PL237242B1 - Peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w procesie regeneracji tkanki złożonej i gojenia się ran u ssaków - Google Patents
Peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w procesie regeneracji tkanki złożonej i gojenia się ran u ssaków Download PDFInfo
- Publication number
- PL237242B1 PL237242B1 PL425351A PL42535118A PL237242B1 PL 237242 B1 PL237242 B1 PL 237242B1 PL 425351 A PL425351 A PL 425351A PL 42535118 A PL42535118 A PL 42535118A PL 237242 B1 PL237242 B1 PL 237242B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- peptide
- cells
- mice
- regeneration
- tissue
- Prior art date
Links
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims description 106
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 title claims description 27
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 title claims description 27
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 title claims description 25
- 206010052428 Wound Diseases 0.000 title claims description 18
- 230000000638 stimulation Effects 0.000 title description 18
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title description 4
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 31
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 11
- 230000035876 healing Effects 0.000 claims description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 7
- 239000002131 composite material Substances 0.000 claims description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 claims description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 claims description 4
- 230000001575 pathological effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 4
- 230000005855 radiation Effects 0.000 claims description 4
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 claims description 3
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 55
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 44
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 34
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 32
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 24
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 23
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 22
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 21
- 210000002510 keratinocyte Anatomy 0.000 description 20
- 230000008569 process Effects 0.000 description 18
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 17
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 17
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 16
- 230000029663 wound healing Effects 0.000 description 16
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 15
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 15
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 14
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 13
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 11
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 10
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 10
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 10
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 10
- 238000011160 research Methods 0.000 description 10
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 9
- 229920006008 lipopolysaccharide Polymers 0.000 description 9
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 9
- 210000003819 peripheral blood mononuclear cell Anatomy 0.000 description 9
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA) Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C JGFZNNIVVJXRND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 230000001684 chronic effect Effects 0.000 description 8
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 8
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 8
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 8
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 7
- 238000010171 animal model Methods 0.000 description 7
- 230000008439 repair process Effects 0.000 description 7
- 210000002615 epidermis Anatomy 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 6
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 6
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 6
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 5
- -1 Boc Chemical class 0.000 description 5
- 102000000578 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Human genes 0.000 description 5
- 108010016788 Cyclin-Dependent Kinase Inhibitor p21 Proteins 0.000 description 5
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 101001094700 Homo sapiens POU domain, class 5, transcription factor 1 Proteins 0.000 description 5
- 102100035423 POU domain, class 5, transcription factor 1 Human genes 0.000 description 5
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 5
- 210000003651 basophil Anatomy 0.000 description 5
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 5
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 5
- BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N Aspirin Chemical compound CC(=O)OC1=CC=CC=C1C(O)=O BSYNRYMUTXBXSQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 102100025137 Early activation antigen CD69 Human genes 0.000 description 4
- 102000006354 HLA-DR Antigens Human genes 0.000 description 4
- 108010058597 HLA-DR Antigens Proteins 0.000 description 4
- 101000934374 Homo sapiens Early activation antigen CD69 Proteins 0.000 description 4
- 101001057504 Homo sapiens Interferon-stimulated gene 20 kDa protein Proteins 0.000 description 4
- 101001055144 Homo sapiens Interleukin-2 receptor subunit alpha Proteins 0.000 description 4
- 101000835093 Homo sapiens Transferrin receptor protein 1 Proteins 0.000 description 4
- 102100026878 Interleukin-2 receptor subunit alpha Human genes 0.000 description 4
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 4
- MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N Nitric oxide Chemical compound O=[N] MWUXSHHQAYIFBG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N Piperidine Chemical compound C1CCNCC1 NQRYJNQNLNOLGT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010087999 Steryl-Sulfatase Proteins 0.000 description 4
- 102100026144 Transferrin receptor protein 1 Human genes 0.000 description 4
- 108010078814 Tumor Suppressor Protein p53 Proteins 0.000 description 4
- 102000015098 Tumor Suppressor Protein p53 Human genes 0.000 description 4
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 4
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 4
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 4
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 4
- 210000005069 ears Anatomy 0.000 description 4
- 230000006870 function Effects 0.000 description 4
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 4
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 4
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 4
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 4
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 4
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 4
- NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M potassium iodide Substances [K+].[I-] NLKNQRATVPKPDG-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 4
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 4
- 230000004044 response Effects 0.000 description 4
- 231100000241 scar Toxicity 0.000 description 4
- 210000000130 stem cell Anatomy 0.000 description 4
- 230000017423 tissue regeneration Effects 0.000 description 4
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 4
- 125000003088 (fluoren-9-ylmethoxy)carbonyl group Chemical group 0.000 description 3
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 3
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 102000008186 Collagen Human genes 0.000 description 3
- 108010035532 Collagen Proteins 0.000 description 3
- 102000016942 Elastin Human genes 0.000 description 3
- 108010014258 Elastin Proteins 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 3
- 206010061218 Inflammation Diseases 0.000 description 3
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 3
- 238000000585 Mann–Whitney U test Methods 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N N-formyl-methionyl-leucyl-phenylalanin Chemical compound CSCCC(NC=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 PRQROPMIIGLWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 208000012868 Overgrowth Diseases 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 3
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 3
- KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N [(8r,9s,10r,13s,14s,17r)-17-acetyl-6-formyl-3-methoxy-10,13-dimethyl-1,2,7,8,9,11,12,14,15,16-decahydrocyclopenta[a]phenanthren-17-yl] acetate Chemical compound C1C[C@@H]2[C@](CCC(OC)=C3)(C)C3=C(C=O)C[C@H]2[C@@H]2CC[C@](OC(C)=O)(C(C)=O)[C@]21C KPFBUSLHFFWMAI-HYRPPVSQSA-N 0.000 description 3
- 229960001138 acetylsalicylic acid Drugs 0.000 description 3
- 239000013543 active substance Substances 0.000 description 3
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 3
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 3
- 230000033228 biological regulation Effects 0.000 description 3
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 3
- 230000009087 cell motility Effects 0.000 description 3
- 230000008859 change Effects 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 229920001436 collagen Polymers 0.000 description 3
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 3
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 3
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 3
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 3
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000002500 effect on skin Effects 0.000 description 3
- 229920002549 elastin Polymers 0.000 description 3
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 230000004054 inflammatory process Effects 0.000 description 3
- 210000000822 natural killer cell Anatomy 0.000 description 3
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 3
- 230000022983 regulation of cell cycle Effects 0.000 description 3
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 3
- 108010018091 rusalatide acetate Proteins 0.000 description 3
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 3
- 230000004936 stimulating effect Effects 0.000 description 3
- 210000000434 stratum corneum Anatomy 0.000 description 3
- 125000000999 tert-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 108010015893 thymohexin Proteins 0.000 description 3
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 3
- HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N (2s)-5-[[amino-[(2,2,4,6,7-pentamethyl-3h-1-benzofuran-5-yl)sulfonylamino]methylidene]amino]-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)pentanoic acid Chemical compound C12=CC=CC=C2C2=CC=CC=C2C1COC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)NS(=O)(=O)C1=C(C)C(C)=C2OC(C)(C)CC2=C1C HNICLNKVURBTKV-NDEPHWFRSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 101000728679 Homo sapiens Apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD Proteins 0.000 description 2
- 101000661600 Homo sapiens Steryl-sulfatase Proteins 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- 102000043276 Oncogene Human genes 0.000 description 2
- 108700020796 Oncogene Proteins 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000025865 Ulcer Diseases 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 210000000577 adipose tissue Anatomy 0.000 description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 2
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 2
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 2
- 210000000845 cartilage Anatomy 0.000 description 2
- 230000020411 cell activation Effects 0.000 description 2
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 2
- 230000012292 cell migration Effects 0.000 description 2
- 230000004663 cell proliferation Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 230000035605 chemotaxis Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- AHMIRVCNZZUANP-LPBAWZRYSA-N chrysalin Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C1=CC=CC=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C1=CC=CC=C1.C([C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(N)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)N)C1=CC=CC=C1 AHMIRVCNZZUANP-LPBAWZRYSA-N 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 210000002808 connective tissue Anatomy 0.000 description 2
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 2
- 230000007547 defect Effects 0.000 description 2
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 2
- 230000009274 differential gene expression Effects 0.000 description 2
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 2
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 2
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 230000013020 embryo development Effects 0.000 description 2
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 2
- 210000003714 granulocyte Anatomy 0.000 description 2
- 102000050702 human PYCARD Human genes 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 239000002955 immunomodulating agent Substances 0.000 description 2
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 2
- 208000028867 ischemia Diseases 0.000 description 2
- 238000004895 liquid chromatography mass spectrometry Methods 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000001819 mass spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000010534 mechanism of action Effects 0.000 description 2
- 210000000440 neutrophil Anatomy 0.000 description 2
- 230000000144 pharmacologic effect Effects 0.000 description 2
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 2
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000009719 regenerative response Effects 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 230000036560 skin regeneration Effects 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 description 2
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 2
- 230000001960 triggered effect Effects 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-[4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]phenyl]propanoic acid Chemical compound C1=CC(OC(C)(C)C)=CC=C1C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)OCC1C2=CC=CC=C2C2=CC=CC=C21 JAUKCFULLJFBFN-VWLOTQADSA-N 0.000 description 1
- UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-3-methylbutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UGNIYGNGCNXHTR-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-4-[(2-methylpropan-2-yl)oxy]-4-oxobutanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 FODJWPHPWBKDON-IBGZPJMESA-N 0.000 description 1
- UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N (2s)-2-(9h-fluoren-9-ylmethoxycarbonylamino)-6-[(2-methylpropan-2-yl)oxycarbonylamino]hexanoic acid Chemical compound C1=CC=C2C(COC(=O)N[C@@H](CCCCNC(=O)OC(C)(C)C)C(O)=O)C3=CC=CC=C3C2=C1 UMRUUWFGLGNQLI-QFIPXVFZSA-N 0.000 description 1
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- 201000001320 Atherosclerosis Diseases 0.000 description 1
- 208000035143 Bacterial infection Diseases 0.000 description 1
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 1
- 206010006500 Brucellosis Diseases 0.000 description 1
- 102100024167 C-C chemokine receptor type 3 Human genes 0.000 description 1
- 101710149862 C-C chemokine receptor type 3 Proteins 0.000 description 1
- 238000011746 C57BL/6J (JAX™ mouse strain) Methods 0.000 description 1
- 102100025222 CD63 antigen Human genes 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 208000009043 Chemical Burns Diseases 0.000 description 1
- 208000032544 Cicatrix Diseases 0.000 description 1
- 206010009900 Colitis ulcerative Diseases 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010014666 Endocarditis bacterial Diseases 0.000 description 1
- 206010063560 Excessive granulation tissue Diseases 0.000 description 1
- 102000010834 Extracellular Matrix Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010037362 Extracellular Matrix Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229940123457 Free radical scavenger Drugs 0.000 description 1
- 208000001034 Frostbite Diseases 0.000 description 1
- 208000018522 Gastrointestinal disease Diseases 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000009465 Growth Factor Receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010009202 Growth Factor Receptors Proteins 0.000 description 1
- 208000006968 Helminthiasis Diseases 0.000 description 1
- HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N Heparin Chemical compound OC1C(NC(=O)C)C(O)OC(COS(O)(=O)=O)C1OC1C(OS(O)(=O)=O)C(O)C(OC2C(C(OS(O)(=O)=O)C(OC3C(C(O)C(O)C(O3)C(O)=O)OS(O)(=O)=O)C(CO)O2)NS(O)(=O)=O)C(C(O)=O)O1 HTTJABKRGRZYRN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 1
- 101000934368 Homo sapiens CD63 antigen Proteins 0.000 description 1
- 101000917858 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-A Proteins 0.000 description 1
- 101000917839 Homo sapiens Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Proteins 0.000 description 1
- 101000581981 Homo sapiens Neural cell adhesion molecule 1 Proteins 0.000 description 1
- 101000897042 Homo sapiens Nucleotide pyrophosphatase Proteins 0.000 description 1
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 1
- 108010058683 Immobilized Proteins Proteins 0.000 description 1
- 206010023330 Keloid scar Diseases 0.000 description 1
- 102100023981 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Human genes 0.000 description 1
- 101710163560 Lamina-associated polypeptide 2, isoform alpha Proteins 0.000 description 1
- 101710189385 Lamina-associated polypeptide 2, isoforms beta/gamma Proteins 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100029185 Low affinity immunoglobulin gamma Fc region receptor III-B Human genes 0.000 description 1
- 102000005741 Metalloproteases Human genes 0.000 description 1
- 108010006035 Metalloproteases Proteins 0.000 description 1
- 108010008211 N-Formylmethionine Leucyl-Phenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 102100027347 Neural cell adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 102100021969 Nucleotide pyrophosphatase Human genes 0.000 description 1
- 208000005775 Parakeratosis Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- 201000004681 Psoriasis Diseases 0.000 description 1
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 1
- 206010063562 Radiation skin injury Diseases 0.000 description 1
- 208000028990 Skin injury Diseases 0.000 description 1
- 206010072170 Skin wound Diseases 0.000 description 1
- 208000007107 Stomach Ulcer Diseases 0.000 description 1
- 241000270505 Teiidae Species 0.000 description 1
- 206010053615 Thermal burn Diseases 0.000 description 1
- 239000000898 Thymopoietin Substances 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 241000378605 Tylototriton verrucosus Species 0.000 description 1
- 201000006704 Ulcerative Colitis Diseases 0.000 description 1
- 238000005411 Van der Waals force Methods 0.000 description 1
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000010933 acylation Effects 0.000 description 1
- 238000005917 acylation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- 230000002009 allergenic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000012538 ammonium bicarbonate Nutrition 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 1
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 1
- 125000000637 arginyl group Chemical group N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)* 0.000 description 1
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 208000009361 bacterial endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 208000022362 bacterial infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 210000004082 barrier epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000037365 barrier function of the epidermis Effects 0.000 description 1
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 239000003124 biologic agent Substances 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 239000003181 biological factor Substances 0.000 description 1
- 210000004204 blood vessel Anatomy 0.000 description 1
- 230000009045 body homeostasis Effects 0.000 description 1
- 239000012888 bovine serum Substances 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 238000004422 calculation algorithm Methods 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000013043 chemical agent Substances 0.000 description 1
- 208000037976 chronic inflammation Diseases 0.000 description 1
- 230000006020 chronic inflammation Effects 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002016 colloidosmotic effect Effects 0.000 description 1
- 210000004087 cornea Anatomy 0.000 description 1
- 238000002316 cosmetic surgery Methods 0.000 description 1
- 239000006071 cream Substances 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N dcm dichloromethane Chemical compound ClCCl.ClCCl DEZRYPDIMOWBDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000007123 defense Effects 0.000 description 1
- 230000008260 defense mechanism Effects 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001934 delay Effects 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 210000004443 dendritic cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 210000002249 digestive system Anatomy 0.000 description 1
- UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N dimethylformamide dmf Chemical compound CN(C)C=O.CN(C)C=O UXGNZZKBCMGWAZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010013023 diphtheria Diseases 0.000 description 1
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 1
- 229940126534 drug product Drugs 0.000 description 1
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 description 1
- 210000002889 endothelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000010595 endothelial cell migration Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 230000004890 epithelial barrier function Effects 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- OLAMWIPURJGSKE-UHFFFAOYSA-N et2o diethylether Chemical compound CCOCC.CCOCC OLAMWIPURJGSKE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002744 extracellular matrix Anatomy 0.000 description 1
- 210000001723 extracellular space Anatomy 0.000 description 1
- 230000004136 fatty acid synthesis Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 1
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 1
- 235000021588 free fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 238000010230 functional analysis Methods 0.000 description 1
- 201000005917 gastric ulcer Diseases 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 210000001126 granulation tissue Anatomy 0.000 description 1
- 229910001385 heavy metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960002897 heparin Drugs 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 210000003630 histaminocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 150000004680 hydrogen peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001969 hypertrophic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005934 immune activation Effects 0.000 description 1
- 230000002584 immunomodulator Effects 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010874 in vitro model Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 201000007119 infective endocarditis Diseases 0.000 description 1
- 230000028709 inflammatory response Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000015788 innate immune response Effects 0.000 description 1
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 1
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000011835 investigation Methods 0.000 description 1
- 230000002427 irreversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- SIXIIKVOZAGHPV-UHFFFAOYSA-N lansoprazole Chemical compound CC1=C(OCC(F)(F)F)C=CN=C1CS(=O)C1=NC2=CC=C[CH]C2=N1 SIXIIKVOZAGHPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960003174 lansoprazole Drugs 0.000 description 1
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000012792 lyophilization process Methods 0.000 description 1
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 1
- 210000002540 macrophage Anatomy 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N meoh methanol Chemical compound OC.OC COTNUBDHGSIOTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000002901 mesenchymal stem cell Anatomy 0.000 description 1
- 244000000010 microbial pathogen Species 0.000 description 1
- 238000010232 migration assay Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 239000002808 molecular sieve Substances 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N n-ethyl-n-propan-2-ylpropan-2-amine Chemical compound CCN(C(C)C)C(C)C.CCN(C(C)C)C(C)C WOOWBQQQJXZGIE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000005170 neoplastic cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000065 noncytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002020 noncytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N octafluoropropane Chemical compound FC(F)(F)C(F)(F)C(F)(F)F QYSGYZVSCZSLHT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010033675 panniculitis Diseases 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 210000000578 peripheral nerve Anatomy 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000023603 positive regulation of transcription initiation, DNA-dependent Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 230000002046 pro-migratory effect Effects 0.000 description 1
- 229940002612 prodrug Drugs 0.000 description 1
- 239000000651 prodrug Substances 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 239000002516 radical scavenger Substances 0.000 description 1
- 150000003254 radicals Chemical class 0.000 description 1
- 238000007634 remodeling Methods 0.000 description 1
- 230000008521 reorganization Effects 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 210000001525 retina Anatomy 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000036573 scar formation Effects 0.000 description 1
- 230000037387 scars Effects 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000004904 shortening Methods 0.000 description 1
- URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N sodium aluminosilicate Chemical compound [Na+].[Al+3].[O-][Si]([O-])=O.[O-][Si]([O-])=O URGAHOPLAPQHLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000278 spinal cord Anatomy 0.000 description 1
- 239000000021 stimulant Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 1
- 210000004003 subcutaneous fat Anatomy 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 238000009120 supportive therapy Methods 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000012353 t test Methods 0.000 description 1
- 210000002435 tendon Anatomy 0.000 description 1
- 125000004213 tert-butoxy group Chemical group [H]C([H])([H])C(O*)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005931 tert-butyloxycarbonyl group Chemical group [H]C([H])([H])C(OC(*)=O)(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001541 thymus gland Anatomy 0.000 description 1
- 230000008467 tissue growth Effects 0.000 description 1
- 230000007838 tissue remodeling Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000001944 turbinate Anatomy 0.000 description 1
- 230000007306 turnover Effects 0.000 description 1
- 231100000397 ulcer Toxicity 0.000 description 1
- 230000036269 ulceration Effects 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 108700026220 vif Genes Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/04—Peptides having up to 20 amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
- A61K38/08—Peptides having 5 to 11 amino acids
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
- A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- A61K38/22—Hormones
- A61K38/2292—Thymosin; Related peptides
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Public Health (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
Description
DZIEDZINA TECHNIKI
Przedmiotem wynalazku jest peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania jako środek do pobudzania regeneracji tkanki złożonej lub leczenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne i/lub chemiczne i/lub termiczne i/lub radiacyjne i/lub operacje chirurgiczne i/lub inne stany patologiczne.
STAN TECHNIKI
Regeneracja to proces polegający na odtwarzaniu przez żywe organizmy utraconych lub uszkodzonych części ciała, narządów, tkanek lub komórek. Możliwość regeneracji wynika z faktu, że komórki danego organizmu zawierają prawie jednakowy materiał genetyczny, dzięki czemu mogą one potencjalnie dać początek każdej innej komórce/tkance/narządowi. W rzeczywistości regeneracja możliwa jest tylko u niższych organizmów. Na przykład u gąbek cały organizm może zostać odtworzony z fragmentu złożonego z kilku zaledwie komórek. Im wyżej w hierarchii ewolucji znajduje się organizm t ym gorsze posiada możliwości regeneracji np. jaszczurki posiadają zdolność regeneracji ogona, czego nie obserwuje się już u ssaków. Najczęściej wyróżnia się dwa typy regeneracji. Pierwszy typ to morfalaksja, czyli odtworzenie brakującej części ciała przez zmianę specyfikacji pozostałej tkanki. Drugi typ to epimorfoza, czyli odtworzenie brakującej części ciała polegające na mnożeniu się komórek i wzroście nowej tkanki. Epimorfozę można potencjalnie wzmagać, stosując farmakologiczną stymulację.
W przypadku, gdy możliwości regeneracyjne organizmu są niewielkie, wówczas w miejscu uszkodzenia lub ubytku tkanki dochodzi do wytworzenia tkanki łącznej (blizny). Tkanka ta wypełnia powstałe uszkodzenie przez co uszkodzona tkanka lub organ zachowuje integralność. Proces wytworzenia tkanki łącznej nie prowadzi jednak do przywrócenia pełnej funkcjonalności tkanki czy organu. Powstanie tkanki bliznowatej jest procesem zwykle nieodwracalnym i na trwale upośledzającym funkcje uszkodzonego organu. Poznanie podstawowych mechanizmów towarzyszących regeneracji/naprawie tkanek, może umożliwić wykorzystanie naturalnych możliwości ich regeneracji i zapobieżenie powstania tkanki bliznowatej.
Możliwość odtwarzania funkcji i architektury uszkodzonych narządów i tkanek jest szczególnie istotna w przypadku przewlekłych ran skórnych, gdyż są one trudne do leczenia. Obecnie istnieje duża potrzeba opracowania nowych sposobów leczenia obrażeń/ubytków skórnych wymagających interwencji medycznej, jak np. oparzenia termiczne, chemiczne czy radiacyjne o dużej powierzchni, ran przewlekłych wywołanych chorobami cywilizacyjnymi takimi jak cukrzyca czy miażdżyca. Takim sposobem może być stymulacja regeneracji i bezbliznowego gojenia ran.
Skóra jest największym organem ludzkiego ciała, która pełni niezwykle ważną rolę jaką jest ochrona przed czynnikami fizycznymi, chemicznym i biologicznym. Stanowi również mechaniczną osłonę w obronie organizmu przed drobnoustrojami chorobotwórczymi. Zdolność skóry do naprawy i regeneracji jest niezbędna do utrzymania odpowiedniej homeostazy organizmu. Naturalną odpowiedzią na uraz skóry jest przede wszystkim aktywacja keratynocytów oraz fibroblastów i uruchomienie procesu gojenia rany. Fibroblasty posiadają zdolność do szybszego wypełniania dużych ubytków skóry zazwyczaj będąc obecne przy krawędzi rany. Blizny zazwyczaj powstają kosztem poprawnego etapu regeneracji tkanki skórnej, który jest złożonym procesem przebudowy i wzrostu tkanki skóry. Patologiczne gojenie się ran (rany przewlekłe, blizny przerostowe/keloidu) jest poważnym problemem medycznym, ekonomicznych i społecznym, który dotyka miliony ludzi na całym świecie.
Układ immunologiczny człowieka oprócz zapewniania odporności na różnego rodzaju patogeny i inne zagrożenia zewnętrzne i wewnętrzne, może również wpływać na procesy przebudowy, naprawy i regeneracji tkanek. W procesie regeneracji i gojenia ran istotną rolę odgrywa zarówno odporność wrodzona (bariera naskórkowa, peptydy przeciwbakteryjne, komórki NK), jak również odporność nabyta (limfocyty T, B) oraz inne mechanizmy łączące oba rodzaje odporności (komórki dendrytyczne, makrofagi). Powszechnie wiadomym jest, iż przewlekłe zapalenie (np. chroniczna infekcja bakteryjna) mediowane m.in. przez limfocyty T prowadzi do zahamowania procesów regeneracji i gojenia ran. Natomiast krótka (do 3-5 dni) fizjologiczna stymulacja układu odpornościowego w pierwszych dniach gojenia ran może stymulować gojenie rany poprzez m.in. przyspieszoną migrację i proliferację komórek skóry. Wydaje się zatem, iż modulowanie odpowiedzi immunologicznej może być efektywną strategią stymulacji gojenia ran przewlekłych.
PL 237 242 B1
Jedną z klas związków posiadających potencjalne możliwości pobudzania układu immunologicznego są peptydy, które również mogą wspomagać procesy regeneracyjne. Peptydy działają stymulująco na fibroblasty pobudzając je do proliferacji oraz do produkcji elastyny i kolagenu. Peptyd trombiny, TP508, znany również jako Chrysalin (OrthoLogic, Tempe, Arizona -23 reszty aminokwasowe) jest fragmentem domeny wiążącej receptor natywnej cząsteczki trombiny. Domena ta wiąże się ze specyficzną klasą receptorów znajdujących się na fibroblastach. Peptyd TP508, będący fragmentem domeny trombiny przyspiesza gojenie ran. Innym przykładem jest tripeptyd GHK. Występuje naturalnie w ludzkim organizmie w macierzy pozakomórkowej, ale jego stężenie maleje wraz z wiekiem. W organizmie człowieka uczestniczy w aktywacji procesów związanych z przebudową skóry, poprzez modulowanie aktywności metaloproteinaz I i II z macierzy międzykomórkowej (degradacja kolagenu i elastyny). Wpływa również na aktywację fibroblastów prowadząc do syntezy kolagenu i elastyny. Innym przykładem peptydu o właściwościach proregeneracyjnych jest tylotoin (KCVRQNNKRVCK), wyizolowany ze skóry salamandry Tylototriton verrucosus, peptyd AH90, (ATAWDFGPHGLLPIRPIRIRPLCG) wyizolowany ze skóry żaby Odorrana grahami czy peptyd Tiger 17 (c[WCKPKPKPRCH-NH2]). Szczególnie silne właściwości proregeneracyjne mają peptydy zawierające w swoim składzie sekwencję RGD. Peptydy te wiążą się z integrynami lub receptorami czynników wzrostu przez co aktywują kaskadę sygnałów komórkowych sprzyjających procesom regeneracyjnym.
Peptydy są niestety klasą związków które charakteryzują się niską stabilnością oraz trwałością. Trwałość preparatu farmaceutycznego jest zdefiniowana, jako okres od momentu jego wyprodukowania, aż do momentu, gdy nie odpowiada on wymaganiom Farmakopei, normy lub gdy stężenie substancji czynnej zmniejszy się więcej niż o 10%. Ponadto, preparat ten musi charakteryzować się brakiem zmian w wyglądzie, smaku, dostępności biologicznej, czy toksyczności. Badania stabilności preparatu farmaceutycznego/produktu leczniczego są przeprowadzane w określonych punktach czasowych i warunkach (temperatura, wilgotność, pH itp.), tak by wykazać, że pozostaje on skuteczny i bezpieczny dla pacjentów. Uzyskane wyniki stanowią podstawę do określenia trwałości produktu i jego daty ważności.
Badania stabilności substancji aktywnej wykonuje się w formie: stałej np. wraz z substancjami wypełniającymi (tabletki), emulsjach (kremy), czy rozpuszczonej tj. w wodzie czy układach buforujących. Niezwykle cennych informacji na temat stabilności API (substancji czynnej) dostarczają jej badania w osoczu i/lub pełnej krwi. Badania te pozwalają na ocenę podatności związku na proteolizę enzymatyczną i dobranie odpowiedniej dawki leku, tak by uzyskać pożądany efekt terapeutyczny. Związki, które charakteryzują się krótkim czasem połowicznego zaniku, z reguły wymagają dalszych modyfikacji strukturalnych (nie dotyczy pro-leków), tak by polepszyć parametry połowicznego zaniku. Czasami, związki charakteryzują się krótkim okresem półtrwania w osoczu z uwagi na fakt ich wiązania przez białka z osocza krwi, czyli albuminy. Albuminy należą do grupy rozpuszczalnych białek o m.cz. 66-69 kDa. W osoczu stanowią około 55-65% wszystkich białek. Ich podstawową funkcją fizjologiczną jest wiązanie wody, dzięki czemu utrzymuje się odpowiednie ciśnienie koloidoosmotyczne (onkotyczne) osocza i jego prawidłową objętość. Białka te są również głównymi transporterami wolnych kwasów tłuszczowych, hormonów, witamin, metali ciężkich i niektórych leków (np. kwasu acetylosalicylowego). Większość leków wiąże się z białkiem odwracalnie przy udziale wiązań wodorowych, oddziaływań hydrofobowych lub sił van der Waalsa, tworząc tzw. depot (magazyn), z którego stopniowo uwalniają się cząsteczki leku, zastępując te, które uległy już eliminacji. Obecnie coraz częściej zwraca się uwagę na albuminy, jako egzogenne nośniki leku ze względu na to, że nie są one toksyczne czy immunogenne, a dodatkowo poprawiają profil farmakokinetyczny (t1/2 albuminy wynosi około 15-29 dni) i stabilność leków szybko degradowanych w osoczu. Dodatkowo, białka te są stabilne w zakresie pH 4-9, mogą być ogrzewane do temperatury 60°C przez około 10 godzin i są odporne na denaturację pod działaniem większości odczynników denaturujących, co może być przydatne ze względów technologicznych przy wytwarzaniu leków.
Istnieje szereg modeli oceny aktywności pro-regeneracyjnej związków chemicznych na modelach zwierzęcych. Jednym z modeli pozwalających na badanie regeneracji tkanki złożonej jest eksperyment uszkodzenia małżowiny usznej u myszy polegający na wycinaniu w centrum małżowiny usznej myszy otworów o średnicy 2 mm, co było szeroko wykorzystywaną procedurą permanentnego znakowania zwierząt laboratoryjnych. U zwykłych myszy dochodzi do gojenia umożliwiającego pewną redukcję powierzchni otworu, ale nigdy nie zarasta on całkowicie. Jednym z wyjątków jest mysz MRL/MpJ, u której dochodzi do zamknięcia takich otworów po 30 dniach od uszkodzenia, przy czym następuje odtworzeniem architektury tkanki, w tym nie tylko skóry, ale też naczyń krwionośnych, mięśni, chrząstki i nerwów obwodowych. Co więcej, w tym szczepie zaobserwowano silniejszą odpowiedź regeneracyjną w innych
PL 237 242 B1 narządach, m.in. w sercu, kikutach palców po amputacji, siatkówce i rogówce, w rdzeniu kręgowym, ścięgnach i chrząstce stawów. Odpowiedź regeneracyjna w małżowinie usznej może być uważana za wskaźnik zdolności regeneracyjnych organizmu. Proces ten można pobudzić za pomocą substancji chemicznych u myszy laboratoryjnych, u których takie zjawisko nie występuje samorzutnie.
SZCZEGÓŁOWY OPIS WYNALAZKU
Przedmiotem niniejszego wynalazku jest zastosowanie peptydu o sekwencji RDKVYR (IM) w procesie regeneracji tkanki złożonej i gojeniu się ran u ssaków. Przedstawiona w zgłoszeniu metoda skutecznego gojenia ran oparta jest na podskórnym podaniu peptydu IM ssakowi.
W badaniach niniejszego wynalazku wykorzystano zarówno model komórkowy in vitro, jak również model zwierzęcy. W modelu komórkowym zastosowano głównie ludzkie keratynocyty oraz fibroblasty - komórki kluczowe dla procesów gojenia rany i regeneracji skóry. Obecność tych komórek a szczególnie ich proliferacja (podziały) jest niezbędna dla prawidłowego procesu gojenia rany. W modelu zwierzęcym posłużono się analizą regeneracji ubytku tkanki w małżowinie myszy. Model ten jest powszechnie aprobowany w badaniach nowych związków - potencjalnych leków o działaniu proregeneracyjnym. Z uwagi na zbliżoną fizjologię i biochemię gojenia rany u myszy i ludzi, model zwierzęcy może stanowić podstawę do oceny efektywności działania nowych związków. Ponadto modele zwierzęce dają dużą większą powtarzalność wyników, kontrolę warunków oraz standaryzację doświadczeń w porównaniu do badań z udziałem ludzi.
Peptyd IM jest hydrofilowym heksapeptydem o sekwencji RDKVYR i stanowi fragment 32-37 hormonu tymopeotyny. Tymopoetyna jest jednym z hormonów produkowanych przez grasicę. Jej zadaniem jest stymulacja powstawania, różnicowania oraz dojrzewania limfocytów T. Kontroluje reakcje związane z możliwością odrzucenia przeszczepu oraz mechanizmy obronne skierowane przeciwko komórkom nowotworowym. Jednak najważniejszą z funkcji tego hormonu jest wzmaganie limfopoezy. Oznacza to zwiększoną produkcję limfocytów T przez organizm a one z kolei są odpowiedzialne za odpowiedź immunologiczną organizmu. Peptyd IM jest znany i sprzedawany w Rosji oraz w innych krajach Europy wschodniej, jako lek o działaniu odtruwającym wątrobę, dezaktywującym wolne rodniki i nadtlenki wodoru. Stosowany jest w terapiach wspomagających podczas leczenia chorób nowotworowych, posiada właściwości odtruwające wątrobę, stosowany jest w leczeniu wirusowego zapalenia wątroby typu B i C, HIV, AIDS, wirusem brodawczaka ludzkiego. Wykorzystywany jest również w leczeniu łuszczycy, brucelozy, reumatoidalnego zapalenia stawów, błonicy, bakteryjnego zapalenia wsierdzia. Udowodniono, że podanie peptydu IM pacjentom cierpiącym na wrzodziejące zapalenie jelita grubego i stany zapalne układu pokarmowego skutkuje znacznym ograniczeniem niepożądanych objawów tj. zmniejszeniem wrzodów.
Niestety, jak dotychczas nie znany jest mechanizmu działania peptydu IM. Dowiedziono, że skuteczność samego peptydu IM jest słabsza od lanzoprazolu, popularnego środka stosowanego do leczenia choroby wrzodowej żołądka. Jednak biorąc pod uwagę skuteczność terapeutyczną przy jednoczesnym zastosowaniu niskich stężeń oraz brak efektów ubocznych, w przeciwieństwie do lanzopralu, peptyd IM jako lek posiada większe perspektywy w leczeniu chorób przewodu pokarmowego. Peptyd IM znany jest jako środek immunomodulacyjny.
Celem niniejszego wynalazku jest pokazanie innego zastosowania peptydu IM w procesie regeneracji wielotkankowej. Nieoczekiwanie związek IM przyspiesza procesy regeneracyjne.
Przedmiotem wynalazku jest peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania jako środek do pobudzania regeneracji tkanki złożonej lub leczenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne i/lub chemiczne i/lub termiczne i/lub radiacyjne i/lub operacje chirurgiczne i/lub inne stany patologiczne.
Peptyd RDKVYR ma postać iniekcji, gdzie stosuje się dawkę o stężeniu 0,1-50 pg/ml.
Określenia stosowane w niniejszym opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
Określenie “rana” obejmuje każdy rodzaj uszkodzenia żywej tkanki wywołany przez uderzenie lub ucisk i inne czynniki mechaniczne, oparzenie, odmrożenie, promieniowanie, czynniki chemiczne, niedokrwienie i inne czynniki biologiczne. W szczególności termin “rana” obejmuje uszkodzenia skóry, ale też innych tkanek i organów.
Określenie “gojenie ran” odnosi się do pouszkodzeniowego procesu naprawczego, który obejmuje oczyszczenie obszaru rany z ciał obcych i martwych tkanek i proliferację komórek prowadzącą do odtworzenia ciągłości tkanki bądź to z wytworzeniem blizny lub bez.
PL 237 242 B1
Określenie “regeneracja” oznacza proces odtworzenia utraconych tkanek, struktur i przydatków zachodzący spontanicznie lub pod działaniem stymulacji farmakologicznej.
Określenie “rana przewlekła” lub “rana niegojąca się” odnosi się do ran, które nie wykazują wyraźnego gojenia w czasie przekraczającym normalne gojenie; typowo rany, które nie goją się w ciągu 3 miesięcy są określane jako przewlekłe. Rany przewlekłe lub rany niegojące się są często związane z niedokrwieniem lub owrzodzeniem u pacjentów cukrzycowych, ale nie są ograniczone do tej grupy.
W przypadku, gdy związek podawany we wczesnej fazie gojenia ran, należy rozumieć, że określenie “faza wczesna” obejmuje odpowiedź immunologiczną bezpośrednio po zranieniu.
Określenia stosowane powyżej oraz w opisie i zastrzeżeniach patentowych, mają następujące znaczenie:
Wykaz skrótów:
| IM | - peptyd o sekwencji RDKVYR |
| DMF | - dimetyloformamid |
| DCM | - dichlorometan |
| MeOH | - metanol |
| KI | - jodek potasu |
| DIPEA | - N,N-diizopropyloetyloamina |
| Fmoc | - grupa 9-fluorenylometoksykarbonylowa |
| Boc | - grupa tert-butyloksykarbonylowa |
| Oxyma pure | - (hydroksyimino)cyjanooctan etylu |
| DIC | - N,N'-Diizopropylokarbodiimid |
| Et2O | - eter dietylowy |
| Pbf | - grupa 2,2,4,6,7-pentametylodihydrobenzofurano-5-sulfonylowa |
| OtBu | - ester tert-butylowy |
| tBu | - grupa tert-butylowa |
| TIPSI | - triizopropylosilan |
| TFA | - kwas triflorooctowy |
| API | - aktywne substancje farmaceutyczne |
| 46BR.1N | - unieśmiertelniona linia ludzkich fibroblastów skórnych |
| HaCaT | - unieśmiertelniona linia ludzkich keratynocytów |
| FBS | - płodowa surowica bydlęca (ang. Fetal Bovine Serum) |
| PBS | - buforowana fosforanem sól fizjologiczna (ang. Phospahte-Buffered Saline) |
| PBMC | - jednojądrzaste komórki krwi obwodowej |
| fMLP | - N-formyl-metionyl-leucylo fenyloalanina |
| P/S | - penicylina/streptomycyna |
| ASA | - kwas acetylosalicylowy |
| LPS | - lipopolisacharyd |
| PHA | - fitohemaglutynina |
| BAT | - test aktywacji bazofili (ang. Basophil Activation Test) |
| ASC | - komórki macierzyste tkanki tłuszczowej ASCs (ang. Adipose Derived Stem Cells) |
| Balb/C | - komercyjnie dostępny, wsobny szczep myszy |
| C57BL6J | - komercyjnie dostępny, wsobny szczep myszy |
Opis figur:
Fig. 1 - przedstawia badania stabilności związku IM w osoczu ludzkim (góra) oraz w wodzie (dół). Stabilność była badana w czasie 24 godzin. Obecność związku IM była monitorowana za pomocą techniki HPLC z detektorem PDA.
Fig. 2 - przedstawia widmo masowe zarejestrowane dla ostatniego mililitra buforu (last wash góra) dla peptydu IM. Widmo wskazuje, że kolumna została poprawnie odmyta z nadmiaru naniesionego peptydu na co wskazuje brak masy IM. Widmo masowe zarejestrowane dla frakcji elucji (dół) dla peptydu IM. Na widmie widoczny jest pik m/z 836.887, odpowiadający pozornemu, protonowemu jonowi pochodzącemu od tego peptydu.
PL 237 242 B1
Fig. 3 - przedstawia wpływ IM na proliferację fibroblastów 46BR.1N (góra) i keratynocytów HaCaT (dół). Wykresy przedstawiają wyniki z 4 cykli doświadczeń dla HaCaT (n=16) i 3 cykli doświadczeń dla 46BR.1N (n=12). * - różnice istotne statystycznie, test U-Manna Whitneya (p<0,05).
Fig. 4 - przedstawia wykres (góra) pokazujący wpływ IM w stężeniach 0,01 i 0,1 gg/ml na migrację keratynocytów HaCaT i fibroblastów 46BR.1N po 24 h inkubacji ze związkiem oraz zdjęcia powierzchni rysy (dół) w kontroli i po stymulacji IM fibroblastów 46BR.1N z pojedynczego doświadczenia. * - różnice istotne statystycznie (Test U-Manna Whitneya p<0,05).
Fig. 5 - przedstawia badania immunogenności dla związku IM. Na wykresie pokazano poziomy ekspresji powierzchniowych markerów aktywacji (CD25, CD69, CD71, HLA-DR) na cytotoksycznych limfocytach T (CTL). Zastosowano następujące warunki doświadczalne: kontrola - komórki bez stymulacji, samo medium hodowlane; LPS/PHA - kontrola dodatnia, komórki stymulowane lipopolisacharydem i fitohemaglutyniną; IM 0,1 - komórki stymulowane IM w stężeniu 0,1 mg/ml; IM 1,0 - komórki stymulowane IM w stężeniu 1,0 mg/ml. Wyniki przedstawiono jako medianę (min-max).
Fig. 6 - przedstawia badania immunogenności dla związku IM. Na wykresie pokazano poziomy ekspresji powierzchniowych markerów aktywacji (CD25, CD69, CD71, HLA-DR) na pomocniczych limfocytach T (Th). Zastosowano następujące warunki doświadczalne: kontrola - komórki bez stymulacji, samo medium hodowlane; LPS/PHA - kontrola dodatnia, komórki stymulowane lipopolisacharydem i fitohemaglutyniną; IM 0,1 - komórki stymulowane IM w stężeniu 0,1 mg/ml; IM 1,0 - komórki stymulowane IM w stężeniu 1,0 mg/ml. Wyniki przedstawiono jako medianę (min-max).
Fig. 7 - przedstawia badania immunogenności dla związku IM. Na wykresie pokazano poziomy ekspresji powierzchniowych markerów aktywacji (CD25, CD69, CD71, HLA-DR) na komórkach cytotoksycznych - Natural Killers (NK). Zastosowano następujące warunki doświadczalne: kontrola - komórki bez stymulacji samo medium hodowlane; LPS/PHA - kontrola dodatnia, komórki stymulowane lipopolisacharydem i fitohemaglutyniną; IM 0,1 - komórki stymulowane IM w stężeniu 0,1 mg/ml; IM 1,0 komórki stymulowane IM w stężeniu 1,0 mg/ml. Wyniki przedstawiono jako medianę (min-max).
Fig. 8 - przedstawia wynik testu aktywacji bazofili w przeliczeniu na % pobudzonych komórek; kontrola negatywna (neg), kontrola pozytywna (fMLP - trójpeptyd pochodzenia bakteryjnego), dodatkowa kontrola (kwas acetylosalicylowy ASA), peptyd IM (0,1 gg/mL).
Fig. 9 - przedstawia sieć regulatorową o najwyższym współczynniku zgodności (consistency score (29,69)) dla komórek ASCs pozyskanych z pacjenta PS9 (góra), PS1 (środek) oraz PS8 (dół) stymulowanych peptydem IM (0,1 gg/ml). Wartości liczbowe poniżej poszczególnych cząsteczek oznaczają odpowiednio wartość log2 zmiany ekspresji oraz wartość p (prawdopodobieństwo testowe, ang. p-value). Wartość dodatnia i ujemna oznacza odpowiednio wzrost lub spadek ekspresji. W panelu dolnym strzałka skierowana w górę wskazuje na aktywację zjawiska.
Fig. 10 - przedstawia wpływ związku IM na ekspresję genów pluripotencji i regulacji cyklu komórkowego (CDKN1A MYC, KIT, POU5F1, TGFB3, TP53) w komórkach ludzkich ASC izolowanych od trzech różnych pacjentów. Genami referencyjnymi są AKTB i TBP. Pacjenci reagują na związki w sposób indywidualny. Brak jest obserwowalnych korelacji oraz trendów w zmianach ekspresji pod wpływem badanych związków.
Fig. 11 - przedstawia wpływ związku IM na ekspresję genów pluripotencji i regulacji cyklu komórkowego (CDKN1A, MYC, KIT, POU5F1, TGFB3, TP53) w komórkach ludzkich pierwotnych keratynocytów izolowanych od trzech różnych pacjentów. Genami referencyjnymi są AKTB i TBP. Pacjenci reagują na związki w sposób indywidualny. Brak jest obserwowalnych korelacji oraz trendów w zmianach ekspresji pod wpływem badanych związków.
Fig. 12 - przedstawia reprezentatywne zdjęcie dla grupy badawczej myszy C57BL6/J otrzymującej peptyd IM (prawa kolumna) w porównaniu do reprezentatywnych zdjęć dla grupy kontrolnej otrzymującej sam rozpuszczalnik (roztwór soli fizjologicznej, NaCl).
Fig. 13 - przedstawia wpływ peptydu IM na regenerację wielotkankową u myszy szczepu C57BL6/J. Podano uśrednione pole powierzchni otworów w małżowinie usznej i odchylenia standardowe (SD). Różnice istotne statystycznie (t.test * - p<0,05; ** - 001<p<0,01).
Fig. 14 - przedstawia reprezentatywne zdjęcie dla grupy badawczej myszy Balb/C otrzymującej peptyd IM (prawa kolumna) w porównaniu do reprezentatywnych zdjęć dla grupy kontrolnej otrzymującej sam rozpuszczalnik (roztwór soli fizjologicznej, NaCl).
Fig. 15 - przedstawia wpływ peptydu IM na regenerację wielotkankową u myszy szczepu Balb/C. Podano uśrednione pole powierzchni otworów w małżowinie usznej i odchylenia standardowe (SD). Różnice istotne statystycznie (t.test * - p<0,05; ** - 0,001<p<0,01).
PL 237 242 B1
Fig. 16 - przedstawia obrazy histopatologiczne małżowiny usznej u myszy po 42 dniach od rozpoczęcia procedury podawania IM (5 μg/g masy ciała) (panel A) w odniesieniu do myszy otrzymujących tylko nośnik (panel B) (buforowany roztwór soli fizjologicznej). U myszy otrzymujących IM widać większe pobudzenie warstw naskórka (strzałki - panel A2), podczas gdy w kontroli naskórek jest w fazie bardziej zróżnicowanej (strzałki - panel B2). Obrazy z paneli A1 i B1 pokazują jedynie te fragmenty tkanki która uległa regeneracji. Obrazy z paneli A3 i B3 pokazują całą tkankę uzyskaną w preparacie.
Wynalazek ilustrują następujące przykłady wykonania, nie stanowiące jego ograniczenia: SYNTEZA CHEMICZNA
P r z y k ł a d 1:
Synteza chemiczna peptydu IM
Synteza peptydu IM o sekwencji RDKVYR została wykonana na nośniku stałym, zgodnie z metodologią chemii Fmoc, przy zastosowaniu syntezatora mikrofalowego Liberty Blue™ (CEM Corporation). Do syntezy wykorzystano żywicę Cl-TCP(Cl) ProTide (CEM Corporation) o stopniu osadzenia 0,4 mmol/g.
Odczynniki wykorzystane do syntezy:
• DMF suszony nad sitami molekularnymi A3 oraz A4 • 0,2 M roztwory N“-Fmoc-pochodnych aminokwasów w DMF:
• Fmoc-Arg (Pbf)-OH;
• Fmoc-Asp(OtBu)-OH;
• Fmoc-Lys(Boc)-OH;
• Fmoc-Val-OH;
• Fmoc-Tyr(tBu)-OH;
• 20% roztwór piperydyny w DMF;
• 1 M DIPEA + 0,125 M KI w DMF;
• 1 M Oxyma pure + 0,1 M DIPEA w DMF;
• 0,5 M DIC w DMF.
Pierwszy N-chroniony aminokwas (Fmoc-Arg(Pbf)-OH) został przyłączony do żywicy przy zastosowaniu 0.2M roztworu N-Fmoc-aminokwasu w 1M DIPEA + 0.125M KI w DMF poddając promieniowaniu mikrofalowemu o mocy 75 W przez 60 sekund i w temperaturze 80°C, a następnie o mocy 20 W przez 540 sekund w temperaturze 90°C. Kolejno wykonano cykl przemywań z wykorzystaniem DMF. Następnie usunięto osłonę grupy aminowej Fmoc stosując 20% roztwór piperydyny w DMF poddając promieniowaniu mikrofalowemu o mocy 125 W przez 25 sekund w temperaturze 70°C oraz 30 W przez 65 sekund w temperaturze 90°C. Kolejne 5 reszt aminokwasowych zostało przyłączone z mocą 170 W przez 15 sekund w temperaturze 75°C oraz 30 W przez 110 sekund w temp. 89°C, za każdym razem uprzednio usuwając osłonę grupy aminowej jak wyżej. Do łączenia aminokwasów za każdym razem zastosowano 0,5M roztwór DIC w DMF jako odczynnika sprzęgającego oraz 1M roztwór Oxyma pure jako supresora racemizacji oraz 0.1 M DIPEA w DMF jako zmiatacza wolnych rodników. Jedynie dla N-końcowej reszty argininy zastosowano podwójne sprzęganie według opisanej procedury. Po każdym acylowaniu peptydylożywica została czterokrotnie odmyta DMF.
Odszczepienie peptydu od nośnika:
Do odczepienia peptydu z nośnika z jednoczesnym usunięciem osłon bocznych użyto mieszaniny 88% TFA (SigmaAldrich) + 5% H2O + 5% fenol + 2% TIPSI (SigmaAldrich) (v/v/v/v). Reakcję prowadzono przez trzy godziny z wykorzystaniem wytrząsarki laboratoryjnej, a następnie żywicę odsączono pod zmniejszonym ciśnieniem, a przesącz odparowano do sucha na wyparce próżniowej. Otrzyma ny osad zalano zimnym eterem di etylowym, roztarto, a następnie zwirowano (20 min). Osad przemyto trzykrotnie Et2O w celu usunięcia zanieczyszczeń (wirując po każdym przemyciu), po czym pozostawiono do wysuszenia w eksykatorze próżniowym. Tak uzyskany surowy produkt został rozpuszczony w wodzie i poddany procesowi liofilizacji.
Charakterystyka otrzymanego produktu - HPLC oraz LC-MS:
Uzyskany surowy produkt został poddany analizie chromatograficznej z wykorzystaniem wysokosprawnej chromatografii cieczowej na fazach odwróconych (RP-HPLC). Kolumna chromatograficzna : Luna 5 μm C18, 100 A, 250x4.6 mm. Układ faz A 0,1% TFA w wodzie, B: 0,1% TFA w 80% acetonitrylu w wodzie, przepływ 1 ml/min, detekcja UV przy 223 nm (tR=14,093 min). LC-MS ESI TOF na kolumnie Kromasil C8, 5 μm 100 A (250 mm x 1 mm). Masa oznaczona: 835,401 Masa obliczona (monoizotopowa, średnia): 835,9618.
PL 237 242 B1
Wymiana przeciwjonu trifluorooctowego na jon octanowy:
Wymiana przeciwjonu trifluorooctowego na jon octanowy została wykonana ma kolumience Strata C18-E (55 μm, 70A) według procedury:
- na zrównowagowaną kolumnę naniesiono peptyd rozpuszczony w wodzie,
- postęp wiązania się peptydu ze złożem kolumienki był monitorowany przy pomocy wysokosprawnej chromatografii cieczowej w układzie faz odwróconych,
- po związaniu się peptydu na kolumience, przemyto ją 0,1 M wodnym roztworem octanu amonu,
- peptyd wyeluowano za pomocą 0,1 M roztworu octanu amonu w MeOH.
Uzyskany eluat odparowano przy pomocy wyparki próżniowej, a następnie odsublimowano nadmiar octanu amonu na liofilizatorze. W celu usunięcia resztek amonu, liofilizat ponownie rozpuszczono w wodzie i powtórnie zliofilizowano.
P r z y k ł a d 2:
Badanie stabilności peptydu IM w osoczu i w wodzie
Krew została pobrana od zdrowych dawców i zwirowana na probówkach pokrytych heparyną litową. Jako antykoagulant użyto EDTA. Peptyd IM został inkubowany w osoczu w temperaturze 37°C (końcowe stężenie peptydu: 144 μΜ), a jego rozkład przeanalizowany w punkach czasowych: 1,2, 3, 6 i 24 h. Próbki zostały przygotowane w sterylnych warunkach. Po odpowiednim czasie, został dodany 4-krotny nadmiar etanolu, a następnie próbka została przetrzymana na lodzie przez kolejne 15 min. Następnie została zwirowana (32000 rcf, 4°C, 20 min) na wirówce. Supernatant został zebrany i odparowany, a pozostałość została rozpuszczona w 100 μL 0,01% roztworu TFA w H2O. Analizy zostały prowadzone za pomocą HPLC, na kolumnie Phenomenex Luna C18(2) (5 μm, 100 A 4.6 x 250 mm) z detektorem PDA. 0,01% roztwór TFA w H2O (A) oraz 0,01% TFA w 80% MeCN w wodzie (B) został użyty jako bufor. Do analizy zastosowano liniowy gradient 5-100% w 60 min z przepływem 1 mL/min. Obliczenia zostały wykonane przy pomocy oprogramowania Shimadzu LCsolution. Po godzinie inkubacji w 37°C, można zauważyć brak sygnału od peptydu IM (Fig. 1 góra).
W celu wykonania stabilności peptydu IM w wodzie, peptyd o stężeniu 0.5 mg/ml inkubowano przez 24 godziny w temperaturze 37°C z zastosowaniem ciągłego wytrząsania. Stabilność peptydu badano w następujących punktach czasowych 1,2, 3, 6 i 24 h. Analizy zostały prowadzone za pomocą HPLC, na kolumnie Phenomenex Luna C18(2) (5 μm, 100 A 4.6 x 250 mm) z detektorem PDA. 0,01% roztwór TFA w H2O (A) oraz 0,01 % TFA w 80% MeCN w wodzie (B) został użyty jako bufor. Do analizy zastosowano liniowy gradient 5-100% w 60 min z przepływem 1 mL/min. Obliczenia zostały wykonane przy pomocy oprogramowania Shimadzu LCsolution. Po 2 godzinach inkubacji w 37°C, można zauważyć niewielki rozpada sygnału od peptydu IM (Fig. 1 dół).
P r z y k ł a d 3:
Określenie powinowactwa peptydu IM do albuminy wołowej
Do przygotowania kolumny i wykonania testów powinowactwa zastosowano następujące bufory: 1. bufor sprzęgający (ang. coupling buffer, CB) - 0,2 M NaHCOs i 0,5 M NaCl (pH 8,3),
2. bufor fosforanowy (ang. phosphate buffer saline, PBS) - 5 mM Na2HPO4 i 150 mM NaCl (pH 7,4),
3. bufor blokujący (ang. blocking buffer, BB) - 0,1 M etanoloamina i 0,5 M NaCl (pH 8,3),
4. bufor myjący (ang. washing buffer, WB) - 0,2 M CHsCOONa i 0,5 M NaCl (pH 4),
5. bufor amonowy - 50 mM NH4HCO3 (pH 7,4).
Przygotowanie mikrokolumny do chromatografii powinowactwa:
W celu wykonania testu powinowactwa IM do albumin wykorzystano mikrokolumnę Mobicol „F” firmy Abo (#M105035F). 100 μg białka albuminy odważono i rozpuszczono w 100 μl 0,2 mM buforu sprzęgającego. 0,06 g sefarozy (Activated CH-Sepharose 4B, A9019 Sigma-Aldrich) odważono do mikrokolumienki i namoczono w buforze sprzęgającym przez 5 minut celem spęcznienia żywicy. Rozpuszczoną albuminę przeniesiono do mikrokolumienki i inkubowano przez dwie godziny w temperaturze 25°C z zastosowaniem ciągłego wytrząsania. Następnie mikrokolumnę przemyto czterokrotnie buforem blokującym i myjącym. Kolumnę ponownie poddano godzinnej inkubacji z zastosowaniem wytrząsania w temperaturze 25°C w roztworze blokującym. Po zakończeniu inkubacji kolumnę czterokrotnie przemyto naprzemiennie roztworem blokującym i myjącym.
PL 237 242 B1
Wykonanie testu powinowactwa:
Kolumnę zrównoważono 20 ml 50 mM buforu amonowego, a następnie dodano 20 μο peptydu rozpuszczonego w 20 μl buforu amonowego i inkubowano w temperaturze 25°C przez 2 godziny z zastosowaniem ciągłego mieszania. Po 2 godzinach kolumienkę przemyto 100 ml buforu amonowego zbierając pierwszy i ostatni mililitr roztworu (frakcja supernatant oraz last wash). Kompleks związany na kolumnie oddysocjowano po 15 minutowej inkubacji z 0,1% TFA w wodzie z zastosowaniem ciągłego wytrząsania. Procedurę powtórzono dwukrotnie każdorazowo zbierając frakcje eluat. Kolumienkę przemyto roztworem PBS w celu renaturacji immobilizowanego białka i przechowywano w temperaturze 4°C. Wszystkie frakcje zostały zliofilizowane i poddane analizie z wykorzystaniem spektrometrii mas (ESI-IT-TOF firmy SHIMADZU).
Analiza uzyskanych widm:
Widmo frakcji ostatniego mililitra bufom dla peptydu IM wskazuje, że kolumna została poprawnie odmyta z nadmiaru naniesionego peptydu na co wskazuje brak masy IM (Fig. 2 - góra). Na widmie frakcji eluatu (Fig. 2 - dół) widoczny jest pik m/z 836,887 który jest zgodny z masą peptydu IM. Na podstawie uzyskanego widma można wnioskować, że badany peptyd oddziałuje z albuminą, gdyż we frakcji elucji obecny jest sygnał m/z odpowiadający pozornemu, protonowemu jonowi pochodzącemu od tego peptydu. Test powinowactwa został wykonany dwukrotnie z powtarzalnym wynikiem.
BADANIA BIOLOGICZNE
P r z y k ł a d 4:
Testy cytotoksyczności i proliferacji komórek ludzkich fibroblastów i keratynocytów po stymulacji peptydem IM
Peptyd IM został przebadany w modelach in vitro z wykorzystaniem:
1) ludzkich komórek skóry oraz
2) komórek jednojądrzastych krwi obwodowej (PBMC).
Badanie z użyciem komórek skóry miało na celu ocenę wpływu peptydu IM na ich proliferację (namnażanie). Proces ten jest kluczowy podczas gojenia ran (odbudowa skóry). Zbadano wpływ peptydu IM na proliferację unieśmiertelnionych, ludzkich komórek linii fibroblastów skórnych (46BR.1N) i keratynocytów skórnych (HaCaT) oraz jego cytotoksyczność wobec tych komórek. Testy proliferacyjne (XTT) wykonano dla stężeń: 0,01; 0,1; 1; 10; 25; 50; 100; 150 μg/ml, a cytotoksyczności (FDH) dla stężeń: 50, 100, 150 μg/ml.
Uzyskane wyniki pokazują, że peptyd IM nie jest cytotoksyczny wobec badanych komórek. Ponadto, związek ten stymuluje proliferację fibroblastów 46BR.1N - wzrost liczby komórek w hodowli względem kontroli o 20-40% po 48 h i 72 h w stężeniach: 0,1; 1; 10; 25; 50 μg/ml oraz keratynocytów HaCaT - wzrost liczby komórek o 10-40% po 48 h i 72 h w stężeniach: 0,1; 1; 10 μg/ml (Fig. 3). Peptyd IM nie powodował zahamowania proliferacji fibroblastów i keratynocytów we wszystkich badanych stężeniach.
P r z y k ł a d 5:
Testy migracji komórek ludzkich fibroblastów i keratynocytów po stymulacji peptydem IM
Zbadano wpływ peptydu IM w stężeniach 0,01 i 0,1 μg/ml na migrację komórek unieśmiertelnionych linii ludzkich keratynocytów HaCaT i fibroblastów 46BR.1N przy użyciu testu scratch assay. Otrzymane wyniki pokazują, że peptyd IM w stężeniu 0,01 μg/ml stymuluje migrację komórek linii 46BR.1N (fibroblastów) w porównaniu do komórek kontrolnych (Fig. 4), hodowanych w medium bezsurowiczym (różnice istotne statystycznie, test U-Manna Whitneya, p<0,05). Dla komórek linii HaCaT nie zaobserwowano efektu promigracyjnego.
P r z y k ł a d 6:
Ocena immunogenności dla peptydy IM
Drugi typ analizy miał na celu ocenę immunogenności peptydu IM. Aspekt ten jest istotny z uwagi na możliwe działania niepożądane peptydów, które wiążą się m.in. z aktywacją układu odpornościowego i indukcją zapalenia (limfocyty) oraz możliwymi odczynami alergicznymi (bazofile/komórki tuczne).
Materiałem do badań były tzw. kożuszki leukocytarne, z których izolowano jednojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMC) wykorzystując wirowanie w gradiencie gęstości (histopaque, Sigma). Po dwukrotnym płukaniu PBMC w PBS, lizie erytrocytów i zliczeniu (licznik komórek Bio-Rad), komórki wysiewano na płytkę 24-dołkową w ilości 1 mln kk/ 1 ml RPMI 1640 (P/S, 10% FBS)/dołek. Następnie komórki adaptowały się do nowych warunków przez 24 godziny (tzw. resting). Po tym czasie dodawano
PL 237 242 Β1 badanego związku - peptyd IM w dwóch stężeniach końcowych: 0,1 μg/ml i 1,0 μg/ml i inkubowano w cieplarce przez 48 h. Kontrolę negatywną stanowiły komórki niestymulowane, natomiast pozytywną - komórki stymulowane LPS (1 μg/ml) i PHA (2,5 μg/ml). Komórki zbierano z dołków po zakończeniu inkubacji, płukano w PBS, zliczano i przygotowywano do analizy cytometrycznej: 100 tys kk/100 μΙ wybarwiano przeciwciałami, a po 30 minutowej inkubacji w temp, pokojowej w ciemności analizowano z wykorzystaniem cytometru przepływowego - LSRFortessa, BD.
Badania immunogenności:
Badania wpływu peptydu IM na komórki układu immunologicznego wykonano z wykorzystaniem izolowanych jednojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMC). Komórki te były inkubowane z badanym związkiem - IM (0,1 μg/ml i 1,0 μg/ml) przez 48 godzin, następnie efekty ich działania analizowano z wykorzystaniem cytometrii przepływowej. Określono stopień pobudzenia limfocytów T (CD3/CD4/CD8) i komórek NK (CD16/CD56) poprzez ocenę ekspresji markerów aktywacji: CD69, CD71, CD25, HLA-DR.
Wykonane analizy wskazują na brak właściwości immunogennych peptydu IM w obu badanych stężeniach. Poziom wybranych subpopulacji komórek układu immunologicznego (CTL - komórki cytotoksyczne, Th, komórki NK) zachowywał wartości zbliżone dla prób kontrolnych (Fig. 5, Fig. 6 i Fig. 7). Wyniki te świadczą, iż peptyd IM nie indukuje zapalenia i posiada wysoki profil bezpieczeństwa immunologicznego.
Przykład 7:
Ocena potencjału alergizującego peptydu IM
W celu oceny aktywacji bazofili pod wpływem związku - peptydu IM zastosowano zestaw komercyjny Flow CAST® highsens (Buhlmann Laboratories, Switzerland). Test ten (BAT, Basophil Activation Test) służy do oceny potencjału alergicznego różnego rodzaju związków chemicznych, w tym leków. Badanie wykonano na próbkach krwi pobranych od zdrowych ochotników i przeprowadzono w ciągu 24 godzin od pobrania, zgodnie z instrukcją producenta. 100 μί krwi pełnej inkubowano z badanym związkiem - peptyd IM w stężeniu końcowym 0,1 μg/ml. Następnie próbki barwiono roztworem przeciwciał (CD63, CD203c, CCR3) i inkubowano przez 15 min w łaźni wodnej w temp. 37°C. Po zakończeniu inkubacji, lizie erytrocytów i płukaniu, próby były analizowane cytometrycznie (BD FACSCanto II). Dla każdej próby przygotowano również kontrole: negatywną i pozytywną (anti-FceRI mAb i fMLP). Uzyskane wyniki wskazują na brak aktywacji granulocytów w obecności IM (0,1 μg/ml) - wartości niższe niż w kontroli negatywnej (wykres poniżej). Świadczy to bardzo niskim prawdopodobieństwie wywołania reakcji alergicznej przez peptyd IM u ludzi (Fig. 8).
Przykład 8:
Ocena profilu transkryptomicznego komórek ASCs pod wpływem peptydu IM
Sprawdzono wpływ dodatku peptydu IM na profil transkryptomiczny pierwotnych linii komórkowych - mezenchymalnych komórek macierzystych pochodzących z tkanki tłuszczowej (ang. ASCs Adipose Derived Stern Cells). Podskórną tkankę tłuszczową pozyskano od trzech zdrowych pacjentów Kliniki Chirurgii Plastycznej GUMed (zgoda nr NKBBN/387/2014 Niezależnej Komisji Bioetycznej ds. Badań Naukowych GUMed). Izolację komórek ASCs przeprowadzono wg standardowego protokołu (Gerlach et al. 2012) w pożywce DMEM Iow glucose (Dulbecco’s modified Eagle medium) z dodatkiem 10% surowicy bydlęcej (FBS - Fetal Bovine Serum). Wpływ peptydu IM badano po drugim pasażu, w taki sposób, że po zmianie pożywki komórki były hodowane przez 24 h z dodatkiem 10% FBS, kolejne 24 h z 5% FBS, a następnie przez 48 h wyłącznie z dodatkiem peptydu IM w stężeniu 0,1 μg/ml. Jako kontroli użyto komórek ASCs, które przez ostatnie 48 h były hodowane bez żadnych czynników stymulujących (kontrola bez dodatku FBS). Po etapie stymulacji komórki poddano trypsynizacji, płukaniu, a z zamrożonych pelletów komórkowych izolowano RNA do badań transkryptomicznych (dla prób o współczynniku RNA Integrity Number> 7). Dla prób pozyskanych od trzech pacjentów (oznaczonych odpowiednio symbolami PS, PS8 oraz PS9) przeprowadzono wysokoprzepustowe sekwencjonowanie RNA w celu profilowania całego transkryptomu. Otrzymane fragmenty po sekwencjonowaniu zmapowano do genomu referencyjnego człowieka (edycja hg19) z użyciem oprogramowania TopHat. Analizy porównawcze profili transkryptomicznych ASCs traktowanych peptydem IM przeprowadzono w odniesieniu do kontroli FBS Min (komórki ASCs hodowane bez dodatku czynników stymulujących) z wykorzystaniem pakietu Cufflinks według procedury opisanej przez twórców oprogramowania (workflow for Cufflinks version 2.2.0 and higher - http://cole-trapnell-lab.qithub.io/cufflinks/manual/). Wyniki badań porównawczych dla poszczególnych prób pojedynczo oraz dla triplikatu w postaci matryc DGE (ang.
PL 237 242 Β1
Differential Gene Expression) poddawano analizie funkcjonalnej w pakiecie Ingenuity Pathway Analysis (IPA).
IPA pozwala na analizę zmian transkryptów w badanym zestawie danych i powiązanie ich ze zmianami regulatorów „upstream” oraz zjawiskami biologicznymi zachodzącymi w wyniku tych zmian (tzw. „downstream effects”). Współczynnik, który opisuje dopasowanie tych danych to „consistency score”. Sieć regulatorowa o najwyższym consistency score (29,69) dla pacjenta o symbolu PS9 wykazała wyraźną aktywację komórek, zwiększenie migracji i chemotaksji, aktywację odpowiedzi immunologicznej i aktywację syntezy tlenku azotu (Fig. 9 - góra). Dla pacjenta PS1 obserwowano podobne efekty biologiczne, przy czym przy wyraźnie wyższych wartościach p-value (Fig. 9 - środek), zaś dla pacjenta PS8 zmiany miały charakter przeciwny (Fig. 9 - dół).
Dodatkowo dla pacjenta PS9, którego komórki ASCs najsilniej zareagowały na stymulację peptydem IM zaobserwowano całą listę aktywowanych zjawisk biologicznych (Tabela 1).
Tabela 1. Lista zjawisk biologicznych aktywowanych w komórkach ASCs pochodzących od pacjenta PS9 w wyniku stymulacji peptydem IM (0.1 gg/ml). Z-scorejest algorytmem w IPA pozwalającym na identyfikację zjawisk i funkcji aktywowanych (z-score > 2) lub hamowanych (z-score < -2) w wyniku zmian ekspresji obserwowanych w badanym zestawie danych.
| Zjawisko | z-score | Kierunek zmiany | p-value | Ilość z aangażowanych transkryptów |
| Aktywacja komórek | 3,84E-03 | Aktywacja | 2,685 | 21 |
| Odpowiedź zapalna | L33E-04 | Aktywacja | 2,628 | 25 |
| Chemotaksja | 3,57E-07 | Aktywacja | 2,555 | 29 |
| Ruchy komórkowe | L48E-06 | Aktywacja | 2,455 | 68 |
| Synteza tlenku azotu | 6,62E-04 | Aktywacja | 2,391 | 9 |
| Transaktywacja RNA | l,22E-03 | Aktywacja | 2,318 | 20 |
| Ruchy komórkowe granulocytów | L67E-03 | Aktywacja | 2,316 | 12 |
| Przepuszczalność komórek śródblonka | 2J5E-03 | Aktywacja | 2,193 | 5 |
| Wiązanie neutrofili | 2,82E-03 | Aktywacja | 2,168 | 6 |
| Migracja komórek śródblonka | l,21E-05 | Aktywacja | 2,149 | 22 |
| Sekrecja lipidów | 3,45E-03 | Aktywacja | 2,122 | 7 |
| Ruchy komórkowe neutrofili | 4,48E-04 | Aktywacja | 2,099 | 11 |
| Migracja komórek | l,78E-04 | Aktywacja | 2,063 | 55 |
| Synteza kwasów tłuszczowych | l,12E-03 | Aktywacja | 2,021 | 13 |
Przykład 9:
Ocena profilu transkryptomicznego komórek ASCs oraz keratynocytów pod wpływem peptydu IM
PL 237 242 B1
W celu określenia działania pochodnych IM na ekspresję genów pluripotencji i regulacji cyklu komórkowego, wykonano szereg hodowli ludzkich linii komórkowych ASC oraz keratynocytów pobranych od pacjentów. Hodowle stymulowano pochodnymi IM w 2 różnych stężeniach (0,1 pg/ml i 1,0 pg/ml). Jako kontrolę przyjęto hodowlę linii komórkowych ASC bez dodatku FBS (oznaczona jako Kontrola). Zbadano poziomy transkryptów dla panelu genów obejmującego CDKN1A, MYC, KIT, POU5F1, TGFB3, TP53. Izolacja RNA została wykonana przy użyciu zestawu RNeasy (Qiagen). Poziomy wybranych transkryptów wyznaczono przy użyciu metody ilościowego PCR w czasie rzeczywistym przy wykorzystaniu TBP i ACTB jako transkryptów referencyjnych.
W niemal wszystkich zbadanych przypadkach nie zaobserwowano znamiennej odpowiedzi transkrypcyjnej na stymulację komórek ASC peptydem IM. Jedynie w wypadku działania peptydem IM 0,1 pg/ml linii ASC wyprowadzonej od pacjenta 1 (Fig. 10) wykazano bardzo silny, ponad jeden rząd wielkości wzrost ekspresji transkryptu POU5F1 - odpowiedzialnego za rozwój embrionalny i pluripotencję komórek macierzystych.
W niemal wszystkich zbadanych przypadkach nie zaobserwowano znamiennej odpowiedzi transkrypcyjnej na stymulację keratynocytów peptydem IM. Jedynie w wypadku działania peptydem IM 0,1 pg/ml na linię keratynocytów wyprowadzonej od pacjenta 4 widać duży wzrost ekspresji transkryptów POU5F1 (odpowiedzialnego za rozwój embrionalny i pluripotencję komórek macierzystych) oraz CDKN1A (odpowiedzialnego za regulację cyklu komórkowego) (Fig. 11). Dodatkowo, dla tej samej hodowli, zauważyć można spadek poziomu ekspresji transkryptu MYC (odpowiedzialnego za aktywację transkrypcyjnych genów związanych ze wzrostem komórek).
Brak znaczącej reakcji transkrypcyjnej genów kodujących czynniki kluczowe dla regulacji proliferacji (CDKN1A, TP53), w tym onkogenów (MYC, KIT) można interpretować jako korzystną właściwość IM, ponieważ wyniki takie sugerują, że działanie pro-regeneracyjne IM nie pociągałoby za sobą zaburzenia cyklu komórkowego lub aktywacji onkogenów (Fig. 10 i Fig. 11).
MODEL ZWIERZĘCY
P r z v k ł a d 10:
Wpływ peptydu IM na regenerację tkanki złożonej u myszy szczepu C57BL6/J
Jako model doświadczalny wybrano myszy szczepu C57BL6, samice, w wieku 7-9 tygodni w momencie rozpoczęcia eksperymentu. W dniu rozpoczęcia eksperymentu za pomocą sterylnej sztancy biopsyjnej o średnicy 2 mm wykonywano po jednym otworze w lewej i prawej małżowinie usznej u myszy. Peptyd IM podawano w ilości 5 pg/g masy ciała myszy w iniekcjach podskórnych między łopatki. Roztwór iniekcyjny był przyrządzany w soli fizjologicznej i podawany raz dziennie, w dniu indukcji uszkodzenia, przez kolejne cztery dni, a następnie raz w tygodniu, licząc od dnia 7 do 42, kiedy zwierzęta były poddane eutanazji i pobierano próbki tkankowe. Co 7 dni kondycję myszy dokumentowano zbierając fotografie. Zwierzęta otrzymujące w identycznym układzie i z identyczną częstotliwością samą sól fizjologiczną stanowiły kontrolę do przeprowadzonych eksperymentów. Uszy fotografowano co 7 dni przez 42 dni, a przebieg zarastania otworu śledzono wyznaczając jego powierzchnię za pomocą komputerowej analizy wykonanych zdjęć (ImageJ). Łącznie przeanalizowano 8 myszy w grupie badawczej, 18 myszy w grupie kontrolnej. Zliczano i porównywano pole powierzchni otworów w uszach myszy z grup badawczej i kontrolnej w poszczególnych dniach zdjęciowych.
Protokół eksperymentów na zwierzętach został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyczną nr 1 w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego w Warszawie (nr zgody 491/2013, z uwzględnieniem uchwały nr 799/2015).
Regeneracja wielotkankowa badana była na podstawie zarastania otworu w małżowinie myszy. Średnie powierzchnie otworu w małżowinie usznej wyznaczone w dniu 42 po uszkodzeniu wynosiły dla myszy C57BL6J traktowanych IM i kontroli otrzymujących sól fizjologiczną, odpowiednio, 1,67 ± 0,37 mm2 i 3,14 ± 0,43 mm2 (Fig. 12 i Fig. 13).
P r z v k ł a d 11:
Wpływ peptydu IM na regenerację tkanki złożonej u myszy szczepu Balb/C
Jako model doświadczalny wybrano myszy szczepu BALBc, samice, w wieku 7-9 tygodni w momencie rozpoczęcia eksperymentu. W dniu rozpoczęcia eksperymentu za pomocą sterylnej sztancy biopsyjnej o średnicy 2 mm wykonywano po jednym otworze w lewej i prawej małżowinie usznej u myszy. Peptyd IM podawano w ilości 5 pg/g masy ciała myszy w iniekcjach podskórnych między łopatki. Roztwór iniekcyjny był przyrządzany w soli fizjologicznej, i podawany raz dziennie, w dniu indukcji
PL 237 242 B1 uszkodzenia, przez kolejne cztery dni, a następnie raz w tygodniu, licząc od dnia 7 do 42, kiedy zwierzęta były poddane eutanazji i pobierano próbki tkankowe. Co 7 dni kondycję myszy dokumentowano zbierając fotografie. Zwierzęta otrzymujące w identycznym układzie i z identyczną częstotliwością samą sól fizjologiczną stanowiły kontrolę do przeprowadzonych eksperymentów. Uszy fotografowano co 7 dni przez 42 dni, a przebieg zarastania otworu śledzono wyznaczając jego powierzchnię za pomocą komputerowej analizy wykonanych zdjęć (ImageJ). Łącznie przeanalizowano 12 myszy w grupie badawczej oraz 12 myszy w grupie kontrolnej. Zliczano i porównywano pole powierzchni otworów w uszach myszy z grup badawczej i kontrolnej w poszczególnych dniach zdjęciowych.
Protokół eksperymentów na zwierzętach został zatwierdzony przez Lokalną Komisję Etyczną nr 1 w Instytucie Biologii Doświadczalnej im. M. Nenckiego w Warszawie (nr zgody 491/2013, z uwzględnieniem uchwały nr 799/2015).
Regeneracja wielotkankowa badana była na podstawie zarastania otworu w małżowinie myszy. Średnie powierzchnie otworu w małżowinie usznej wyznaczone w dniu 42 po uszkodzeniu wynosiły dla myszy BALB/c traktowanych IM i kontroli otrzymujących sól fizjologiczną 1,65 ± 0,29 i 1,95 ± 0,39 mm2 (Fig. 14 i Fig. 15).
Preparaty histopatologiczne:
Obrazy histopatologiczne małżowiny usznej u myszy po 42 dniach od rozpoczęcia procedury podawania: (A1 oraz powiększenie A2) IM (5 pg/g masy ciała) w odniesieniu do (B1 i powiększenie B2) myszy otrzymujących tylko nośnik (buforowany roztwór soli fizjologiczn ej). U myszy traktowanych IM (A1 i A2) obserwuje się naskórek w fazie mniej zróżnicowanej (Fig. 16 - lewa strona), co może się wiązać z zachodzącymi procesami reorganizacji/przebudowy, podczas gdy w kontroli (B1 i B2) (Fig. 16 - prawa strona) naskórek jest w fazie bardziej dojrzałej/zróżnicowanej. W kontroli skóra jest zwarta a keratynocyty podstawne są w większości spłaszczone. Naskórek myszy z podanym IM jest pogrubiony z powiększonymi kolumnowymi komórkami podstawnymi. Warstwa ziarnista i ziarna keratohialiny występują licznie u myszy otrzymujących sam nośnik w przeciwieństwie do skóry myszy z podanym IM. U myszy z podanym IM nabłonek wykazuje rozległą parakeratozę (obecność jąder warstwy rogowej naskórka). Może to być związane ze skróceniem czasu przejścia keratynocytu (ang. turnover time) z warstwy podstawnej naskórka do warstwy rogowej. Myszy z podanym IM posiadają zwartą warstwę rogową. Dodatkowo, przestrzenie międzykomórkowe warstwy kolczystej w tkance po IM są bardziej poszerzone niż w kontroli, gdzie komórki są już ściśle upakowane. W wewnętrznej części małżowiny usznej po działaniu IM obserwuje się nieznacznie większą gęstość fibroblastów niż w kontroli, dodatkowo fibroblasty te są mniej dojrzałe, choć w obu przypadkach ogólny obraz mieszaniny fibroblastów (ziarniny) jest dość zbliżony.
Wnioski:
Stosowanie peptydu IM powoduje przyspieszenie procesu regeneracji tkanki złożonej. Potwierdzają to badania proliferacji i migracji na liniach komórkowych fibroblastów i keratynocytów. Peptyd IM nie jest cytotoksyczny w szerokim zakresie stężeń. Jest również bezpieczny pod względem immunologicznym i onkologicznym. Przyspieszenie regeneracji po zastosowaniu peptydu IM potwierdziły badania in vivo na myszach, wg modelu uszkodzenia małżowiny usznej. Statystycznie lepsza regeneracja w małżowinie usznej odbywała się u myszy otrzymujących IM w obydwu szczepach myszy w porównaniu do myszy otrzymujących sól fizjologiczną. Widoczny był wyraźny efekt zmniejszenia otworu u myszy otrzymujących IM w 14 dniu podania. Efekt ten utrzymywał się do końca trwania eksperymentu. Maksymalne zarośnięcie widoczne było ok. 28 dnia eksperymentu. Wyniki uzyskane w szczepie Balb/C potwierdzają udział peptydu IM w regeneracji wielotkankowej obserwowane również w szczepie C57BL6/J. Uzyskane wyniki wskazują, że w odtworzonych tkankach stymulowanych peptydem IM proces wypełniania otworu zregenerowaną tkanką rozpoczyna się wcześniej w porównaniu z kontrolną. Zastosowanie peptydu IM wpływa na jakość odtworzonej tkanki. Powstała tkanka ma cechy tkanki młodszej, o większym potencjalne regeneracyjnym. Podsumowując, IM hamuje różnicowanie keratynocytów i opóźnia zamknięcie bariery nabłonkowej, co może sprzyjać tworzeniu blastemy i przyspieszać regenerację skóry. Blastemę tworzą niezróżnicowane komórki pluripotentne. Blastemę obserwuje się na wczesnych okresach rozwoju organizmu bądź podczas regeneracji.
Nie jest znany mechanizm działania peptydu IM. Najprawdopodobniej jest on związany w jakimś stopniu z regulacją układu odpornościowego organizmu ssaka, na co wskazują wcześniejsze badania prowadzone dla peptydu IM. W powyższych testach nie zaobserwowano zmian w zakresie aktywacji układu immunologicznego, co najprawdopodobniej wynika z faktu prowadzenia badań na izolowanych
PL 237 242 B1 układach/modelach a nie na całym organizmie/układzie immunologicznym. Aktywację mechanizmów sprzyjających regeneracji pod wpływem IM można również zauważyć na przykładzie zwiększonej ilości transkryptów proregeneracyjnych pod wpływem peptydu IM wobec komórek ASC w analizie transkryptomicznej.
LITERATURA:
[1] Pisarev, V.M.; Tutel'ian, A.V.; Danilina, A.V.; Kremlev, S.G.; Tkacheva, T.D.; Lebedeve, V.V.; Pevnitskii, L.A.; Mechanisms of inhibiting production of tumor necrosis factor alpha by the synthetic hexapeptide - immunophane. Vopr. Med. Khim. 1995, 41,5-11.
[2] http://imunofan.coo.rs/imunofan-u-ampulama
[3] Buckley, G.; Metcalfe, A.D.; Ferguson, M.W.; Peripheral nerve regeneration in the MRL/MpJ ear wound model. J. Anat. 2011,218, 163-172.
[4] Gerlach, J.C.; Lin, Y.C.; Brayfield, C.A.; Minteer, D.M.; Li, H.; Rubin, J.P.; Marra, K.G.; Adipogenesis of Human Adipose-Derived Stem Cells Within Three-Dimensional Hollow Fiber-Based Bioreactors. Tissue Eng. Part C Methods 2012, 18, 54-61.
[5] Kim, D.; Pertea, G.; Trapnell, C.; Pimentel, H.; Kelley, R.; Salzberg, S.L.; TopHat2: accurate alignment of transcriptomes in the presence of insertions, deletions and gene fusions. Genome Biol. 2013, 14, R36.
[6] Trapnell, C.; Williams, B.A.; Pertea, G.; Mortazavi, A.; Kwan, G.; van Baren, M.J.; Salzberg, S.L.; Wold, B.J.; Pachter L.; Transcript assembly and quantification by RNA-Seq reveals unannotated transcripts and isoform switching during cell differentiation. Nat. Biotechnol. 2010, 28, 511-515.
[7] Liu, H.; Mu, L.; Tang, J.; Shen, C.; Gao, C.; Rong, M.; Zhang, Z.; Liu, J.; Wu, X.; Yu, H.; et al. A potential wound healing-promoting peptide from frog skin. Int. J. Biochem. Cell Biol. 2014, 49, 32-41.
[8] Nakagami, H.; Nishikawa, T.; Tamura, N.; Maeda, A.; Hibino, H.; Mochizuki, M.; Shimosato, T.; Moriya, T.; Morishita, R.; Tamai, K.; Tomono, K.; Kaneda, Y.; Modification of a novel angiogenic peptide, ag30, for the development of novel therapeutic agents. J. Cell. Mol. Med. 2012, 16, 1629-1639.
[9] Tang, J.; Liu, H.; Gao, C.; Mu, L.; Yang, S.; Rong, M.; Zhang, Z.; Liu, J.; Ding, Q.; Lai, R.; A small peptide with potential ability to promote wound healing. PLoS ONE 2014, 9, e92082.
[10] Mu, L.; Tang, J.; Liu, H.; Shen, C.; Rong, M.; Zhang, Z.; Lai, R.; A potential woundhealing-promoting peptide from salamander skin. FASEB J. 2014, 28, 3919-3929.
[11] Kępa, A.; Peptydy biomimetyczne i czynniki wzrostu. Kosmetologia Estetyczna. 2013, 2, 105-111.
[12] Clark, L. D.; Clark, R.K.; Heber-Katz, E.; A new murine model for mammalian wound repair and regeneration. Clin. Immunol. Immunopathol. 1998, 88, 35-45.
[13] Leferovich, J. M.; Bedelbaeva, K.; Samulewicz, S.; Zhang, X.M.; Zwas, D.; Lankford, E.B.; Heber-Katz, E.; Heart regeneration in adult MRL mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2001,98,9830-9835.
[14] Chadwick, R. B.; Bu, L.; Yu, H.; Hu, Y.; Wergedal, J.E.; Mohan, S.; Baylink, D.J.; Digit tip regrowth and differential gene expression in MRL/Mpj, DBA/2, and C57BL/6 mice. Wound Repair Regen. 2007, 15, 275-284.
[15] Xia, H.; Krebs, M.P.; Kaushal, S.; Scott, E.W.; Enhanced retinal pigment epithelium regeneration after injury in MRL/MpJ mice. Exp. Eye Res. 2011,93, 862-872.
[16] Ueno, M.; Lyons B.L.; Burzenski, L.M.; Gott, B.; Shaffer, D.J.; Roopenian, D.C.; Shultz, L.D.; Accelerated wound healing of alkali-burned corneas in MRL mice is associated with a reduced inflammatory signature. Invest. Ophthalmol. Vis. Sci. 2005, 46, 4097-4106.
[17] Thuret, S.; Thallmair, M.; Horky, L.L.; Gage, F.H.; Enhanced functional recovery in MRL/MpJ mice after spinal cord dorsal hemisection. PLoS ONE. 2012, 7, e30904.
[18] Lalley, A. L.; Dyment, N.A.; Kazemi, N.; Renter, K.; Gooch, C.; Rowe, D.W.; Butler, D.L.; Shearn, J.T.; Improved biomechanical and biological outcomes in the MRL/MpJ murine strain following a full-length patellar tendon injury. J. Orthop. Res. 2015, 33, 1693-1703.
PL 237 242 B1
[19] Fitzgerald, J.; Rich, C.; Burkhardt, D.; Allen, J.; Herzka, A.S.; Little, C.B.; Evidence for articular cartilage regeneration in MRL/MpJ mice. Osteoarthritis Cartilage. 2008, 16, 1319-1326.
[20] Bastakoty, D.; Saraswati, S.; Cates, J.; Lee, E.; Nanney L.B.; Young, P.P.; Inhibition of Wnt/3-catenin pathway promotes regenerative repair of cutaneous and cartilage injury. FASEB J. 2015, 29, 4881-4892.
[21] Zhang, Y.; Strehin, I.; Bedelbaeva, K.; Gourevitch, D.; Clark, L.; Leferovich, J.; Messersmith, P.B.; Heber-Katz, E.; Drug-induced regeneration in adult mice. Sci Transl Med. 2015, 7, 290ra292.
[22] Jabłońska, S.; Majewski S.; Choroby skóry i choroby przenoszone drogą płciową. PZWL 2005, ISBN 83-200-3367-5.
[23] Nasadyuk, C.Ł Sklyarov, A.; Thymohexin exhibits cytoprotective effect in experimental gastric lesions in rats both through the inhibition of inducible nitric oxide synthase and reduction of oxidative mucosal damage, Regulatory Peptides 2013 180, 50-57.
[24] Lebedev V. V.; Kremlev S. G.; Pisarev V. M.; Tutel’yan A. V.,; Effect of the synthetic regulatory peptide thymohexin on the production of various classes of immunoglobulins,. Bull. Exp. Biol. Med., vol. 118, no. 4, pp. 1117-1120, 1994.
[25] BIONOX, “Research and Production Enterprise NPP ‘ΒΙΟΝΟΧ,’” 1991. [Online]. Available: http://www.imunofan.ru/eng/bionox_im.pdf. [Accessed: 19-Feb-2018].
[26] BIONOX, “About NPP Bionox and immunomodulator IMUNOFAN,” 1991. [Online]. Available: http://www.imunofan.ru/eng/bionox_im.pdf. [Accessed: 18-Feb-2018].
[27] Lebedev V. V.,; Modern aspects of peptide immuno-modulating agent use in the system of vaccinal prevention and vaccinal therapy.” [Online]. Available: http://www.imuno- fan.ru/eng/vac_im.pdf. [Accessed: 19-Feb-2018].
[28] Lebedev V. V.,; Novikov S. A.,; Hydrophilic hexapeptide imunofan as a hyperactive regulator of transport proteins for multiple drug resistance. Bull. Exp. Biol. Med., vol. 142, no. 6, pp. 693-695, 2006.
[29] Pukhalsky A. L.; Bliacher M. S.; Danilina A. V.; Kalashnikova E. A.; Lopatina T. K.; Fedorova I. M.; Changes in TNF and IL-6 production after diphtheria toxoid vaccination: drug modulation of the cytokine levels; Mediators Inflamm, vol. 5, no. 6, pp. 429-433, 1996.
[30] Nasadyuk C.; Sklyarov A.,; Thymohexin exhibits cytoprotective effect in experimental gastric lesions in rats both through the inhibition of inducible nitric oxide synthase and reduction of oxidative mucosal damage,.; Regul. Pept., vol. 180, no. 1, pp. 50-57, Jan. 2013.
[31] Mamykova O. I.; Negative impact of Imunofan modulation on a result of specific therapy of helminthiases; Russ. Agric. Sci., vol. 43, no. 1, pp. 66-70, 2017.
Claims (3)
1. Peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania jako środek do pobudzania regeneracji tkanki złożonej lub leczenia ran wywołanych przez uszkodzenia mechaniczne i/lub chemiczne i/lub termiczne i/lub radiacyjne i/lub operacje chirurgiczne i/lub inne stany patologiczne.
2. Peptyd RDKVYR według zastrz. 1, znamienny tym, że ma postać iniekcji.
3. Peptyd RDKVYR według zastrz. 1-2, znamienny tym, że stosuje się dawkę RDKVYR o stężeniu 0,1-50 μg/ml.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425351A PL237242B1 (pl) | 2018-04-24 | 2018-04-24 | Peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w procesie regeneracji tkanki złożonej i gojenia się ran u ssaków |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL425351A PL237242B1 (pl) | 2018-04-24 | 2018-04-24 | Peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w procesie regeneracji tkanki złożonej i gojenia się ran u ssaków |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL425351A1 PL425351A1 (pl) | 2019-11-04 |
| PL237242B1 true PL237242B1 (pl) | 2021-03-22 |
Family
ID=68501230
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL425351A PL237242B1 (pl) | 2018-04-24 | 2018-04-24 | Peptyd RDKVYR lub jego farmaceutycznie dopuszczalna sól do zastosowania w procesie regeneracji tkanki złożonej i gojenia się ran u ssaków |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL237242B1 (pl) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4721751A1 (en) | 2024-10-07 | 2026-04-08 | Gdanski Uniwersytet Medyczny | Pharmaceutical composition with protective and pro-regenerative effects and its use |
-
2018
- 2018-04-24 PL PL425351A patent/PL237242B1/pl unknown
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP4721751A1 (en) | 2024-10-07 | 2026-04-08 | Gdanski Uniwersytet Medyczny | Pharmaceutical composition with protective and pro-regenerative effects and its use |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL425351A1 (pl) | 2019-11-04 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Yuan et al. | Cell-adaptable dynamic hydrogel reinforced with stem cells improves the functional repair of spinal cord injury by alleviating neuroinflammation | |
| Meng et al. | Solubilized extracellular matrix from brain and urinary bladder elicits distinct functional and phenotypic responses in macrophages | |
| JP6472142B2 (ja) | Ｈｃ−ｈａ／ｐｔｘ３複合体を含む組成物およびその使用方法 | |
| CA2801010C (en) | Peptide and use thereof for treatment of cartilage damage and arthritis | |
| Tucker et al. | The use of progenitor cell/biodegradable MMP2–PLGA polymer constructs to enhance cellular integration and retinal repopulation | |
| Zhang et al. | Inhibition of histone deacetylase-induced myocardial repair is mediated by c-kit in infarcted hearts | |
| Wu et al. | MSC-derived extracellular vesicles: roles and molecular mechanisms for tissue repair | |
| KR20090086066A (ko) | 당뇨성 창상 치유에 유용한 방법 및 조성물 | |
| EP2365815A2 (en) | Extracellular matrix compositions for the treatment of cancer | |
| Zhao et al. | Preparation of decellularized biphasic hierarchical myotendinous junction extracellular matrix for muscle regeneration | |
| CN112955161B (zh) | 通过活化细胞修复组织 | |
| Shteyer et al. | Reduced liver cell death using an alginate scaffold bandage: A novel approach for liver reconstruction after extended partial hepatectomy | |
| Liu et al. | Impact of marine-based biomaterials on the immunoregulatory properties of bone marrow-derived mesenchymal stem cells: potential use of fish collagen in bone tissue engineering | |
| CN114191555A (zh) | 一种治疗勃起功能障碍的药物及其应用 | |
| CN110507668A (zh) | 用于治疗免疫性疾病的干细胞制剂及其应用 | |
| AU2019295576B2 (en) | Compositions and methods for propagating insulin-producing islet cells and therapeutic uses thereof | |
| US20180318357A1 (en) | Pharmaceutical composition for treating diabetes, comprising pancreatic islet cells and elastin-like artificial extracellular matrix | |
| Cheng et al. | A new function of a previously isolated compound that stimulates activation and differentiation of myogenic precursor cells leading to efficient myofiber regeneration and muscle repair | |
| PL240667B1 (pl) | Peptyd, będący fragmentem płytkopochodnego czynnika wzrostu do zastosowania jako środek leczniczy do podania na skórę w zaburzeniach naskórka do stymulacji odbudowy naskórka | |
| KR20070084456A (ko) | 피불린-5의 생성을 촉진 및/또는 활성을 항진시키기 위한조성물 및 방법 | |
| Yan et al. | Rosuvastatin-loaded injectable immunomodulatory hydrogel mitigates local immune response against transplanted stem cells and promotes heart repair in vivo | |
| Liao et al. | A cationic thermosensitive polymer scaffold combined with fibroblast growth factor-4/insulin-like growth factor-1 (FGF-4/IGF-1) promotes liver regeneration in acute liver failure | |
| JPH0411896A (ja) | 細胞毒性因子 | |
| WO2012009538A2 (en) | Adipocyte-derived membrane extract with biological activity | |
| Uspenskaya et al. | Induction of apoptosis in bone marrow cells is mediated via purinergic receptors |