znakowanego związku II w mitochondriach komórek mysiego czerniaka.
Fig. 4 -przedstawia pęcznienie mitochondriów podczas inkubacji ze związkiem II.
Fig. 5 -przedstawia nowe związki będące przedmiotem wynalazku (wzory strukturalne oraz zapis sekwencji aminokwasów za pomocą skrótów jednoliterowych).
Określenia stosowane w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie: ACN - Acetonitryl
DIPEA - Diizopropyloetyloamina
DIC - N,N'-Diizopropylokarbodiimid
DMF - N,N-Dimetyloformamid
DCM - Dichlorometan
Fmoc - 9-Fluorenylometoksykarbonyl
Pal - reszta kwasu palmitynowego tBu - tert-butyl
TIS - triizopropylosilan
TFA - kwas trifluorooctowy
Wynalazek opisują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia:
Przykład 1
Synteza chemiczna
Związek otrzymano drogą syntezy na nośniku stałym zgodnie ze strategią Fmoc/tBu. W tym celu odważoną żywicę Fmoc Rink-Amide AM RAM, którą poddano pęcznieniu w naczyniu reakcyjnym
PL 236 060 B1 w DCM przez 60 min. Po odsączeniu rozpuszczalnika dodano 20% roztwór piperydyny w DMF (v/v) w celu usunięcia osłony grupy aminowej, następnie odsączono rozpuszczalniki i żywicę przemyto z wykorzystaniem DMF i DCM. Syntezę liniowego peptydu (związek I) - Pal-Arg-Lys-NH2; (Pal-RK-NH2), prowadzono zgodnie z procedurą, która obejmuje następujące etapy:
a) Deprotekcja grupy aminowej przy użyciu 20% roztworu piperydyny w DMF.
b) Cykl przemywań żywicy (DMF, DCM).
c) Reakcja acylowania (sprzęgania) przy użyciu równomolowej mieszaniny chronionego aminokwasu, DIC oraz Oxyma Pure (Fmoc-AA:DIC:Oxyma Pure, 1:1:1). Reakcja wspomagana była promieniowaniem mikrofalowym (reaktor CEM Discover®), zaś naczynie reakcyjne chłodzone było strumieniem sprężonego powietrza. Parametry procesu: czas - 15 min, temperatura - 65°C, moc - 40 W.
Kolejne pochodne aminokwasowe przyłączano stosując 2-krotny molowy nadmiar w stosunku do stopnia osadzenia nośnika. Postęp acylowania badano testem chloranilowym - zielone zabarwienie ziaren żywicy potwierdzało występowanie wolnej grupy aminowej, natomiast brak zabarwienia świadczył o całkowitym przyłączeniu Fmoc-chronionego aminokwasu do żywicy.
Do odszczepienia peptydu od żywicy przygotowano roztwór składający się z TFA oraz zmiataczy tj.: wody dejonizowanej, fenolu i TIS. Stosunek objętościowy mieszaniny TFA:H2O:TIS:fenol wynosił odpowiednio 95:2:2:1 (v/v/v/w). Peptydylo-żywicę umieszczono w powyżej opisanym roztworze i mieszano na mieszadle magnetycznym przez 60 min. Po tym czasie roztwór odsączono, a z otrzymanego przesączu surowy peptyd wytrącono schłodzonym eterem dietylowym. Odwirowany osad (surowy produkt) rozpuszczono w wodzie destylowanej z 10% dodatkiem kwasu octowego, zamrożono w ciekłym azocie i zliofilizowano.
Ostatnim krokiem była analiza otrzymanego peptydu, oczyszczenie oraz potwierdzenie jego tożsamości. Związek analizowano oraz oczyszczano przy użyciu wysokosprawnej chromatografii cieczowej w odwróconym układzie faz (RP-HPFC). Analizy przeprowadzono z użyciem chromatografu Varian Prostar, na kolumnie C18 Phenomenex (4,6 x 150 mm) w układzie eluentów H 2O/ACN. Eluenty zawierały dodatek 0,1% TFA (v/v). Przepływ wynosił 2 ml/min, a czas analizy 20 min. Absorbancję mierzono przy długość fali λ = 214 nm. Uzyskany związek poddano oczyszczaniu przy użyciu RP-HPFC (Knauer), z wykorzystaniem kolumny C18 Phenomenex Funa (21,2 x 250 mm, 15 μm). Podczas oczyszczania związków jako fazę organiczną zastosowano etanol (0,1% TFA, v/v) w celu zminimalizowania szkodliwości procesu dla środowiska. Absorbancja mierzona była przy długości fali λ = 220 nm. Czas oczyszczania wynosił ok. 120 min, zaś zastosowany przepływ - 8 ml/min. Uzyskane czyste frakcje związku (czystość powyżej 95%) zliofilizowano.
Tożsamość związku potwierdzono za pomocą spektrometrii MALDI-TOF MS (Spektrometr mas MALDI-TOF Biflex III Bruker, Niemcy).
Otrzymano peptyd o sekwencji aminokwasowej (związek I):
Pal-Arg-Lys-NH2; (Pal-RK-NH2).
P r z v k ł a d 2
Synteza pochodnej peptydu CA(1-8)M(1-18) (związek II) przeprowadzana jest w sposób analogiczny jak w przykładzie 1. Różnica dotyczy sekwencji aminokwasowej, która dla związku II wygląda następująco:
Pal-Arg-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Gly-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-LeuLys-Val-Leu-Thr-Thr-Gly-Leu-Pro-Ala-Leu-Ile-Ser-NH2
Pal-RKWKLFKKIGIGAVLKVLTTGLPALIS-NH2
Schemat otrzymywania pochodnej (II):
1. Synteza związku w fazie stałej metodą karbodiimidową na żywicy Fmoc Rink Amide AM RAM; wspomagana promieniowaniem mikrofalowym.
2. Odszczepienie peptydu od żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon znajdujących się na łańcuchach bocznych.
3. Oczyszczanie i analiza otrzymanego peptydu.
Parametry poszczególnych procesów tak jak w przykładzie 1.
P r z v k ł a d 3
Synteza grupy pochodnych CAMEL przeprowadzana jest w sposób analogiczny do przedstawionego przykładu 1. Pochodne zawierają dodatkową resztę aminokwasową na C-końcu peptydu o wzorze ogólnym:
Pal-Arg-Lys-Trp-Lys-Leu-Phe-Lys-Lys-Ile-Gly-Ala-Val-Leu-Lys-Val-Leu-X-NH2
PL 236 060 B1
Pal-RKWKLFKKIGAVLKVLX-NH2
Gdzie, X oznacza dowolną resztę aminokwasową.
Aminokwasy stosowane do syntezy: Ala, Arg(Pbf), Asn(Trt), Asp(OtBu), Cys(Trt), Glu(OtBu), Gln(Trt), Gly, His(Trt), Ile, Leu, Lys(Boc), Met, Phe, Pro, Ser(tBu), Thr(tBu), Trp(Boc), Tyr(tBu), Val.
Schemat otrzymywania pochodnych peptydów:
1. Synteza związków w fazie stałej metodą karbodiimidową na żywicy Fmoc Rink Amide AM RAM; wspomagana promieniowaniem mikrofalowym.
2. Odszczepienie peptydów od żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon znajdujących się na łańcuchach bocznych.
3. Oczyszczanie i analiza otrzymanych peptydów.
P r z v k ł a d 4
Cytotoksyczność peptydów względem mysich linii komórkowych (B16-F10 - komórki mysiego czerniaka; mysie fibroblasty NIH3T3)
Linie komórek nowotworowych: hodowano w pożywce RPMI 1640 lub DMEM high glucose z 10% surowicą (FBS - ang. Fetal Bovine Serum) na płytkach 96-dołkowych. Ilość komórek w 100 μL na dołek wynosiła ok. 3 x 103. Po 24 godzinach pożywkę hodowlaną zmieniano na pożywkę zawierającą odpowiednie stężenie (od 1-50 μΜ) związku I lub II. Komórki inkubowano w atmosferze 5% CO2 i w temperaturze 37°C przez 24-72 godziny. Po usunięciu pożywki do każdego dołka dodano 100 μL roztworu MTT (0,5 mg/ml w PBS) i inkubowano przez 3 godziny w temperaturze 37°C. Wytworzone kryształy formazanu rozpuszczano dodając 100 μl 0,125% HCl w izopropanolu. Pomiary spektrofotometryczne prowadzono przy długości fali λ = 570 nm przy użyciu czytnika ELISA i na podstawie uzyskanych wartości absorbancji obliczano procent żywych komórek w stosunku do kontroli, gdzie nie dodano badanych związków.
Za pomocą testu MTT wykazano, że toksyczność związku I i II w stosunku do komórek nowotworowych jest wysoka. IC50 (ang. Inhibitory Concentration), czyli stężenie, które powodowało 50% zahamowanie wzrostu komórek nowotworowych, wynosiło: w przypadku związku I - ok. 4 μM, natomiast w przypadku związku II ok. 8 μΜ. Dla porównania wartość IC50 dla citropiny, cekropiny A i B oraz magaininy wynosiła odpowiednio: 50 μM, 2 μM, 200 μΜ. Związek I powodował śmierć komórek nowotworowych, przy niższych stężeniach. Wyniki przedstawiono na Fig. 1.
P r z v k ł a d 5
Badanie drogi śmierci komórek
Badano drogę śmierci komórek za pomocą cytometrycznego oznaczenia aneksyny V oraz 7AAD (7-aminoaktynomycyna D) lub PI (jodek propidyny). Odczynniki pochodziły z BD Biosciences.
Dla związku II zbadano drogę śmierci komórek. Wykazano, że peptyd ten wywoływał nekrozę, co wiązało się ze spadkiem ilości ATP w komórkach, brakiem aktywacji kaspazy oraz było widoczne w badaniach mikroskopowych.
P r z v k ł a d 6
Hemoliza erytrocytów po podaniu związku II
Myszom szczepu C57B1/6 pobierano krew pełną do probówki Vacutainer K2E z roztwor em EDTA (firmy BD Biosciences). Próbkę wirowano a osad zawierający komórki krwi przepłukiwano dwukrotnie roztworem PBS. Przygotowywano 10% zawiesinę erytrocytów i inkubowano ją przy rosnącym stężeniu związku II: 1, 5, 10, 20, 40, 100 μΜ. Negatywną kontrolę stanowił roztwór erytrocytów w PBS, a pozytywną 1% roztwór Triton X-100 w PBS. Po 30 i 120 minutach inkubacji w temperaturze 37°C komórki wirowano, a nadsącz przenoszono na płytkę 96-dołkową. Następnie dokonywano pomiaru spektrofotometrycznego za pomocą c zytnika ELISA (ELx800 firmy Bio-Tec Instruments Inc.) przy długości fali λ = 405 nm. Na podstawie odczytanej absorbancji obliczono procent lizy erytrocytów.
Pomiary po 30 i 120 minutach inkubacji z peptydem były takie same jak te uzyskane dla kontroli negatywnej. Po podaniu związku II nie obserwowano nasilenia hemolizy erytrocytów . Do stężenia 10 μΜ nie wykazano żadnych zmian w hemolizie w porównaniu do komórek, które nie były traktowane peptydem. Przy stężeniu 20 μΜ zauważono wzrost hemolizy do 5%, po podaniu peptydu w stężeniu 40 μΜ ilość komórek ulegających hemolizie wynosiła 17%, natomiast w stężeniu 100 μM 30% (Ryc. 2). Nawet po podaniu najwyższego badanego stężenia peptydu nie obserwowano lizy 50% krwinek. Roztwór 1% Triton X-100 stanowił kontrolę pozytywną i powodował całkowitą liżę erytrocytów. Związek II w stężeniach toksycznych dla komórek nowotworowych nie powoduje hemolizy krwinek czerwonych.
PL 236 060 B1
P r z y k ł a d 7
Lokalizacja znakowanego związku II w komórkach guza czerniaka mysiego
Związek II połączono z barwnikiem fluorescencyjnym FITC (izotiocyjanian fluoresceiny) w celu badania jego lokalizacji w komórce. Przeprowadzono syntezę związku o następującej sekwencji aminokwasowej - Pal-RKWKLFKKIGIGAVLKVLTTGLPALISK(FITC)-NH2. Syntezę wykonano tak jak opisano to w przykładzie 2 z tą różnicą, że pierwszym przyłączanym do żywicy aminokwasem była Fmoc-L-Lys(FITC)-OH. Komórki B16-F10 w ilości 2 x 105 komórek umieszczono w 3 mL pożywki hodowlanej na płytkach o średnicy 3 cm (NUNC™) i inkubowano 24 godziny. Po inkubacji pożywkę hodowlaną usunięto, a do płytek dodano 2 mL pożywki zawierającej 100 nM roztworu MitoTracker. Po 10 minutach inkubacji roztwór MitoTracker usunięto, a komórki przemyto roztworem PBS. Następnie podano 10 μΜ roztwór znakowanego peptydu i inkubowano komórki przez 30 minut. Komórki próby kontrolnej nie były traktowane peptydem. Po inkubacji komórki przemywano dwukrotnie 1 mL PBS i obserwowano przy użyciu mikroskopu fluorescencyjnego Nikon Eclipse 80i przy długości fali λ = 488 nm dla zielonej fluorescencji CAMEL-FITC i λ = 540 nm dla emitującego czerwone światło MitoTracker. Wykonane zdjęcia i obrazy analizowano przy użyciu programu Lucia.
W celu zbadania swoistości wiązania znakowanego peptydu do mitochondriów izolowano mitochondria z mysiej wątroby. W tym celu umieszczano wątrobę w buforze o składzie: 20 mM Tris pH 7.5, 10 mM KCl, 2 mM MgCl2, 1 mM DTT (ditiotreitol), 0.5 mM EDTA pH 8.0, 5% glicerol. Wątrobę cięto na skrawki i homogenizowano homogenizatorem teflonowym. Homogenat wirowano w warunkach 800 x g, 10 minut w temperaturze 4°C, następnie supernatant zbierano i wirowano ponownie. Następnie nadsącz poddawano kolejnemu wirowaniu (10 000 g, 15 min., 4°C). Osad przemyto buforem, wirowano jak wcześniej i zawieszono w buforze. Następnie m itochondria inkubowano ze związkiem II znakowanym FITC w stężeniu 5 μM oraz roztworem MitoTracker Red CMXRos firmy Invitrogen w stężeniu 500 nM i inkubowano 10 minut. Analizę przeprowadzono na cytometrze przepływowym FACS Canto (Becton-Dickinson).
Rezultaty przedstawiono na Ryc. 3. Czerwona fluorescencja pochodzi z barwnika Mito Tracker Red barwiącego mitochondria (czerwone strzałki), natomiast zielona fluorescencja pochodzi od związku II wyznakowanego barwnikiem FITC (zielone strzałki). Po nałożeniu fluorescencji czerwonej i zielonej obserwowano komórki wybarwione na kolor pomarańczowy (pomarańczowe strzałki), co wskazuje na nałożenie się obu barwników. Powiększenie obiektywu wynosiło 40 x.
Obserwację potwierdzono również przy użyciu mikroskopu elektronowego. Wykonano zdjęcia, które przedstawiają komórki z widocznymi powiększonymi mitochondriami - powiększenie 2600 x. Zdjęcia przedstawiają pojedyncze mitochondria w komórce i ich znaczne pęcznienie w czasie - powiększenie 10000 x.
P r z y k ł a d 8
Terapia myszy z guzami czerniaka mysiego z wykorzystaniem związku II
Myszom szczepu C57BL/6 z guzami czerniaka mysiego B16-F10 w 6 dniu od podania komórek nowotworowych podawano wprost do guza peptyd terapeutyczny (związek II) w dawce 250 μg rozpuszczonej w 100 μL PBS. Peptyd podawano myszom codziennie. W sumie myszy otrzymały 5 dawek peptydu. Następnie terapię przerywano na 5 dni. Gdy guzy zaczynały odrastać myszom podawano ponownie związek II. W sumie wykonano 3 serie podań peptydu. Grupę kontrolną stanowiły myszy, które zamiast peptydu otrzymywały 100 μL roztworu PBS. Każda grupa liczyła 5 myszy. Na podstawie pomiarów objętości guzów oraz czasu przeżycia myszy potwierdzono skuteczność prowadzonej terapii. Podanie roztworu peptydu znacznie hamowało wzrost guzów u leczonych myszy.
P r z y k ł a d 9
Barwienie skrawków guzów przy pomocy hematoksyliny/eozyny, oraz analiza immunohistochemiczna
Myszom szczepu C57BL/6 wprowadzono śródskórnie, po stronie grzbietowej, 2 x 105 komórek czerniaka mysiego B16-F10. Gdy średnica guzów osiągała rozmiar około 0,5 cm, myszom podano związek II w dawce 115 μg w 100 μL PBS. Po 24 godzinach guzy pobierano, utrwalano w 2% paraformaldehydzie (pH 7,2) i zatapiano w parafinie. Guzy pokrojono przy pomocy mikrotomu na skrawki o grubości 10 μm. Otrzymane skrawki barwiono roztworem hematoksyliny i eozyny. Identyfikację obszarów martwiczych przeprowadzono przy pomocy mikroskopu Nikon 80i w świetle widzialnym. Skrawki inkubowano z króliczym przeciwciałem anty-HMGBl firmy Abcam przez 1 godzinę. Skrawki przepłukiwano roztworem PBS i dodawano drugie przeciwciało anty-królicze z peroksydazą chrzanową (1 μg/mL) firmy Vector Laboratories, inkubowano 30 minut. Skrawki ponownie przemywano roz
PL 236 060 Β1 tworem PBS, a następnie inkubowano z DAB (3,3’-diaminobenzydyna). Dodatkowo skrawki barwiono roztworem hematoksyliny. Wykonano zdjęcia i analizowano obraz za pomocą programu NIS-Elements Advanced Research.
Barwienia histochemiczne wykazały znaczne obszary nekrozy w badanych guzach po podaniu związku II, czego nie obserwowano w grupach kontrolnych. Obserwowano znaczny wyrzut białka HMGB1 (wskazującego na proces nekrozy w tkance).
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Nowe związki o wzorze ogólnym:gdzie „R” oznacza:-IGAVLKVLTTGLPALIS -NH2-avlkvla-nh2-avlkvlr-nh2-AVLKVLN-NH2-avlkvld-nh2-avlkvlc-nh2-AVLKVLQ-NH2-avlkvle-nh2-avlkvlg-nh2PL 236 060 Β1-AVLKVLH-NH2-avlkvli-nh2-avlkvll-nh2-avlkvlk-nh2-avlkvlm-nh2-avlkvlf-nh2-avlkvlp-nh2-avlkvlsnh2-avlkvlt-nh2-avlkvlw-nh2-avlkvly-nh2-avlkvlv-nh2
- 2. Sposób otrzymywania związków zdefiniowanych w zastrzeżeniu nr 1, znamienny tym, że otrzymuje się w następujących etapach:a) 60 minutowy proces pęcznienia żywicy amidowej Fmoc-Rink Amidę AM RAM w DCM;b) deprotekcja osłony Fmoc, blokującej grupę a-aminową w 20% roztworze piperydyny w DMF;c) przemywanie żywicy (DMF, DCM);d) wykonanie testu chloranilowego;e) reakcja acylowania poprzez przyłączenie Fmoc-chronionego aminokwasu; wspomaganie promieniowaniem mikrofalowym: czas - 15 min, temperatura - 65°C, moc - 40 W; przy użyciu równomolowej mieszaniny chronionego aminokwasu, DIC oraz Oxyma Pure (Fmoc-AA:DIC:Oxyma Pure, 1:1:1) i zastosowaniu dwukrotnego molowego nadmiaru w stosunku do stopnia osadzenia nośnika;f) przemywanie żywicy (DMF, DCM);g) wykonanie testu chloranilowego;h) powtarzanie etapów od b) do g) aż do momentu uzyskania peptydu z zastrzeżenia 1 ;i) odszczepienie peptydu od żywicy z jednoczesnym usunięciem osłon znajdujących się na łańcuchach bocznych za pomocą mieszaniny TFA : H2O : TIS : fenol (95:2:2:1, v/v/v/w);j) odsączenie, wytrącenie eterem schłodzonym w ciekłym azocie, rozpuszczenie osadu w wodzie destylowanej z 10% CH3COOH, następnie zamrożenie za pomocą ciekłego azotu i liofilizacja;k) analiza i oczyszczanie za pomocą RP-HPLC;I) spektrometria mas w celu potwierdzenia tożsamości.
- 3. Nowe związki określone w zastrzeżeniu 1 do zastosowania jako lek do leczenia chorób nowotworowych.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL420046A PL236060B1 (pl) | 2016-12-29 | 2016-12-29 | Grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL420046A PL236060B1 (pl) | 2016-12-29 | 2016-12-29 | Grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL420046A1 PL420046A1 (pl) | 2018-07-02 |
| PL236060B1 true PL236060B1 (pl) | 2020-11-30 |
Family
ID=62705206
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL420046A PL236060B1 (pl) | 2016-12-29 | 2016-12-29 | Grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236060B1 (pl) |
-
2016
- 2016-12-29 PL PL420046A patent/PL236060B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL420046A1 (pl) | 2018-07-02 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP7627726B2 (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
| JP2022078262A (ja) | 細胞透過性ペプチド、それを含んだコンジュゲート、及びそれを含んだ組成物 | |
| US8207122B2 (en) | Anti-cancer bioactive peptides isolated from crude venom of Xinjiang Lycosa singoriensis | |
| ES2404052T3 (es) | Péptidos que tienen actividad farmacológica para el tratamiento de trastornos asociados con la migración celular alterada, tal como el cáncer | |
| Horváti et al. | Comparative analysis of internalisation, haemolytic, cytotoxic and antibacterial effect of membrane-active cationic peptides: Aspects of experimental setup | |
| KR102017645B1 (ko) | 세포자멸사의 억제제 및 이의 용도 | |
| Wood et al. | Modified cysteine-deleted tachyplesin (CDT) analogs as linear antimicrobial peptides: Influence of chain length, positive charge, and hydrophobicity on antimicrobial and hemolytic activity | |
| CN115151556A (zh) | 人转铁蛋白受体结合肽 | |
| WO2018098226A1 (en) | Bicyclic peptidyl inhibitor of tumor necrosis factor-alpha | |
| CN116421712A (zh) | 一种d-构型溶瘤肽-喜树碱缀合物及其制备方法和应用 | |
| JP2019535702A (ja) | ジンセンチド及びジンセンチド様ペプチドの調製及び使用 | |
| KR101171381B1 (ko) | 암세포에 특이적인 활성을 갖는 신규 펩타이드 항암제 | |
| CN107022004B (zh) | 一种靶向肿瘤细胞的多肽及其应用 | |
| Vernieri et al. | An optimized Fmoc synthesis of human defensin 5 | |
| CN106699850B (zh) | Rbbp4靶向多肽和抗肿瘤多肽及其应用 | |
| US10562935B2 (en) | Stapled peptides and uses thereof | |
| PL236060B1 (pl) | Grupa pochodnych peptydów przeciwnowotworowych, sposób otrzymywania oraz ich zastosowanie | |
| CN107602670A (zh) | 一种可拮抗ewsr1蛋白rna结合活性的多肽eip‑22及其应用 | |
| CN108640973B (zh) | 一种靶向作用Syntenin蛋白的多肽及其二聚体和应用 | |
| WO2019085926A1 (zh) | 多黏菌素类似物及其制备方法 | |
| CN110724179B (zh) | 一种抗肿瘤多肽及其制备方法和用途 | |
| KR101323669B1 (ko) | 암세포 특이적 세포괴사 유도 및 암 소멸 효과를 나타내는 세포사 유도 융합 펩타이드 | |
| KR101775625B1 (ko) | 혈장 내에서 안정성이 증가된 신규한 세포투과성 펩타이드 및 이것의 용도 | |
| CN118184743A (zh) | 一种源于海洋动物的细胞膜穿透剂及其应用 | |
| US6177405B1 (en) | Cyclic analogs of tuftsin |