PL236671B1 - Sposób analizy białek w próbce moczu - Google Patents
Sposób analizy białek w próbce moczu Download PDFInfo
- Publication number
- PL236671B1 PL236671B1 PL415033A PL41503315A PL236671B1 PL 236671 B1 PL236671 B1 PL 236671B1 PL 415033 A PL415033 A PL 415033A PL 41503315 A PL41503315 A PL 41503315A PL 236671 B1 PL236671 B1 PL 236671B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- urine
- sample
- urine sample
- analysis
- proteins
- Prior art date
Links
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 title claims abstract description 140
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 79
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 title claims abstract description 69
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 69
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 title claims abstract description 44
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims abstract description 14
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 23
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 claims description 18
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 claims description 17
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 claims description 15
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 claims description 13
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 claims description 13
- 238000001262 western blot Methods 0.000 claims description 13
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 claims description 9
- 102000016918 Complement C3 Human genes 0.000 claims description 8
- 108010028780 Complement C3 Proteins 0.000 claims description 8
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 claims description 8
- 238000009835 boiling Methods 0.000 claims description 7
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 7
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 claims description 7
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 7
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 7
- DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 4,4-diethylpiperidine Chemical compound CCC1(CC)CCNCC1 DGZSVBBLLGZHSF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 6
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 claims description 6
- 230000007423 decrease Effects 0.000 claims description 5
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 5
- 238000002331 protein detection Methods 0.000 claims description 5
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000006862 enzymatic digestion Effects 0.000 claims description 3
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 claims description 3
- 238000002156 mixing Methods 0.000 abstract description 8
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 108
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 18
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 17
- UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L di(octadecanoyloxy)lead Chemical compound [Pb+2].CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O.CCCCCCCCCCCCCCCCCC([O-])=O UQLDLKMNUJERMK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 16
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 12
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 12
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 12
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 12
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 11
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 10
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 9
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 8
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 238000011161 development Methods 0.000 description 6
- 235000020183 skimmed milk Nutrition 0.000 description 6
- 108010026552 Proteome Proteins 0.000 description 5
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 5
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 230000002980 postoperative effect Effects 0.000 description 5
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 5
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 4
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 4
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000008859 change Effects 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 4
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 4
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 4
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 4
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 4
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 3
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 3
- 238000007710 freezing Methods 0.000 description 3
- 230000008014 freezing Effects 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000013610 patient sample Substances 0.000 description 3
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 3
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 3
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 2
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 2
- 230000002776 aggregation Effects 0.000 description 2
- 238000004220 aggregation Methods 0.000 description 2
- 230000006399 behavior Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000004005 microsphere Substances 0.000 description 2
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 201000001474 proteinuria Diseases 0.000 description 2
- 238000000575 proteomic method Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 2
- 239000013595 supernatant sample Substances 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000007704 transition Effects 0.000 description 2
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010003694 Atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108700004676 Bence Jones Proteins 0.000 description 1
- FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 Chemical compound C1(=CC=CC=C1)N1C2=C(NC([C@H](C1)NC=1OC(=NN=1)C1=CC=CC=C1)=O)C=CC=C2 FGUUSXIOTUKUDN-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- 235000009161 Espostoa lanata Nutrition 0.000 description 1
- 240000001624 Espostoa lanata Species 0.000 description 1
- 206010016654 Fibrosis Diseases 0.000 description 1
- 206010048748 Graft loss Diseases 0.000 description 1
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 description 1
- 208000034578 Multiple myelomas Diseases 0.000 description 1
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 241000097929 Porphyria Species 0.000 description 1
- 208000010642 Porphyrias Diseases 0.000 description 1
- 206010038540 Renal tubular necrosis Diseases 0.000 description 1
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000037444 atrophy Effects 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 238000007630 basic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000008238 biochemical pathway Effects 0.000 description 1
- 239000000090 biomarker Substances 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 238000013375 chromatographic separation Methods 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000004590 computer program Methods 0.000 description 1
- 238000004163 cytometry Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000006866 deterioration Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000002526 effect on cardiovascular system Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 230000029142 excretion Effects 0.000 description 1
- 230000004761 fibrosis Effects 0.000 description 1
- 230000008570 general process Effects 0.000 description 1
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 238000010166 immunofluorescence Methods 0.000 description 1
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 1
- 229940027941 immunoglobulin g Drugs 0.000 description 1
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 description 1
- 229960003444 immunosuppressant agent Drugs 0.000 description 1
- 230000001861 immunosuppressant effect Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 210000004969 inflammatory cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000011862 kidney biopsy Methods 0.000 description 1
- 208000017169 kidney disease Diseases 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 208000030159 metabolic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000013188 needle biopsy Methods 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035764 nutrition Effects 0.000 description 1
- 230000004768 organ dysfunction Effects 0.000 description 1
- 231100000915 pathological change Toxicity 0.000 description 1
- 230000036285 pathological change Effects 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- 238000011533 pre-incubation Methods 0.000 description 1
- 238000012502 risk assessment Methods 0.000 description 1
- 238000005070 sampling Methods 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 230000002269 spontaneous effect Effects 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 230000000451 tissue damage Effects 0.000 description 1
- 231100000827 tissue damage Toxicity 0.000 description 1
- 238000005353 urine analysis Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
- G01N33/6854—Immunoglobulins
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/558—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor using diffusion or migration of antigen or antibody
- G01N33/561—Immunoelectrophoresis
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
- G01N2800/24—Immunology or allergic disorders
- G01N2800/245—Transplantation related diseases, e.g. graft versus host disease
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Immunology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Pathology (AREA)
- Food Science & Technology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Electrochemistry (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Abstract
Zgłoszenie dotyczy sposobu analizy białek w próbce moczu, obejmujący przygotowanie próbki moczu oraz detekcję białek, w którym etap przygotowania próbki moczu do analizy obejmuje mieszanie próbki bez jej wirowania, a detekcja białek wykonywana jest dla moczu pełnego.
Description
Opis wynalazku
Przedmiot wynalazku
Wynalazek dotyczy sposobu analizy białek w próbce moczu, obejmujący przygotowanie próbki moczu pełnego oraz detekcję białek, który to sposób ma zastosowanie w celu oceny stanu zdrowia pacjenta przy ocenie ryzyka odrzucenia przeszczepu nerki.
Stan techniki
Mocz jako materiał do badań diagnostycznych
Mocz jest niemal idealnym źródłem do wykrywania biomarkerów wielu chorób, w tym nowotworowych. Jest on łatwo dostępny od niemal wszystkich pacjentów, jego pozyskiwanie jest relatywnie proste i nie wymaga inwazyjnych procedur (odnośnik literaturowy nr (1)). Dlatego też badanie składu moczu (proteomu, metabolomu, a nawet obecności określonych komórek) stanowi przedmiot intensywnych badań laboratoriów na całym świecie. Pomimo tych zalet istnieją również problemy związane z analizą moczu. Zaliczyć do nich można między innymi dużą ilość soli oraz innych związków, które mogą zaburzać właściwy sygnał, niskie stężenie białek (w przypadku badania proteomu), ogólną zmienność składu moczu wynikającą z różnic stylu życia i odżywiania pomiędzy poszczególnymi osobami.
Mocz jako materiał do badań jest powszechnie wykorzystywany w diagnostyce klinicznej do oceny ogólnego stanu zdrowia pacjenta czy w badaniach przesiewowych. Zgodnie ze standardami postępowania z próbką moczu Europejskiej Konfederacji Medycyny Laboratoryjnej (ECLM) mocz jest wirowany w wirówce z chłodzeniem (4°C) przez 5 minut w 400xg (2). Uzyskiwany osad jest oceniany za pomocą mikroskopu, a supernatant poddawany dalszym analizom chemicznym i biochemicznym, co jest wykorzystywane m.in. do:
• Diagnostyki chorób układu moczowego oraz nerek;
• Diagnostyki chorób metabolicznych np. różnego typu porfirii;
• Diagnostyki szpiczaka mnogiego - białko Bence-Jonesa.
W przypadku analizy proteomu problemem staje się losowa agregacja i degradacja białek, przez co nawet pojedyncze białko może występować w moczu w wielu formach o różnej rozpuszczalności. Dlatego też, dla rzetelnej analizy proteomicznej konieczna jest kompletna próbka moczu, gdzie badaniu poddawana jest zarówno frakcja rozpuszczalna, standardowo badana dotychczas, jak i frakcja nierozpuszczalna, w której skład wchodzą komórki pacjenta, bakterie oraz wielkocząsteczkowe agregaty, do tej pory rutynowo usuwana z analiz poprzez zastosowanie procedury wirowania (odnośnik literaturowy (3) (4) (5) (6)).
Badanie odrzucenia przeszczepu
Wystąpienie epizodu ostrego odrzucania przeszczepionego organu w ciągu pierwszego półrocza po przeszczepie zwiększa ryzyko utraty narządu do 50%. Ostre odrzucanie przeszczepu nerki koreluje z powstawaniem włóknienia śródmiąższowego i zaniku cewek, czyli sprzyja powstaniu przewlekłej nefropatii przeszczepu, która jest główną przyczyną utraty narządu w ciągu pierwszego roku od transplantacji.
Ostre odrzucenie przeszczepionej nerki jest zdefiniowane jako nagłe pogorszenie funkcji narządu związane z określonymi zmianami patologicznymi w przeszczepie. Wyróżnia się dwie główne postacie histologiczne ostrego odrzucania:
Ostre odrzucenie komórkowe - charakteryzujące się infiltracją narządu przez limfocyty T i inne komórki zapalne.
Ostre odrzucenia humoraine - charakteryzujące się uszkodzeniem tkanki, spowodowane aktywnością krążących we krwi przeciwciał skierowanych przeciwko antygenom dawcy narządu i obecnością immunologicznych dowodów tego procesu (np. depozytów C4d w narządzie).
Wczesne odrzucenie typu humoralnego występuje z reguły w pierwszych kilku miesiącach po przeszczepieniu, szczególnie u pacjentów wysoko immunizowanych. Najczęstszą nieprawidłowością jest wzrost poziomu kreatyniny. Ostateczne rozpoznanie dokonywane jest na podstawie biopsji nerki, a markerem uszkodzenia humoralnego jest rozlane gromadzenie się znacznika przeciwciał anty-C4d w badaniu immunofluorescencyjnym. Na podstawie obrazu klinicznego i metod obrazowych odrzucenie tego typu jest łatwe do przeoczenia i trudne do odróżnienia od martwicy cewek nerkowych (ATN). Dodatkowo odrzucenie typu humoralnego może być powikłane z odrzuceniem komórkowym, co jeszcze bardziej utrudnia rozpoznanie i skuteczne leczenie.
Chociaż proces ostrego odrzucania występuje głównie we wczesnym okresie pooperacyjnym, to jednak w niektórych przypadkach dochodzi do procesu ostrego odrzucania w kilka miesięcy lub nawet
PL 236 671 B1 lat po przeszczepieniu narządu. Nie ma jednoznacznej granicy dzielącej epizody ostrego odrzucenia na wczesne i późne. Obecnie większość ośrodków transplantacyjnych przyjmuje granicę pomiędzy wczesnym a późnym odrzucaniem po trzecim miesiącu od przeszczepienia narządu. Przewlekłe odrzucanie jest częścią ogólnego procesu, zwanego przewlekłym uszkodzeniem przeszczepu GAI (ang. Chronic Allograft Injury) i jest, następną po zgonie pacjenta z przyczyn naczyniowo-sercowych, główną przyczyną utraty przeszczepu. Od początku lat 70-tych biopsja przeszczepionej nerki pozostaje złotym standardem diagnostyki zaburzeń czynności narządu, a także oceny adekwatności immunosupresji. Materiał do badania histopatologicznego pobiera się najczęściej metodą biopsji gruboigłowej.
Biopsje „ze wskazań” wykonywane są w przypadku zaistnienia niedającej się wyjaśnić metodami nieinwazyjnymi niesatysfakcjonującej czynności przeszczepu i w przypadku wystąpienia odchyleń w badaniu ogólnym moczu, przede wszystkim białkomoczu.
Około t/3 potwierdzonych histologicznie epizodów ostrego odrzucania przebiega subklinicznie, to znaczy przy prawidłowych wartościach kreatyniny i braku innych objawów klinicznych.
Przeszczepienie nerki u biorcy wysoko zimmunizowanego jest obarczone wysokim ryzykiem odrzucania zależnego od przeciwciał AMR (ang. Antibody-Mediated Rejection), a nawet przy braku AMR przeżycie przeszczepu w tej grupie jest znacząco gorsze, co może się wiązać z procesem przewlekłego odrzucania narządu zależnego od przeciwciał. Dlatego ciągle istnieje zapotrzebowanie na coraz czulsze metody umożliwiające precyzyjny dobór narządu do przeszczepu w oparciu o identyfikację szkodliwych przeciwciał.
Monitorowanie obecności przeciwciał po przeszczepieniu nadal nie jest rutynowym działaniem, ale obszarem poddawanym intensywnym badaniom. Szczególnie istotna jest produkcja de novo przeciwciał anty-HLA, a nie tylko DSA-specyficznych. (ang. Donor-Specific Antibodies)
Identyfikacja przeciwciał odbywa się metodą fluorymetryczną. Polistyrenowe mikrokulki opłaszczone są antygenami HLA, do których łączą się przeciwciała pochodzące z surowicy. Dalej do układu dodaje się znakowane fluorescencyjnie immunoglobuliny IgG, które łączą się z przeciwciałami z surowicy. Następnie sygnał fluorescencyjny jest analizowany przez program komputerowy dając informację o zawartości przeciwciał anty-HLA w danej surowicy. W zależności od rodzaju testu mikrokulki są pokryte jednym antygenem (testy typu single antigen) lub sześcioma antygenami (testy typu screening i PRA (ang. Panel Reactive Antibody)), co przekłada się na rozdzielczość testu.
Przeciwciała anty-HLA występują de novo u 25,7% biorców, przy czym w zależności od metody (ELISA, cytometria, Luminex) ich wykrywalność waha się od 15,9% (ELISA) do 25,7% (Luminex). Najwydatniej na przeżycie przeszczepu wpływają przeciwciała anty-HLA o swoistości DSA obecne wśród innych swoistych cząsteczek wytworzonych de novo. Jednak przeciwciała DSA wykrywa się tylko u 16% biorców anty-HLA(+). Na niską wykrywalność przeciwciał DSA - specyficznych może mieć wpływ ich adsorpcja w tkance przeszczepu.
Niestety biopsja jest zabiegiem inwazyjnym dla pacjenta. W celu pobrania próbki konieczny jest wykwalifikowany personel medyczny, odpowiednia aparatura, sprzęt oraz pomieszczenia niezbędne do przeprowadzenia zabiegu. Z tego powodu nie jest możliwe monitorowanie stanu pacjenta na bieżąco, co często skutkuje wykryciem odrzutu przeszczepu dopiero w momencie, gdy zmiany są już nieodwracalne.
Do diagnostyki odrzutu przeszczepu można wykorzystać fakt, że występują różnice w rozpuszczalności oraz ilości przeciwciała IgG w moczu u osób zdrowych i pacjentów po przeszczepie nerki. U osób zdrowych elementy IgG są rozpuszczone w moczu i nie wykazują tendencji do agregacji i precypitacji. W przypadku pacjentów po przeszczepie nerki, po operacji następuje wzrost stężenia przeciwciał, a także ich spontaniczne wytrącanie się z roztworu. Ten proces wytrącania jest jednak zjawiskiem losowym, dlatego wykorzystywanie do badań jedynie osadu lub supernatantu może dawać błędne wyniki.
Twórcy niniejszego wynalazku, nieoczekiwanie stwierdzili, że możliwe jest wykorzystanie do analizy białek (w szczególności przeciwciał lub komponentów dopełniacza) moczu pełnego (niewirowanego). Rutynowy i uznany jako konieczny standard etap wirowania zastąpiono mieszaniem próbek w celu stworzenia jednorodnej zawiesiny będącej przedmiotem analiz proteomicznych. Twórcy opracowali sposób analizy próbek moczu według wynalazku, dzięki któremu można monitorować zmiany poziomu białek w moczu pacjentów, a w korzystnym przykładzie wykonania wynalazku, monitorować zmiany stężenia przeciwciał IgG w moczu u pacjentów po przeszczepie, dla określenia jego stanu.
PL 236 671 B1
Istota wynalazku
Opisane zostało wykorzystanie w celach diagnostycznej analizy białek, w szczególności przeciwciał, korzystnie przeciwciał IgG lub komponentów dopełniacza, moczu pełnego - niewirowanego, zawierającego większą liczbę specyficznych białek, w porównaniu do analizowanego rutynowo - wirowanego.
W przypadku analizy białek problemem jest tendencja białek do losowej agregacji i degradacji, przez co nawet pojedyncze białko może występować w moczu w wielu formach o różnej rozpuszczalności. Jak stwierdzili twórcy niniejszego wynalazku, u różnych pacjentów, w różnych dniach obserwować można różne zachowania białek w wirowanej próbce moczu (Fig. 1): przechodzenia w fazę nierozpuszczalnych agregatów (większa ilość białek po wirowaniu znajduje się w pelecie- „4”), bądź pozostawania w fazie rozpuszczonej (większa ilość białek po wirowaniu znajduje się w supernatancie- „T”) po wirowaniu, co przedstawiono na przykładzie trzech białek - HSA (Human Serum Albumin, odnośnik literaturowy nr (7)), C3 (komponent dopełniacza 3, odnośnik literaturowy nr (8)), IgG (Immunoglobulina G, odnośnik literaturowy nr (9)). Jak wynika z danych przedstawionych na Fig. 1, agregacja i wytrącanie się z roztworu jest w przypadku białek w moczu zjawiskiem częstym i różnym dla każdego białka. HSA zwykle pozostaje w formie rozpuszczalnej, dlatego stanowi marker białkomoczu, rutynowo badany w diagnostyce klinicznej.
Z przedstawionych powyżej powodów, dla rzetelnej analizy białek konieczna jest pełna próbka moczu, gdzie badaniu poddawana jest zarówno frakcja rozpuszczalna, standardowo badana dotychczas, jak i frakcja nierozpuszczalna, w której skład wchodzą komórki pacjenta, bakterie oraz wielkocząsteczkowe agregaty, do tej pory rutynowo usuwana z analiz poprzez zastosowanie procedury wirowania.
Wynalazek dotyczy więc sposobu analizy białek w próbce moczu, obejmującego przygotowanie próbki moczu oraz detekcję białek, który to obejmuje etapy przygotowania próbki moczu pobranego od pacjenta po zabiegu przeszczepienia nerki do analizy, w którym to miesza się próbkę moczu bez jej wirowania, na tak przygotowanej próbce moczu pełnego prowadzi się detekcję białek sposobem detekcji, przy czym wykrywanymi białkami są przeciwciała IgG i/lub komponenty dopełniacza C3, przy czym analiza wykonywana jest w diagnostyce ex vivo ryzyka immunologicznego odrzucenia przeszczepu nerki.
W korzystnym sposobie analizy białek w próbce moczu analiza obejmuje monitorowanie zmian poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza C3, w moczu pełnym pobranym od pacjenta po zabiegu przeszczepienia nerki, przy czym wzrost poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza C3 w czasie wskazuje na ryzyko odrzucenia przeszczepu, a spadek poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza C3 w czasie wskazuje na prawdopodobne przyjęcie się przeszczepu.
W korzystnym sposobie analizy białek w próbce moczu detekcja białek wykonywana jest techniką Western blot.
W korzystnym sposobie analizy białek w próbce moczu techniką Western biot obejmuje następujące etapy:
a) zawieszanie próbki moczu, korzystnie przez intensywne pipetowanie lub z wykorzystaniem Vortexu;
b) dodanie do próbki moczu buforu obciążającego;
c) rozbicie agregatów białkowych, korzystnie przez zagotowanie próbki moczu lub trawienie enzymatyczne, korzystnie w temperaturze 95°C przez 2 minuty;
d) nałożenie próbki na żel poliakrylamidowy i elektroforezę SDS-PAGE, korzystnie w 4-15% gradientowym żelu poliakrylamidowym i przy czym korzystnie elektroforeza przebiega w buforze 1 x Tris-glicyna przez około 30 min przy natężeniu około 40 mA/żel;
e) usunięcie nadmiaru soli ze studzienek;
f) detekcję białek, pr zy czym korzystnie próbka moczu po pobraniu przechowywana jest w pojemniku szklanym;
pr zy czym korzystnie do próbki moczu przed analizą dodawany jest SDS do stężenia około 1% (v/v);
przy czym korzystnie próbka moczu po pobraniu, a przed analizą jest zamrażana, a tuż przed analizą próbka rozmrażana jest w temperaturze pokojowej.
PL 236 671 B1
Opisany został sposób analizy białek w próbce moczu, obejmujący przygotowanie próbki moczu oraz detekcję białek, w którym etap przygotowania próbki moczu do analizy obejmuje mieszanie próbki bez jej wirowania, a detekcja białek wykonywana jest dla moczu pełnego.
Opisany sposób obejmuje więc przygotowanie próbki moczu do analizy, w tym mieszanie i zawieszanie próbki, ale bez etapu wirowania oraz następującą detekcję analizowanych białek.
W sposobie według wynalazku można stosować różne, znane w dziedzinie, sposoby detekcji analizowanych białek. Korzystne jest wykorzystywanie metody detekcji, której specyficzność jest na tyle duża, iż dodatkowe źródło interferencji jakim są elementy z komórek, nie stanowi problemu. Taką metodą jest metoda Western Blot.
Korzystnie, opisany sposób ma zastosowanie w analizie przeciwciał, korzystniej przeciwciał IgG.
W korzystnym przykładzie wykonania białkami są komponenty dopełniacza, w szczególności C3.
Stosowany tu termin „mocz pełny” oznacza mocz zawierający w sobie wszystkie elementy znajdujące się w pęcherzu moczowym, wśród których znajdują się również nierozpuszczalne agregaty białkowe, oraz komórki nabłonka i bakteryjne dostające się do moczu w trakcie wydalania.
W przykładzie wykonania, opisany sposób ma zastosowanie do diagnostyki ex vivo ryzyka immunologicznego odrzucenia przeszczepu nerki, który obejmuje monitorowanie ogólnego poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów C3 w próbkach moczu pełnego, bez etapu wirowania przed przystąpieniem do detekcji białek.
Dodatkowo, twórcy wykazali, że pomiar dokonywany sposobem według wynalazku jest stabilny niezależnie od sposobu przechowywania próbki, co daje pewność, iż zmiana poziomu przeciwciał w przypadku próbek od pacjentów jest wywołana reakcją immunologiczną organizmu, a nie artefaktem preparatyki.
Twórcy wynalazku, nieoczekiwanie stwierdzili, że analiza próbki moczu sposobem według wynalazku pozwala na szybką i wiarygodną analizę poziomu przeciwciał w moczu, w szczególności w celu wczesnego wykrywania potencjalnego odrzutu przeszczepu nerki. Jak wspomniano wyżej, u pacjentów z ryzykiem odrzutu rośnie poziom przeciwciał IgG w moczu, natomiast precypitacja tychże przeciwciał może następować losowo, stąd wirowanie próbki i badanie osadu może dawać błędne wyniki. Niedogodność tę niweluje sposób według wynalazku.
Ponadto, twórcy nieoczekiwanie stwierdzili, że występuje również korelacja między zmianami poziomu przeciwciał IgG oraz komponentów C3 w kolejnych dniach po zabiegu przeszczepienia nerki, co sugeruje, że IgG i C3 tworzą kompleks (Przykład 4).
W korzystnym przykładzie wykonania sposobu według wynalazku, analiza obejmuje więc monitorowanie zmian poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza, w szczególności C3, w moczu pełnym pobranym od pacjenta po zabiegu przeszczepienia nerki, przy czym wzrost poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza, w szczególności C3 w czasie wskazuje na ryzyko odrzucenia przeszczepu, a spadek poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza, w szczególności C3 w czasie wskazuje na prawdopodobne przyjęcie się przeszczepu. Sposób analizy białek w próbce moczu według wynalazku umożliwia uzyskanie wyniku już w ciągu kilku godzin.
Sposób według powyższego przykładu wykonania wynalazku ma wiele zalet w stosunku do sposobów analizy ryzyka odrzucenia przeszczepu ze stanu techniki.
• Metoda jest nieinwazyjna dla pacjentów;
• Umożliwia pobieranie próbek od pacjenta nawet kilka razy dziennie w celu monitorowania stanu przeszczepu;
• Jest relatywnie szybka, gdyż wynik analizy uzyskuje się po kilku godzinach;
• W porównaniu do wcześniejszych metod jest specyficzna w stosunku do immunologicznego odrzutu przeszczepu.
Dodatkowo, twórcy wykazali, że pomiar dokonywany sposobem analizy białek w próbce moczu według wynalazku jest stabilny niezależnie od sposobu przechowywania próbki, co daje pewność, iż zmiana poziomu białek, nie jest artefaktem preparatyki, np. zmiana poziomu IgG w przypadku próbek od pacjentów jest wywołana reakcją immunologiczną organizmu.
Sposób analizy białek w próbce moczu według wynalazku korzystnie obejmuje następujące etapy:
a. zawieszanie próbki moczu;
b. dodanie do próbki moczu buforu obciążającego, ułatwiającego nakładanie próbek białkowych na żel;
PL 236 671 B1
c. rozbicie agregatów białkowych przez, na przykład, zagotowanie próbki moczu lub trawienie enzymatyczne;
d. nałożenie próbki na żel poliakrylamidowy i elektroforezę SDS-PAGE;
e. usunięcie ze studzienek nadmiaru soli;
f. detekcję białek.
Specjalista w dziedzinie z łatwością dobierze odpowiedni bufor obciążający do etapu b). Przykładem korzystnego buforu obciążającego jest bufor Laemmli’ego o składzie: 2% SDS, 10% glicerol, 5% β-merkaptoetanol, 0,002% błękit bromofenolu, 0,125 M Tris-HCI, pH 6,8.
Korzystnie, próbka moczu po pobraniu przechowywana jest w pojemniku szklanym.
Korzystnie, do próbki moczu przed analizą dodawany jest SDS do stężenia około 1% v/v.
Próbka moczu po pobraniu, a przed analizą korzystnie jest zamrażana, na przykład w -20°C, jeśli musi być przechowywana dłużej niż przez około 16 godzin. Przed analizą próbka korzystnie rozmrażana jest w temperaturze pokojowej (~23°C).
Etap a) może być przeprowadzany, na przykład, przez intensywne pipetowanie lub z wykorzystaniem Vortexu.
Etap c) korzystnie wykonywany jest w temperaturze 95°C przez 2 minuty.
Etap d) korzystnie wykonywany jest w 4-15% gradientowym żelu poliakrylamidowym. Elektroforeza korzystnie przebiega w buforze 1 x Tris-glicyna przez około 30 min przy natężeniu około 40 mA/żel.
Etap f) korzystnie wykonywany jest z pomocą techniki Western lot. Można jednak wykorzystywać dowolną inną znaną w dziedzinie odpowiednią technikę detekcji białek jak na przykład spektrometria mas.
Krótki opis figur
Fig. 1 przedstawia porównanie zachowania białek w moczu, przechodzenia w fazę nierozpuszczalnych agregatów (większa ilość białek po wirowaniu znajduje się w pelecie- „4”), bądź pozostawania w fazie rozpuszczonej (większa ilość białek po wirowaniu znajduje się w supernatancie- „T”) po wirowaniu, na przykładzie trzech białek - HSA, C3, IgG.
Fig. 2 przedstawia wyniki analizy próbek moczu metodą Western blot po inkubacji w różnych warunkach. A: 1- ION60/D, 2- ION60/G, 3- ION37/D, 4- ION37/G, 5- ION37/D, 6- ION37/G, 7- ION23/ZM, 8- ION23/ZM, 9- ION23/D, 10- ION23/G, 11- ION23/D, 12- ION23/G, 13- ION23/ZM, 14-M, 15- ION4/ZM; B: 1- M, 2- NI, 3- M, 4- NI, 5- TCA/ZAW, 6- TCA/ZAW, 7- W30/SUP, 8- W30/SUP, 9- W30/ZAW, 10- W30/ZAW, 11- ION-20/ZW, 12- ION4/G, 13- ION4/ZM, 14- ION4/G, 15-ION4/ZM. D - próbka pobierana z dolnej części pojemnika z moczem; G - próbka pobierana z górnej części pojemnika z moczem; ION-20 - inkubacja próbki przez noc w -20°C; ION4 - inkubacja próbki przez noc w 4°C; ION23 - inkubacja próbki przez noc w temperaturze pokojowej; ION37 - inkubacja próbki przez noc w 37°; ION60 - inkubacja próbki przez noc w 60°C, M - marker ciężaru cząsteczkowego „PageRuler™ Unstained Protein Ladder” (firmy ThermoFisher Scientific); ZM - próbka pobrana ze środkowej części pojemnika z moczem po uprzednim mieszaniu przy pomocy Vortexu lub przez pipetowanie; NI - próbka przygotowana bez wstępnej inkubacji; SUP - supernatant po wirowaniu; TCA - strącanie białek za pomocą procedury z wykorzystaniem kwasu trójchlorooctowego; W30 - wirowanie próbki przez 10 min 30 000 g w 4°C; ZAW - zawieszanie fazy stałej w 160 pl buforu Leamliego.
Fig. 3 przedstawia zmiany poziomu przeciwciał IgG w moczu pacjentów po przeszczepie nerki, na podstawie analizy ilości ciężkiego łańcucha IgG metodą Western blot. A: Zawartość poszczególnych studzienek: 2: M; 3-8: Pacjent A 1,2, 3, 6, 8, 9 dzień po operacji; 9-15: Pacjent B 1, 2, 3, 4, 5, 7, 11 dzień po operacji; B: Zawartość poszczególnych studzienek: 3: M; 4-9: Pacjent C 2, 3, 4, 6, 9,11 dzień po operacji; 10-15: Pacjent D 1, 2, 3, 4, 7, 8 dzień po operacji; C: Zawartość poszczególnych studzienek: 1 :M; 3-8: Pacjent E 1,2, 3, 4, 7, 11 dzień po operacji; 9-15: Pacjent F 1,2, 3, 4, 6, 8, 11 dzień po operacji.
Fig. 4 przedstawia zmiany poziomu komponentu C3 w moczu pacjentów po przeszczepie nerki, na podstawie analizy ilości jego dwóch form w próbce (75 kDa i 120 kDa) metodą Western blot. A: Zawartość poszczególnych studzienek: 2: M; 3-8: Pacjent A 1,2, 3, 6, 8, 9 dzień po operacji; 9-15: Pacjent B 1, 2, 3, 4, 5, 7, 11 dzień po operacji; B: Zawartość poszczególnych studzienek: 3:M; 4-9: Pacjent C 2, 3, 4, 6, 9, 11 dzień po operacji; 10-15: Pacjent D 1, 2, 3, 4, 7, 8 dzień po operacji; C: Zawartość poszczególnych studzienek: 1:M; 3-8: Pacjent E 1,2, 3, 4, 7,11 dzień po operacji; 9-15: Pacjent F 1, 2, 3, 4, 6, 8, 11 dzień po operacji;
Fig. 5 przedstawia obraz frakcji po chromatografii FPLC na kolumnie typu Size Exclusion. Próbki były analizowane za pomocą metody Western Blot, pod kątem występowania różnych rozpuszczalnych
PL 236 671 B1 form, w moczu, przeciwciała IgG (bloty C i D) oraz komponentu C3 (bloty A i B). Zawartość poszczególnych studzienek: A, C:1:M; 2: Próbka supernatantu moczu pacjenta F (dzień drugi po operacji) nakładana na kolumnę; 3-14: Frakcje 1-12 z kolumny; 15: Próbka supernatantu moczu pacjenta F (dzień drugi po operacji) nakładana na kolumnę. B,D:1: Próbka supernatantu moczu pacjenta C (dzień trzeci po operacji) nakładana na kolumnę; 2-3: Frakcje 1-2 z kolumny; 4: M; 4-14: Frakcje 3-14 z kolumny; 15: Próbka supernatantu moczu pacjenta C (dzień trzeci po operacji) nakładana na kolumnę.
Fig. 6 przedstawia wpływ pojemnika, w którym przetrzymywano mocz, na skład białek w próbce. Porównanie moczu pełnego inkubowanego przez godzinę w pojemniku, do elementów przyczepionych do ścianek pojemnika. Sygnał pochodził od reszt aromatycznych zawartych w aminokwasach. Rejestracja sygnału przez aparat firmy Bio-Rad ChemiDoc™ MP. A: Zawartość poszczególnych studzienek: 1-2: Próbki ze ścianek pojemników, do których wstępnie zbierano mocz; 3: M; 4: 1TK; 5: 1TR; 6: 1TS; 7: 1TN; 8: 1TSp; 9: 2TK; 10: 2TR; 11: 2TS; 12: 2TN; 13:2TSp; 14: 3TK; 15: Pacjent C, mocz z 4 dnia po operacji; B: Zawartość poszczególnych studzienek: 1:3TR; 2:3TS; 3:3TN; 4:M; 5:3TSp; 6:4TK; 7:4TR; 8:4TS; 9:4TN; 10:4TNSp; 11:5TK; 12:5TR; 13:5TS; 14:5TN; 15:5TSp; C: Zawartość poszczególnych studzienek: 1:M; 2:1 ŚK; 3: 1ŚR; 4: 1ŚS; 5:1ŚN; 6:1ŚSp; 7: 2ŚK; 8: 2ŚR; 9: 2ŚS;
10: 2ŚN;11: 2ŚSp; 12: 5ŚK; 13: 5ŚR; 14: 5ŚS; 15: Pacjent C, mocz z 4 dnia po operacji; D: Zawartość poszczególnych studzienek: 1: 3ŚK; 2: M; 3: 3ŚR; 4: 3ŚS; 5: 3ŚN; 6: 3ŚSp; 7: 4ŚK; 8: 4ŚR; 9:4ŚS; 10: 4ŚN; 11: 4ŚSp; 12: 5ŚN; 13: 5ŚSp; 14: Próbka ze ścianki pojemnika, do którego wstępnie zbierano mocz; 15: Pacjent C, mocz z 4 dnia po operacji; Oznaczenia 1 - Niesterylny pojemnik na mocz (plastikowy); 2 - Sterylny pojemnik na mocz (plastikowy); 3 - Sterylny pojemnik na mocz (szklany); 4 - Eppendorf, 5 ml; 5 - Eppendorf typu Iow bind, 5 ml; T - próbka moczu pełnego; Ś - próbka pobrana z wewnętrznych ścianek pojemnika za pomocą patyczka higienicznego; K - pojemnik kontrolny; R - dwukrotne rozcieńczenie próbki; S - próbka z 1% roztworem SDS; N - pokrycie wewnętrznej powierzchni pojemnika nabłyszczaczem; Sp - pokrycie zewnętrznej powierzchni pojemnika warstwą preparatu antyelektrostatycznego;
PRZYKŁADY
P r z y k ł a d 1 Analiza próbki moczu pacjentów po operacji przeszczepu nerki w kierunku obecności przeciwciał IgG
Przykładowa analiza próbki moczu wykonywana sposobem według wynalazku obejmuje:
a) przygotowanie próbki moczu
- pobieranie moczu od pacjenta zgodnie ze standardową procedurą (odnośnik literaturowy nr (2))
- mrożenie próbki w -20°C (W przypadku przechowywania próbek dłużej niż przez 16 godz. (odnośnik literaturowy nr (1))
- transport do laboratorium
- rozmrożenie w temperaturze pokojowej (~23°C)
- zawieszanie próbki moczu przez intensywne pipetowania lub mieszanie z wykorzystaniem Vortexu
- dodanie do próbki moczu buforu Laemmli’ego (buforu obciążającego), tak by w próbce znajdowało się:
- 2% SDS
- 10% glicerol
- 5% β-merkaptoetanol
- 0,002% błękit bromofenolu
- 0,125 MTris-HCI
- pH 6,8
- zagotowanie próbki w temperaturze 95°C przez 2 min
- nałożenie 10 μl próbki na gradientowy 4-15% żel poliakrylamidowy
- SDS-PAGE w buforze 1 x Tris-glicyna przez 30 min przy stałym natężeniu 40 mA/żel
- około 2 min po rozpoczęciu elektroforezy, gdy białka z próbki znajdują się w żelu, zatrzymanie procedury i usunięcie nadmiaru soli obecnej w studzienkach przez odpłukanie b) analizę zmian poziomu przeciwciał IgG w próbce moczu z wykorzystaniem metody Western Blot:
- transfer półsuchy z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową przy użyciu buforu (Tris 96 mM, Glicyna 78 mM, SDS 0,075% (m/v), Metanol 40% (v/v)) do transferu przez 1 h przy napięciu 10V,
PL 236 671 B1
- blokowanie membrany w 10% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka rozpuszczonego w PBST (bufor PBS o pH 7,4 z 0,1% (v/v) TWEEN® 20 (CAS# 9005-64-5)) przez 1 h - zdekantowanie roztworu mleka
- inkubacja w 5% (m/v) roztworze mleka w PBST przez 2 h z przeciwciałami anti-lgG w stężeniu 1:5000
- dekantacja niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min)
- usunięcie TWEENu za pomocą buforu PBS (3 razy po 5 min)
- wywoływanie z użyciem odczynnika do chemiluminescencji i kamery CCD.
Wyniki analiz próbek moczu pochodzących od pacjentów po przeszczepie nerki pokazują poziom przeciwciał z grupy IgG na przestrzeni dni. Na podstawie analizy zmian poziomu przeciwciał (reprezentowanych przez prążek o masie ok 52 kDa- ciężki łańcuch przeciwciał IgG) stwierdza się wzrost poziomu przeciwciał po przeszczepie, co można tłumaczyć reakcją immunologiczną organizmu biorcy. Poziom przeciwciał osiąga maksimum około trzeciego-piątego dnia, a następnie zaczyna spadać, co ewidentnie ma związek z rozpoczęciem terapii immunosupresantami zapobiegającej odrzuceniu przeszczepu.
P r z y k ł a d 2 Analiza próbki moczu pacjentów po operacji przeszczepu nerki w kierunku obecności komponentów C3
Przykładowa analiza próbki moczu wykonywana sposobem według wynalazku obejmuje:
c) przygotowanie próbki moczu;
- pobieranie moczu od pacjenta zgodnie ze standardową procedurą (odnośnik literaturowy nr (2))
- mrożenie próbki w -20°C (W przypadku przechowywania próbek dłużej niż przez 16 godz. (odnośnik literaturowy nr (1))
- transport do laboratorium
- rozmrożenie w temperaturze pokojowej (~23°C)
- zawieszanie próbki moczu przez intensywne pipetowania lub mieszanie z wykorzystaniem Vortexu
- dodanie do próbki moczu buforu Laemmli'ego (buforu obciążającego), tak by w próbce znajdowało się:
- 2% SDS
- 10% glicerol
- 5% β-merkaptoetanol
- 0,002% błękit bromofenolu
- 0,125 MTris-HCI
- pH 6,8
- zagotowanie próbki w temperaturze 95°C przez 2 min
- nałożenie 10 ąl próbki na gradientowy 4-15% żel poliakrylamidowy
- SDS-PAGE w buforze 1x Tris-glicyna przez 30 min przy stałym natężeniu 40 mA/żel.
- około 2 min po rozpoczęciu elektroforezy, gdy białka z próbki znajdują się w żelu, zatrzymanie procedury i usunięcie nadmiaru soli obecnej w studzienkach przez odpłukanie.
d) analizę zmian poziomu komponentu C3 w próbce moczu z wykorzystaniem metody Western Blot;
- transfer półsuchy z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową przy użyciu buforu (Tris 96 mM, Glicyna 78 mM, SDS 0,075% (m/v), Metanol 40% (v/v)) do transferu przez 1 h przy napięciu 10V.
- blokowanie membrany w 10% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka rozpuszczonego w PBST (bufor PBS o pH 7,4 z 0,1% (v/v) TWEEN® 20 (CAS# 9005-64-5)) przez 1 h
- inkubacja w 5% (m/v) roztworu mleka w PBST przez noc z przeciwciałami anti-C3 w stężeniu 1:1000
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min)
- inkubację w 5% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka w PBST przez 3 h z drugorzę- dowymi przeciwciałami anti-mouse w stężeniu 1:5000
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min)
- usunięcie TWEENu za pomocą buforu PBS (3 razy po 5 min)
- wywoływanie z użyciem odczynnika do chemiluminescencji i kamery CCD.
PL 236 671 B1
P r z y k ł a d 3 Badanie skuteczności sposobu dla różnych warunków przechowywania próbki.
Dla sprawdzenia jak czynniki zewnętrzne mogą wpływać na oznaczenie zbadano różne warianty postępowania z próbką, wprowadzając modyfikacje w podstawowej procedurze. Zbadano mocz pochodzący z grupy kontrolnej obejmującej pięć osób. Wzięto pod uwagę następujące czynniki:
a) Temperaturę w jakiej przechowywano próbkę:
1) -20°C,
2)4°C,
3)23°C,
4)37°C,
5)60°C.
b) Czas inkubacji próbki:
1) bez inkubacji,
2) inkubacja przez noc.
c) Sposób postępowania z próbką:
1) badanie zawiesiny moczu,
2) badanie moczu po 5 minutowej sedymentacji: pobieranie próbki z dna oraz z powierzchni cieczy,
3) badanie supernatantu i osadu po zwirowaniu przez 5 min 14,000xg,
4) strącanie białek z całej zawiesiny za pomocą kwasu trójchlorooctowego (TCA).
We wszystkich przypadkach poziom IgG w moczu utrzymywał się na podobnym poziomie (Fig. 2) niezależnie od metody przygotowania próbki (z wyłączeniem całonocnej inkubacji w 60°C). Pomiar jest stabilny niezależnie od sposobu przechowywania próbki, co daje pewność, iż zmiana poziomu IgG w przypadku próbek od pacjentów jest wywołana reakcją immunologiczną organizmu, a nie artefaktem preparatyki.
Przykładowe wyniki analiz ogólnego poziomu przeciwciał IgG w moczu pacjentów, wykonane sposobem według wynalazku przedstawiono na Figurze 3.
P r z y k ł a d 4 Określenie w jakich formach rozpuszczalnych mogą występować białka obecne w moczu.
Dla wyjaśnienia faktu z czym związany jest wzrost poziomu IgG sprawdzono czy białko to tworzy kompleksy z innymi białkami obecnymi w moczu. Wykorzystano do tego kolumnę typu Size Exlusion, rozdzielającą białka na podstawie ich masy. Następnie przeprowadzono detekcję za pomocą techniki Western Blot, w sposób analogiczny do poprzednich próbek.
Przykładowa analiza próbki moczu obejmowała:
a) przygotowanie próbki moczu;
- pobieranie moczu od pacjenta zgodnie ze standardową procedurą (odnośnik literaturowy nr (2))
- mrożenie próbki w -20°C (W przypadku przechowywania próbek dłużej niż przez 16 godz. (odnośnik literaturowy nr (1)
- transport do laboratorium
- rozmrożenie w temperaturze pokojowej (~23°C)
b) rozdział chromatograficzny na kolumnie
- wirowanie próbki moczu przez 5 min przy 30 tys. x g
- nałożenie 1 ml próbki na kolumnę i zbieranie frakcji o objętości 1 ml
- wytrącanie białek za pomocą TCA
- zawieszenie osadu za pomocą buforu Laemmli’ego (buforu obciążającego), o składzie:
- 2% SDS
- 10% glicerol
- 5% β-merkaptoetanol
- 0,002% błękit bromofenolu
- 0,125 MTris-HCI
- pH 6,8
- zagotowanie próbki w temperaturze 95°C przez 2 min
- nałożenie 10 μl próbki na gradientowy 4-15% żel poliakrylamidowy
- SDS-PAGE w buforze 1x Tris-glicyna przez 30 min przy stałym natężeniu 40 mA/żel
PL 236 671 B1
- około 2 min po rozpoczęciu elektroforezy, gdy białka z próbki znajdują się w żelu, zatrzymanie procedury i usunięcie nadmiaru soli obecnej w studzienkach.
c) analizę zmian poziomu przeciwciał IgG w próbce moczu z wykorzystaniem metody Western Blot;
- transfer półsuchy z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową przy użyciu buforu (Tris 96 mM, Glicyna 78 mM, SDS 0,075% (m/v), Metanol 40% (v/v)) do transferu przez 1 h przy napięciu 10V.
- blokowanie membrany w 10% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka rozpuszczonego w PBST (bufor PBS o pH 7,4 z 0,1% (v/v) TWEEN® 20 (CAS# 9005-64-5)) przez noc
- zdekantowanie mleka
- inkubację w 5% (m/v) roztworze mleka w PBST przez 2 h z przeciwciałami anti-lgG w stężeniu 1:5000
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min)
- usunięcie TWEENu za pomocą buforu PBS (3 razy po 5 min)
- wywoływanie z użyciem odczynnika do chemiluminescencji i kamery CCD.
d) analizę zmian poziomu komponentu C3 w próbce moczu z wykorzystaniem metody Western Blot;
- transfer półsuchy z żelu poliakrylamidowego na membranę nitrocelulozową przy użyciu buforu (Tris 96 mM, Glicyna 78 mM, SDS 0,075% (m/v), Metanol 40% (v/v)) do transferu przez 1 h przy napięciu 10V.
- blokowanie membrany w 10% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka rozpuszczonego w PBST (bufor PBS o pH 7,4 z 0,1% (v/v) TWEEN® 20 (CAS# 9005-64-5)) przez godzinę
- inkubację w 5% (m/v) roztworu mleka w PBST przez noc z przeciwciałami anti-C3 w stężeniu 1:1000
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min)
- inkubację w 5% (m/v) roztworze odłuszczonego mleka w PBST przez 3 h z drugo rzę- dowy mi przeciwciałami anti-mouse w stężeniu 1:5000
- dekantację niezwiązanych przeciwciał i mleka za pomocą buforu PBST (5 razy po 5 min)
- usunięcie TWEENu za pomocą buforu PBS (3 razy po 5 min)
- wywoływanie z użyciem odczynnika do chemiluminescencji i kamery CCD
Analiza frakcji z kolumn pokazuje, że komponenty C3 oraz przeciwciała IgG są obecne w tych samych frakcjach. Co oznacza, że oba białka mogą znajdować się w kompleksie o takiej samej masie. Komponent C3 jest białkiem będącym elementem układu dopełniacza, czyli szlaku biochemicznego między innymi odpowiadającego za immunologiczny odrzut przeszczepu. Występuje również korelacja między zmianami poziomu przeciwciał IgG oraz komponentów C3 w kolejnych dniach po operacji, co sugeruje, że IgG i C3 tworzą kompleks. To z kolei prowadzi do wniosku, że spadek poziomu przeciwciał IgG w końcowych dniach i przyjęcie się przeszczepu są ze sobą powiązane, dzięki czemu wykorzystywana metoda daje poprawne wyniki. Jak widać na Figurze 1 oba wyżej wymienione białka mają tendencję do agregacji i wytrącania się z roztworu. Dlatego też stosowanie moczu pełnego jest uzasadnione.
P r z y k ł a d 5 Określenie wpływu pojemnika na proteom obecny moczu
a) Pobieranie próbki
- Przygotowanie pojemników do pobierania moczu. Pokrycie wewnętrznej powierzchni warstwą nabłyszczacza oraz zewnętrznej powierzchni warstwą preparatu anty-elektrostatycznego
- Pobranie moczu zgodnie ze standardową procedurą (3 osoby płci męskiej w wieku 25-27 lat)
- Zmieszanie równych ilości moczu razem
- Przygotowanie po 5 sztuk następujących pojemników:
1. Niesterylny pojemnik na mocz (plastikowy)
2. Sterylny pojemnik na mocz (plastikowy)
3. Sterylny pojemnik na mocz (szklany)
4. Probówka typu „Eppendorf”, 5 ml
5. Probówka typu „Eppendorf Iow bind, 5 ml
PL 236 671 B1
- Nadanie pojemnikom oznaczeń K, R, S, N, Sp i wykonanie na nich następujących procedur:
1. K- pojemnik kontrolny
2. R - dodanie 2 ml miliQ
3. N - pokrycie wewnętrznej powierzchni pojemnika nabłyszczaczem
4. Sp - pokrycie zewnętrznej powierzchni pojemnika warstwą preparatu antyelektrostatycznego
- Przeniesienie po 4,5 ml zmieszanego moczu do nowych pojemników
- Dodanie do pojemników oznaczonych „S” 500 pl 10% (v/v) roztworu SDS
- Inkubacja próbki w temperaturze pokojowej przez 1 h, co jakiś czas delikatnie mieszając
- Usunięcie cieczy za pomocą pipety
- Zanurzenie patyczka higienicznego z wacikiem w buforze Leammli’ego
- Zebranie za pomocą wacika białek przyczepionych do ścianek (z wyżej opisanych 25 pojemników oraz z trzech pierwszych pojemników, do których wstępnie pobierano mocz)
- Przeniesienie wacika do probówkę typu eppendorf
- Oddzielenie roztworu od wacika za pomocą wirowania
- Zebranie próbki w buforze do nowej probówki
- Zagotowanie próbki w temperaturze 95°C przez 2 min
- Dalsza procedura analogicznie do przedstawionej w przykładzie 1.
Porównanie proteomu próbki z moczu pełnego oraz próbki pobranej ze ścianek pojemnika (Fig. 6), ujawniło różny wzór białek na żelu. Oznacza to, że doszło do osadzania się części białek na wewnętrznej powierzchni naczynia. Efekt ten jest najmniejszy w przypadku szklanego pojemnika oraz obecności w próbce moczu pełnego 1% (v/v) roztworu SDS.
Literatura
1. Thongboonkerd V. Practical Points in Urinary Proteomics. Journal of Proteome Research. 2007, 6(10), 3881-3890.
2. Delanghe J., Speeckaert, M. Preanalytical requirements of urinalysis. Biochemia Medica. 2014, 24(1), 89-104
3. Decramer S, de Peredo, A. G., Breuil, B., Mischak, H., Monsarrat. B., Bascands, J. -., & Schanstra, J. P. Urine in clinical proteomics. Molecular and Cellular Proteomics, 2008, 7(10), 1850-1862.
4. Thongboonkerd V, & Saetun, P., Bacterial overgrowth affects urinary proteome analysis: Recommendation: for centrifugation, temperature, duration, and the use of preservatives during sample collection. Journal of Proteome Research, 2007, 6(11), 4173-4181.
5. Bakun M. Niemczyk, M., Domanski, D., Jazwiec, R., Perzanowska, A., Niemczyk, S., Dadlez, M. Urine proteome of autosomal dominant polycystic kidney disease patients. Clinical Proteomics, 2012, 9(1).
6. Rodriguez-del Valle M., Quakyi, I. A., Amuesi, J., Quaye, J. T., Nkrumah, F. K., & Taylor, D. W. Detection of antigens and antibodies in the urine of humans with plasmodium falciparum malaria. Journal of Clinical Microbiology, 1991,29(6). 1238-1242.
7. [Online] http://www.uniprot.org/uniprot/P02768.
8. [Online] http://www.uniprot.org/uniprot P01024.
9. [Online] http://emedicine.medscape.com/article/136897-overview.
Claims (10)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób analizy białek w próbce moczu, obejmujący przygotowanie próbki moczu oraz detekcję białek, znamienny tym, że obejmuje etapy przygotowania próbki moczu pobranego od pacjenta po zabiegu przeszczepienia nerki do analizy, w którym to miesza się próbkę moczu bez jej wirowania, na tak przygotowanej próbce moczu pełnego prowadzi się detekcję białek sposobem detekcji, przy czym wykrywanymi białkami są przeciwciała IgG i/lub komponenty dopełniacza C3,PL 236 671 B1 przy czym analiza wykonywana jest w diagnostyce ex vivo ryzyka immunologicznego odrzucenia przeszczepu nerki.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że analiza obejmuje monitorowanie zmian poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza C3, w moczu pełnym pobranym od pacjenta po zabiegu przeszczepienia nerki, przy czym wzrost poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza C3 w czasie wskazuje na ryzyko odrzucenia przeszczepu, a spadek poziomu przeciwciał IgG i/lub komponentów dopełniacza C3 w czasie wskazuje na prawdopodobne przyjęcie się przeszczepu.
- 3. Sposób według zastrz. 1-2, znamienny tym, że detekcja białek wykonywana jest techniką Western blot.
- 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że obejmuje następujące etapy:a) zawieszanie próbki moczu;b) dodanie do próbki moczu buforu obciążającego;c) rozbicie agregatów białkowych, korzystnie przez zagotowanie próbki moczu lub trawienie enzymatyczne;d) nałożenie próbki na żel poliakrylamidowy i elektroforezę SDS-PAGE;e) usunięcie nadmiaru soli ze studzienek;f) detekcję białek.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że próbka moczu po pobraniu przechowywana jest w pojemniku szklanym.
- 6. Sposób według zastrz. 3-5, znamienny tym, że do próbki moczu przed analizą dodawany jest SDS do stężenia około 1% (v/v).
- 7. Sposób według dowolnego z zastrz. 3-6, znamienny tym, że próbka moczu po pobraniu, a przed analizą jest zamrażana, a tuż przed analizą próbka rozmrażana jest w temperaturze pokojowej.
- 8. Sposób według dowolnego z zastrz. 3-7, znamienny tym, że etap a) jest przeprowadzany przez intensywne pipetowanie lub z wykorzystaniem Vortexu.
- 9. Sposób według dowolnego z zastrz. 3-8, znamienny tym, że etap c) wykonywany jest w temperaturze 95°C przez 2 minuty.
- 10. Sposób według dowolnego z zastrz. 3-9, znamienny tym, że etap d) wykonywany jest w 4-15% gradientowym żelu poliakrylamidowym, a elektroforeza przebiega w buforze 1x Tris-glicyna przez około 30 min przy natężeniu około 40 mA/żel.
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415033A PL236671B1 (pl) | 2015-12-02 | 2015-12-02 | Sposób analizy białek w próbce moczu |
| PCT/IB2016/057240 WO2017093920A1 (en) | 2015-12-02 | 2016-12-01 | Method of analysis of proteins in urine |
| EP16823045.6A EP3384289B1 (en) | 2015-12-02 | 2016-12-01 | Method of analysis of proteins in urine |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL415033A PL236671B1 (pl) | 2015-12-02 | 2015-12-02 | Sposób analizy białek w próbce moczu |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL415033A1 PL415033A1 (pl) | 2017-06-05 |
| PL236671B1 true PL236671B1 (pl) | 2021-02-08 |
Family
ID=58793758
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL415033A PL236671B1 (pl) | 2015-12-02 | 2015-12-02 | Sposób analizy białek w próbce moczu |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP3384289B1 (pl) |
| PL (1) | PL236671B1 (pl) |
| WO (1) | WO2017093920A1 (pl) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| PL3469372T3 (pl) | 2016-06-10 | 2023-12-04 | Warszawski Uniwersytet Medyczny | Sposoby diagnozowania i monitorowania z wykorzystaniem białek moczu jako markerów nefropatii IgA |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5326707A (en) * | 1991-11-29 | 1994-07-05 | Miles Inc. | Composition and device for urinary protein assay and method of using the same |
| MX2014013224A (es) * | 2012-05-01 | 2015-02-10 | Kypha Inc | Deteccion de activacion de complemento. |
| US20150219667A1 (en) * | 2014-02-05 | 2015-08-06 | The Trustees Of Columbia University In The City Of New York | PRE-TRANSPLANT IgG REACTIVITY TO APOPTOTIC CELLS CORRELATES WITH LATE KIDNEY ALLOGRAFT LOSS |
-
2015
- 2015-12-02 PL PL415033A patent/PL236671B1/pl unknown
-
2016
- 2016-12-01 EP EP16823045.6A patent/EP3384289B1/en not_active Not-in-force
- 2016-12-01 WO PCT/IB2016/057240 patent/WO2017093920A1/en not_active Ceased
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP3384289A1 (en) | 2018-10-10 |
| EP3384289B1 (en) | 2022-06-01 |
| PL415033A1 (pl) | 2017-06-05 |
| WO2017093920A1 (en) | 2017-06-08 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| KR101678703B1 (ko) | 갈렉틴-３ 면역검정 | |
| US8067190B2 (en) | Use of protein SATB2 as a marker for colorectal cancer | |
| Bentall et al. | Characterization of ABH-subtype donor-specific antibodies in ABO-A-incompatible kidney transplantation | |
| Siddon et al. | The chemical and laboratory investigation of hemolysis | |
| JP7457337B2 (ja) | アルツハイマー病バイオマーカー | |
| WO2011085165A2 (en) | Ca-125 immune complexes as biomarkers of ovarian cancer | |
| EP3178846A2 (en) | Novel phosphorylation of cardiac troponin i as a monitor for cardiac injury | |
| Greene et al. | Evidence for a functional role of the molecular chaperone clusterin in amyloidotic cardiomyopathy | |
| RS58244B1 (sr) | Antitelo koje vezuje linearni epitop humanog p53 i njegove dijagnostičke primene | |
| EP3264083B1 (en) | L-fabp immunoassay method | |
| US20120303083A1 (en) | Novel desmin phosphorylation sites useful in diagnosis and intervention of cardiac disease | |
| PL236671B1 (pl) | Sposób analizy białek w próbce moczu | |
| CN101680895A (zh) | 前列腺癌的恶性程度判定试剂盒和其方法 | |
| Rosskopf et al. | The pre-analytical processing of blood samples for detecting biomarkers on protein microarrays | |
| JP7657626B2 (ja) | 被検者における心血管疾患の発症リスクを判定する方法、被検者における血管石灰化を判定する方法、および検査キット | |
| US20130252265A1 (en) | Method for testing for cerebral infarction via cartilage acidic protein 1 | |
| JP2012107935A (ja) | Ｄｅｓｍｏｇｌｅｉｎ−２蛋白質による脳梗塞の検査方法 | |
| ES2718689T3 (es) | Método para determinar la concentración de células epiteliales en una muestra de sangre o una muestra de aspirado | |
| JP2011237402A (ja) | ガレクチン−３結合蛋白質による脳梗塞の検査方法 | |
| EP2557423B1 (en) | Immunoassay of carboxymethylarginine | |
| JP2012107932A (ja) | Ｃｌｕｓｔｅｒｉｎ蛋白質による脳梗塞の検査方法 | |
| Khadjavi et al. | A high-throughput assay for the detection of Tyr-phosphorylated proteins in urine of bladder cancer patients | |
| Sodi | ANALYTICAL ASPECTS | |
| Sypniewska et al. | The use of biochip cardiac array technology for early diagnosis of acute coronary syndromes | |
| Herries et al. | Brain biomarkers: follow-up of RNA expression discovery approach: CSF assays for neurogranin, SNAP-25, and VILIP-1 |