PL237408B1 - Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka wątrobowokomórkowego - Google Patents
Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka wątrobowokomórkowego Download PDFInfo
- Publication number
- PL237408B1 PL237408B1 PL424804A PL42480418A PL237408B1 PL 237408 B1 PL237408 B1 PL 237408B1 PL 424804 A PL424804 A PL 424804A PL 42480418 A PL42480418 A PL 42480418A PL 237408 B1 PL237408 B1 PL 237408B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- extract
- cells
- hepatocellular carcinoma
- cochlospermum
- angolense
- Prior art date
Links
- 239000000284 extract Substances 0.000 title claims description 38
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 title claims description 24
- 231100000844 hepatocellular carcinoma Toxicity 0.000 title claims description 23
- 241000480100 Cochlospermum angolense Species 0.000 title claims description 15
- 230000000259 anti-tumor effect Effects 0.000 title claims description 10
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims description 7
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 9
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 6
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 claims description 6
- 238000002803 maceration Methods 0.000 claims description 5
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 claims description 3
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 241000934834 Cochlospermum Species 0.000 claims description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims description 2
- 238000001704 evaporation Methods 0.000 claims description 2
- 230000008020 evaporation Effects 0.000 claims description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 40
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 19
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 18
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 12
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 5
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 4
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000012656 cationic ring opening polymerization Methods 0.000 description 3
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 3
- OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;hexane Chemical compound CCCCCC.CCOC(C)=O OAYLNYINCPYISS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 3
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 3
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 3
- 231100000002 MTT assay Toxicity 0.000 description 2
- 238000000134 MTT assay Methods 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 2
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 2
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 2
- 239000002026 chloroform extract Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 2
- 235000015872 dietary supplement Nutrition 0.000 description 2
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 2
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 2
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 2
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 description 2
- BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N renifolin D Natural products CC(=C)[C@@H]1Cc2c(O)c(O)ccc2[C@H]1CC(=O)c3ccc(O)cc3O BOLDJAUMGUJJKM-LSDHHAIUSA-N 0.000 description 2
- UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N streptomycin Chemical compound CN[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](CO)O[C@H]1O[C@@H]1[C@](C=O)(O)[C@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@@H](NC(N)=N)[C@H](O)[C@H]1O UCSJYZPVAKXKNQ-HZYVHMACSA-N 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide Chemical compound [Br-].S1C(C)=C(C)N=C1[N+]1=NC(C=2C=CC=CC=2)=NN1C1=CC=CC=C1 AZKSAVLVSZKNRD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 244000019459 Cynara cardunculus Species 0.000 description 1
- 235000019106 Cynara scolymus Nutrition 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 206010019851 Hepatotoxicity Diseases 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 208000030852 Parasitic disease Diseases 0.000 description 1
- 229930182555 Penicillin Natural products 0.000 description 1
- JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N Penicillin G Chemical compound N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C(O)=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 JGSARLDLIJGVTE-MBNYWOFBSA-N 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000223960 Plasmodium falciparum Species 0.000 description 1
- 229940123066 Polymerase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 241000320380 Silybum Species 0.000 description 1
- 235000010841 Silybum marianum Nutrition 0.000 description 1
- 238000000692 Student's t-test Methods 0.000 description 1
- 102000019259 Succinate Dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108010012901 Succinate Dehydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000000844 anti-bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000001093 anti-cancer Effects 0.000 description 1
- 230000000078 anti-malarial effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003430 antimalarial agent Substances 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000016520 artichoke thistle Nutrition 0.000 description 1
- 235000021466 carotenoid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001747 carotenoids Chemical class 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000007541 cellular toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008602 contraction Effects 0.000 description 1
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 201000006549 dyspepsia Diseases 0.000 description 1
- UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N ethyl acetate;methanol Chemical compound OC.CCOC(C)=O UREBWPXBXRYXRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010016256 fatigue Diseases 0.000 description 1
- 231100000304 hepatotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007686 hepatotoxicity Effects 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000001172 liquid--solid extraction Methods 0.000 description 1
- 201000007270 liver cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000019423 liver disease Diseases 0.000 description 1
- 230000005976 liver dysfunction Effects 0.000 description 1
- 208000014018 liver neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000002879 macerating effect Effects 0.000 description 1
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001000 micrograph Methods 0.000 description 1
- 230000002438 mitochondrial effect Effects 0.000 description 1
- 230000004660 morphological change Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N n'-amino-n-iminomethanimidamide Chemical compound N\N=C\N=N VMGAPWLDMVPYIA-HIDZBRGKSA-N 0.000 description 1
- 244000045947 parasite Species 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 229940049954 penicillin Drugs 0.000 description 1
- 239000000419 plant extract Substances 0.000 description 1
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 1
- 229960005322 streptomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- -1 tetrazole salt Chemical class 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
Landscapes
- Medicines Containing Plant Substances (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Compounds Of Unknown Constitution (AREA)
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense Welw. ex Oliv, o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense Welw. ex Oliv. syn. Maximilianea angolensis (Welw. ex Oliv.) Kuntze w leczeniu raka wątrobowokomórkowego oraz do wytwarzania preparatu farmaceutycznego do leczenia raka wątrobowokomórkowego.
Cochlospermum angolense, zwane potocznie Borututu, występuje w środowisku naturalnym w południowo-zachodniej Afryce. Napar z kory korzenia borututu znalazł zastosowanie w suplementacji diety u osób z zaburzeniami czynności wątroby, niestrawności i zmęczenia. Znany jest również hamujący wpływ naparu z korzenia Cochlospermum angolense na rozwój Plasmodium falciparum, zarodźca sierpowatego - pierwotniaka będącego jednym z głównych patogenów, wywołujących malarię u ludzi, co udokumentowali Presber, Hegenscheid (ACTA TROP, 1992, 50(4):331-8). Z ich publikacji z 1987 roku (Presber W, Hegenscheid B i in., PHARMAZIE, 1987, 42(10):707-8.) znane są również właściwości przeciwwirusowe naparu z korzenia tej rośliny. Pereira, Barros, Calhelha i in. w publikacjach z lat 2013-2015 (Pereira C, Calhelha R i in., IND CROP PROD, 2013;49:61-5; Pereira C, Barros L i in., IND CROP PROD, 2015, 74 412-6; Pereira C, Calhelha R i in., IND CROP PROD, 2014, 52:709-13) wykazali aktywność antyoksydacyjną, antybakteryjną oraz cytotoksyczną w stosunku do komórek raka wątroby różnych suplementów diety na bazie ekstraktów wodnych z korzenia borututu. Z kolei z opisów patentowych DE 4021428, DE 4021427 i DE4021426, znane jest zastosowanie ekstraktu karotenoidowego z korzenia Cochlospermum angolense do terapii infekcji pasożytniczych, a także jako inhibitora polimerazy, związku o właściwościach antymalarycznych czy antywirusowych.
Dotychczas zbadano cytotoksyczne działanie wodnego ekstraktu Cochlospermum angolense na komórki raka wątrobowokomórkowego (Pereira C i in. Antioxidant properties, anti-hepatocellular carcinoma activity and hepatotoxicity of artichoke, milk thistle and borututu. IND CROP PROD. 2013;49:61-5), jednak wg naszej wiedzy skład jakościowy ekstraktów znacząco się różni w zależności od użytych rozpuszczalników. W literaturze brak jest informacji dotyczącej stosowania chloroformowego ekstraktu z tego surowca lub przetworów z tego surowca w leczeniu raka wątrobowokomórkowego. Wynalazek rozwiązuje zagadnienie zastosowania ekstraktu z Cochlospermum angolense o wysokiej aktywności i w stosunku do komórek raka wątrobowokomórkowego, przy jednoczesnej bardzo niskiej toksyczności w stosunku do komórek ludzkich fibroblastów.
W wyniku badań, okazało się nieoczekiwanie, że ekstrakt z Cochlospermum angolense otrzymany na drodze dwustopniowej ekstrakcji: maceracji chloroformem oraz ekstrakcji heksanem lub octanem etylu i/lub ich mieszaniną (Ex2), wykazuje wysoką aktywność przeciwnowotworową w stosunku do komórek ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (Fig. 1-3), przy jednocześnie nieznacznej toksyczności komórek prawidłowych w najwyższym badanym stężeniu (Fig. 4-5).
Istotą wynalazku jest sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolensis (Borututu), o aktywności przeciwnowotworowej polegający na tym, że sproszkowaną substancję roślinną Borututu maceruje się chloroformem, korzystnie dwukrotnie, każdorazowo przez 12-72 godzin korzystnie 48, stosując korzystnie ilości najpierw 1:20, a następnie 1:10, po czym macerat chloroformowy lub połączone maceraty odparowuje się pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze nie przekraczającej 40°C i suchą pozostałość (SP) miesza się z żelem krzemionkowym w proporcjach wagowych od 1:1 do 1:100 korzystnie 1:10 i poddaje się dalszej ekstrakcji w układzie ciecz/ciało stałe przy użyciu heksanu lub octanu etylu i/lub ich mieszaniną korzystnie w proporcji 1:1, po czym po odparowaniu eluentu otrzymuje się ekstrakt o wysokiej aktywności przeciwnowotworowej. Korzystnie, gdy sproszkowaną substancję roślinną stanowi korzeń Borututu. Korzystnie, gdy dalszą ekstrakcję prowadzi się najpierw pojedynczym rozpuszczalnikiem korzystnie heksanem lub octanem etylu w ilości odpowiednio od 1:40 do 1:120 korzystnie 1:80, a następnie mieszaniną heksan - octan etylu korzystnie w proporcji 1:1, w ilości od 1:100 do 1:400, korzystnie 1:240.
Przedmiotem wynalazku jest także ekstrakt z Cochlospermum angolense Welw. ex Oliv. syn. Maximilianea angolensis (Welw. ex Oliv.), otrzymany na drodze dwustopniowej ekstrakcji: maceracji chloroformem oraz ekstrakcji heksanem lub octanem etylu i/lub ich mieszaniną (Ex2), do zastosowania w leczeniu raka wątrobowokomórkowego.
Ponadto przedmiotem wynalazku jest zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense Welw. ex Oliv. syn. Maximilianea angolensis (Welw. ex Oliv.) otrzymanego sposobem według wynalazku do wytwarzania preparatów farmaceutycznych do leczenia raka wątrobowokomórkowego.
PL 237 408 B1
Ekstrakt roślinny według wynalazku wykazujący wysoką aktywność w stosunku do komórek raka wątrobowokomórkowego, przy jednoczesnej bardzo niskiej toksyczności w stosunku do komórek ludzkich fibroblastów stanowi lepszą alternatywę w leczeniu raka wątrobowokomórkowego w stosunku do leków syntetycznych.
Wynalazek przedstawiono w poniższych przykładach wykonania.
P r z y k ł a d 1. Sproszkowaną substancję roślinną (kora korzenia Cochlospermum angolense) poddano procesowi 48-godzinnej maceracji chloroformem (1:20 w/w), następnie czynność powtórzono dodając do surowca kolejną porcję czystego rozpuszczalnika w czasie jak poprzednio stosując proporcje surowiec rozpuszczalnik (1:10 w/w). Z maceratów chloroformowych odparowano rozpuszczalnik pod zmniejszonym ciśnieniem w temperaturze nie przekraczającej 40°C do suchej pozostałości, którą otrzymując odpowiednio w ilości 2000 mg i 326 mg suchej pozostałości (SP), następnie zmieszano z żelem krzemionkowym w proporcjach wagowych 1:10 i umieszczono w lejku typu Schott. Gradientową elucję prowadzono pod zmniejszonym ciśnieniem rozpuszczalnikami: heksan (200 mL), heksan-octan etylu (300:300 mL v/v). Otrzymano ekstrakt, który oznaczono Ex.2 o masie osadu: 14 mg.
Ponadto prowadzono elucję przy użyciu rozpuszczalników octan etylu-metanol (200:200 mL v/v), metanol (400 mL), woda (100 mL).
Wszystkie otrzymane ekstrakty poddano badaniu w kierunku aktywności przeciwnowotworowej wobec komórek raka wątrobowokomórkowego linii Hep-G2 oraz toksyczności wobec prawidłowych ludzkich fibroblastów linii BJ. Ekstrakt oznaczony jako Ex.2 otrzymany przy użyciu rozpuszczalników heksan, heksan-octan etylu wykazał istotną statystycznie aktywność przeciwnowotworową w stosunku do komórek raka wątrobowokomórkowego (Fig. 1-3).
P r z y k ł a d 2.
W badaniach in vitro oceniono aktywność przeciwnowotworową ekstraktu chloroformowego Cochlospermum angolense oznaczonego jako Ex.2 na komórki ludzkiego raka wątrobowokomórkowego (linia Hep-G2). Hodowle komórkowe prowadzono w butelkach 75 cm2 w odpowiednich dla linii komórkowej medium wzbogaconym 10% inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą FBS i antybiotykami (penicyliną, streptomycyną) w inkubatorze w temperaturze 37°C w atmosferze zawierającej 95% powietrza, 5% CO2 i stałej wilgotności. Po osiągnięciu właściwego stanu konfluencji komórki wysiewano na płytki 96-dołkowe w ilości 5 x 104. Ekstrakt (Ex2) rozpuszczono w DMSO sporządzając stok wyjściowy o stężeniu 20 mg/ml, następnie w celu wyznaczenia wartości IC50 dodawano do komórek w rosnącym szeregu stężeń, tak, że stężenie w pożywce hodowlanej wynosiło 0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/ml. Najwyższe stężenie badanego Ekstraktu (Ex2) użyte do badań wynosiło 0,2 mg/ml, zawartość DMSO wynosiła wtedy 1% (dla zbadania czy nie jest to zbyt wysokie stężenie wykonano kontrolę z samym DMSO).
Po 24 godzinach inkubacji oceniono aktywność przeciwnowotworową badanego Ekstraktu (Ex2) na komórki raka wątrobowokomórkowego poprzez analizę ich morfologii w mikroskopie kontrastowo-fazowym z odwróconą optyką Nikon Eclipse Ti. Uwzględniono zmiany morfologiczne komórek tj. obecność odklejonych i martwych komórek, obkurczenie komórek, zahamowanie wzrostu kolonii i proliferacji. Obserwację porównywano z kontrolą, którą stanowiły komórki raka wątrobowokomórkowego hodowane bez dodatku badanego Ekstraktu (Ex2), co pokazano na rysunku Fig. 3. Następnie na podstawie testu MTT określano żywotność komórek poprzez pomiar aktywności metabolicznej badanych komórek.
Test MTT jest oparty na zdolności enzymu - mitochondrialnej dehydrogenazy bursztynianowej do przekształcania pomarańczowej, rozpuszczalnej w wodzie soli tetrazolowej [bromek 3-(4,5-dimetylotiazol-2-yl)-2,5-difenylotetrazoliowy] do nierozpuszczalnego formazanu będącego ciemno niebieskim produktem powyższej reakcji. Po rozpuszczeniu kryształów formnazanu w DMSO, powstaje barwny roztwór, którego intensywność zabarwienia mierzona jest spektrofotometrycznie w zakresie długości fal 490-570 nm. Ilość barwnego zredukowanego MTT jest proporcjonalna do liczby aktywnych metabolicznie (żywych) komórek w populacji. Test MTT jest obecnie najczęściej stosowany do oceny działania cytotoksycznego i zalecany jako referencyjny przez międzynarodowe organizacje normotwórcze. Z otrzymanych w teście odczytów absorbancji wyliczono % żywotność komórek w obecności badanego związku, przyjmując absorbancję roztworu komórek kontrolnych za 100%.
Wyniki uzyskane w teście MTT analizowano statystycznie w aplikacji STATISTICA v. 12.0 (StaftSoft, Kraków) przy użyciu średnich i standardowych wartości odchylenia. Statystyczną istotność różnic między grupą kontrolną a grupami badanymi oceniono za pomocą testu t-Studenta. Różnice dla p<0,05 przyjęto za istotne statystycznie. Analizę wykonano dla 9 powtórzeń (Fig. 1 oraz 2).
PL 237 408 B1
Fig. 1 przedstawia ocenę żywotności komórek fibroblastów (BJ - po lewej) oraz raka wątrobowokomórkowego (Hep-G2 - po prawej) po 24 godz. ekspozycji na ekstrakt otrzymany na drodze maceracji chloroformem oraz ekstrakty otrzymane poprzez ekstrakcje ciecz-ciało stałe (Ex1-Ex5) w stężeniach 0,005; 0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/mL wykonana przy użyciu testu MTT.
Fig. 2 przedstawia wyniki testu MTT. Ocena żywotności ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego linia Hep-G2 poddanych działaniu badanego Ekstraktu Ex2 w stężeniach 0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/mL w porównaniu do komórek grupy kontrolnej.
Wyniki:
Po 24 godzinnej ekspozycji komórek raka wątrobowokomórkowego na działanie badanego Ekstraktu Ex2 nieoczekiwanie zaobserwowano istotny statystycznie spadek żywotności komórek w porównaniu do komórek grupy kontrolnej (Fig. 1,2). Nasilenie zmian było wprost proporcjonalne do użytego stężenia badanego Ekstraktu Ex2. Przy najwyższym badanym stężeniu 0,2 mg/mL żywotność komórek wynosiła 40%. Wyznaczone IC50 dla Ex2 wynosiło IC50 = 0,195 mg/mL.
Wraz ze wzrostem stężenia badanej substancji nasilały się także zmiany w morfologii komórek raka wątrobowokomórkowego. Fig. 3, Tab. 1 przedstawia morfologię ludzkich komórek raka wątrobowokomórkowego po 24 h inkubacji ze stężeniami 0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/mL badanego Ekstraktu Ex2 w porównaniu do komórek grupy kontrolnej. Obraz z mikroskopu kontrastowo-fazowego, powiększenie x200. Przy stężeniu odpowiadającym wartości IC50 komórki traciły typowy kształt i charakterystyczny zwarty układ. Wzrost w charakterystycznych koloniach ulegał zahamowaniu. Komórki traciły właściwości adherentne względem podłoża i względem sąsiadujących komórek.
Kolejnym etapem badań in vitro była ocena aktywności badanego Ekstraktu Ex2 na komórki prawidłowe - ludzkie fibroblasty linii BJ. Badanie przeprowadzono w sposób analogiczny jak w przypadku komórek raka wątrobowokomórkowego. Po osiągnięciu właściwego stanu konfluencji komórki wysiewano na płytki 96-dołkowe w ilości 3x104 komórek/dołek i hodowano do uzyskania pojedynczej, adherentnej warstwy komórek w każdym dołku. Następnie do poszczególnych dołków z komórkami dodawano pożywkę hodowlaną z wybranymi na podstawie wcześniejszych badań na szpiczaku stężeniami badanego Ekstraktu Ex2 (0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/mL). Najwyższe stężenie badanego Ekstraktu Ex2 użyte do badań wynosiło 0,2 mg/mL, zawartość DMSO wynosiła wtedy 1% (dla zbadania czy nie jest to zbyt wysokie stężenie wykonano kontrolę z samym DMSO).
Po 24 godzinach inkubacji oceniono wpływ badanego Ekstraktu Ex2 na komórki fibroblastów poprzez analizę morfologii komórek w mikroskopie kontrastowo-fazowym z odwróconą optyką Nikon Eclipse Ti oraz wyniki testu MTT. Wyniki porównywano z kontrolą, którą stanowiły komórki fibroblastów hodowane w identycznych warunkach, ale bez dodatku badanego Ekstraktu (Ex2), co pokazano na rysunku Fig. 4 i 5, gdzie na Fig. 4 pokazano wyniki testu MTT oraz ocenę żywotności prawidłowych ludzkich komórek fibroblastów linii BJ poddanych działaniu badanego Ekstraktu Ex2 w stężeniach 0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/mL w porównaniu do komórek grupy kontrolnej. Zaś Fig. 5 przedstawia morfologię prawidłowych ludzkich komórek fibroblastów linii BJ po 24 h inkubacji ze stężeniami 0,01; 0,05; 0,1; 0,2 mg/ml badanego Ekstraktu (Ex2) w porównaniu do komórek grupy kontrolnej - obraz z mikroskopu kontrastowo-fazowego, powiększenie x200.
Uzyskane za pomocą testu (MTT) wyniki wskazują na brak znaczącego działania toksycznego badanego Ekstraktu (Ex2) w stosunku do prawidłowych komórek ludzkich fibroblastów.
Badany Ekstrakt (Ex2) w stężeniach 0,1, 0,05 i 0,01 mg/mL nie powodował widocznych zmian morfologii komórek fibroblastów w porównaniu z kontrolą. W najwyższym stężeniu 0,2 mg/mL widocznie zmniejszyło się zagęszczenie hodowli fibroblastów, jednakże nie zaobserwowano martwych, odklejonych komórek; pływających w podłożu hodowlanym.
Claims (3)
1. Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolensis (Borututu) o aktywności przeciwnowotworowej polegający na maceracji sproszkowanej substancji roślinnej Borututu rozpuszczalnikiem, znamienny tym, że sproszkowaną substancję roślinną Borututu maceruje się chloroformem, korzystnie dwukrotnie, każdorazowo przez 12-72 godzin korzystnie 48 godzin, stosując korzystnie ilości najpierw 1:20, a następnie 1:10, po czym macerat chloroformowy tub połączone maceraty odparowuje się w temperaturze nie przekraczającej 40°C i suchą pozostałość (SP) miesza się z żelem krzemionkowym w proporcjach wagowych od 1:1 do
PL 237 408 B1
1:100, korzystnie 1:10 i poddaje się dalszej ekstrakcji w układzie ciecz/ciało stałe przy użyciu heksanu lub octanu etylu i/lub ich mieszaniną korzystnie w proporcji 1:1, po czym po odparowaniu eluentu otrzymuje się ekstrakt o dużej aktywności przeciwnowotworowej.
2. Sposób według zastrzeż. 1, znamienny tym, że sproszkowaną substancję roślinną stanowi korzeń Borututu.
3. Ekstrakt z Cochlospermum angolense Welw. ex Oliv. syn. Maximilianea angolensis Welw. ex Oliv.) do zastosowania w leczeniu raka wątrobowokomórkowego.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL424804A PL237408B1 (pl) | 2018-03-08 | 2018-03-08 | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka wątrobowokomórkowego |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| PL424804A PL237408B1 (pl) | 2018-03-08 | 2018-03-08 | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka wątrobowokomórkowego |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| PL424804A1 PL424804A1 (pl) | 2019-09-09 |
| PL237408B1 true PL237408B1 (pl) | 2021-04-19 |
Family
ID=67844605
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| PL424804A PL237408B1 (pl) | 2018-03-08 | 2018-03-08 | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka wątrobowokomórkowego |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| PL (1) | PL237408B1 (pl) |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| DD293963A5 (de) * | 1989-07-14 | 1991-09-19 | ��������`������������@��@������k�������@�������@M�������]k�� | Verfahren zur herstellung eines anthelminthikums |
-
2018
- 2018-03-08 PL PL424804A patent/PL237408B1/pl unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| PL424804A1 (pl) | 2019-09-09 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Al Amri et al. | Comparison of total phenols, flavonoids and antioxidant potential of local and imported ripe bananas | |
| Vittaya et al. | Comparative analyses of saponin, phenolic, and flavonoid contents in various parts of Rhizophora mucronata and Rhizophora apiculata and their growth inhibition of aquatic pathogenic bacteria | |
| Badami et al. | Antioxidant activity of Aporosa lindleyana root | |
| Chithambo et al. | Anti-malarial synergy of secondary metabolites from Morinda lucida Benth | |
| Turker et al. | Free radical scavenging activity and phenolic content of edible wild fruits from Kazdagi (Ida Mountains), Turkey | |
| Gobalakrishnan et al. | Antimicrobial potential and bioactive constituents from aerial parts of Vitis setosa wall | |
| Datta et al. | Anti-diabetic, anti-inflammatory and anti-oxidant properties of four underutilized ethnomedicinal plants of West Bengal, India: an in vitro approach | |
| Sidaoui et al. | Study of Tunisian nettle leaves (Urtica dioica L.): mineral composition and antioxidant capacity of their extracts obtained by maceration and supercritical fluid extraction | |
| Benjamin et al. | Bioactivity and chemical analysis of Drepanoalpha: an anti-sickle cell anemia poly-herbal formula from Congo-Kinshasa | |
| Powthong et al. | Comparative analysis of antioxidant, antimicrobial, and tyrosinase inhibitory activities of Centella asiatica (l.) Urb and Eichhornia crassipes (mart.) Solms | |
| Ydyrys et al. | Green synthesis of silver nanoparticles using plant leaf extraction andphytochemical profile and biological potential of Artemisia schrenkiana | |
| Umashankar et al. | Isolation, purification and in vitro cytotoxicity activities of coumarin isolated from endophytic fungi, Alternaria species of Crotalaria pallida | |
| Azhagu Madhavan et al. | In-vitro anticancer activity of phyto-pharmacological and GC-MS analysis of bioactive compounds presents in Avicennia marina leaves ethanolic extract against Hep-G2 cell line | |
| PL237408B1 (pl) | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka wątrobowokomórkowego | |
| Kang et al. | Antioxidant compounds of Sambucus pendula stem | |
| PL237410B1 (pl) | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu czerniaka | |
| PL236370B1 (pl) | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu raka żołądka | |
| PL237206B1 (pl) | Sposób otrzymywania ekstraktu z Cochlospermum angolense o aktywności przeciwnowotworowej oraz zastosowanie ekstraktu z Cochlospermum angolense w leczeniu szpiczaka | |
| Setu et al. | Study on antioxidant and cytotoxic activities of methanolic and ethyl acetate extracts of peel and seed of Diospyros blancoi | |
| Thayyil et al. | Comparative Evaluation of in vitro antioxidant activities of various extracts from Chomelia asiatica (Linn) and Pavetta indica (Linn) | |
| Alidadi et al. | Antioxidant potential and total phenolic compounds of extracts and fractions of Pistasia atlantica | |
| KR101794995B1 (ko) | 야관문 추출물 유래의 베타-시토스테롤-6-리노레노일-3-O-베타-D-글루코피라노사이드 (β-sitosterol-6'-linolenoyl-3-O-β-D-glucopyranoside)를 함유하는 발기부전치료제 및 이를 포함하는 성기능 개선 기능성식품 조성물 | |
| Ogechukwu et al. | In vivo antimalarial activity and phytochemical screening of tree bark extract of ficus elastica | |
| Wang et al. | Antibacterial effects of chebulagic acid and chebulinic acid isolated from Terminalia chebula against Vibrio parahaemolyticus | |
| Choudhari et al. | In Vitro Evaluation of Berberis aristata for Cytotoxic Activity |