PL236298B1 - Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych - Google Patents
Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych Download PDFInfo
- Publication number
- PL236298B1 PL236298B1 PL422916A PL42291617A PL236298B1 PL 236298 B1 PL236298 B1 PL 236298B1 PL 422916 A PL422916 A PL 422916A PL 42291617 A PL42291617 A PL 42291617A PL 236298 B1 PL236298 B1 PL 236298B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- cells
- concentration
- medium
- days
- dmem
- Prior art date
Links
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 55
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 17
- 210000004263 induced pluripotent stem cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims abstract description 41
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 36
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 claims abstract description 14
- 239000012580 N-2 Supplement Substances 0.000 claims abstract description 13
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 12
- 239000012895 dilution Substances 0.000 claims abstract description 10
- 238000010790 dilution Methods 0.000 claims abstract description 10
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 claims abstract description 9
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 claims abstract description 9
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 claims abstract description 8
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 claims abstract description 8
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 claims abstract description 5
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 claims abstract description 5
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims abstract description 5
- 102100037680 Fibroblast growth factor 8 Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 102100037362 Fibronectin Human genes 0.000 claims abstract description 4
- 108010067306 Fibronectins Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 101001027382 Homo sapiens Fibroblast growth factor 8 Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 claims abstract description 4
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 4
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 claims abstract description 4
- CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N bucladesine Chemical compound C([C@H]1O2)OP(O)(=O)O[C@H]1[C@@H](OC(=O)CCC)[C@@H]2N1C(N=CN=C2NC(=O)CCC)=C2N=C1 CJGYSWNGNKCJSB-YVLZZHOMSA-N 0.000 claims abstract description 4
- 229960005263 bucladesine Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 230000021164 cell adhesion Effects 0.000 claims abstract description 4
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 4
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 108010055896 polyornithine Proteins 0.000 claims abstract description 4
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 claims abstract description 4
- 239000012984 antibiotic solution Substances 0.000 claims abstract description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 claims abstract description 3
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 claims abstract description 3
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 claims abstract description 3
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 claims description 6
- 230000024245 cell differentiation Effects 0.000 claims description 5
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 3
- 210000002242 embryoid body Anatomy 0.000 abstract description 3
- 230000011712 cell development Effects 0.000 abstract 1
- 239000012533 medium component Substances 0.000 abstract 1
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 7
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 7
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 210000002752 melanocyte Anatomy 0.000 description 4
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 3
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 3
- RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N Progesterone Chemical compound C1CC2=CC(=O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H](C(=O)C)[C@@]1(C)CC2 RJKFOVLPORLFTN-LEKSSAKUSA-N 0.000 description 2
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 2
- 238000012760 immunocytochemical staining Methods 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003463 organelle Anatomy 0.000 description 2
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 2
- KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N putrescine Chemical compound NCCCCN KIDHWZJUCRJVML-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 230000004960 subcellular localization Effects 0.000 description 2
- MXNRLFUSFKVQSK-UHFFFAOYSA-N 2-Amino-6-(trimethylazaniumyl)hexanoate Chemical compound C[N+](C)(C)CCCCC(N)C([O-])=O MXNRLFUSFKVQSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxy-n-naphthalen-2-ylnaphthalene-2-carboxamide Chemical compound C1=CC=CC2=CC(NC(=O)C3=CC4=CC=CC=C4C=C3O)=CC=C21 PMYDPQQPEAYXKD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102100031181 Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 101001109698 Homo sapiens Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 Proteins 0.000 description 1
- 101000713575 Homo sapiens Tubulin beta-3 chain Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- 229930182816 L-glutamine Natural products 0.000 description 1
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 108010093175 Member 2 Group A Nuclear Receptor Subfamily 4 Proteins 0.000 description 1
- 102000002559 Member 2 Group A Nuclear Receptor Subfamily 4 Human genes 0.000 description 1
- 108010050345 Microphthalmia-Associated Transcription Factor Proteins 0.000 description 1
- 102100030157 Microphthalmia-associated transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 102100022676 Nuclear receptor subfamily 4 group A member 2 Human genes 0.000 description 1
- 208000012641 Pigmentation disease Diseases 0.000 description 1
- 239000005700 Putrescine Substances 0.000 description 1
- 108010017842 Telomerase Proteins 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 102100036790 Tubulin beta-3 chain Human genes 0.000 description 1
- 108091000117 Tyrosine 3-Monooxygenase Proteins 0.000 description 1
- 102000048218 Tyrosine 3-monooxygenases Human genes 0.000 description 1
- 230000006750 UV protection Effects 0.000 description 1
- 206010047642 Vitiligo Diseases 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 1
- 210000005064 dopaminergic neuron Anatomy 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 1
- 108020004445 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108010045676 holotransferrin Proteins 0.000 description 1
- 238000012606 in vitro cell culture Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 210000005061 intracellular organelle Anatomy 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 210000002780 melanosome Anatomy 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000019612 pigmentation Effects 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 229960003387 progesterone Drugs 0.000 description 1
- 239000000186 progesterone Substances 0.000 description 1
- XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N protirelin Chemical compound NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)CC1=CN=CN1 XNSAINXGIQZQOO-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 230000008672 reprogramming Effects 0.000 description 1
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 1
- 229960001881 sodium selenate Drugs 0.000 description 1
- 235000018716 sodium selenate Nutrition 0.000 description 1
- 239000011655 sodium selenate Substances 0.000 description 1
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 238000004627 transmission electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0618—Cells of the nervous system
- C12N5/0621—Eye cells, e.g. cornea, iris pigmented cells
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
- C12N5/0602—Vertebrate cells
- C12N5/0625—Epidermal cells, skin cells; Cells of the oral mucosa
- C12N5/0626—Melanocytes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2506/00—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells
- C12N2506/45—Differentiation of animal cells from one lineage to another; Differentiation of pluripotent cells from artificially induced pluripotent stem cells
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
Przedmiotem zgłoszenia jest sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, charakteryzuje się tym, że obejmuje następujące etapy: a) zawiesinę konfluentnych komórek iPS wysiewa się, korzystnie na szalkę uniemożliwiającą adhezję komórek, w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632, korzystnie w gęstości 2-2,5 x 104 komórek/cm2, a następnie hoduje się, korzystnie przez 4 dni, do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB, b) uzyskane w etapie a) ciałka embrioidalne EB zbiera się oraz wysiewa się, korzystnie na szalkę adherentną, i prowadzi hodowlę w medium do komórek iMEF, korzystnie przez 18 godzin, prowadzi się selekcję progenitorów w medium N1 zawierającym: suplement N2, korzystnie w jednokrotnym rozcieńczeniu, fibronektynę, korzystnie w stężeniu 250 ng/ml, roztwór antybiotyków zawierający penicylinę i streptomycynę P/S, korzystnie w stężeniu 100 U/ml /100 µg/ml, rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, korzystnie przez 10 dni, usuwając okresowo martwe komórki oraz uzupełniając składniki pożywki, d) uzyskane komórki progenitorów rozdysocjowuje się, wysiewa się, korzystnie w gęstości 0,5 - 2 x 105/cm2, na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną oraz prowadzi się ich ekspansję, korzystnie przez 7 dni, w medium N2 zawierającym: suplement N2, korzystnie w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę, korzystnie w stężeniu 1 mg/ml, bFGF, korzystnie w stężeniu 20 µg/ml, FGF8, korzystnie w stężeniu 100 ng/ml, P/S, korzystnie w stężeniu 100 U/ml /100 µg/ml, rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, a uzyskane komórki przed ich wykorzystaniem w kolejnym etapie ewentualnie przechowuje się zamrożone w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 miliony komórek/ml, e) prowadzi się, korzystnie przez 7 - 16 dni, ostateczne różnicowanie komórek poprzez ich hodowlę w medium N3 zawierającym: suplement N2, korzystnie w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę, korzystnie w stężeniu 1 mg/ml, dibutyrylo-cAMP, korzystnie w stężeniu 0,5 mM, kwas askorbinowy, korzystnie w stężeniu 200 µM, P/S, korzystnie w stężeniu 100 U/ml / 100 µg/ml, rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, uzyskując ludzkie komórki upigmentowane melaniną. Zgłoszenie zawiera też zastosowanie komórek uzyskiwanych w powyższym sposobie.
Description
Opis wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu różnicowania ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych (ang. induced Pluripotent Stem cells - iPS) do komórek upigmentowanych. Uzyskiwane za pomocą tego protokołu komórki produkują czarny pigment - melaninę.
Melanina jest to naturalny barwnik skóry, którego dotychczasowe źródła są bardzo ograniczone. Melaninę izoluje się z biopsji skórnych lub włosów, jednak w bardzo małej ilości i w stanie mocno zdegradowanym. Dotychczasowe metody uzyskiwania komórek upigmentowanych in vitro są niezwykle mało wydajne.
Celem wynalazku jest dostarczenie wydajnego sposobu otrzymywania bogatych w melaninę komórek ludzkich.
Nieoczekiwanie określony powyżej cel został osiągnięty w niniejszym wynalazku.
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych charakteryzujący się tym, że obejmuje następujące etapy:
a) zawiesinę konfluentnych komórek iPS wysiewa się na szalkę uniemożliwiającą adhezję komórek w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632 w gęstości 2-2,5 x 104 komórek/cm2, a następnie hoduje się przez 4 dni do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB,
b) uzyskane w etapie a) ciałka embrioidalne EB zbiera się oraz wysiewa się na szalkę adherentną i prowadzi hodowlę w medium do komórek iMEF przez 18 godzin,
c) prowadzi się selekcję progenitorów w medium N1 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, fibronektynę w stężeniu 250 ng/ml, roztwór antybiotyków zawierający penicylinę i streptomycynę P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 μg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, przez 10 dni, usuwając okresowo martwe komórki oraz uzupełniając składniki pożywki,
d) uzyskane komórki progenitorów rozdysocjowuje się, wysiewa się w gęstości 0,5-2 x 105/cm2, na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną oraz prowadzi się ich ekspansję przez 7 dni w medium N2 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, bFGF w stężeniu 20 μg/ml, FGF8 w stężeniu 100 ng/ml, P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 μg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, a uzyskane komórki przed ich wykorzystaniem w kolejnym etapie ewentualnie przechowuje się zamrożone w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 miliony komórek/ml,
e) prowadzi się przez 7-16 dni ostateczne różnicowanie komórek poprzez ich hodowlę w medium N3 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, dibutyrylo-cAMP w stężeniu 0,5 mM, kwas askorbinowy w stężeniu 200 μM, P/S w stężeniu 100 U/ml /100 μg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, uzyskując ludzkie komórki upigmentowane melaniną.
Korzystnie, pożywki N1, N2 i N3 składają się wyłącznie ze wskazanych składników.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zastosowanie komórek uzyskiwanych w sposobie według wynalazku określonym powyżej do otrzymywania melaniny metodą in-vitro.
Prowadzona zgodnie z wynalazkiem hodowla komórkowa in vitro jest dogodnym, i jednocześnie nieograniczonym źródłem melaniny, dostępnej w formie niezdegradowanej. Znane sposoby uzyskiwania melaniny in vitro nie posiadają zbliżonej wydajności do uzyskiwanej zgodnie z wynalazkiem. Za pomocą wynalazku można uzyskać znaczące ilości pigmentu gotowego do badań biofizycznych w krótkim czasie i relatywnie niskim kosztem. Wyizolowana melanina może znaleźć wiele zastosowań przemysłowych, w tym jako substrat do opracowania nowej generacji naturalnych kremów chroniących przed promieniowaniem UV. Uzyskane komórki mogą także zostać wykorzystane do leczenia chorych na bielactwo jako naturalny substytut melanocytów. Protokół uzyskiwania komórek upigmentowanych zamieszczono poniżej.
Przykład 1. Sposób uzyskiwania wysoce upigmentowanych melaniną komórek ludzkich z ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych.
Wykorzystywano konfluentne komórki piPS (protein-iPS) zakupione od firmy System Bioscience (cat no. SC801A-1, SC802A-1) (Kim et al. 2009) lub linie wyprowadzone w Zakładzie Transplantologii CMUJ poprzez reprogramowanie komórek somatycznych dawców.
W pierwszym etapie konfluentne komórki iPS (Fig. 1A.) hodowane na warstwie odżywczej z komórek iMEF zbierano akutazą oraz wysiewano w postaci zawiesiny pojedynczych komórek na szalkę
PL 236 298 Β1 uniemożliwiającą adhezję komórek, w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632, w gęstości 2-2,5 χ 104/cm2. Następnie komórki iPS hodowano w zawiesinie przez 4 dni, aż do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB (Fig. 1B.).
Skład medium do komórek iPS:
| Składnik | Stężenie |
| KSR (ThermoFisher Scientific) | 20% |
| β-Mercaptoetanol (Sigma-Aldrich) | 0,1mM |
| Non-essential Amino Acids (ThermoFisher Scientific) | 1X |
| Penicylina/ Streptomycyna (P/S) (ThermoFisher Scientific) | 100 U/ml/100 pg/ml |
| bFGF (ThermoFisher Scientific) | 10 ng/ml |
| DMEM/F12 (ThermoFisher Scientific) |
W kolejnym kroku ciałka embrioidalne zebrano, żwirowano (300 rpm, 5 minut) oraz wysiano na szalkę adherentną o takiej samej powierzchni jak użyta szalka nieadherentna w medium do komórek iMEF. Skład medium do komórek iMEF:
| Składnik | Stężenie |
| Fetal Bovine Serum (EurX) | 10% |
| L-glutamina (ThermoFisher Scientific) | 2mM |
| P/S | 100 U/ml/100 pg/ml |
| DMEM 4,5g/l (Lonza) |
Po ok. 18 godzinach rozpoczęto selekcję progenitorów (Fig. 1C.) zmieniając medium na medium N1 o składzie:
| Składnik | Stężenie |
| Suplement N2 (ThermoFisher Scientific) | 1x |
| Fibronektyna (ThermoFisher Scientific) | 250 ng/ml |
| P/S | 100 U/ml/100 pg/ml |
| DMEM/F12 (ThermoFisher Scientific) |
PL 236 298 Β1
Selekcję w bezsurowiczym medium N1 prowadzono przez 10 dni co drugi dzień usuwając martwe komórki oraz podając świeże medium N1. Wykorzystano Suplement N2 oferowany przez firmę Life Technologies zawierający ludzkie: insulinę (0,1 mg/ml), holotransferynę (5 μg/ml), progesteron (20 μΜ), putrescynę (0,1 mM), selenian sodu (30 nM) (stężenia końcowe, po rozcieńczeniu w medium).
W kolejnym kroku prowadzono ekspansję wyselekcjonowanych progenitorów (Fig. 1D.). Komórki rozdysocjowano trypsyną na pojedyncze komórki oraz wysiano w gęstości 0,5-2 x 105/cm2 na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną.
Ekspansję komórek prowadzono przez 7 dni w medium N2 o składzie:
| Składnik | Stężenie |
| Suplement N2 | 1x |
| Laminina (ThermoFisher Scientific) | 1 mg/ml |
| bFGF | 20 pg/ml |
| FGF8 (ThermoFisher Scientific) | 100 ng/ml |
| P/S | 100 U/ml /100 pg/ml |
| DMEMF12 |
Progenitory mrożono w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 x 106 komórek/ml. Po zakończonej ekspansji przez 7-16 dni prowadzono terminalne różnicowanie komórek zmieniając medium z N2 na medium N3. Skład medium N3 prezentuje poniższa tabela:
| Składnik | Stężenie |
| Suplement N2 | 1x |
| Laminina | 1 mg/ml |
| Dibutyrylo-cAMP (Sigma-Aldrich) | 0,5 mM |
| Kwas askorbinowy (Sigma-Aldrich) | 200 pM |
| P/S | 100 U/ml / 100 pg/ml |
| DMEM/F12 |
W wyniku opisanej metody różnicowania w sposób bardzo powtarzalny rutynowo otrzymywano wysoce upigmentowane komórki (Fig. 1E—I.). Wydajność procesu różnicowania była zawsze podobna i pozwalała na uzyskanie znacznej liczby (>3 χ 106) silnie upigmentowanych komórek.
Na fig. 1 zaprezentowano wyniki kolejnych etapów różnicowania komórek iPS do komórek upigmentowanych. A - Komórki piPS rosnące na warstwie odżywczej. B - wielokomórkowe ciałka embrioidalne EB w zawiesinie. C - wyselekcjonowane komórki NPC zostały poddane ekspansji (D). W ostatecznym etapie różnicowania komórki przyjmowały czarne zabarwienie (E-l)
Przykład 2. Charakterystyka uzyskanych komórek oraz izolowanego z nich pigmentu.
Uzyskiwany pigment został jednoznacznie zidentyfikowany jako melanina za pomocą elektronowego rezonansu paramagnetycznego (EPR) (Fig. 2A.) oraz barwienia Fontany-Massona (Fig. 2B.).
Uzyskane upigmentowane komórki zostały scharakteryzowane pod kątem analizy ekspresji genów za pomocą reakcji RT-PCR (Fig. 3.) oraz za pomocą barwienia immunocytochemicznego (ICC) (Fig. 4.).
Na fig. 3 została zaprezentowana ekspresja markerów na poziomie RNA. A - Upigmentowane komórki, w przeciwieństwie do komórek iPS, posiadają ekspresję markerów melanocytów (MITF-M,
PL 236 298 B1
TRP1, TYR). B - W kolejnych etapach różnicowania komórek (A-F) spada ekspresja markerów embrionalnych (OCT-4, NANOG, TERT), a rośnie ekspresja markerów neuro-ektodermalnych (NURR1, TUJ-1, TH). TERT- telomeraza, TUJ-1 - tubulina β III, TH - hydroksylaza tyrozyny NURR1 - białko związane z receptorem jądrowym, Gen konstytutywny GAPDH posłużył jako kontrola pozytywna reakcji PCR.
Na fig. 4 została zaprezentowana ekspresja markerów na poziomie białka. Uzyskane komórki posiadają ekspresję markerów melanocytów - TRP1 oraz MITF (A i B). W otrzymanej heterogennej populacji komórek obecne są również neurony dopaminergiczne posiadające ekspresję TUJ-1 oraz TH (C i D).
Subkomórkowa lokalizacja melaniny została określona za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) (Fig. 5.)
Na fig. 5 została zaprezentowana subkomórkowa lokalizacja melaniny w uzyskanych komórkach. Melanina uorganizowana jest w organellach przypominających kolejne stadia rozwoju melanosomów (I-IV w A). Organella te otoczone są podwójną błoną komórkową (B).
Uzyskane wyniki pozwalają jednoznacznie stwierdzić, że uzyskany pigment to melanina. Zróżnicowane upigmentowane komórki pod wieloma względami przypominają melanocyty (ekspresja markerów, profil ekspresji genów, obecność błoniastych, wewnątrzkomórkowych organelli wypełnionych pigmentem). Jednak ilość upigmentowanych komórek oraz stopień upigmentowania uzyskanych komórek są nieoczekiwanie wysokie w porównaniu ze znanymi ze stanu techniki. Opisany sposób dostarcza bardzo dużych ilości niezwykle silnie upigmentowanych komórek, które mogą posłużyć do izolacji czystej, niezdegradowanej melaniny w dużych ilościach i relatywnie niskim kosztem.
Claims (3)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:a) zawiesinę konfluentnych komórek iPS wysiewa się na szalkę uniemożliwiającą adhezję komórek w medium do komórek iPS bez bFGF z inhibitorem Y27632 w gęstości 2-2,5 x 104 komórek/cm2, a następnie hoduje się przez 4 dni do wytworzenia ciałek embrioidalnych EB, b) uzyskane w etapie a) ciałka embrioidalne EB zbiera się oraz wysiewa się na szalkę adherentną i prowadzi hodowlę w medium do komórek iMEF przez 18 godzin,c) prowadzi się selekcję progenitorów w medium N1 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, fibronektynę w stężeniu 250 ng/ml, roztwór antybiotyków zawierający penicylinę i streptomycynę P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 gg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, przez 10 dni, usuwając okresowo martwe komórki oraz uzupełniając składniki pożywki,d) uzyskane komórki progenitorów rozdysocjowuje się, wysiewa się w gęstości 0,5-2 x 105/cm2, na szalki pokryte lamininą i poli-ornityną oraz prowadzi się ich ekspansję przez 7 dni w medium N2 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, bFGF w stężeniu 20 gg/ml, FGF8 w stężeniu 100 ng/ml, P/S w stężeniu 100 U/ml / 100 gg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, a uzyskane komórki przed ich wykorzystaniem w kolejnym etapie ewentualnie przechowuje się zamrożone w medium N2 z 10% DMSO w gęstości 2 miliony komórek/ml,e) prowadzi się przez 7-16 dni ostateczne różnicowanie komórek poprzez ich hodowlę w medium N3 zawierającym: suplement N2 w jednokrotnym rozcieńczeniu, lamininę w stężeniu 1 mg/ml, dibutyrylo-cAMP w stężeniu 0,5 mM, kwas askorbinowy w stężeniu 200 gM, P/S w stężeniu 100 U/ml /100 gg/ml rozpuszczone w pożywce DMEM/F12, uzyskując ludzkie komórki upigmentowane melaniną.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że pożywki N1, N2 i N3 składają się wyłącznie ze wskazanych składników.
- 3. Zastosowanie komórek uzyskiwanych w sposobie określonym w zastrz. 1-2 do otrzymywania melaniny metodą in-vitro.
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422916A PL236298B1 (pl) | 2017-09-21 | 2017-09-21 | Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych |
| PCT/PL2018/050049 WO2019059792A1 (en) | 2017-09-21 | 2018-09-21 | The method of obtaining pigmented cells in vitro by the differentiation of human induced pluripotent stem cells |
| EP18857980.9A EP3684916A4 (en) | 2017-09-21 | 2018-09-21 | METHOD FOR IN VITRO GENERATION OF PIGMENTED CELLS BY DIFFERENTIATION FROM HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS |
| US16/649,041 US11739295B2 (en) | 2017-09-21 | 2018-09-21 | Method of obtaining pigmented cells in vitro by the differentiation of human induced pluripotent stem cells |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL422916A PL236298B1 (pl) | 2017-09-21 | 2017-09-21 | Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL422916A1 PL422916A1 (pl) | 2019-03-25 |
| PL236298B1 true PL236298B1 (pl) | 2020-12-28 |
Family
ID=65799941
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL422916A PL236298B1 (pl) | 2017-09-21 | 2017-09-21 | Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US11739295B2 (pl) |
| EP (1) | EP3684916A4 (pl) |
| PL (1) | PL236298B1 (pl) |
| WO (1) | WO2019059792A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2020210382A1 (en) * | 2019-04-08 | 2020-10-15 | The General Hospital Corporation | Enhancement of melanocyte migration using rock inhibitors |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011104200A1 (en) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for preparing human melanocytes from human pluripotent stem cells |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2771792A (en) * | 1992-03-31 | 1993-11-08 | Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd. | Novel cosmetic |
| DK3578988T3 (da) * | 2010-05-25 | 2025-02-24 | Memorial Sloan Kettering Cancer Center | Fremgangsmåde til nociceptordifferentiering af humane embryonale stamceller og anvendelse heraf |
| AU2013216382B2 (en) * | 2012-01-31 | 2018-08-02 | Hadasit Medical Research Services And Development Ltd. | Methods of selecting retinal pigmented epithelial cells |
| JP2015146803A (ja) | 2014-01-10 | 2015-08-20 | 学校法人 聖マリアンナ医科大学 | メラノサイトの分化誘導方法 |
| US10080771B2 (en) * | 2015-01-28 | 2018-09-25 | The Trustees Of The University Of Pennsylvania | Compositions and methods for generation of human epithelial stem cells |
| DK3347456T3 (da) * | 2015-09-08 | 2024-02-19 | Us Health | Fremgangsmåde til reproducerbar differentiering af retinale pigmentepitelceller af klinisk kvalitet |
-
2017
- 2017-09-21 PL PL422916A patent/PL236298B1/pl unknown
-
2018
- 2018-09-21 WO PCT/PL2018/050049 patent/WO2019059792A1/en not_active Ceased
- 2018-09-21 US US16/649,041 patent/US11739295B2/en active Active
- 2018-09-21 EP EP18857980.9A patent/EP3684916A4/en active Pending
Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2011104200A1 (en) * | 2010-02-23 | 2011-09-01 | INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale) | Methods for preparing human melanocytes from human pluripotent stem cells |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| JONES J.C. ET AL.: "2013", MELANOCYTES DERIVED FROM TRANSGENE-FREE HUMAN INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS * |
| OHTA S. ET AL.: "201101", GENERATION OF HUMAN MELANOCYTES FROM INDUCED PLURIPOTENT STEM CELLS * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US20200216804A1 (en) | 2020-07-09 |
| US11739295B2 (en) | 2023-08-29 |
| EP3684916A1 (en) | 2020-07-29 |
| EP3684916A4 (en) | 2021-07-14 |
| WO2019059792A1 (en) | 2019-03-28 |
| PL422916A1 (pl) | 2019-03-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6215216B2 (ja) | 毛包外毛根鞘からメラノサイトを誘導する方法および移植のための調製 | |
| EP2274419B1 (en) | Methods for producing hair microfollicles and de novo papillae and their use for in vitro tests and in vivo implantations | |
| Tucker et al. | Use of a synthetic xeno-free culture substrate for induced pluripotent stem cell induction and retinal differentiation | |
| JP2004535820A5 (pl) | ||
| US12018278B2 (en) | Methods for chemically induced lineage reprogramming | |
| CN102186969A (zh) | 由人多能干细胞制备人皮肤替代品的方法 | |
| EP2539438A1 (en) | Methods for preparing human melanocytes from human pluripotent stem cells | |
| US9592257B2 (en) | Complete human skin organ generated from culture-expanded cells | |
| US20110142935A1 (en) | Cardiac differentiation of human pluripotent stem cells under defined conditions using matrix overlay methods | |
| US12584110B2 (en) | Functional feline pancreatic cells from adipose tissue | |
| EP1937798A4 (en) | CHEMICALLY DEFINED CULTURAL MEDIA FOR THE EXPANSION AND DIFFERENTIATION OF EPIDERMIC CELLS AND USES THEREOF FOR THE IN VITRO FARMING OF HAIRFOLLICLES | |
| US20050019310A1 (en) | Method for culturing and expansion of mammalian undifferentiated epidermal kerainocytes exhibiting stem cell characteristics | |
| PL236298B1 (pl) | Sposób otrzymywania upigmentowanych komórek in vitro poprzez różnicowanie ludzkich indukowanych pluripotencjalnych komórek macierzystych | |
| JP2022545861A (ja) | 体細胞を別の細胞運命又は原始細胞状態にリプログラミングする方法 | |
| KR20200073281A (ko) | 진피 모유두 및 모낭 등가물의 시험관 내 제조 방법 | |
| Rapoport et al. | Isolation and in vitro cultivation turns cells from exocrine human pancreas into multipotent stem-cells | |
| JP6921960B2 (ja) | 微小毛包を調製するための胚細胞の使用 | |
| LV13763B (lv) | Paņēmiens autologu cilmes šūnu populācijas iegūšanai no pieauguša cilvēka ādas dermas audiem |