PL236572B1 - Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi o złym rokowaniu - Google Patents
Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi o złym rokowaniu Download PDFInfo
- Publication number
- PL236572B1 PL236572B1 PL410186A PL41018614A PL236572B1 PL 236572 B1 PL236572 B1 PL 236572B1 PL 410186 A PL410186 A PL 410186A PL 41018614 A PL41018614 A PL 41018614A PL 236572 B1 PL236572 B1 PL 236572B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mutation
- palb2
- breast cancer
- women
- cancer
- Prior art date
Links
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 title claims description 80
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 title claims description 80
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 15
- 238000004393 prognosis Methods 0.000 title description 7
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 127
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 61
- 101100518728 Homo sapiens PALB2 gene Proteins 0.000 claims description 44
- 101150099884 PALB2 gene Proteins 0.000 claims description 44
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 19
- 102220036074 rs515726123 Human genes 0.000 claims description 17
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 claims description 14
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 5
- 102220035967 rs180177143 Human genes 0.000 claims description 4
- 230000001143 conditioned effect Effects 0.000 claims description 2
- 108010067741 Fanconi Anemia Complementation Group N protein Proteins 0.000 description 55
- 102100040884 Partner and localizer of BRCA2 Human genes 0.000 description 54
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 30
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 27
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 22
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 20
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 15
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 102000015694 estrogen receptors Human genes 0.000 description 13
- 108010038795 estrogen receptors Proteins 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 230000034994 death Effects 0.000 description 12
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 11
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 9
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 9
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 7
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 102000003998 progesterone receptors Human genes 0.000 description 7
- 108090000468 progesterone receptors Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 5
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 5
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 5
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101150072950 BRCA1 gene Proteins 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 206010027476 Metastases Diseases 0.000 description 3
- 230000002146 bilateral effect Effects 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 3
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 3
- 238000000491 multivariate analysis Methods 0.000 description 3
- 230000036438 mutation frequency Effects 0.000 description 3
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 3
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 3
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 3
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 2
- 102000036365 BRCA1 Human genes 0.000 description 2
- 108700020463 BRCA1 Proteins 0.000 description 2
- 108700040618 BRCA1 Genes Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 101000772194 Homo sapiens Transthyretin Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 2
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 102100029290 Transthyretin Human genes 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000009607 mammography Methods 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 2
- 102200067153 rs28897672 Human genes 0.000 description 2
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 201000009030 Carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 206010014733 Endometrial cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010014759 Endometrial neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 102000016627 Fanconi Anemia Complementation Group N protein Human genes 0.000 description 1
- 208000001613 Gambling Diseases 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 201000010915 Glioblastoma multiforme Diseases 0.000 description 1
- 208000033640 Hereditary breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 101500025419 Homo sapiens Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 1
- 208000007433 Lymphatic Metastasis Diseases 0.000 description 1
- 206010027459 Metastases to lymph nodes Diseases 0.000 description 1
- 108700019961 Neoplasm Genes Proteins 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 208000037842 advanced-stage tumor Diseases 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 201000000967 bilateral breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 1
- 238000000546 chi-square test Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000012937 correction Methods 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 208000005017 glioblastoma Diseases 0.000 description 1
- 208000025581 hereditary breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 229940116978 human epidermal growth factor Drugs 0.000 description 1
- 208000030776 invasive breast carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N nepidermin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(C)C)C(C)C)C1=CC=C(O)C=C1 GVUGOAYIVIDWIO-UFWWTJHBSA-N 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 1
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 1
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000007473 univariate analysis Methods 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotami wynalazku są sposób wykrywania raka piersi o złym rokowaniu przez zastosowanie wykrywania mutacji genu PALB2. Wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej wykrywającej raka piersi o złym rokowaniu u kobiet.
W przedstawianym sposobie wykrywania mutacji genu PALB2, identyfikuje się grupę kobiet, które są w grupie wysokiego ryzyka zachorowania na raka piersi o złym rokowaniu co do przeżycia. Tak więc, przedstawiany w zgłoszeniu patentowym sposób dotyczy opracowania nowych markerów (mutacji genu PALB2) złego rokowania dla raka piersi.
Mutacje genu PALB2 opisano jako zmiany związane ze zwiększonym ryzykiem raka piersi na świecie (1). W polskiej populacji wykryto poprzednio jedną mutacje skracającą genu PALB2 (c.509_510delGA) u czterech pacjentek z rakiem piersi, jednak nie oszacowano ryzyka związanego z nosicielstwem mutacji PALB2, nie opisano charakterystyki klinicznej raków piersi u nosicielek mutacji PALB2 oraz wpływu tych mutacji na przeżycie pacjentek z rakiem piersi (2). Tym samym użyteczność kliniczna badania mutacji PABL2 w polskiej populacji nie była zanana.
Problemy te rozwiązuje niniejszy wynalazek precyzyjnie ustalający po raz pierwszy: częstość mutacji założycielskich genu PALB2 u kobiet z rakiem piersi i kobiet zdrowych w polskiej populacji oraz ryzyko raka piersi związanego z nosicielstwem mutacji genu PALB2 u Polek;
charakterystykę kliniczną raków piersi u Polek z mutacją konstytucyjną PALB2 w tym agresywny kliniczny przebieg raków piersi u nosicielek mutacji PALB2 wyrażony złym rokowaniem co do przeżycia.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi o złym rokowaniu charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność zmiany konstytucyjnej w obrębie genu PALB2 wybranej z grupy obejmującej: mutację c.509_510delGA i mutację c.172_175delTTGT, przy czym pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego. Korzystnie, bada się obecność mutacji konstytucyjnej genu PALB2 u kobiety, niezależnie od historii rodzinnej zachorowań na nowotwory.
Obecność zmiany germinalnej można badać techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), real-time PCR i innych metod pośredniego lub metod bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.
Wykrycie obecność mutacji genu PALB2 jest wskazaniem dla stosowania postępowania klinicznego ukierunkowanego na diagnostykę raka piersi poczynając od 25 roku życia pacjentki, zwłaszcza z zastosowaniem badań obrazowych takich jak USG, mammografia oraz rezonans magnetyczny piersi i biopsji zmian stwierdzonych w piersi.
Ponadto, wykrycie obecność mutacji genu PALB2 jest wskazaniem dla stosowania profilaktycznej podskórnej mastektomii.
Zatem, możliwe jest zastosowanie mutacji w obrębie genu PALB2 albo polinukleotydu zawierającego tą mutację albo polipeptydu kodowanego przez allel genu PALB2 zawierający tą mutację do wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi o złym rokowaniu, przy czym korzystnie mutacja wybrana jest z grupy obejmującej następujące mutacje genu PALB2: mutację c.509_510delGA i mutację c. 172_175delTTGT.
Do realizacji wynalazku służyć może zestaw do wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi o złym rokowaniu, który zawiera przynajmniej dwa różne oligonukleotydy pozwalające na amplifikację regionu zawierającego mutację w obrębie genu PALB2, przy czym korzystnie amplifikowany region zawiera mutację wybraną z grupy obejmującej następujące mutacje genu PALB2: mutację c.509_510delGA i mutację c.172_175delTTGT.
Na Fig. 3 przedstawiono fragment sekwencji genomowego DNA zawierający przykładowe badane mutacje PALB2.
Szczegółowy opis wynalazku
W wynalazku po raz pierwszy oszacowano ryzyko raka piersi u Polek z mutacją genu PALB2. Ustalono, że wykrycie jednej z dwóch mutacji genu PALB2 (c.509_510delGA lub c,172_175delTTGT) wiąże się z około 4,5-krotnie zwiększonym ryzykiem raka piersi, co odpowiada około 30% ryzyku zachorowania na ten nowotwór w naszej populacji do 70 roku życia. Ryzyko to dodatkowo wzrasta w przypadku, gdy w rodzinie nosicielki występuje zachorowanie na raki piersi w rodzinie: 1) gdy co najmniej jedna krewna I lub II stopnia chorowała na raka piersi ryzyko jest zwiększone około 8,5-krotnie
PL 236 572 B1 co odpowiada ryzku raka piersi u Polki wynoszącemu aż 51%, a gdy wstępują dwa zachorowania w rodzinie u krewnych I lub II stopnia ryzyko to jest zwiększone około 18-krotnie, co odpowiada blisko 100% ryzyku zachorowania na raka piersi. Szacuje się, że około 1% raków piersi w Polsce jest wywołanych przez jedną z dwóch mutacji genu PALB2 (c.509_510delGA lub c,172_175delTTGT).
Wykazano, że u nosicielek mutacji genu PALB2 z rakiem piersi stwierdza się częstsze występowanie guzów potrójnie ujemnych (a więc guzów bez receptora estrogenowego (ER), bez receptora progesteronowego (PR) oraz bez wysokiej ekspresji receptorów dla ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2 (HER2)), niż w grupie kobiet bez mutacji PALB2 (33% vs 14%, p<0,0001). Ponadto, w grupie kobiet z mutacją PALB2 częstość guzów obustronnych wynosiła 8,6% w porównaniu do jedynie 3,2% u kobiet bez mutacji (p = 0,005).
Najistotniejszym elementem wynalazku jest odkrycie i udokumentowanie, że u nosicielek rozwija się agresywna forma raka piersi o złym rokowaniu co do przeżycia. Odkrycie to możliwe było dzięki analizie dużej grupy kobiet z rakiem piersi w homogennej genetycznie populacji polskiej. Podczas średniego okresu obserwacji 64 miesiące, w grupie 116 nosicielek mutacji PALB2 z rakiem piersi zmarło 32,8% pacjentek (38 zgonów), a w grupie 11 978 kobiet z rakiem piersi bez mutacji PALB2 zmarło 16.9% pacjentek (2027 zgonów) (p<0.0001). Przeżycie 5-letnie pacjentek z rakiem piersi z mutacją PALB2 wynosiło jednie 72% w porównaniu do 84,5% u kobiet z rakiem piersi ale bez mutacji PALB2 (p = 0,002). Przeżycie 10-letnie również było również istotnie gorsze w grupie nosicielek mutacji z rakiem piersi niż w grupie kobiet z rakiem ale bez mutacji PALB2 (49,6% versus 75,6%; p <0,0001).
Współczynnik ryzyka (hazard ratio - HR) dla umieralności związanej z mutacją genu PALB2 wynosił 2,13 (p < 0,0001, log rank test). Po wprowadzeniu poprawek na wiek rozpoznania, wielkość guza (< 2,0 cm; 2,0 - 4,9 cm; > 5<0 cm), zajęcie węzłów chłonnych (przerzuty/brak przerzutów) oraz stan receptora estrogenowego (dodatni/ujemny), współczynnik HR wynosił 2,18 i pozostał silnie istotny statystycznie (p < 0,0001, Cox regression). Tak więc te oryginalne wyniki po raz pierwszy jednoznacznie udowadniają, że powtarzalne mutacje PALB2 (c.509_510delGA oraz c,172_175delTTGT) są niezależnymi czynnikami złego rokowania u kobiet z rakiem piersi u Polek.
Niezwykle istotnym elementem niniejszego wynalazku są wyniki dowodzące, że w grupie kobiet z rakiem piersi oraz mutacją genu PLAB2 zdecydowanie najsilniejszym markerem złego rokowania jest wielkość guza. Guzy małe, o wielkości do 2 cm związane były z dobrym rokowaniem u nosicieli mutacji - w podgrupie kobiet z małymi guzami (< 2,0 cm) współczynnik HR był korzystny 0,69 (95% CI = 0,17 - 2,74). Natomiast w grupie kobiet z dużymi guzami o średnicy 2 cm lub więcej, obserwowano bardzo złe rokowanie co do przeżycia (HR = 2,60; 95% CI = 1,8 - 3,8; p < 0,0001).
Tak więc uzyskane wyniki zdecydowanie wskazują, że raki piersi u nosicieli mutacji genu PALB2 powinny być wykrywane wcześnie oraz leczone na etapie gdy guz nowotworowy nie przekroczy wielkości 2 cm. Leczenie na takim etapie wiąże się z dobrym rokowaniem. Ryzyko zgonu nosicielki mutacji PALB2 z rozpoznanym guzem o wielkości od 2 do 4.9 cm, w porównaniu z ryzykiem zgonu nosicielki mutacji z małym guzem (o wielkości <2 cm) było aż 10-krotnie wyższe (HR = 9,6, p = 0,002). Ryzyko zgonu nosicielki mutacji PALB2 z rozpoznanym guzem o wielkości powyżej 4,9 cm, w porównaniu z ryzykiem zgonu nosicielki mutacji z małym guzem (o wielkości <2 cm) było aż 38-krotnie wyższe (HR = 38,4, p < 0,0001). A wiec wcześniejsze rozpoznanie nowotworu na etapie guza poniżej 2 cm wiąże się z około 10-krotnie większą szansą przeżycia niż leczenie na etapie guza o wielkości od 2 do 4,9 cm, oraz około 38-krotnie wyższą szansą przeżycia niż rozpoznanie na etapie guza większego niż 4,9 cm.
Tak więc niniejszy wynalazek dotyczy opcji zmiany postępowania medycznego w przypadku wykrycia rzeczonej mutacji genu PALB2 u zdrowej Polki. Identyfikacja mutacji genu PALB2 powinna być wskazaniem do wykonywania regularnych badań kontrolnych za pomocą badań obrazowych takich jak USG, MMG i ewentualnie MRI, mających na celu wczesne wykrycie raka piersi optymalnie o wielkości guza poniżej 2 cm, co wiąże się z dobrym rokowaniem. Proponowany schemat badań obejmuje coroczne USG piersi od 25 roku życia oraz MMG (ew. poszerzone o MRI) od 35 roku życia.
Przy obserwowanym wysokim ryzyku raka piersi (zwłaszcza u nosicielek mutacji PALB2, u których w rodzinie występowały przypadki zachorowania na raka piersi) i dużą śmiertelnością związaną z rakiem piersi u nosicielek mutacji PALB2, jako opcję postępowania medycznego rozważyć należy profilaktyczną mastektomię.
Ujawniony sposób korzysta z opracowania nowego markera złego rokowania dla raka piersi co do przeżycia (mutacji genu PALB2). Wcześniej nikt nie badał związku pomiędzy nosicielstwem mutacji PALB2 w naszej populacji i przeżyciem pacjentek. Niniejszy wynalazek w oparciu o analizę kliniczną
PL 236 572 B1 raków piersi w dużej grupie nosicielek PALB2 przedstawia również sposoby postępowania medycznego, które mogą uchronić nosicielki mutacji PALB2 przed zachorowaniem na raka i /lub rozpoznaniem raka na zaawansowanym etapie związanego ze złym rokowaniem co do przeżycia.
Warunkiem zastosowania takiego postępowania medycznego jest identyfikacja specyficznych mutacji genu PALB2 za pomocą testu diagnostycznego opracowanego na podstawie niniejszego wynalazku. Tak więc przedmiotem wynalazku jest sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi o złym rokowaniu, charakteryzujący się tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność dwóch wiodących zmian konstytucyjnych genu PALB2: mutacji c.509_510delGA oraz mutacji c,172_175delTTGT, przy czym korzystne jest, jeśli pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego. Jak ustalono w przykładzie 1 wynalazku w polskiej populacji mutacja c.509_510delGA występuje z częstością 0,15% (7/4702) a mutacja c,172_175delTTGT genu PALB2 występuje z częstością 0,06% (3/4702), a więc w Polsce żyje około 40 000 nosicielek tych mutacji konstytucyjnych PALB2.
Koszt testu opartego o wykrywanie wybranych zmian PALB2 - mutacji charakterystycznych dla polskiej populacji, jest wielokrotnie mniejszy niż koszt pełnej analizy sekwencji genu PALB2, a czas badania nieporównywalnie krótszy. Taki test może być wykonywany w wielu laboratoriach bez konieczności stosowania skomplikowanego i kosztownego sprzętu. Obecność mutacji powtarzalnych genu PALB2 w naszej populacji stwarza unikalną możliwość niezwykle efektywnej diagnostyki genetycznej (opartej o identyfikację tych zmian DNA).
Mutacje konstytucyjne genu PALB2 są obecne u nosicieli od urodzenia. Identyf ikacja takich mutacji stwarza możliwość wykrycia zagrożenia rakiem piersi na wiele lat przed zachorowaniem. Tak wiec zastosowanie testu PALB2 stwarza możliwość objęcia kobiet zindywidualizowanym postępowaniem medycznym. Test można wykonać u każdej dorosłej kobiety (a zwłaszcza u kobiet, w których rodzinie występował rak piersi). Wykrycie mutacji PALB2 u kobiety byłoby wówczas wskazaniem do wykonywania regularnych badań okresowych piersi od 25 roku życia. Takie zindywidualizowane postępowanie medyczne najprawdopodobniej przyczyni się do wczesnego rozpoznania i leczenia tego nowotworu na wczesnych etapach rozwoju, gdy całkowite wyleczenie jest możliwe. Odpowiednie postępowanie medyczne (badania okresowe lub profilaktyczna podskórna mastektomia) zastosowane dzięki niniejszemu wynalazkowi najprawdopodobniej doprowadzi do zmniejszenia umieralności nosicielek mutacji PALB2 w Polsce. Tak więc wynalazek stanowi unikalną szansę zmniejszenia umieralności nosicielek mutacji PALB2. Uzasadnione jest, aby dwie mutacje powtarzalne PALB2 (mutacja c.509_510delGA oraz mutacja c,172_175delTTGT) zostały włączone do panelu podstawowego mutacji dla testu wysokiego ryzyka raka piersi, który może być wykonany u każdej dorosłej Polki.
P r z y k ł a d 1
A) Ustalanie korelacji pomiędzy obecnością mutacji skracających białko PALB2 (mutacja c.509_510delGA oraz mutacja c,172_175delTTGT) a ryzykiem raka piersi, charakterystyką kliniczną raków piersi oraz okresem przeżycia pacjentek w polskiej populacji. Mutacje te wyselekcjonowaliśmy do badania, gdyż wykryliśmy je za pomocą sekwencjonowania w polskiej populacji w grupie 144 kobiet z dziedzicznym rakiem piersi (3).
Zasady testu, wybór grupy pacjentów
Aby ustalić ryzyko związane z występowaniem mutacji genu PALB2, przeprowadzono analizę występowania zmian c.509_510delGA oraz c,172_175delTTGT w grupie 12 904 kobiet z inwazyjnym rakiem piersi, zdiagnozowanych w latach od 1996 do 2012 w 18 szpitalach w Polsce. Pacjentki nie były selekcjonowane pod względem historii rodzinnej zachorowań na nowotwory. Łącznie zaproszono 17 900 kobiet z rakiem piersi, z których 13 622 zgodziło się wsiąść udział w badaniu (76,1%). Badanie objęło pierwsze przypadki zachorowań na raka piersi wobec tego 114 kobiet wykluczono ze względu na diagnozę raka drugiej piersi w przeszłości oraz 854 wykluczono ze względu na to, że upłynęły ponad 2 lata od daty rozpoznania do momentu pobrania krwi na test DNA. Po tych wykluczeniach pozostało do badania 12 679 kobiet z rakiem piersi, od których uzyskano próbki krwi i wyizolowano genomowy DNA. Oznaczenie dwóch mutacji PALB2 z powodzeniem wykonano u 12529 z 12679 (99%) badanych kobiet.
Wszystkie kobiety (n = 12 529) zostały również przebadane na obecność trzech mutacji założycielskich genu BRCA1 (C61G, 4153delA i 5382insC), które stanowią około 90% wszystkich mutacji BRCA1 stwierdzanych w polskiej populacji (4). W 435 przypadkach stwierdzono jedną z trzech mutacji założycielskich genu BRCA1 (C61G lub 4153delA lub 5382insC) -- przypadki te zostały wykluczone z dalszych analiz.
PL 236 572 B1
Ostatecznie badanie mutacji genu PALB2 wykonano w grupie 12 094 kobiet z rakiem piersi, u których nie stwierdzono mutacji genu BRCA1 (wiek rozpoznania od 18 do 92 lat, średnia wieku rozpoznania 54 lata). 5 691 raków zdiagnozowano wieku 50 lat lub poniżej a 6403 raków zdiagnozowano w wieku powyżej 50 lat.
Grupę kontrolną stanowiło 4730 kobiet w wieku 18-94 lat (średnia wieku 53 lat). Celem grupy kontrolnej było ustalenie częstości badanych mutacji w populacji zdrowych kobiet w Polsce. Kontrole te pochodziły z czterech źródeł. Pierwsza grupa to 987 kobiet z regionu Szczecina (w wieku 24-84 lat), sparowanych pod względem płci z pacjentkami z rakiem piersi zdiagnozowanymi w Szczecinie w latach 1996 oraz 2004. Druga grupa to 1717 kobiet (w wieku od 32 do 72), które brały udział w badaniach okresowych (USG i mammografia) w 8 ośrodkach w Polsce w latach 2009-2011. Trzecia podgrupa kontrolna składała się z 1036 zdrowych kobiet z okolic Opola (przedział wiekowy 20-94) od których pobrano próbki krwi w latach 2012 i 2013. Czwarta seria zawierała 990 zdrowych kobiet (w wieku 50-66), które uczestniczyły w kolonoskopowym programie badań przesiewowych w latach 2007-2010. Stwierdzone częstości mutacji genu PALB2 były podobne w podgrupach kontroli pochodzącej z czterech źródeł.
Aby ustalić charakterystykę kliniczną raków piersi u nosicielek mutacji PALB2, porównano raki piersi zdiagnozowane u nosicielek mutacji (n=116) do raków piersi u kobiet bez mutacji PALB2 (n=11 978). Istotność określono za pomocą testu Fishera lub testu chi-kwadrat. Zgromadzono informacje odnośnie charakterystyki klinicznej raków w tym wiek rozpoznania, rok rozpoznania, wielkość guza, obecność przerzutów w okolicznych węzłach chłonnych, obecność receptorów ER, PR i HER2 w komórkach nowotworowych oraz dane o obustronności guzów. Dla kobiet z obustronnym rakiem piersi, wiek zachorowania na raka drugiej piersi został odnotowany (pacjentki z rakiem piersi zdiagnozowanym w przeszłości zostały wykluczone z badania). Dane odnośnie rodzinnej historii raków dotyczyły liczby krewnych I i II stopnia z rakiem piersi lub rakiem jajnika.
Aby ocenić przeżycie pacjentki były poddane obserwacji od daty rozpoznania raka do daty śmieci lub do czasu ostatniej obserwacji (dla żyjących kobiet) czyli do lipca 2014 roku. Dane te były dostępne dla wszystkich badanych kobiet. Średni okres obserwacji wynosił 64 miesiące. Określono krzywe przeżycia Kaplana-Meiera dla nosicielek mutacji genu PALB2 (116 osoby) oraz dla kobiet bez mutacji genu PALB2 (11 978 osób). Przeżycie porównano za pomocą testu log-rank oraz za pomocą modelu proporcjonalnego hazardu Coxa (Cox regression). W analizach proporcjonalnego hazardu brano pod uwagę wiek rozpoznania, wielkość guza, stan receptora ER oraz obecność przerzutów w okolicznych węzłach chłonnych. W analizach wzięto również poprawki na czas od daty rozpoznania do daty pobrania krwi na test DNA.
Izolacja genomowego DNA
Od wszystkich pacjentek pobrano próbkę krwi obwodowej. Do probówek zawierających 1 ml 1M wersenianu sodu pobierano 10 ml krwi obwodowej. W celu rozbicia błony komórkowej do próbek dodawano roztwór TKM (10 mM Tris-HCL, 10 mM KCL, 2 mM EDTA, 4 mM MgCl2) i 1 ml Igepal (SIGMA). Następnie próbkę wirowano w temp. 20°C przez 10 minut przy 3400 obr./min. (w wirówce Eppendorf 5810R). Po odwirowaniu zlewano supernatant zostawiając osad leukocytów, który następnie zalewano roztworem TKM i rozbijano ręcznie. Powstałą mieszaninę wirowano przy 3400 obr. w temp. 20°C przez 5 minut. Supernatant zlewano a powstały osad przepłukiwano dwu krotnie roztworem TKM. Następnie dodawano 0,5 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) i całość mieszano pipetą Pasterowską. W następnym etapie w celu rozbicia kompleksów białko-DNA próbkę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez 7 minut. Białko z roztworu wytrącano dodając 1 ml 5 M NaCl. Tak przygotowaną mieszaninę wirowano w temp. 20°C, przy 9900 obr./min. przez 25 minut. Powstały supernatant przenoszono do odrębnej probówki. Z roztworu supernatantu wytrącano DNA dodając 10 ml 96% alkoholu etylowego. Wytrącony „kłaczek” DNA przenoszono do probówki i suszono w suszarce próżniowej przez 10 minut. DNA rozpuszczano w 200 μl TE (25 Mm Tris, HCL, 1Mm EDTA; pH 8,4) i przechowywano w 4°C.
Wykrywanie mutacji
Mutacje wykrywano za pomocą techniki PCR czasu rzeczywistego z wykorzystaniem starterów o sekwencji 509_F: TTGCTACTGATTTCTTCCTGTTCCTTT oraz 509_R: CAGGAGAGAGACTGTGTCTTTGG i sond o sekwencji 509_WT: TGATTCACTCAGATTGTCT i 509_M: CTGATTCACTCATTGTCT dla mutacji PALB2 c.509_510delGA, a starterów o sekwencji 172_F CTGAAAAGATTAAGCATTCTATTAAG
PL 236 572 B1 i 172_R GGTCTAGATTTACCTGAGTGTTTTAG oraz sond o sekwencji 172WT: TAGAAGAACAAGATTGTTTGT i 172_M: TAGAAGAACAAGATTGTCTCA dla mutacji PALB2 c,172_175delTTGT (sekwencje podano od końca 5’ do 3’).
Reakcje PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (LightCycler® Real-Time PCR 480 System (Roche Life Science). Mieszanina reakcyjna o objętości 5 μl zawierała: 1 μl (10ng) genomowego DNA, 0,0625 μl (Assay 80x) gotowego mixu starterów i sond (Applied Biosystems, Life Technologies), 2,5 μl mixu reakcyjnego (GoTaq Probe qPCR Master Mix 2X, Promega), uzupełnione do 5 μl wodą wolną od nukleaz. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.
Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:
| 1. | 95°C > 10 min | (zmiana temp. 4,8°C/s) |
| 2. | 95°C > 10 sec. | (zmiana temp. 4,8°C/s) |
| 55°C > 30 sec. | (zmiana temp. 2,5°C/s) 45 cykli | |
| 72°C > 1 sec. | (zmiana temp. 4,8°C/s) | |
| 3. | 40°C > 30 sec. | (zmiana temp. 2,5°C/s) |
| 4. | 60°C > 61°C > 1 | sec. (zmiana temp. 0,06°C/s) |
| 5. | 40°C > 30 sec. | (zmiana temp. 2,5°C/s) |
Obecność mutacji wykrytych w analizach PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.
Potwierdzenie obecności mutacji przez sekwencjonowanie
Amplifikację sekwencji kodującej genu PALB2 zawierającej badane mutacje DNA przeprowadzono z użyciem starterów wykorzystanych do wykrywania tej mutacji, które są przedstawione powyżej. Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA Thermal Cycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μl zawierała: 1 μl (50ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdej pary starterów, 2,5 μl buforu reakcyjnego (100mM T ris-HCl, 500mM KCL, 15mM MgC12, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 200 μM każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Taq DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA. Amplifikację przeprowadzano w warunkach przedstawionych poniżej.
1. 94°C > 25 sec.
55°C > 30 sec.
72°C > 35 sec.
cykli
4°C >/
Oczyszczanie produktów PCR: Produkty amplifikacji przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μl wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μl H20 i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez 3 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μl czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 pl.
PCR sekwencyjny: Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 μl mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol jednego startera, 4 μl oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 μl BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W przypadkach gdy stwierdzono zmianę w trakcje sekwencjonowania z jednym starterem, wynik został potwierdzony poprzez sekwencjionowanie z drugim starterem z danej pary.
Parametry sekwencyjnego PCR:
wstępna denaturacja - 96°C 30 sekund cykli, każdy składający się z:
denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 55 °C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund
PL 236 572 B1
Całość produktów sekwencjonowania (20μΙ) przenoszono do probówki Eppendorf o pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μΙ 96% etanolu oraz dodawano 1 μl kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po odwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μl 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20 - 30 min, po czym rozpuszczano w 4 μl sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μl formamidu dejonizowanego, 50 μl 50mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid - 19:1, 1 x TBE, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems).
Wyniki
Przebadano 12 094 kobiet z rakiem piersi, 5 691 zdiagnozowanych poniżej 51 roku życia (47.1%) a 6 403 kobiet (52.9%) zdiagnozowanych powyżej 50 roku życia. 1 623 z 10 023 kobiet podawało zachorowania na raka piersi w rodzinie u krewnych I lub II stopnia (15,9%).
Mutację genu PALB2 (c.509_510delGA lub c172_175delTTGT) wykryto w 116 z 12 094 przypadków (0,96%) w porównaniu do 10 z 4,702 kontroli (0,21%). Mutacja c.509_510delGA była stwierdzona w 76 przypadkach (0,63%) i 7 kontrolach (0,15%). Mutacja c172_175delTTGT była stwierdzona w 40 przypadkach (0,33%) i 3 kontrolach (0,06%). Iloraz szans (odds ratio - OR) dla raka piersi związany z obecnością mutacji genu PALB2 (c.509_510delGA lub c172_175delTTGT) wynosił 4,54 (95% CI = 2,4 - 8,7; p < 0,0001). Częstość mutacji wynosiła 1,13% u kobiet z rakiem zdiagnozowanym poniżej 40 rż. , wynosiła 0,4% u kobiet z rakiem zdiagnozowanym pomiędzy 40 a 50 rż., oraz wynosiła 1,02% u kobiet z rakiem zdiagnozowanym powyżej 50 rż. Współczynnik ryzyka OR wynosił 4,24 (95% CI = 2,2 - 8,4) u kobiet z rakiem zdiagnozowanym poniżej 51 rż oraz wynosił 4,81 (95% CI = 2,5-9,4) u kobiet z rakiem zdiagnozowanym powyżej 50 rż. Częstości mutacji oraz wartości wskaźników ryzyka (OR), w zależności od wieku przypadków oraz nowotworowego wywiadu rodzinnego przedstawia tabela 1.
PL 236 572 Β1
Tabela 1
Częstość mutacji PALB2 (c.509_510delGA i c172_175delTTGT) w grupie 12 094 kobietz rakiem piersi; w zależności od wieku rozpoznania oraz nowotworowego wywiadu rodzinnego.
| Kategoria | Liczba nosicieli | Liczebność całej grupy | % | OR | 95% CI | liczba p |
| Wszystkie przypadki | 116 | 12094 | 0,96% | 4,54 | 2,4-8,7 | <0,0001 |
| Wiek (lata) | ||||||
| <40 | 12 | 1058 | 1,13% | 5,38 | 2,3-12,5 | <0,0001 |
| 40-49 | 29 | 3914 | 0,74% | 3,50 | 1,7-7,2 | 0,0005 |
| 50-59 | 44 | 3487 | 1,26% | 6,00 | 3,0-11,9 | <0,0001 |
| 60-69 | 21 | 2313 | 0,91% | 4,30 | 2,0-9,1 | <0,0001 |
| >70 | 10 | 1322 | 0,76% | 3,58 | 1,5-8,6 | 0,006 |
| Liczba krewnych z rakiem piersi | ||||||
| 0 | 84 | 8600 | 0,98% | 4,63 | 2,4-8,9 | <0,0001 |
| 1+ | 29 | 1623 | 1,79% | 8,54 | 4,1-17,5 | <0,0001 |
| 2+ | 11 | 290 | 3,79% | 18,5 | 7,8-43,9 | <0,0001 |
| Liczba krewnych z rakiem jajnika | ||||||
| 0 | 111 | 10223 | 1,09% | 5,15 | 2,7-9,8 | <0,0001 |
| 1 + | 2 | 274 | 0,73% | 3,34 | 0,7-15,8 | 0,3 |
| Grupa kontrolna kobiet zdrowych | 10 | 4702 | 0,21% | 1,0 | - | - |
Wywiad rodzinny odnosi się do występowania nowotworów u krewnych pierwszego lub drugiego stopnia.
Iloraz szans i wartości liczby p obliczono względem grupy kontrolnej
Charakterystykę raków piersi u kobiet z i bez mutacji PALB2 przedstawiono w tabeli 2. Raki u nosicielek mutacji były częściej ER-ujemne (38,9% versus 28,2%; p= 0,03), PR-ujemne (41,8% versus 26,6%; p= 0,002) and HER2-ujemne (91,5% versus 81,7%; p= 0,03) niż raki u kobiet bez mutacji PALB2. Raki piersi u kobiet z mutacją PALB2 były częściej potrójnie-ujemne (triple negative) niż raki u kobiet bez mutacji (32,9% versus 14,1%; p< 0,0001).
PL 236 572 Β1
Tabela 2
Charakterystyka kliniczna raków piersi u nosicieli mutacji genu PALB2 oraz u osób bez tej mutacji
| Charakterystyka | Nosicielki mutacji PALB2 (n= 116) | Przypadki bez mutacji PALB2 (n= 11 978) | Liczba P | ||||
| Data rozpoznania (średnia, zakres) | 2007,6 (2000-2012) | 2007,5 (1996-2013) | 0,8 | ||||
| Rok urodzenia (średnia, zakres) | 1954,1 (1928-1984) | 1953,6 (1918-1993) | 0,7 | ||||
| Wick (średnia, zakres) | 53,3 (22-80) | 53,8 (18-92) | 0,6 | ||||
| Okres obserwacji, miesiące (średnia, zakres)* | 60,2 (2-146) | 64,0 (1-219) | 0,3 | ||||
| No. | Total No. | % | No. | Total No. | % | ||
| Wielkość guza, cm | |||||||
| < 1 | 5 | 85 | 5,88% | 901 | 7992 | 11,27% | 0,2 |
| 1-1.9 | 30 | 85 | 35,29% | 3247 | 7992 | 40,63% | 0,4 |
| 2-4.9 | 45 | 85 | 52,94% | 3512 | 7992 | 43,94% | 0,1 |
| > 5 | 5 | 85 | 5,88% | 332 | 7992 | 4,15% | 0,6 |
| Okoliczne węzły chłonne | 45 | 95 | 47,37% | 3654 | 8153 | 44,82% | 0,7 |
| Obustronność | 9 | 104 | 8,65% | 246 | 9640 | 2,55% | 0,0004 |
| ER ujemne guzy | 37 | 95 | 38,95% | 2525 | 8965 | 28,17% | 0,03 |
| PR ujemne guzy' | 38 | 91 | 41,76% | 2295 | 8626 | 26,61% | 0,002 |
| HER2 ujemne guzy | 75 | 82 | 91,46% | 5923 | 7249 | 81,71% | 0,03 |
| Potrójnie ujemne guzy’ (triplc ncgativc - ER, PR i HER2 ujemne) | Tl | 82 | 32,93% | 989 | 7026 | 14,08% | <0,0001 |
| Odsetek zmarłych | 38 | 116 | 32,76% | 1942 | 11978 | 16,21% | <0,0001 |
Wartość P odnosi się do porównania grupy osób z mutacją PALB2 do grupy bez mutacji PALB2 Skróty: ER, receptor estrogenowy: PR, receptor progesteronowy; HER2, receptor ludzkiego naskórkowego czynnika wzrostu 2.
* Od diagnozy do śmierci dla zmarłych i od diagnozy do lipca 2014 dla żyjących.
Dane odnośnie przeżycia dostępne były dla wszystkich kobiet z rakiem piersi. Średni okres obserwacji wynosił 64 miesiące (od 1 do 219 miesięcy). W okresie obserwacji, odnotowano 38 zgonów (32,8%) w grupie 116 nosicielek mutacji genu PALB2 oraz 1942 (16,2%) zgonów w grupie 11978 osób bez mutacji (p<0,0001). Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera dla nosicielek mutacji PALB2 oraz dla kobiet bez mutacji przedstawia rycina 1. Przeżycie było istotnie gorsze w grupie kobiet z rakiem i mutacją genu PALB2 w porównaniu do kobiet z rakiem, u których nie stwierdzono mutacji genu PALB2 (HR = 2,13; p < 0,0001, log-rank test). Przeżycie 5-letnie nosicielek mutacji genu PALB2 wynosiło jedynie 72%, w porównaniu do 85% u pacjentek bez mutacji (p = 0,0009). Przeżycie 10-letnie nosicielek mutacji genu PALB2 wynosiło jedynie 49%, w porównaniu do 77% u pacjentek bez mutacji (p < 0,0001). Przeżycie u kobiet z rakiem piersi i mutacją genu PALB2 pozostało statystycznie istotnie gorsze (niż u kobiet z rakiem piersi, ale bez mutacji genu PALB2) po wprowadzeniu poprawek na wiek rozpoznania, wielkość guza (< 2 cm; 2,0- 4,9 cm; > 5,0 cm) zajęcie węzłów chłonnych i stan receptora estrogenowego (HR = 2,18; 95% Cl 1,5 to 3,14; p<0,0001, Cox regression). Wgrupie kobiet z małymi guzami nowotworowymi (< 2,0 cm) wskaźnik ryzyka HR związany z mutacją PALB2 wynosił 0,69 (95CI 0,17-2,74). W grupie kobiet z dużymi guzami (2 cm i powyżej) wskaźnik HR wynosił 2,60 (95%CI 1,79-3,80).
PL 236 572 Β1
Na Fig. 1 przedstawiono krzywe przeżycia Kaplana-Meiera kobiet z rakiem piersi: dla nosicielek 116 mutacji genu PALB2 w tym 76 kobiet z mutacją C.509 510GA oraz 40 kobiet z c172_175delTTGT oraz dla 11 978 kobiet bez mutacji PALB2.
Wśród kobiet z mutacją PALB2 przeżycie ulegało znacznemu skróceniu wraz ze wzrostem wielkości guza (rycina 2). Dziesięcioletnie przeżycie w grupie kobiet z mutacją, u których rozpoznano guzy o wielkości od 0,1 do 1,9 cm wynosiło 85%, a dziesięcioletnie przeżycie nosicielek mutacji u których rozpoznano guzy o wielkości od 2 cm do 4,9 cm wynosiło jedynie 35% (HR = 9,6, p = 0,0002).
Na Fig. 2 przedstawiono krzywe przeżycia nosicielek mutacji genu PALB2 (n=85) w zależności od wielkości guza w chwili rozpoznania.
Współczynniki ryzyka zgonu (HR) dla wybranych zmiennych wśród kobiet z rakiem piersi i mutacją PALB 2 przedstawiono w tabeli 3. Najsilniejszym czynnikiem predykcyjnym umieralności wśród nosicieli mutacji była wielkość guza: guzy o wielkości 2-4,9 cm i o wielkości > 5 cm związane były w analizie jednoczynnikowej z współczynnikiem HR = 9,6 (p = 0,002) i 38,4 (p < 0,0001), a w analizie wieloczynnikowej z współczynnikiem HR = 6,6 (p = 0,02) i 26,5 (p = 0,0005) w porównaniu z guzami o średnicy mniejszej niż 2 cm.
Tabela 3
Wskaźniki HR dla wybranych zmiennych w grupie kobiet z rakiem piersi z mutacją genu PALB 2 (n=116)
| Zmienna | Analiza jednoczy unikowa | Analiza wieloczynnikowa | ||||
| HR | 95% CI | P | HR | 95% CI | P | |
| Rok urodzenia (trend) | 0,99 | 0,96- 1,02 | 0,4 | 1,02 | 0,97-1,07 | 0,5 |
| Wiek rozpoznania, lat | ||||||
| <40 | 1 | 1 | ||||
| > 40 | 1,18 | 0,42-3,31 | 0,8 | 0,86 | 0,20 - 3,77 | 0,85 |
| Stan receptora ER | ||||||
| Ujemny | 1 | 1 | ||||
| Dodatni | 0,47 | 0,24 - 0,92 | 0,03 | 0,55 | 0,24-1,24 | 0,15 |
| Wielkość guza, cm | ||||||
| <2 | 1 | 1 | ||||
| 2-4,9 | 9,57 | 2,28-40,2 | 0,002 | 6,6 | 1,51-29,2 | 0,02 |
| >5 | 38,4 | 6,76-217,0 | <0,0001 | 26,5 | 4,21 - 167,3 | 0,0005 |
| Węzły' chłonne | ||||||
| Niezajęte | 1 | 1 | ||||
| Zajęte | 4,34 | 1,96-9,61 | 0,0003 | 3,61 | 1,34 - 9,72 | 0.01 |
| Chemoterapia | ||||||
| Nic | 1 | 1 | ||||
| Tak | 2,47 | 0.59- 10.26 | 0,21 | 0,35 | 0,06-2,12 | 0,25 |
Skróty: ER, receptor estrogenowy; HR, hazard rado;
Analiza wieloczynnikowaprzeprowadzono na grupie 85 z 116 (73,2%) pacjentek z mutacją
PALB2 dla których dostępne były wszystkie zmienne.
Analizy wykonano za pomocą modelu proporcjonalnego hazardu Coxa
Zebraliśmy dane odnośnie przyczyn śmierci kobiet z rakiem piersi i mutacją genu PALB2 dla 27 z 38 zmarłych kobiet z mutacją (71%). Spośród 27 chorych, 22 kobiety (81%) zmarły z powodu raka
PL 236 572 B1 piersi, jedna (4%) zmarła z powodu raka błony śluzowej macicy, jedna (4%) zmarła z powodu glejaka wielopostaciowego i trzy (11%) zmarły z innych powodów.
W podsumowaniu, wynalazek dowodzi, że specyficzne mutacje genu PALB2 charakterystyczne dla polskiej populacji są markerami raka piersi o złym rokowaniu.
Literatura
1. Rahman N, Seal S, Thompson D, Kelly P, Renwick A, Elliott A, Reid S, Spanova K, Barfoot R, Chagtai T, Jayatilake H, McGuffog L, Hanks S, Evans DG, Eccles D; Breast Cancer Susceptibility Collaboration (UK), Easton DF, Stratton MR. PALB2, which encodes a BRCA2-interacting protein, is a breast cancer susceptibility gene. Nat Genet. 2007 Feb;39(2): 165-7. Epub 2006 Dec 31 PubMed PMID: 17200668; PubMed Central PMCID: PMC2871593.
2. Dansonka-Mieszkowska A, Kluska A, Moes J, Dąbrowską M, Nowakowska D, Niwinska A, Derlatka P, Cendrowski K, Kupryjanczyk J. A novel germline PALB2 deletion in Polish breast and ovarian cancer patients. BMC Med Genet. 2010 Feb 2; 11:20. doi: 10.1186/1471-2350-11-20. PubMed PMID: 20122277; PubMed Central PMCID: PMC2829009.
3. Cybulski C, Lubiński J, Wokołorczyk D, Kuźniak W, Kashyap A, Sopik V, Huzarski T, Gronwald J, Byrski T, Szwiec M, Jakubowska A, Górski B, Dębniak T, Narod SA, Akbari MR. Mutations Predisposing to Breast Cancer in 12 Candidate Genes in Breast Cancer Patients from Poland. Clin Genet. 2014 Oct 20. doi:
10.1111/cge.12524. [Epub ahead of print] PubMed PMID: 25330149.
3. Górski B, Jakubowska A, Huzarski T, Byrski T, Gronwald J, Grzybowska E, Mackiewicz
A, Stawicka M, Bebenek M, Sorokin D, Fiszer-Maliszewska Ł, Haus O, Janiszewska H, Niepsuj S, Góźdź S, Zaremba L, Posmyk M, Płuzańska M, Kilar E, Czudowska D, Waśko B, Miturski R, Kowalczyk JR, Urbański K, Szwiec M, Koc J, Debniak B, Rozmiarek A, Debniak T, Cybulski C, Kowalska E, Tołoczko-Grabarek A, Zajączek S, Menkiszak J, Medrek K, Masojć B, Mierzejewski M, Narod SA, Lubiński J. A high proportion of founder BRCA1 mutations in Polish breast cancer families.
IntJ Cancer. 2004 Jul 10; 110(5):683-6. PubMed PMID: 15146557.
Claims (2)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka piersi o złym rokowaniu, znamienny tym, że w próbce materiału genetycznego pobranej od pacjentki bada się obecność zmiany konstytucyjnej w obrębie genu PALB2 wybranej z grupy obejmującej: mutację c.509_510delGA i mutację c. 172_175delTTGT, przy czym pacjentka jest osobą pochodzenia polskiego.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że bada się obecność mutacji konstytucyjnej genu PALB2 u kobiety, niezależnie od historii rodzinnej zachorowań na nowotwory.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410186A PL236572B1 (pl) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi o złym rokowaniu |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL410186A PL236572B1 (pl) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi o złym rokowaniu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL410186A1 PL410186A1 (pl) | 2016-05-23 |
| PL236572B1 true PL236572B1 (pl) | 2021-01-25 |
Family
ID=55970673
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL410186A PL236572B1 (pl) | 2014-11-20 | 2014-11-20 | Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi o złym rokowaniu |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236572B1 (pl) |
-
2014
- 2014-11-20 PL PL410186A patent/PL236572B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL410186A1 (pl) | 2016-05-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP6770957B2 (ja) | 試料中のｐｉｋ３ｃａ突然変異状態を決定する方法 | |
| US6607898B1 (en) | Method for detection of hTR and hTERT telomerase-associated RNA in plasma or serum | |
| Le Coutre et al. | Determination of α-1 acid glycoprotein in patients with Ph+ chronic myeloid leukemia during the first 13 weeks of therapy with STI571 | |
| KR20220094218A (ko) | 핵산 분자의 분석 방법 및 시스템 | |
| BR122020016370B1 (pt) | métodos para predizer um resultado de câncer de mama em um tumor de mama positivo para receptor de estrogênio e negativo para her2 de um paciente com câncer de mama | |
| CN105229175A (zh) | 用于扩增和测定rna融合基因变体的方法、区分它们的方法以及有关的引物、探针和试剂盒 | |
| JP2019528081A (ja) | 子宮内膜症についてのバイオマーカーとしてのマイクロｒｎａ | |
| CN101646783A (zh) | 新型癌症标记物 | |
| CN101679971A (zh) | 青光眼恶化风险的判定方法 | |
| JP2016526895A (ja) | 早産のバイオマーカー | |
| ES2637385T3 (es) | Método y kit para determinar la integridad del genoma y/o la calidad de una biblioteca de secuencias de ADN obtenidas por amplificación de genoma completo mediante sitios de restricción determinísticos | |
| JP2009050189A (ja) | 抗癌剤の有効性予測方法 | |
| Uliana et al. | Alport syndrome and leiomyomatosis: the first deletion extending beyond COL4A6 intron 2 | |
| EP3368684B1 (en) | Biomarker for breast cancer | |
| US20030175761A1 (en) | Identification of genes whose expression patterns distinguish benign lymphoid tissue and mantle cell, follicular, and small lymphocytic lymphoma | |
| CN119177288A (zh) | 用于检测卵巢癌的组合物及其用途 | |
| CN107447008B (zh) | 用于诊断不明原因复发性流产的增强子rna组合、引物组及应用和试剂盒 | |
| PL236572B1 (pl) | Sposób wykrywania wysokiego ryzyka raka piersi o złym rokowaniu | |
| RU2440415C1 (ru) | Набор синтетических олигонуклеотидов для определения нуклеотидной последовательности кодирующей части гена brca1 и выявления мутаций, ассоциированных с наследственными формами рака молочной железы | |
| US20090181397A1 (en) | Predictive and diagnostic methods for cancer | |
| RU2728428C1 (ru) | Малоинвазивный способ определения чувствительности опухолей предстательной железы к лучевой терапии на основании изменения копийности генов brca2 и rad50 | |
| US9920376B2 (en) | Method for determining lymph node metastasis in cancer or risk thereof and rapid determination kit for the same | |
| JP3901684B2 (ja) | 神経芽腫の体液による検査方法 | |
| US20100159464A1 (en) | Method for Detection of DNA Methyltransferase RNA in Plasma and Serum | |
| CN107190074B (zh) | hsa_circRNA_103127在唐氏综合征的诊断、治疗及预后中的应用 |