PL237228B1 - Nowy szczep bakterii Lactobacillus hilgardii FLUB oraz zastosowanie szczepu do wytwarzania mannitolu - Google Patents

Abstract

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep z gatunku Lactobacillus hilgardii FLUB zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2067p. Przedmiot wynalazku stanowi również zastosowanie szczepu Lactobacillus hilgardii FLUB do wytwarzania mannitolu.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep bakterii Lactobacillus hilgardii FLUB efektywnie wytwarzający mannitol.

Mannitol jest naturalnie występującym poliolem, szeroko wykorzystywanym w przemyśle farmaceutycznym, spożywczym i chemicznym.

Poliole znalazły swoje zastosowanie jako zamienniki cukru czyli słodziki. Mannitol jest słabo wchłaniany przez organizm ludzki, a zatem wzrost stężenia glukozy we krwi i zapotrzebowanie na insulinę są znacznie mniejsze niż po spożyciu sacharozy. Jest tylko częściowo wchłaniany (~ 25%) z jelita cienkiego i nie jest metabolizowany. Szacuje się że mannitol jest w połowie tak słodki jak sacharoza i ma pożądany efekt chłodzenia, który jest skuteczny w maskowaniu gorzkich smaków. Mannitol można mieszać z innymi składnikami i słodzikami, co może skutkować synergicznym efektem lepszej słodyczy i smaku. Ten alkohol cukrowy charakteryzuje się przyjemnym smakiem, stabilnością, nawet w wysokich temperaturach i wysoką temperaturą topnienia (165-169°C).

Jest używany jako środek teksturujący o słodkim smaku. Mannitol zmniejsza skłonność do krystalizacji produktów, wykazuje bardzo niską higroskopijność wydłuża przydatność produktu do spożycia. Najczęściej jest wykorzystywany jako składnik gum do żucia. Ponieważ mannitol nie jest higroskopijny, stosuje się go jako środek wypełniający dla bezcukrowych powłok gum do żucia lub jako powłokę pudrującą aby zapobiec przywieraniu gumy do urządzeń produkcyjnych czy opakowań.

Mannitol w przemyśle farmaceutycznym zapobiega wchłanianiu wilgoci z powietrza, wykazuje doskonałe właściwości mechaniczne takie jak ściśliwość, nie wchodzi w interakcje z aktywnymi składnikami, a jego słodki, chłodny smak maskuje nieprzyjemny smak wielu leków. Może być również stosowany jako silny diuretyk osmotyczny i jako przeciwutleniacz, niweluje działanie wolnych rodników i tym samym może chronić przed rozwojem raka okrężnicy. Wszystkie te właściwości mannitolu sprawiają, że jako dodatek do żywności zwiększa ich wartości odżywcze i prozdrowotne.

Mannitol na drodze chemicznej syntetyzowany jest przez katalityczne uwodornienie mieszaniny fruktozy i glukozy, w wysokiej temperaturze i ciśnieniu. W wyniku reakcji powstaje mieszanina mannitolu i sorbitolu, która musi zostać oczyszczona, co dodatkowo zwiększa cenę produktu końcowego. Wysokie koszty użytych substratów, warunków fizycznych reakcji i konieczność przeprowadzenia trudnego pr ocesu rozdziału mannitolu od sorbitolu sprawiają że wytwarzanie mannitolu drogą mikrobiologiczną stało się niezwykle atrakcyjne na skalę przemysłową.

W międzynarodowych patentach opisano szczepy z rodzaju Lactobacillus produkujące mannitol. Przykładami takich patentów są: JP6377091A (1991-03-06), EP19910119453 (1991-11-14), US

6,855,526 B2 (2005-02-15), CN 201310111633 (2013-04-01), PCT/CN2014/090476 (2014-11-06).

Znanych jest wiele mikroorganizmów zdolnych do wytwarzania mannitolu. Publikacja amerykańskiego zgłoszenia patentowego o numerze US2009023195 (A1) dotyczy biotechnologicznego wykorzystania szczepów pochodzących z amerykańskiej kolekcji ARS (NRRL) wśród których wybrano Lb. intermedius NRRL B-30560 efektywnie produkujący mannitol. Pierwszorzędowy substrat węglowy zarówno w przemianach fermentacyjnych, jak i biochemicznych stanowi fruktoza, ale wtórnym źródłem węgla może być też glukoza, maltoza, mannoza i galaktoza.

Natomiast z literatury przedmiotu znane są wytwarzające mannitol szczepy: Lb. hilgardii NRRL B-1843 oraz Lb. intermedius NRRL B-3693 (Arena, M. E., Landete, J. M., Manca de Nadra, M. C., Pardo, I., & Ferrer, S. (2008). Factors affecting the production of putrescine from agmatine by Lactobacillus hilgardii XIB isolated from wine. Journal of applied microbiology, 105(1), 158-165.)

Celem wynalazku było wyizolowanie z miodu pitnego - środowiska bogatego we fruktozę i inne cukry takie jak glukoza, sacharoza i maltoza, nowego szczepu bakterii, który bez modyfikacji genetycznych będzie efektywnie wytwarzał mannitol na zewnątrz komórki.

Przedmiotem wynalazku jest nowy szczep z gatunku Lactobacillus hilgardii FLUB zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2067p.

Przedmiot wynalazku stanowi również zastosowanie szczepu Lactobacillus hilgardii FLUB do wytwarzania mannitolu.

Korzystnie, do wytwarzania mannitolu, jako jedyne źródło węgla stosuje się fruktozę.

Korzystnie, jako źródło węgla stosuje się fruktozę i glukozę.

Korzystnie, dodatek każdego z cukrów fruktozy i glukozy w podłożu hodowlanym wynosi po 4% w/v.

Korzystnie, jako jedyne źródło węgla stosuje się syrop glukozowo-fruktozowy.

PL 237 228 Β1

Przykład 1

Identyfikacja szczepu

W celu identyfikacji nowego izolatu wykorzystano technikę MALDI-TOF program BioTyper zakwalifikował go jako Lactobacillus hilgardii z wynikiem 2,03 co pozwala na pewną identyfikację do rodzaju i prawdopodobne przypisanie do gatunku. Dodatkowo wykonano amplifikację i sekwencjonowanie genu 16S rRNA. Przyrównanie sekwencji genu do bazy NCBI GeneBank wykazuje 100% zgodność badanego szczepu z zamieszczonymi tam sekwencjami gatunku Lb. hilgardii.

Wyniki sekwencjonowania fragmentu 16S rRNA, określonego niniejszym wynalazkiem szczepu Lactobacillus hilgardii FLUB przedstawiają się następująco:

TGCAAGTCGAACGCGTCTTGGTCAATGAAGTTGAGTGCTTGCATTTAACT

GATTTGACATTAAGACGAGTGGCGAACTGGTGAGTAACACGTGGGTAAC

TTGCCCCGAAGCGGGGGATAACATTTGGAAACAGGTGCTAATACCGCAT

AACAACAAAAACCACATGGTTTTTGTTTAAAAGATGGTTTCGGCTATCAC

TTTGGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCAC

CAAGGCAATGATACGTAGCCGACCTGAGAGGGTAATCGGCCACATTGGG

ACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTC

CACAATGGACGAAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGG

TTTCGGCTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAACGGGTGTCAGAGTAAC

TGTTGACATCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGC

CAGCAGCCGCGGTAATCGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTATTGGGC

GTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAGGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCT

TAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACCGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGG

ACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAA

CACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGGCTCG

AAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTA

AACGATGAGTGCTAAGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCTGCAGCT

AACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTC

AAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATT

CGATGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTCTGCTAACCTA

AGAGATTAGGCGTTCCCTTCGGGGACGGAATGACAGGTGGTGCATGGTT

GTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCA

ACCCTTATTGTCAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTGGCGAGACTGC

CGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCC

TTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGC

GAAACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCGTTCTCAGTTCGGATTG

TAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGTTGGAATCGCTAGTAATCGTGGATC

AGCATGCCACGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCAC

ACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGCCGGTGAGGTAACCTTCGGGGGC

CAGCC

PL 237 228 Β1

Opisywany szczep Lactobacillus hilgardii FLUB charakteryzuje się następującymi cechami morfologicznymi:

bakterie Gram-dodatnie, nie wytwarzające przetrwalników, mają postać pałeczek występujących pojedynczo lub połączonych w łańcuszki, co przedstawia Fig. 1 (Mikrofotografia komórek Lb. hilgardii FLUB ze skaningowego mikroskopu elektronowego, powiększenie 15 000.) na załączonym rysunku, wykazują wzrost w warunkach beztlenowych i względnie tlenowych, na pożywce MRS (de Man, Ragosa i Sharpe) z agarem. Kolonie są średniej wielkości o średnicy około 1-3 mm, o okrągłym regularnym kształcie. Profil kolonii jest lekko wypukły, o gładkim regularnym brzegu. Kolonia jest nieprzejrzysta, matowa, białego-kremowego koloru. Struktura kolonii jest mazisto-kremowa, po rozmazaniu ciągnąca się, w wodzie czy pożywce łatwo tworzą zawiesinę homogenną. Zapach wydzielany przez kolonie jest wyczuwalny i wyrazisty, charakterystyczny dla fermentacji z dodatkiem etanolu. Wszystkie opisane cechy sprawiają że kolonie tworzone przez szczep Lb. hilgardii FLUB są typu S.

Szczep Lb. hilgardii FLUB izolowany z miodu pitnego znacznie odbiega od szczepów Lb. hilgardii izolowanych z wina, pod względem preferencji wzrostowych. Szczep izolowany z miodu pitnego potrafi rosnąć i namnażać się w wyższych stężeniach cukru. Fig. 1 przedstawia wzrost obu szczepów na pożywkach z 15% i 25% zawartością glukozy, Lb. hilgardii wykazuje wzrost aż do 25% stężenia cukru w pożywce.

Wykorzystanie węglowodanów przez szczep Lb. hilgardii FLUB zostało określone za pomocą Hi-Carbo Kit (HiMedia, Mumbai, Indie). Szczep wykorzystuje fruktozę, L-arabinozę i D-arabinozę, eskulinę oraz malonian. Pozostałe wyniki zamieszczono w tabeli 1.

Tabela 1. Wykorzystanie węglowodanów

Węglowodan	Wynik	Węglowodan	Wynik
laktoza	•	inozytol	-
ksyloza	+	sorbitol	-
maltoza	+	man n i to I	-
fruktoza	+	adonitol	-
dekstroza	-	arabitol	-
galaktoza	+	erytrytol	-
rafinoza	-	alfa-metylo-D-g lu kozyd	-
trehaloza	-	rammnoza	-
melibioza	-	celobioza	-
sacharoza	-	melezitoza	-
L-arabinoza	+	alfa-metylo-D-mannozyd	-
mannoza	-	ksyiitol	-
inulina	-	ONPG	-
glukonian sodu	-	eskulina	+
glicerol	-	D-arabinoza	-
salicyna	-	cytrynian	-
dulcytol	-	malonian	+

W celu identyfikacji wykonano także testy API-ZYM (bioMerieux SA, Marcy l'Etoile, Francja). Zestawienie wyników zostało umieszczone w tabeli 2.

PL 237 228 Β1

Tabela 2. Profil enzymatyczny

Lp.	Enzym	Substrat	pH	Wynik
1.	kontrola	-		-
2.	fosfataza alkaliczna	2-naftylo-fosforan	8,5	-
3.	esteraza (C 4)	2-naftylo-maślan	6,5	+
4.	esteraza Lipaza (C 8)	2-naftylo-kaprylan	7,5	+
5.	lipaza (C 14)	2-naftylo-mirystynian	7,5	+
6.	arylamidaza leucyny	L-leucy lo-2-naftylamid	7,5	+
7.	arylamidaza waliny	L-wal il ο-2-nafty 1 amid	7,5	+
8.	arylamidaza cystyny	L-cy sty lo-2-nafty lam id	7,5	+
9.	trypsyna	N-benzoilo-DL-arginino-2-naftylamid	8,5	-
10.	a-chymotrypsyna	N-glutarylo-fenyloalanin ο-2-naftylamid	7,5	-
11.	fosfataza kwaśna	2-nafty lo-fosforan	5,4	+
12.	fosfohydrolaza naftylo-AS-Bl	Naftylo-AS-BI-fosforan	5,4	+
13.	a-galaktozydaza	6-Br-2-naftylo-aD-ga!aktopiranozyd	5,4	+
14.	β-galaktozydaza	2-naftylo-3D-galaktopiranozyd	5,4	+
15.	β-glukuronidaza	Nafty lo-AS-Bl-pD-glukuronid	5,4	+
16.	a-glukozydaza	2-naftylo-aD-glukopiranozyd	5,4	+
17.	β-glukozydaza	6-Br-2-naftylo-PD-glukopiranozyd	5,4	+
18.	N -acety Ιο-β-glukozam in idaza	1 -naftylo-N-acetyl-pD-glukozamintd	5,4	-
19.	a-mannozydaza	6-Br-2-nafty lo-aD-mannop i ranozyd	5,4	-
20.	β-fukozydaza	2-nafty lo-aL-fukop iranozy d	5,4	-

Wyizolowany z miodu pitnego, nowy szczep Lb. hilgardii FLUB charakteryzuje się osmotolerancją, wykazuje odporność na wysokie ciśnienie osmotyczne, wywołane wysokim stężeniem cukrów w środowisku jego występowania, co przedstawiono na Fig. 2. Może mieć to istotne znaczenie w przemysłowej produkcji mannitolu z wykorzystaniem opisywanego szczepu Lb. hilgardii FLUB. W badaniach jako szczepów kontrolnych użyto Lb. hilgardii NRRL B-1843 oraz Lb. intermedius NRRL B-3693. (Arena et al. 2008, Carvalheiro et al. 2011).

Wyizolowany z miodu pitnego Lb. hilgardii FLUB wytwarza najwięcej mannitolu, na pożywce z glukozą i fruktozą (8% w/v, w stosunku 1:1). Po 7 dniach hodowli oznaczono w podłożu hodowlanym obecność mannitolu na poziomie 4,942% dla Lb. hilgardii FLUB, 4,295 dla Lb. hilgardii NRRL, oraz 1,63% dla Lb. Lb. intermedius NRRL. Po piątym dniu ilość mannitolu zaczyna spadać w przypadku Lb. intermedius NRRL. W przeciwieństwie do Lb. intermedius NRRL, gatunek Lb. hilgardii wtórnie nie metabolizował wytworzonego mannitolu, jako źródła węgla, co poza zdolnością efektywnej produkcji, jest cechą pożądaną. Stwierdzono również, że Lb. hilgardii FLUB w odróżnieniu od Lb. hilgardii NRRL B-1843 wykazuje zdolność do efektywnej biosyntezy mannitolu z fruktozy, gdy jest ona jedynym źródłem węgla w pożywce. W przypadku produkcji mannitolu z użyciem Lb. hilgardii FLUB na pożywce z fruktozą, procentowa zawartość tego poliolu była o ponad 100% wyższa niż w badanych szczepach kontrolnych Lb. hilgardii NRRL B-1843 i Lb. intermedius NRRL. W przypadku użycia pożywki 8% fruktozy, zaobserwowano generalnie mniejsze ilości wytwarzanego mannitolu niż z użyciem pożywki z mieszaniną cukrów 4% glukozy i 4% fruktozy. Jako że mannitol syntezowany jest z fruktozy za pomocą enzymu dehydrogenazy mannitolu, komórki wszystkich wykorzystanych w tym badaniu gatunków wykorzystują glukozę na potrzeby metaboliczne, zaś fruktozę konwertują do mannitolu. W badaniu sprawdzono także produkcję mannitolu na tanim źródle cukrów jakim jest syrop glukozowo-fruktozowy. Tutaj także Lb. hilgardii FLUB wytwarza większe ilości mannitolu w 7 dobie 0,25%, natomiast Lb. hilgardii NRRL, w 7 dobie 0,19%. Lb. intermedius NRRL nie wytwarzał mannitolu na tym źródle węgla. Może być to spowodowane faktem iż syrop glukozowo-fruktozowy jest mieszaniną różnych cukrów nie tylko glukozy i fruktozy, co może powodować zbyt wysokie stężenie osmotyczne dla Lb. intermedius NRRL, lub obecność innych cukrów przekierowuje ten gatunek na inne szlaki metaboliczne. Jednakże wyniki wykonanych badań potwierdziły wyższą efektywność wytwarzania mannitolu przez opisywany szczep Lb. hilgardii FLUB po 7 dniach niż u pozostałych Lb. hilgardii NRRL iLb. intermedius NRRL. Wwykonanych analizach widoczne jest większe powinowactwo do fruktozy u Lb. hilgardii FLUB, co spowodowane jest przystosowaniem się do

PL 237 228 Β1 środowiska w którym żyje. Miód pitny z którego został wyizolowany, jest niekorzystnym środowiskiem ze względu na alkohol, czy wysokie stężenia cukrów, dlatego szczep Lb. hilgardii FLUB wykształcił odpowiednie mechanizmy aby przejąć tę niszę ekologiczną. Jego przystosowanie do środowiska bogatego w cukry, a w szczególności w fruktozę, spowodowało to, że jest on doskonałym producentem mannitolu.

Przykład 2

Wytwarzanie mannitolu z fruktozy przez szczep Lb. hilgardii FLUB

Kolby z pożywką MRS zaszczepiono 2% inokulum. Hodowle założono na podłożu hodowlanym z dodatkiem fruktozy 8% (w/v). Hodowle prowadzono przez 7 dni w temperaturze 30°C, z wytrząsaniem 150 rpm (Minitron Incubator Shaker Infors AG, Szwajcaria). Codziennie pobierano próbki hodowli i po odwirowaniu biomasy czysty płyn pohodowlany przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych analiz. Procentową zawartość mannitolu określono za pomocą HPLC (Gilson Medical Electronics, Villiers-le-Bel, Francja). Próbki wcześniej oczyszczono z białek za pomocą odczynnika Carreza III. Stężenie mannitolu odczytano z chromatogramów z wykorzystaniem oprogramowania CHROMAX (POL-LAB). Procentową ilość wytworzonego przez badane szczepy mannitolu w każdym dniu hodowli przedstawiono w Tabeli 3 z uwzględnieniem wydajności procesu biosyntezy oraz na wykresie przedstawionym na Fig. 3.

Tabela 3

dni	Mannitol w pożywce [%]
Lactobacillus hilgardii FLUB	Lactobacillus hilgardii NRRL	Lactobacillus intermedius NRRL
I	0,253	0,230	0,284
II	0,369	0,258	0,325
III	0,556	0,233	0,544
IV	1,673	0,928	0,963
V	1,993	1,112	3,010
VI	2,786	1,329	1,887
VI]	3,698	1,604	1,351

Przykład 3

Wytwarzanie mannitolu z glukozy i fruktozy przez szczep Lb. hilgardii FLUB

Kolby z pożywką MRS zaszczepiono 2% inokulum. Hodowle założono na podłożu hodowlanym z dodatkiem glukozy i fruktozy po 4% w/v każdego cukru. Hodowle prowadzono przez 7 dni w temperaturze 30°C, z wytrząsaniem 150 rpm (Minitron Incubator Shaker Infors AG, Szwajcaria). Codziennie pobierano próbki hodowli i po odwirowaniu biomasy czysty płyn pohodowlany przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych analiz. Procentową zawartość mannitolu określono za pomocą HPLC (Gilson Medical Electronics, Villiers-le-Bel, Francja). Próbki wcześniej oczyszczono z białek za pomocą odczynnika Carreza I II. Stężenie mannitolu odczytano z chromatogramów z wykorzystaniem oprogramowania CHROMAX (POL-LAB). Procentową ilość wytworzonego przez badane szczepy mannitolu w każdym dniu hodowli przedstawiono w Tabeli 4 z uwzględnieniem wydajności procesu biosyntezy oraz na wykresie przedstawionym na Fig. 4.

Tabela 4

dni	Mannitol w pożywce [%
Lactobacillus hilgardii FLUB	Lactobacillus hilgardii NRRL	Lactobacillus intermedius NRRL
I	0,152	0,181	0,147
II	0,309	0,223	0,284
III	0,506	0,379	0,515
IV	1,933	1,496	1,356
V	2,205	1,962	3,549
VI	3,099	3,120	2,090
VII	4,942	4,295	1,630

PL 237 228 Β1

Przykład 4

Wytwarzanie mannitolu przez Lb. hilgardii FLUB z wykorzystaniem syropu glukozowo-fruktozowego

Kolby z pożywką MRS zaszczepiono 2% inokulum. Hodowle założono na podłożu, gdzie jedynym źródłem węgla był syrop glukozowo-fruktozowy 8% (w/v). Hodowle prowadzono przez 7 dni w temperaturze 30°C, z wytrząsaniem 150 rpm (Minitron Incubator Shaker Infors AG, Szwajcaria). Po 4 i 7 dobie pobierano próbki hodowli i po odwirowaniu biomasy czysty płyn pohodowlany przechowywano w temperaturze -20°C do dalszych analiz. Procentową zawartość mannitolu określono za pomocą HPLC (Gilson Medical Electronics, Villiers-le-Bel, Francja). Próbki wcześniej oczyszczono z białek za pomocą odczynnika Carreza liii. Stężenie mannitolu odczytano z chromatogramów z wykorzystaniem oprogramowania CHROMAX (POL-LAB). Procentową ilość wytworzonego przez badane szczepy mannitolu w każdym dniu hodowli przedstawiono w Tabeli 5 z uwzględnieniem wydajności procesu biosyntezy oraz na wykresie przedstawionym na Fig. 5.

Tabela 5

Dni	Mannitol w	bOżywce [%]
Lactobacillus hilgardii FLUB	Laciobacillus hilgardii NRRL
]	0,082	0,055
U	0,124	0,098
III	0,153	0,149
JV	0,186	0,188
V	0,192	0,189
V!	O,22i	0,191
VII	0,249	0,194

Zastrzeżenia patentowe

Claims (6)

1. Nowy szczep bakterii Lactobacillus hilgardii FLUB zdeponowany w Międzynarodowej Kolekcji Kultur Drobnoustrojów Przemysłowych Instytutu Biotechnologii Przemysłu Rolno-Spożywczego w Warszawie pod numerem KKP 2067p.

2. Zastosowanie szczepu jak określono w zastrz. 1 do wytwarzania mannitolu,

3. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako jedyne źródło węgla stosuje się fruktozę.

4. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako źródło węgla stosuje się fruktozę i glukozę.

5. Zastosowanie według zastrz. 4, znamienne tym, że dodatek każdego z cukrów fruktozy i glukozy w podłożu hodowlanym wynosi po 4% w/v.

6. Zastosowanie według zastrz. 2, znamienne tym, że jako jedyne źródło węgla stosuje się syrop glukozowo-fruktozowy.