PL237514B1

PL237514B1 - Pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego, sposób ich wytwarzania, ich zastosowanie medyczne oraz kompozycja farmaceutyczna

Info

Publication number: PL237514B1
Application number: PL428441A
Authority: PL
Inventors: Nazar Trotsko; Katarzyna Dzitko; Adrian Bekier
Original assignee: Univ Lodzki; Univ Medyczny W Lublinie
Priority date: 2018-12-31
Filing date: 2018-12-31
Publication date: 2021-04-19
Also published as: PL428441A1

Abstract

Przedmiotem zgłoszenia są pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3. Zgłoszenie obejmuje też sposób otrzymywania powyższych związków oraz kompozycje farmaceutyczną, która je zawiera.

Description

Opis wynalazku

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-Cl-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3. Przedmiotem wynalazku jest także sposób ich wytwarzania, ich zastosowanie medyczne oraz kompozycja farmaceutyczna.

Toxoplasma gondii (T. gondii) należy do gatunku kosmopolitycznego pasożyta wywołującego toksoplazmozę u wszystkich gatunków ptaków i ssaków w tym ludzi. Szacuje się, że nawet 1/3 populacji jest zarażona tym pasożytem [Tenter A.M., Heckeroth A.R., Weiss L.M. Int. J. Parasitol. 2000, 30, 12171258]. Rozwinięta odpowiedź humoralna i komórkowa u osób immunokompetentnych szybko ogranicza intensywną proliferację tachyzoitów, ale gdy nie wyeliminuje pasożyta całkowicie z organizmu gospodarza, skutkuje to długotrwałą obecnością cyst tkankowych zlokalizowanych głównie w ośrodkowym układzie nerwowym (OUN), mięśniach i gałce ocznej. Ta długotrwała obecność pasożyta może nieść ryzyko wystąpienia trwałych uszkodzeń narządu wzrokowego oraz (lub) mózgu, a także wykazuje korelację z występowaniem poważnych zaburzeń nerwowych takich jak: schizofrenia, choroba Parkinsona czy padaczka [Bosch-Driessen L.E., Berendschot T.T., Ongkosuwito J.V., Rothova A. Ophthalmology 2002, 109, 869-878; Torrey E.F., Yolken R.H. Emerg. Infect. Dis. 2003, 9, 1375-1380].

Zarażenie pierwotniakiem wiąże się również z poważnymi skutkami u osób z dysfunkcją układu odpornościowego (osoby HIV+, chorzy na AIDS, pacjenci poddani chemioterapii/po przeszczepach). U ciężarnych natomiast może powodować wady płodu, a nawet poronienia. Noworodki z toksoplazmozą wrodzoną charakteryzują się występowaniem zmian patologicznych w obrębie układu nerwowego, przy czym skutki wrodzonej inwazji T. gondii często są zauważalne dopiero po kilkunastu latach i obejmują uszkodzenia narządu wzroku lub OUN, zaburzenia gospodarki hormonalnej czy nieprawidłowy rozwój płciowy [Wallon M., Kodjikian L, Binquet C, Garweg J., Fleury J., Quantin C., Peyron F. Pediatrics 2004, 113, 1567-1572]. Z kolei toksoplazmoza u osób z obniżoną odpornością objawia się bólami głowy, poczuciem dezorientacji, bólami w klatce piersiowej oraz problemami z oddychaniem [Ferreira M.S., Borges A.S. Mem. Inst Oswaldo Cruz 2002, 97, 443-457]. Ponadto istnieje u tych pacjentów ryzyko wystąpienia trwałych uszkodzeń narządu wzrokowego lub mózgu [Guex-Crosier Y. Int. J. Med. Sci. 2009, 6,140-142; Długońska H. Pol. Merkuriusz Lekarski2008, 24, 275-277]. W przypadkach skrajnych choroba ta jest śmiertelna. Obecnie dostępne leki działają jedynie na ostrą fazę toksoplazmozy lecz nie powodują eradykacji pierwotniaka z organizmu oraz nie eliminują całkowicie cyst pasożytniczych, a co gorsze, wykazują poważne skutki uboczne, do których zaliczyć należy m.in. zaburzenia hematologiczne i neurologiczne, zmiany skórne i błon śluzowych, zaburzenia żołądkowo-jelitowe, uszkodzenia szpiku kostnego, teratogenność, czy kamienicę nerkową [Guex-Crosier Y. Int. J. Med. Sci. 2009, 6, 140-142; Lipka B., Milewska-Bobula B., Filipek M. Wiadomości Parazytologiczne 2011, 57, 87-92]. Odnotowywane są również przypadki oporności wielolekowej. Istnieje zatem rzeczywiste zapotrzebowanie na opracowanie nowych leków, zdolnych do skutecznego leczenia toksoplazmozy oraz pozbawionych skutków ubocznych. Dodatkowo nie są znane jeszcze skuteczne narzędzia immunoprofilaktyczne działające protekcyjnie na ludzi.

Układ tiazolidyn-4-onu należy do ważnej grupy związków heterocyklicznych o różnorodnych aktywnościach biologicznych, takich jak przeciwbakteryjna, przeciwcukrzycowa, przeciwnowotworowa, przeciwgrzybicza, przeciwzapalna itd. Układ ten cieszył się ciągłym zainteresowaniem naukowców na przestrzeni wielu lat. Potwierdzają to liczne prace przeglądowe na temat aktywności oraz mechanizmów działania tiazolidyn-4-onów [Kaminskyy D., Kryshchyshyn A., Lesyk R. Eur. J. Med. Chem. 2017, 140, 542-594; Havrylyuk D., Roman O., Lesyk R. Eur. J. Med. Chem. 2016, 113, 145-166; Chadna N., Bahia M.S., Kaur M., Silakari O. Bioorg. Med. Chem. 2015, 23, 2953-2974; Tripathi A.C., Gupta S.J., Fatima G.N., Sonar P.K., Verma A., Saraf S.K. Eur. J. Med. Chem. 2014, 72, 52-77; Jain V.S., Vora D.K., Ramaa C.S. Bioorg. Med. Chem. 2013, 21,1599-1620; Verma A., Saraf S.K. Eur. J. Med. Chem. 2008, 43, 897-905].

Pierwsza wzmianka o aktywność anty-T. gondii dla pochodnych tiazolidyn-4-onu, mianowicie kwasów {3-alkilo/fenylo-2-[(nitrobenzylideno)hydrazynylideno]-4-okso-1,3-tiazolidyn-5-ylo}octowych ukazała się w publikacji Tenorio R.P. i wsp. w 2005 roku [Tenorio R.P., Carvalho C.S., Pessanha C.S., de Lima J.G., de Faria A.R., Alves AJ., de Melo E.J.T., Goes A.J.S. Bioorg. Med. Chem. Letts. 2005, 15, 2575-2578].

De Aquino T.M. i wsp. przebadali grupę pochodnych kwasu 2-[(benzylideno)hydrazono]-3-fenylo-4-okso-tiazolidyno-5-octowego pod kątem aktywności przeciw-T. gondii. Wszystkie badane związki

PL 237 514 B1 znacząco zmniejszały procent zainfekowanych komórek i średnią liczbę tachyzoitów na komórkę w stężeniu 2 mM. Niektóre pochodne wykazały lepsze wyniki w porównaniu z standardowymi lekami: hydroksymocznikiem i sulfadiazyną. Warto zauważyć, że w stężeniach 2, 5 i 8 mM niektóre związki były wysoce toksyczne. Obserwowano brak zainfekowanych komórek i pasożytów wewnątrzkomórkowych [De Aquino T.M., Liesen A.P., da Silva R.E.A., Lima V.T., Carvalho C.S., de Faria A.R., de Araujo J.M., de Lima J.G., Alves A.J., de Melo E.J.T., Goes A.J.S. Bioorg. Med. Chem. 2008, 16, 446-456].

Liesen A.P. i wsp. zmodyfikowali pochodne kwasu 4-oksotiazolidyno-5-octowego wprowadzając w pozycję 2 układu tiazolidyny pierścień imidazolu. Te związki zostały poddane badaniom pod kątem aktywności anty-T. gondii. Przebadane pochodne znacząco zmniejszały procent infekowanych komórek oraz liczbę tachyzoitów w komórce w stężeniach od 0,1 do 10 mM w porównaniu do sulfadiazyny i hydroksymocznika [Liesen A.P., de Aquino T.M., Carvalho C.S., Lima V.T., de Araujo J.M., de Lima J.G., de Faria A.R., de Melo E.J.T., Alves A.J., Alves E.W., Alves A.Q., Goes AJ.S. Eur. J. Med. Chem. 2010, 45, 3685-3691].

Dla podstawionych 3-benzylowych pochodnych tiazolidyn-4-onu odnotowano poziom skuteczności przeciwko tachyzoitom T. gondii przy IC50 = 5-148 ąM [Carradori S., Secci D., Bizzarri B., Chimenti P., De Monte C., Guglielmi P., Campestre C., Rivanera D., Bordon C., Jones-Brando L. J. Enzyme Inhib. Med. Chem. 2017, 32, 746-758].

Brak 100% skuteczności obecnych leków w leczeniu toksoplazmozy były inspiracją do podjęcia badań w celu otrzymania skutecznych małotoksycznych związków o aktywności przeciw-T. gondii, należących do tej grupy chemicznej.

Przedmiotem wynalazku są nowe pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-Cl-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3 o aktywności anty-T. gondii. Związki te nie były opisane dotąd w literaturze ani pod względem ich budowy ani aktywności biologicznej.

Sposób otrzymywania pochodnych o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3 według wynalazku polega na tym, że otrzymuje się je w wyniku cyklokondensacji odpowiednich tiosemikarbazonów o wzorze 2, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3 z acetylenodikarboksylanem dimetylu, w stosunku molowym 1:1. Reakcja przebiega w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika organicznego jak metanol lub etanol korzystnie etanol.

Pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1 według wynalazku do zastosowania jako lek w leczeniu toksoplazmozy.

Przedmiotem wynalazku jest także kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną w połączeniu z co najmniej 1 nośnikiem lub rozcieńczalnikiem farmaceutycznym, która charakteryzuje się tym, że jako substancję aktywną zawiera pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1.

Nowe związki będące przedmiotem wynalazku wykazują aktywność anty-T. gondii in vitro oraz brak znaczącej cytotoksyczności względem komórek żywicielskich.

P r z y k ł a d I. Otrzymywanie {3-fenylo-2-[(4-hydroksybenzylideno)hydrazynylideno]-4-okso-1,3-tiazolidyn-5-ylideno}octanu metylu

Do 0,003 mola 4-fenylo-1-(4-hydroksybenzylideno)-3-tiosemikarbazydu i 0,003 mola acetylenodikarboksylanu dimetylu dodano 20 mL metanolu i ogrzewano we wrzeniu przez 1,5 godziny. Po ochłodzeniu powstały osad odsączono i wysuszono. Krystalizowano z kwasu octowego.

Wydajność 81%, t.t. 222-224°C.

Ή NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 3,83 s (3H, COOCH3); 6,80 s (1H, CH=); 6,86 d, 7,64 d (4H, 4-HO-C6H4, J=8,7 Hz); 7,47-7,57 m (5H, C6H5); 8,33 s (1H, CH=N); 10,22 s (1H, OH).

¹³C NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 53,0; 115,1; 116,3; 125,0; 128,7; 129,5; 129,6; 130,6; 134,8; 142,5; 159,6; 160,3; 161,2; 164,6; 166,5.

P r z y k ł a d II. W sposób analogiczny do opisanego w przykładzie I otrzymano pozostałe pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1 (gdzie R oznacza 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3):

{3-fenylo-2-[(4-hydroksy-3-metoksybenzylideno)hydrazynylideno]-4-okso-1,3-tiazolidyn-5-ylideno}octan metylu

Wydajność 79%, t.t. 210-212°C.

PL 237 514 B1 ¹H NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 3,81 s (3H, OCH3); 3,82 s (3H, COOCH3); 6,80 s (1H, CH=); 6,87 d, 7,25 dd, 7,35 d (3H, 4-HO-3-CH3O-C6H3, J=8,1; 1,8 Hz); 7,49-7,58 m (5H, C6H5); 8,31 s (1H, CH=N); 9,84 s (1H, OH).

¹³C NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 53,1; 56,0; 111,3; 115,1; 116,2; 123,4; 125,4; 128,7; 129,5; 129,6; 134,8; 142,5; 148,3; 150,8; 159,4; 160,6; 164,6; 166,5.

{2-[(3-etoksy-4-hydroksybenzylideno)hydrazynylideno]-3-fenylo-4-okso-1,3-tiazolidyn-5-ylidenojoctan metylu

Wydajność 81%, t.t. 190-192°C.

¹H NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 1,36 t (3H, OCH2CH3, J=6,9 Hz); 3,82 s (3H, COOCH3); 4,06 q (2H, OCH2CH3, J=6,9 Hz); 6,80 s (1H, CH=); 6,88 d, 7,25 dd, 7,33 d (3H, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, J=8,1; 1,8 Hz); 7,47-7,57 m (5H, C6H5); 8,30 s (1H, CH=N); 9,74 s (1H, OH).

¹³C NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 15,2; 53,1; 64,4; 112,8; 115,1; 116,3; 123,3; 125,4; 128,7; 129,5; 129,6; 137,8; 142,4; 147,5; 151,0; 159,3; 160,6; 164,6; 166,5.

{2-[(3-chloro-4-hydroksybenzylideno)hydrazynylideno]-3-fenylo-4-okso-1,3-tiazolidyn-5-ylidenojoctan metylu

Wydajność 83%, t.t. 238-240°C.

¹H NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 3,83 s (3H, COOCH3); 6,81 s (1H, CH=); 7,07 d, 7,63 dd, 7,74 d (3H, 3-CI-4-HO-C6H3, J=8,4; 2,0 Hz); 7,49-7,57 m (5H, C6H5); 8,34 s (1H, CH=N); 11,00 s (1H, OH).

¹³C NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 53,1; 115,3; 117,5; 120,7; 126,3; 128,5; 128,7; 129,5; 129,6; 130,4; 134,7; 142,3; 156,5; 159,2; 160,5; 164,6; 166,5.

{2-[(3-bromo-4-hydroksybenzylideno)hydrazynylideno]-3-fenylo-4-okso-1,3-tiazolidyn-5-ylidenojoctan metylu

Wydajność 75%, t.t. 236-238°C.

¹H NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 3,83 s (3H, COOCH3); 6,81 s (1H, CH=); 7,06 d, 7,67 dd, 7,90 d (3H, 3-Br-4-HO-C6H3, J=8,4; 2,0 Hz); 7,47-7,57 m (5H, C6H5); 8,34 s (1H, CH=N); 11,06 s (1H, OH).

¹³C NMR δ (ppm) (DMSO-d6): 53,1; 110,3; 115,3; 117,2; 126,7; 128,7; 129,2; 129,5; 129,6; 133,4; 134,7; 142,3; 157,5; 159,0; 160,4; 164,6; 166,5.

Badania biologiczne.

P r z y k ł a d III. Wpływ na żywotność komórek linii L929 - test MTT.

Zasada testu MTT

Oznaczenie cytotoksyczności związków z wykorzystaniem komórek linii L929 wykonano przy użyciu testu MTT, zgodnie z Normą Europejską: ISO 10993-5:2009(E), Biological evaluation of medical devices, Part 5: Test for in vitro cytotoxycity. Test MTT oparty jest na przekształceniu żółtej soli MTT (bromku 3-(4,5-dimetylotiazolo-2-ilo)-2,5-difenylotetrazoliowego) do fioletowego, nierozpuszczalnego formazanu. Za tę konwersję odpowiedzialne są NADPH lub NADH, produkowane przez enzym dehydrogenazę mitochondrialną obecną w aktywnych metabolicznie komórkach. Natężenie barwy fioletowego produktu jest wprost proporcjonalne do liczby żywych komórek w próbce i może być mierzone spektrofotometrycznie.

Część doświadczalna

Na płytkę 96-dołkową (Nunc^TC), naniesiono komórki (L929 ATTC-catalog No. CCL-1™) o gęstości 1x104/100 μl/dołek, zawieszone w pełnym podłożu hodowlanym RPMI 1640 bez czerwieni fenolowej (Biowest) suplementowanym 10% surowicy płodów bydlęcych [FBS - fetal bovine serum] (Cytogen), 2 mM/ml L-glutaminy (Sigma), 100 μg/ml streptomycyny (Sigma), 100 U/ml penicyliny (Sigma) i inkubowano je (37°C, 5% CO2) przez 24 godziny. Po inkubacji usuwano podłoże znad komórek i dodawano po 100 μl związków (stężenia końcowe wynosiły: 200 μg/ml). Związki rozpuszczono w 0,5 M wodorotlenku sodu (NaOH) 6,25 mg/ml i następnie seryjnie rozcieńczono w pełnym podłożu. Końcowe stężenie NaOH nie było wyższe niż 3,2%. Dodatkowe kontrole stanowił: rozpuszczalnik NaOH, sulfadiazyna oraz sulfadiazyna + trimetoprim (5:1). Kontrolę negatywną stanowiły komórki hodowane w pełnym podłożu hodowlanym RPMI.

Po dodaniu ww. związków komórki inkubowano 24 godziny w 37°C, 5% CO2. Po tym czasie hodowle obserwowano pod mikroskopem i wykonywano zdjęcia. Następnie do każdego dołka na płytce dodawano po 50 μl roztworu MTT (C=1 mg/ml PBS bez jonów Ca i Mg, Sigma) i inkubowano (37°C i 5% CO2). Po 4 godzinach płytki wirowano (200xg, 10 min), zbierano supernatant znad komórek,

PL 237 514 Β1 a kryształy formazanu rozpuszczano dodając po 150 μΙ DMSO/studzienkę. Barwę produktu stabilizowano dodając po 25 μΙ buforu glicynowego. Poziom absorbancji mierzono od razu za pomocą czytnika ELISA (Multiskan EX, Labsystems, Vienna, VA, USA), przy długości fali λ=570 nm.

W doświadczeniu oceniano wpływ testowanych związków na żywotność komórek linii L929 przy pomocy testu MTT. Za kontrolę przyjęto hodowle komórkowe inkubowane w pełnym podłożu RPMI, bez dodatku badanych substancji i rozpuszczalnika (NaOH). Żywotność komórek obliczono według wzoru:

Żywotność = „ _100%

Wartość absorbancji próby kontrolnej

Dla badanych związków wyznaczono stężenie CC30 - stężenie cytotoksyczne związków dla 30% komórek (Tabela 1).

Oceniono także wpływ leków powszechnie stosowanych w leczeniu toksoplazmozy na żywotność komórek linii L929. W przypadku sulfadiazyny CC30 wynosi 1506,00 μg/ml, oraz dla sulfadiazyny + trimetoprim CC30 wynosi 850,00 μg/ml.

Tabela 1. Cytotoksyczność pochodnych kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1 (stężenie wyjściowe 6,25 mg/ml 0,5M NaOH), rozcieńczonych seryjnie w pełnym podłożu hodowlanym RPMI. Procent żywych komórek (%) ± odchylenie standardowe.

pochodne kwasu (4-oksotiazolidynS*ylideno)octowego	200	100	50	Stężenia [μg/ml] 25 12,5 6,25	3,1	1,6	0,8	CC30 [μ&Μ
1	25,06 ±1,90	101,31 ±9,83	101,90 ±0,81	96,12 ±1,11	89,64 ±1,86	91,16 ±0,52	92,75 ±1,41	97,80 ±1,34	99,99~ ±2.02	180,00
2	50,62 ±5,50	76,27 ±4,81	98,47 ±5,43	87,96 ±1,62	89,73 ±4,90	90,32 ±7,37	97,72 ±2,92	99,73 ±9,78	98,47 ±2,54	120,00
3	35,40 +3,02	106,22 ±7,16	101,42 +6,57	88,30 +7,27	85,77 ±6,10	87,62 ±5,70	90,99 ±9,67	94,69 ±6,28	97,30 ±8,92	191,00
4	29,60 ±3,21	105,29 +3,21	103,03 +8,99	103,94 ±1,37	95,19 ±2,00	94,69 ±1,76	93,43 ±4,71	97,72 ±5,11	99,48 ±2,75	183,00
5	33,55 ±3,57	103,88 +5,33	104,43 ±5,76	102,85 ±2,66	93,09 ±2,94	93,26 ±6,50	95,28 ±4,87	100,91 +4,24	103,18 +9,11	186,00

Objaśnienia skrótów: 1 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4); 2 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-3-CH3O-C6H3); 3 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 3-C2H5O-4-HO-C6H3); 4 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 3-CI-4-HOC6H3); 5 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 3-Br-4-HO-C₆H₃).

Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1 wykazują niską cytotoksyczność. Stężenie cytotoksyczne CC30 w kierunku linii komórek L929 wynosiło odpowiednio: 180,00 μg/ml (dla związku 1), 120,00 μg/ml (dla związku 2), 191,00 μg/ml (dla związku 3), 183,00 μg/ml (dla związku 4), 186,00 μg/ml (dla związku 5).

Przykład IV. Badanie wpływu pochodnych tiazolidyn-4-onu na wewnątrzkomórkowe namnażanie się tachyzoitów T gondii szczepu RH ATCC* PRA-310™ na komórkach linii Vero ATCC* CCL-81™ (test inkorporacji uracylu znakowanego trytem).

Wpływ pochodnych kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego na wewnątrzkomórkowe namnażanie się pierwotniaka T gondii szczepu RH na komórkach linii Vero wykonano przy użyciu testu wbudowywania uracylu znakowanego trytem. Kontrolę doświadczenia stanowiły komórki fibroblastów nerki małpy zielonej zarażone pierwotniakiem i inkubowane w podłożu hodowlanym bez leku (kontrola negatywna - przyjęto jako 100% proliferacji Tg). Wyznaczono wartość IC50 (halfmaximal inhibitory concentration - stężenie powodujące zahamowanie namnażania się pierwotniaka o 50%).

Test inkorporacji ³H-uracylu polega na pomiarze radioaktywności pierwiastka trytu, który wraz z uracylem jest wychwytywany i wbudowywany do łańcucha RNA T gondii. Mniejsza liczba zliczeń przez czytnik scyntylacyjny w porównaniu do kontroli świadczy o hamowaniu namnażania się pierwotniaka w mikrohodowli w obecności testowanych związków.

Część doświadczalna

24-godzinną hodowlę komórek Vero (1x10⁴/studzienkę) zarażono tachyzoitami T gondiiszczepu RH w stosunku 1 komórka żywicielska do 10 komórek pierwotniaka (1x10⁵/100 μΙ/studzienkę) - w całym

PL237 514B1 teście inkorporacji uracylu stosowano podłoże hodowlane DMEM [Dulbecco's Modified Eagle's Medium] (ATCC) suplementowane 3% termicznie inaktywowanej surowicy płodów bydlęcych [HIFBS - heat inactivated fetal bovine serum] (ATCC), 100 μg/ml streptomycyny (ATCC), 100 U/ml penicyliny (ATCC). Mikrohodowle inkubowano 1 godzinę w 37°C, 5% CO2, umożliwiając pierwotniakowi wniknięcie do komórek i utworzenie wakuoli pasożytniczej. Po tym czasie dodano po 100 μΙ badanego związku, uzyskując końcowe stężenia: 0,8-200 μg/ml, kontrolę pozytywną stanowiła sulfadiazyna (najwyższe stężenie 2500 μg/ml) oraz sulfadiazyna + trimetoprim w stosunku 5:1 (najwyższe stężenie odpowiednio 2500 i 500 μg/ml). Płytki inkubowano 24 godziny (37°C, 5% CO2), a następnie do każdej studzienki dodawano ³H-uracylu (1 μΰί/50 μΙ), po czym kontynuowano inkubację przez 48 godziny w warunkach jw. Po tym czasie płytki zamrożono w -20°C. Przed przystąpieniem do odczytu testu płytkę rozmrażano, a zawartość studzienek zbierano na bibułę z włókna szklanego (Wallac Oy PrintedFiltermat A), którą pozostawiono do wyschnięcia. Do pomiaru poziomu promieniowania β użyto czytnika scyntylacyjnego (Wallac Oy, Turku, Finland), uprzednio nasączając bibuły płynem scyntylacyjnym (BetaplateScint, PerkinElmer).

Oceniono wpływ pochodnych kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego według wynalazku na namnażanie się pierwotniaka w hodowlach komórek linii Vero. Wartości stężeń IC50 obliczono za pomocą programu GraphPad Prism wersja 7.00 dla Windows (GraphPad Software, San Diego, CA, USA) na podstawie danych zamieszczonych w Tabeli 2.

Tabela 2. Aktywność przeciw-Toxoplasma gondii. Procent proliferacji T. gondii ± odchylenie standardowe.

	pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego
1	2	3	4	5
gg/ml	wartość	±SD	wartość	+SD	wartość	±SD	wartość	±SD	wartość	±SD
200	3/4	1,08	nt	nt	nt	nt	nt	nt	0,32	0,14
150	17,22	1,05	28,38	7,22	23,97	9,17	0,55	0,14	0,45	0,14
100	44,94	10,59	43,59	9,16	49,61	8,23	5,54	1,38	2,26	1,59
50	55,82	18,99	60,67	8,72	59,09	6,63	35,69	11,01	21,30	3,86
25	59,98	16,18	70,19	14,24	79,30	13,78	56,66	6,02	46,20	26,70
12,5	72,45	8,50	84,13	9,81	83,12	10,33	53,70	7,67	59,65	13,66
6,25	73,58	9,39	81,82	7,87	81,72	8,66	61,27	9,37	69,26	8,41
3,13	81,60	11,32	84,27	4,44	76,98	11,80	68,87	13,21	77,17	11,77
1,56	78,96	7,66	85,43	8,16	82,90	3,14	71,09	12,17	74,97	4,70
0,78	87,58	10,09	75,58	8,23	78,67	4,03	74,65	14,37	81,08	3,16
IC50	40,69	74,17	87,07	13,33	14,54
CC30	180,00	120,00	191,00	183,00	186,00
IC₅o:CC₃q	0,23	0,62	0,46	0,07	0,08
Kontrola	sulfadiazyna	sulfadiazyna + trimetoprim (5:1)
IC50	1756,40					130,70
CC30	1506,00					850,00
IC₅q:CC₃o	1,17					0,15

Objaśnienia skrótów: 1 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4); 2 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-3-CH3O-C6H3); 3 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 3-C2H5O-4-HO-C6H3); 4 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 3-CI-4-HO-C6H3); 5 (związek o wzorze 1, gdzie R oznacza 3-Br-4-HO-C6H3); nt - stężenie nie testowane ze względu na cytotoksyczność pochodnej.

PL 237 514 B1

Wartości stężeń IC50 dla substancji wzorcowych (sulfadiazyna oraz sulfadiazyna + trimetoprim 5:1) wynosiły - 1756,40 μg/ml (dla sulfadiazyny) oraz 130,70 μg/ml (dla sulfadiazyny + trimetoprimu).

Na podstawie przeprowadzonych badań wykazano, że nowe pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn5-ylideno)octowego wykazują hamowanie proliferacji T. gondii in vitro przy stężeniu wyrażonym jako IC50 niższym niż przy stosowanych lekach wzorcowych - sulfadiazyna (1756,40 μg/ml) oraz synergistycznym działaniu sulfadiazyny + trimetoprimu (130,70 μg/ml). Ponadto związki 4 i 5 wykazują hamowanie proliferacji przy około 130 razy mniejszym wartości IC50 w stosunku do sulfadiazyny i ponad dziewięciokrotnie mniejszych w stosunku do synergistycznego działania sulfadiazyny z trimetoprimem.

Claims

1. Pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3.

2. Sposób otrzymywania pochodnych kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3, znamienny tym, że otrzymuje się ich w wyniku cyklokondensacji odpowiednich tiosemikarbazonów o wzorze 2, gdzie R ma wyżej podane znaczenie z acetylenodikarboksylanem dimetylu, w stosunku molowym 1:1, w temperaturze wrzenia rozpuszczalnika organicznego jak metanol, etanol korzystnie metanol.

3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że otrzymane związki krystalizuje się z lodowatego kwasu octowego.

4. Pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze ogólnym 1 przedstawionym na rysunku, gdzie R oznacza 4-HO-C6H4, 4-HO-3-CH3O-C6H3, 3-C2H5O-4-HO-C6H3, 3-CI-4-HO-C6H3 i 3-Br-4-HO-C6H3 do zastosowania jako lek w leczeniu toksoplazmozy.

5. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca substancję czynną w połączeniu z co najmniej 1 nośnikiem lub rozcieńczalnikiem farmaceutycznym, znamienna tym, że jako substancję aktywną zawiera pochodne kwasu (4-oksotiazolidyn-5-ylideno)octowego o wzorze 1.