PL236986B1 - Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 - Google Patents
Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 Download PDFInfo
- Publication number
- PL236986B1 PL236986B1 PL401271A PL40127112A PL236986B1 PL 236986 B1 PL236986 B1 PL 236986B1 PL 401271 A PL401271 A PL 401271A PL 40127112 A PL40127112 A PL 40127112A PL 236986 B1 PL236986 B1 PL 236986B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- mutation
- prostate cancer
- nbs1
- gene
- survival
- Prior art date
Links
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 title claims description 53
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 title claims description 49
- 238000010837 poor prognosis Methods 0.000 title claims description 12
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 11
- 238000000034 method Methods 0.000 title description 5
- 101150016316 NBS1 gene Proteins 0.000 claims description 47
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 claims description 27
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 13
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 claims description 7
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 claims description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 66
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 24
- 206010064571 Gene mutation Diseases 0.000 description 18
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 16
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 15
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 15
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 101001128138 Homo sapiens NACHT, LRR and PYD domains-containing protein 2 Proteins 0.000 description 11
- 101000981336 Homo sapiens Nibrin Proteins 0.000 description 11
- 102100024403 Nibrin Human genes 0.000 description 11
- 108010072866 Prostate-Specific Antigen Proteins 0.000 description 10
- 102100038358 Prostate-specific antigen Human genes 0.000 description 10
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 10
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 7
- 235000019441 ethanol Nutrition 0.000 description 5
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 5
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 4
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 4
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 4
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 210000002307 prostate Anatomy 0.000 description 4
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 230000034994 death Effects 0.000 description 3
- 231100000517 death Toxicity 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000033616 DNA repair Effects 0.000 description 2
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 2
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 2
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 2
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 2
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 2
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 2
- 238000001325 log-rank test Methods 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 210000005259 peripheral blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000011886 peripheral blood Substances 0.000 description 2
- 239000011535 reaction buffer Substances 0.000 description 2
- OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;2-[2-[bis(carboxymethyl)amino]ethyl-(carboxymethyl)amino]acetic acid;boric acid Chemical compound OB(O)O.OCC(N)(CO)CO.OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O OSBLTNPMIGYQGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 1
- 230000009946 DNA mutation Effects 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L EDTA disodium salt (anhydrous) Chemical compound [Na+].[Na+].OC(=O)CN(CC([O-])=O)CCN(CC(O)=O)CC([O-])=O ZGTMUACCHSMWAC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 102000014119 Nibrin Human genes 0.000 description 1
- 108050003990 Nibrin Proteins 0.000 description 1
- 208000004485 Nijmegen breakage syndrome Diseases 0.000 description 1
- 108010064218 Poly (ADP-Ribose) Polymerase-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100023712 Poly [ADP-ribose] polymerase 1 Human genes 0.000 description 1
- 238000012300 Sequence Analysis Methods 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000008051 TBE buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000007844 allele-specific PCR Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 238000000137 annealing Methods 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 1
- DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L cisplatin Chemical compound N[Pt](N)(Cl)Cl DQLATGHUWYMOKM-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229960004316 cisplatin Drugs 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000013480 data collection Methods 0.000 description 1
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 1
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 1
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 238000013399 early diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 1
- 230000001771 impaired effect Effects 0.000 description 1
- 230000000415 inactivating effect Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 201000001514 prostate carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000003753 real-time PCR Methods 0.000 description 1
- 238000000611 regression analysis Methods 0.000 description 1
- 230000003252 repetitive effect Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000007894 restriction fragment length polymorphism technique Methods 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 229940037001 sodium edetate Drugs 0.000 description 1
- 239000010414 supernatant solution Substances 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
Opis wynalazku
Przedmiotami wynalazku jest zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 do wykrywania in vitro genetycznie uwarunkowanego agresywnego raka prostaty o złym rokowaniu u pacjenta z rakiem prostaty. Wynalazek dotyczy nowej metody diagnostycznej wykrywającej agresywnego raka prostaty u mężczyzn.
W przedstawianym wynalazku, zastosowanie wykrywania mutacji genu NBS1, identyfikuje grupę mężczyzn, którzy są w grupie zwiększonego ryzyka zachorowania na agresywnego raka prostaty o złym rokowaniu co do przeżycia. Tak więc, przedstawiany wynalazek dotyczy opracowania nowego markera (mutacji genu NBS1) złego rokowania dla raka gruczołu krokowego.
W polskiej populacji występuje powtarzalna mutacja 657del5 genu NBS1 [1]. Jest to mutacja założycielska pochodząca od wspólnych przodków w naszej homogennej genetycznie populacji [2]. Mutacja ta występuje z częstością około 0,6% w naszej populacji, a więc w Polsce żyje około 250 000 nosicieli tej mutacji genu NBS1. Koszt testu opartego o wykrywanie mutacji charakterystycznych dla polskiej populacji jest wielokrotnie mniejszy niż koszt pełnej analizy sekwencji genu NBS1, a czas badania nieporównywalnie krótszy. Taki test może być wykonywany w wielu laboratoriach bez konieczności stosowania skomplikowanego i kosztownego sprzętu. Obecność pojedynczej mutacji genu NBS1 (657del5) w polskiej populacji występującej ze względnie dużą częstością stwarza unikalną możliwość niezwykle efektywnej diagnostyki genetycznej (opartej o identyfikację tej zmiany DNA) oraz w konsekwencji wyjątkowego modelu do badania znaczenia mutacji genu NBS1 w korelacjach genetyczno-klinicznych.
Dotychczas wykazano, że mutacja założycielska 657del5 genu NBS1 predysponuje do zachorowania na raka prostaty [Patent No. 7,319,007 B2 (USA), publikacja 3]. Szacujemy, że w Polsce około 2% przypadków raka stercza jest wywołanych przez mutację 657del5 genu NBS1. Tym niemniej istnieje nadal zapotrzebowanie na sposób pozwalający identyfikować grupę najwyższego ryzyka, tj. pacjentów u których rozwija się agresywna forma raka gruczołu krokowego o złym rokowaniu.
Przedmiotem wynalazku jest zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 do wykrywania in vitro genetycznie uwarunkowanego agresywnego raka prostaty o złym rokowaniu u pacjenta z rakiem prostaty, przy czym agresywnym rakiem prostaty o złym rokowaniu jest rak, w którym mediana czasu przeżycia wynosi 57 miesięcy, a przeżywalność pacjenta jest ponad 2-krotnie krótsza niż przeżywalność pacjenta z rakiem prostaty, u którego nie stwierdzono mutacji genu NSB1, przy czym rzeczona różnica przeżywalności występuje podczas stosowania u obydwu pacjentów tego samego standardowego postępowania klinicznego.
W przykładowej realizacji bada się obecność mutacji konstytucyjnej genu NBS1 u mężczyzny, niezależnie od historii rodzinnej zachorowań na nowotwory.
Korzystnie, obecność zmiany germinalnej bada się techniką wybraną spośród metod pośredniego wykrywania mutacji jak np. ASO PCR (ang. Allele specific - PCR), SSCP (ang. single-strand conformation polymorphism), ASA (ang. allele specific analysis), RFLP-PCR (ang. restriction fragment length polymorphism - polymerase chain reaction), real-time PCR i innych metod pośredniego lub metod bezpośredniego wykrywania mutacji jak sekwencjonowanie.
W przykładowej realizacji obecność mutacji genu NBS1 bada się w celu zmiany postępowania klinicznego w stosunku do nosicieli mutacji genu NBS1, w którym diagnostyka raka prostaty zaczyna się od 45 roku życia (z zastosowaniem markerów raka stercza (np. PSA) i biopsji stercza).
W szczególności, obecność mutacji genu NBS1 bada się w celu zmiany postępowania klinicznego w stosunku do nosicieli mutacji genu NBS1, w którym leczenie raka prostaty poszerza się o chemioterapię.
W zalecanym sposobie postępowania klinicznego w stosunku do mężczyzn, nosicieli mutacji genu NBS1, diagnostykę raka prostaty rozpoczyna się od 45 roku życia (z zastosowaniem markerów raka stercza (np. PSA) i biopsji stercza) i/lub leczenie raka prostaty poszerza się o chemioterapię.
W stanie techniki wiadomo było jedynie, że zmiany germinalne w genie NBS1 mogą predysponować do raka prostaty. Obecnie nieoczekiwanie ustalono, że u mężczyzn, u których występuje taka zmiana DNA rozwija się agresywna forma raka gruczołu krokowego o złym rokowaniu. Odkrycie to możliwe było dzięki analizie dużej grupy mężczyzn z rakiem stercza w homogennej genetycznie populacji polskiej.
W pracach wiodących do przedmiotowego wynalazku nieoczekiwanie odkryto, że u nosicieli mutacji 657del5 genu NBS1 stwierdzono częste występowanie guzów o wysokim stopniu zaawansowania
PL 236 986 B1 klinicznego (T4) oraz guzów o wysokim stopniu zaawansowania histopatologicznego: ~ 30% raków u nosicieli tej mutacji oceniono według skali Gleasona na 8 do 10 punktów. Równie nieoczekiwanie wykazano, że średni okres przeżycia pacjentów z rakiem prostaty z mutacją 657del5 genu NBS1 jest znacząco krótszy (51 miesięcy versus 121 miesięcy; HR = 1.85, p = 0.008), niż u mężczyzn z rakiem prostaty bez mutacji 657del5 genu NBS1. Około połowa pacjentów z rakiem starcza i mutacją 657del5 zmarła w ciągu 5 lat od postawienia rozpoznania tego nowotworu; 5-letnie przeżycie u nosicieli mutacji 657del5 genu NBS1 wynosiło jedynie 49%, w porównaniu do 72% u pacjentów bez tej mutacji. Przeżycie u mężczyzn z rakiem prostaty i mutacją 657del5 genu NBS1 pozostało statystycznie istotnie gorsze (niż u mężczyzn z rakiem stercza bez mutacji 657del5 genu NBS1) po wprowadzeniu poprawki na wiek rozpoznania, poziom markera PSA w momencie rozpoznania, stopień zaawansowania klinicznego i histopatologicznego (HR = 1.86; 95% CI, 1.05 to 3.32; p = 0.04).
Prezentowany wynalazek dotyczy opracowania nowego markera złego rokowania dla raka stercza (mutacji genu NBS1). Wcześniej nikt nie badał związku pomiędzy nosicielstwem mutacji NBS1 a charakterystyką kliniczną raka prostaty i przeżyciem pacjentów.
Uzyskane wyniki nieoczekiwanie wskazują, że raki stercza u nosicieli mutacji genu NBS1 powinny być wykrywane wcześnie oraz leczone radykalniej niż dotychczas, na przykład przez poszerzenie leczenia o chemioterapię już od pierwszych etapów leczenia. Gen NBS1 jest genem naprawy DNA a raki prostaty u nosicieli mutacji NBS1 nie posiadają prawidłowej nibryny (produktu genu NBS1) i mają skrajnie upośledzoną naprawę DNA [3]. Dlatego pacjenci z rakiem stercza i mutacją genu NBS1 mogą dobrze odpowiadać na leczenie cisplatyną i inhibitorami PARP1. Tak więc wykrycie mutacji genu NBS1 u mężczyzn z rakiem stercza może być wskazaniem do chemioterapii np. z zastosowaniem leków uszkadzających DNA.
Mutacje konstytucyjne genu NBS1 są obecne u nosicieli od urodzenia. Identyfikacja takich mutacji stwarza możliwość wykrycia zagrożenia rakiem stercza na wiele lat przed zachorowaniem. Tak więc zastosowanie testu NBS1 stwarza możliwość objęcia mężczyzn zindywidualizowanym postępowaniem medycznym. Uważamy, że taki test można wykonać około 40 roku życia, ponieważ w naszych badaniach najwcześniejsze zachorowanie na raka stercza u nosicieli mutacji NBS1 odnotowano w wieku 50 lat. Wykrycie tej mutacji u mężczyzny byłoby wówczas wskazaniem do wykonywania regularnych badań przesiewowych raka stercza (PSA - Prostate-specific antigen, badanie urologiczne, biopsja stercza) od około 45 roku życia. Takie zindywidualizowane postępowanie medyczne najprawdopodobniej przyczyni się do wczesnego rozpoznania i wprowadzenia radykalnego leczenia tego nowotworu na wczesnych etapach rozwoju, gdy całkowite wyleczenie jest możliwe.
P r z y k ł a d 1
A) Ustalanie korelacji pomiędzy mutacją skracającą białko NBS1 (657del5) a charakterystyką kliniczną raka prostaty i przeżyciem w polskiej populacji Zasady testu, wybór grupy pacjentów
Aby ustalić charakterystykę kliniczną raków prostaty u nosicielu mutacji NBS1, przeprowadzono analizę występowania tej mutacji w grupie 3750 mężczyzn z rakiem prostaty, zdiagnozowanych w latach od 1999 do 2012 w 14 szpitalach w Polsce. Pacjenci nie byli selekcjonowani pod względem historii rodzinnej zachorowań na nowotwory. Wiek zachowania wynosił od 41 do 96 lat (średnia 68.8). Do badania włączono 3750 mężczyzn, od których wyizolowano genomowe DNA oraz ustalono genotyp (obecność lub brak mutacji 657del5). Zgromadzono informacje odnośnie charakterystyki klinicznej raków prostaty (poziomu PSA w chwili rozpoznania oraz stopienia zawansowania klinicznego i histopatologicznego).
Aby ocenić przeżycie, pacjenci byli obserwowani od daty biopsji stercza (rozpoznania raka prostaty) do daty śmieci lub do kwietnia 2012. Średni okres obserwacji wynosił 54 miesiące. Określono krzywe przeżycia Kaplana-Meiera dla nosicieli mutacji genu NBS1 (52 osoby) oraz dla mężczyzn bez mutacji genu NBS1 (3082 osób). Przeżycie porównano za pomocą testu log-rank (log rank test). Pełna charakterystyka kliniczna nowotworów (poziom PSA w chwili rozpoznania, stopień zawansowania klinicznego i histopatologicznego) była dostępna dla grupy 1804 pacjentów (w tym 37 nosicieli mutacji genu NBS1). W grupie tej przeprowadzono analizę wieloczynnikową Cox regression, w której rozpatrywano wiek rozpoznania, rok rozpoznania, poziom PSA w momencie diagnozy, stopień zaawansowania histopatologicznego (wg skali Gleasona) oraz stopień zawansowania klinicznego (T1-4) jako potencjalne czynniki mające wpływ na asocjację pomiędzy obecnością mutacji genu NBS1 a okresem przeżycia.
PL 236 986 Β1
Izolacja genomowego DNA
Od wszystkich pacjentów pobrano próbkę krwi obwodowej. Do probówek zawierających 1 ml 1 M wersenianu sodu pobierano 10 ml krwi obwodowej. W celu rozbicia błony komórkowej do próbek dodawano roztwór TKM (10 mM Tris-HCL, 10 mM KCL, 2 mM EDTA, 4 mM MgCb) i 1 ml Igepal (SIGMA). Następnie próbkę wirowano w temp. 20°C przez 10 minut przy 3400 obr/min (w wirówce Eppendorf 5810R). Po odwirowaniu zlewano supernatant zostawiając osad leukocytów, który następnie zalewano roztworem TKM i rozbijano ręcznie. Powstałą mieszaninę wirowano przy 3400 obr w temp. 20°C przez 5 minut. Supernatant zlewano a powstały osad przepłukiwano dwukrotnie roztworem TKM. Następnie dodawano 0,5 ml 10% SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) i całość mieszano pipetą Pasterowską. W następnym etapie w celu rozbicia kompleksów białko-DNA próbkę inkubowano w łaźni wodnej w temperaturze 60°C przez 7 minut. Białko z roztworu wytrącano dodając 1 ml 5 M NaCI. Tak przygotowaną mieszaninę wirowano w temp. 20°C, przy 9900 obr/min przez 25 minut. Powstały supernatant przenoszono do odrębnej probówki. Z roztworu supernatantu wytrącano DNA dodając 10 ml 96% alkoholu etylowego. Wytrącony „kłaczek” DNA przenoszono do probówki i suszono w suszarce próżniowej przez 10 minut. DNA rozpuszczano w 200 μΙ TE (25 Mm Tris, HOL, 1Mm EDTA; pH 8,4) i przechowywano w 4°C.
Wykrywanie mutacji 657del5
Nbsex6f 5'CACCTCTTGATGAACCATCT
Nbsex6r 5'CGTTAACAACTACTGATAAGAG
Nbsdel5 5'GGCCGGCAGGAAAGAAATCTT
Reakcję POR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA ThermalCycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΙ zawierała: 1 μΙ (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdego startera, 2,5 μΙ buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCI, 500 mM KCL, 15 mM MgCb, 1 mg/ml żelatyny; pH 8,6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Tag DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA.
Amplifikację przeprowadzano w następujących warunkach:
1. 94°C^10min
2. 94°C 25 sek. 9 cykli
68°C do 56°C 25 sek. (obniżana temp, o 1,4°C w każdym cyklu)
72°C 35 sek.
3. 94°C 25 sec.
56°C 30 sec. 31 cykli
72°C 35 sec.
4. 4°C-> oo
Następnie, 15 μΙ produktu PCR rozdzielano na 3% żelu agarozowym (żel agarozowy (SeaKem FMC), 1X bufor TBE, 25 μg/ml bromku etydyny) pod napięciem 6V/cm przez 45 minut. Rozdzielone produkty uwidaczniano w świetle UV. W przypadkach z mutacją uwidaczniał się dodatkowy produkt PCR zawierający delecję 5 nukleotydów. Obecność mutacji wykrytych w analizach ASO-PCR potwierdzono za pomocą bezpośredniego sekwencjonowania.
Potwierdzenie obecności mutacji przez sekwencionowanie
Amplifikację sekwencji kodującej genu NBS1 zawierającej badane mutacje DNA przeprowadzono z użyciem starterów wykorzystanych do wykrywania tej mutacji, które są przedstawione powyżej. Reakcję PCR przeprowadzano w automatycznym termocyklerze (DNA Thermal Cycler 9600 - Perkin Elmer). Mieszanina reakcyjna o objętości 25 μΙ zawierała: 1 μΙ (50 ng) genomowego DNA, po 4 pmol każdej pary starterów, 2,5 μΙ buforu reakcyjnego (100 mM Tris-HCI, 500 mM KCL, 15 mM MgCb, 1 mg/ml żelatyny; pH 8.6), 200 μΜ każdego z deoksynukleotydów (dATP, dCTP, dGTP i dTTP) oraz 1 U polimerazy Tag DNA. Analogicznie przygotowano kontrolę ujemną, która nie zawierała DNA. Amplifikację przeprowadzano w warunkach przedstawionych powyżej dla reakcji ASO-PCR.
Oczyszczanie produktów PCR: Produkty amplifikacji przenoszono na kolumienkę Microcon-100 (Amicon) umieszczoną na probówce Eppendorf, dodawano 400 μΙ wody destylowanej i wirowano przy 1850 g przez 15 minut. Przesącz zawierający startery i pozostałości mieszaniny reakcyjnej PCR wylewano, zaś produkty reakcji pozostałe na filtrze kolumienki zalewano 400 μΙ H2O i wirowano ponownie przez 15 minut przy 1850 g. Ostatnią czynność powtarzano 3-krotnie. W celu odzyskania oczyszczonych produktów PCR odwróconą o 180° kolumienkę przenoszono na nową probówkę i wirowano przez
PL 236 986 Β1 minuty przy 9000 g. Wszystkie wirowania przeprowadzono w temp 25°C. Uzyskiwano w ten sposób około 5 μΙ czystego produktu, który rozcieńczano wodą do objętości 20 μΙ.
PCR sekwencyjny: Asymetryczny PCR sekwencyjny wykonywano w automatycznym termocyklerze Gene Amp PCR System 9600 firmy Perkin Elmer w 20 μΙ mieszaninie reakcyjnej zawierającej: 1 pmol jednego startera, 4 μΙ oczyszczonego matrycowego produktu PCR, 8 μΙ BigDye Terminator Ready Reaction Kit v3.0 (Applied Biosystems). W przypadkach, gdy stwierdzono zmianę w trakcje sekwencjonowania z jednym starterem, wynik został potwierdzony poprzez sekwencjonowanie z drugim starterem z danej pary.
Parametry sekwencyjnego PCR:
wstępna denaturacja - 96°C 30 sekund 30 cykli, każdy składający się z:
denaturacji - 94°C 30 sekund przyłączania starterów - 55°C 45 sekund wydłużania komplementarnego DNA - 72°C 60 sekund
Całość produktów sekwencjonowania (20 μΙ) przenoszono do probówki Eppendorfo pojemności 0,5 ml, zalewano 60 μΙ 96% etanolu oraz dodawano 1 μΙ kwaśnego octanu sodu (pH 5,0) w celu wytrącenia produktów PCR. Probówki wirowano w 3000 g przez 20 min w 25°C. Po odwirowaniu etanol wylewano, a osad zawierający produkty PCR-u sekwencyjnego przepłukiwano zalewając go 200 μΙ 70% etanolu oraz wirowano w 3000 g przez 5 min w 25°C. Następnie cały alkohol ostrożnie wylewano, a pozostały w probówce osad suszono w aparacie próżniowym Eppendorf Concentrator 5301 przez 20-30 min, po czym rozpuszczano w 4 μΙ sekwencyjnego buforu obciążającego (150 μΙ formamidu dejonizowanego, 50 μΙ 50 mM EDTA, 0.05% Dextran Blue). Rozpuszczone w buforze obciążającym produkty denaturowano przez 4 minuty w 94°C, przenoszono do łaźni z lodem, po czym nanoszono na denaturujący poliakrylamidowy żel sekwencyjny (4% akrylamid -19:1,1 χΤΒΕ, 6M mocznik). Rozdział elektroforetyczny dokonywano w automatycznym aparacie do sekwencjonowania ABI PRISM 377 DNA Sequencer (Applied Biosystems). Zbieranie danych w trakcie elektroforezy oraz ich analiza odbywały się za pomocą programów ABI PRISM 377 Collection Software and Sequencing Analysis Software Version 3.0 (Applied Biosystems).
Wyniki
Charakterystyka kliniczna raków u 53 nosicieli mutacji 657del5 oraz u 3307 osób bez tej mutacji jest przedstawiona w tabeli 1. Raki prostaty o najwyższym stopniu zaawansowania klinicznego (T4) były statystycznie istotnie częstsze u nosicieli mutacji genu NBS1 niż u osób bez tej mutacji (19.5% vs 7.7%; p = 0.01). Ponadto, agresywne guzy (ocenione wg skali Gleasona na od 8 do 10 punków) były częstsze u nosicieli mutacji niż u mężczyzn bez mutacji (28.4% versus 19.1%) lecz różnica nie była istotna statystycznie (p = 0.1).
Tabela 1. Charakterystyka kliniczna raków prostaty u nosicieli mutacji genu NBS1 oraz u osób bez tej mutacji
| Nosiciele mutacji NB SI (n=53) | Przypadki bez mutacji NBS1 (n = 3307) | Liczba P | ||
| Wiek rozpoznania (lata) | Średnia | 67.3 | 68.9 | 0.2 |
| Poziom PSA w momencie rozpoznania | Mediana | 10.7 | 11.2 | 0.8 |
| <4.0 | 2.8% (1/36) | 4.5% (112/2474) | 0.9 | |
| 4.1-10 | 47.2% (17/36) | 40.4% (999/2474) | 0.5 | |
| 10.1-20.0 | 25.0% (9/36) | 25 0% (619/2474) | 0.8 | |
| >20.0 | 25.0% (9/36) | 30.1% (744/2474) | 0.6 | |
| Wynik wg skali Gleasona | <7 | 43.6% (20/46) | 51.9% (1341/2584) | 0.3 |
| 7 | 28.2% (13/46) | 29.0% (749/2584) | 1.0 | |
| >7 | 28.2% (13/46) | 19.1% (494/2584) | 0.1 | |
| Stopień zaawansowania klinicznego | T3 | 14.6% (6/41) | 17.8% (362/2029) | 0.8 |
| T4 | 19.5% (8/41) | 7.7% (156/2029) | 0.01 |
Obja śnienie do tabeli 1:
Wartości liczy p obliczono za pomocą testu Fiszera (Fishei esact test)
PL 236 986 Β1
Dane odnośnie przeżycia dostępne były dla 52 nosicieli mutacji 657del5 oraz dla 3082 osób bez tej mutacji (tabela 2). W okresie obserwacji, odnotowano 19 zgonów (36.5%) w grupie 52 nosicieli mutacji genu NBS1 oraz 755 (24.5%) zgonów w grupie 3082 osób bez mutacji. Krzywe przeżycia Kaplana-Meiera dla nosicieli mutacji 657del5 genu NBS1 oraz dla mężczyzn bez tej mutacji przedstawia rycina 1. Przeżycie było istotnie gorsze w grupie mężczyzn z rakiem prostaty i mutacją genu NBS1 w porównaniu do mężczyzn z rakiem prostaty, u których nie stwierdzono mutacji genu NSB1 (HR = 1.85; p = 0.008). Średnie przeżycie w grupie nosicieli było ponad 2-krotnie krótsze w grupie nosicieli, niż u osób bez mutacji (57 miesięcy versus 121 miesięcy). Gorsze przeżycie było zwłaszcza widoczne w okresie do 5 lat od postawienia rozpoznania raka gruczołu krokowego (HR = 2.08; p = 002). 5-letnie przeżycie u nosicieli mutacji genu NBS1 wynosiło jedynie 49%, w porównaniu do 72% u pacjentów bez tej mutacji. Przeżycie u mężczyzn z rakiem prostaty i mutacją genu NBS1 pozostało statystycznie istotnie gorsze (niż u mężczyzn z rakiem stercza, ale bez mutacji 657del5 genu NBS1) po wprowadzeniu poprawek na wiek rozpoznania, poziom PSA w momencie rozpoznania, stopień zaawansowania klinicznego i histopatologicznego (HR = 1.86; 95% Cl, 1.05 to 3.32; p = 0.04).
Figura 1 przedstawia krzywe przeżycia Kaplana-Meiera mężczyzn z rakiem prostaty: dla nosicieli mutacji genu NBS1 (n = 52) oraz dla mężczyzn bez tej mutacji (n = 3082).
Figura 2 przedstawia fragment sekwencji genu NBS1 zawierający exon 6 tego genu (sekwencja exonu 6 jest pogrubiona) (Genbank, Accession AB013139) (Matsuura, S., Tauchi, H., Nakamura, A., Kondo, N., Sakamoto, S., Endo, S., Smeets, D., Solder, B., Belohradsky, B.H., Kaloustian, V.M., Oshimura, M., Isomura ,M., Nakamura, Y. and Komatsu, K. Positional cloning of the gene for Nijmegen breakage syndrome Nat. Genet. 19 (2), 179-181 (1998)). Mutacja 657del5 jest wyróżniona podkreśleniem.
Tabela 2. Porównanie przeżycia u mężczyzn z rakiem stercza z mutacją 657del5 genu NBS1 do przeżycia u mężczyzn z rakiem stercza bez tej mutacji
| Nosiciele mutacji NBS1 (n=52) | Przypadki bez mutacji NBS1 (n = 3082) | |
| Średni okres obserwacji (miesiące) | 53.6 | 54.0 |
| Odsetek zmarłych | 36.5% | 24.5% |
| Mediana czasu przeżycia (miesiące) | 57 | 121 |
| 5-letnie przeżycie | 49% | 72% |
| 10-letnie przeżycie | 39% | 52% |
| HR | 1.85 | 1.0* |
| 95% CI | 1.17-2.91 | - |
| Liczba p | 0.008 | - |
Objaśnienie do tabeli 2:
HR, 95% CI, wartość liczby p obliczono za pomocą log-rank test
W podsumowaniu, niniejsze wyniki dowodzą, że mutacja inaktywująca białko NBS1 jest markerem raka stercza o złym rokowaniu.
Literatura
1. Varon R, Vissinga C, Platzer M, Cerosaletti KM, Chrzanowska KH, Saar K, Beckmann G, Seemanova E, Cooper PR, Nowak NJ, Stumm M, Weemaes CM, Gatti RA, Wilson RK, Digweed M, Rosenthal A, Sperling K, Concannon P, Reis A (1998) Nibrin, a novel DNA double-strand break repair protein, is mutated in Nijmegen breakage syndrome. Celi 93: 467-476
2. Varon R, Seemanova E, Chrzanowska K, Hnateyko O, Piekutowska-Abramczuk D, KrajewskaWalasek M, Sykut-Cegielska J, Sperling K, Reis A (2000) Clinical ascertainment of Nijmegen breakage syndrome (NBS) and prevalence of the major mutation, 657del5, in three Slav populations. Eur J Hum Genet 8: 900-902
PL 236 986 Β1
3. Cybulski C, Górski B, DebniakT, Gliniewicz B, Mierzejewski M, Masojć B, Jakubowska A, Matyjasik J, Złowocka E, Sikorski A, Naród SA, Lubiński J (2004) NBS1 is a prostatę cancer susceptibility gene. Cancer Res 64: 1215-9
Claims (1)
- Zastrzeżenie patentowe1. Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 do wykrywania in vitro genetycznie uwarunkowanego agresywnego raka prostaty o złym rokowaniu u pacjenta z rakiem prostaty, przy czym agresywnym rakiem prostaty o złym rokowaniu jest rak, w którym mediana czasu przeżycia wynosi 57 miesięcy, a przeżywalność pacjenta jest ponad 2-krotnie krótsza niż przeżywalność pacjenta z rakiem prostaty, u którego nie stwierdzono mutacji genu NSB1, przy czym rzeczona różnica przeżywalności występuje podczas stosowania u obydwu pacjentów tego samego standardowego postępowania klinicznego.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL401271A PL236986B1 (pl) | 2012-10-17 | 2012-10-17 | Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL401271A PL236986B1 (pl) | 2012-10-17 | 2012-10-17 | Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL401271A1 PL401271A1 (pl) | 2014-04-28 |
| PL236986B1 true PL236986B1 (pl) | 2021-03-08 |
Family
ID=50514932
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL401271A PL236986B1 (pl) | 2012-10-17 | 2012-10-17 | Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL236986B1 (pl) |
-
2012
- 2012-10-17 PL PL401271A patent/PL236986B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL401271A1 (pl) | 2014-04-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| NO324963B1 (no) | Fremgangsmate til deteksjon av Ki-ras mutasjoner og oligonukleotidprimer molekyl for anvendelse til deteksjonen. | |
| JP2017525977A (ja) | 細胞増殖性異常検出用または疾患程度等級付け用の遺伝子組成物およびその用途 | |
| Schumacher et al. | Detection of the c-kit D816V mutation in systemic mastocytosis by allele-specific PCR | |
| CN109234396B (zh) | 一种乳腺癌易感基因BRCA2位点 g.32336534T>C突变体及其应用 | |
| Yoo et al. | Analysis of fluorescence in situ hybridization, mtDNA quantification, and mtDNA sequence for the detection of early bladder cancer | |
| MX2014006186A (es) | Capacidad de respuesta a los inhibidores de la angiogenesis. | |
| PL236986B1 (pl) | Zastosowanie zmiany germinalnej 657del5 w obrębie genu NBS1 | |
| US9920376B2 (en) | Method for determining lymph node metastasis in cancer or risk thereof and rapid determination kit for the same | |
| PL201608B1 (pl) | Sposób i zestaw do wykrywania wysokiej genetycznie uwarunkowanej predyspozycji do raka prostaty oraz zastosowanie zmiany germinalnej w obrębie genu NBS1 | |
| KR101423745B1 (ko) | 류마티스 관절염 감수성 진단 방법 | |
| JP6644478B2 (ja) | チオプリン製剤による副作用の危険性の判定方法 | |
| CN105765077B (zh) | 测定抗甲状腺药物诱导的粒细胞缺乏症风险的检测方法以及测定用试剂盒 | |
| WO2011068610A1 (en) | Methods for detecting risk of myelodysplastic syndrome by genotypic analysis | |
| JP2019024455A (ja) | 結核菌遺伝系統特異的に結核症発症のリスクを判定する方法 | |
| PL244067B1 (pl) | Sposób wykrywania raka prostaty o złym rokowaniu | |
| PL236138B1 (pl) | Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka prostaty | |
| JP2025149412A (ja) | ヘリコバクター・シネディの検出方法、及びそれに用いるキット | |
| PL226331B1 (pl) | Sposób wykrywania genetycznie uwarunkowanej wysokiej predyspozycji do raka piersi oraz zastosowanie mutacji skracających białko CHEK2 | |
| Yi et al. | Prenatal Detection of Beta-Thalassemia CD17 (A→ T) Mutation by Polymerase Chain Reaction/Ligase Detection Reaction/Capillary Electrophoresis for Fetal DNA in Maternal Plasma–A Case Report | |
| JP4533978B2 (ja) | ウイルス感染のリスク評価方法 | |
| CZ2023403A3 (cs) | Sada primerů, diagnostický set, způsob detekce mutace V600E v genu BRAF a jejich použití | |
| KR20220093991A (ko) | ANK2 또는 EPAS1 유전자에서 CpG 부위의 메틸화 수준을 이용한 유방암 진단용 조성물, 키트, 및 이를 이용한 방법 | |
| Salie | Investigating candidate genes identified by genome-wide studies of granulomatous diseases in susceptibility to tuberculosis: ANXA11 and the CADM family | |
| Capelle et al. | The identification of host genetic polymorphisms for H. pyloriinfection: a genome wide association study | |
| 藤原亜紀 | Simultaneous Inactivation of the p16, p15, and p14 Genes Encoding Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors in Canine T-lymphoid tumor cells |